Artículo de método

Cosecha, incrustación y cultivo de ganglios de la raíz dorsal en dispositivos multicompartimentales para estudiar las características neuronales periféricas

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DOI:

10.3791/66854

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28 de junio de 2024

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1Department of Biological Systems Engineering, University of Nebraska-Lincoln

En este artículo

Resumen

Este protocolo proporciona una técnica para cosechar y cultivar ganglios de raíz dorsal explantados (DRG) de ratas Sprague Dawley adultas en un dispositivo multicompartimento (MC).

Resumen

La característica neuronal periférica más común del dolor es un umbral de estimulación disminuido o hipersensibilidad de los nervios terminales de los ganglios de la raíz dorsal (DRG). Una de las causas propuestas de esta hipersensibilidad está asociada a la interacción entre las células inmunitarias del tejido periférico y las neuronas. Los modelos in vitro han proporcionado conocimientos fundamentales para comprender cómo estos mecanismos dan lugar a la hipersensibilidad de los nociceptores. Sin embargo, los modelos in vitro se enfrentan al reto de trasladar la eficacia a los humanos. Para abordar este desafío, se ha desarrollado un modelo in vitro fisiológica y anatómicamente relevante para el cultivo de ganglios de raíz dorsal intactos (DRG) en tres compartimentos aislados en una placa de 48 pocillos. Los DRG primarios se extraen de ratas Sprague Dawley adultas después de la eutanasia humanitaria. Se recorta el exceso de raíces nerviosas y el DRG se corta en tamaños apropiados para el cultivo. A continuación, los GRD se cultivan en hidrogeles naturales, lo que permite un crecimiento robusto en todos los compartimentos. Este sistema multicompartimentado ofrece un aislamiento anatómicamente relevante de los cuerpos celulares DRG de las neuritas, los tipos de células fisiológicamente relevantes y las propiedades mecánicas para estudiar las interacciones entre las células neuronales e inmunitarias. Por lo tanto, esta plataforma de cultivo proporciona una herramienta valiosa para investigar las estrategias de aislamiento del tratamiento, lo que en última instancia conduce a un mejor enfoque de detección para predecir el dolor.

Introducción

El dolor crónico es la principal causa de discapacidad y pérdida de trabajo en todo el mundo1. El dolor crónico afecta a alrededor del 20% de los adultos en todo el mundo e impone una carga social y económicasignificativa 2, con costos totales estimados entre $560 y $635 mil millones cada año en los Estados Unidos3.

La principal característica periférica que presentan los pacientes con dolor crónico es la disminución del umbral de estimulación de los nervios, lo que hace que el sistema nervioso responda mejor a los estímulos 4,5. La disminución del umbral de estimulación puede dar lugar a una respuesta dolorosa a un estímulo previamente no doloroso (alodinia) o a una respuesta intensificada a un estímulo doloroso (hiperalgesia)6. Los tratamientos actuales para el dolor crónico tienen una eficacia limitada, y los tratamientos que tienen éxito en modelos animales a menudo fracasan en los ensayos en humanos debido a las diferencias mecanicistasen la manifestación del dolor. Los modelos in vitro que pueden imitar con mayor precisión los mecanismos de sensibilización periférica tienen el potencial de aumentar la traducción de nuevas terapias 8,9. Además, al modelar aspectos clave de los nervios sensibilizados en un sistema de cultivo, los investigadores podrían desarrollar una comprensión más profunda de los mecanismos que impulsan los umbrales más bajos e identificar nuevos objetivos terapéuticosque los reviertan.

Las plataformas in vitro o sistemas microfisiológicos ideales incorporarían la separación física de las neuritas distales y el cuerpo de las células de los ganglios de la raíz dorsal (DRG), un entorno celular tridimensional (3D) y la presencia de células de soporte nativas para imitar de cerca las condiciones in vivo . Sin embargo, un trabajo reciente de Caparaso et al.11 muestra que las plataformas actuales de cultivo de DRG carecen de una o más de estas características clave, lo que las hace insuficientes para replicarse en condiciones in vivo . Aunque estas plataformas son fáciles de instalar, no imitan la base biológica de la sensibilización periférica y, por lo tanto, es posible que no se traduzcan en eficacia in vivo . Para abordar esta limitación, se ha desarrollado un modelo in vitro fisiológicamente relevante para el cultivo de ganglios de la raíz dorsal (DRG) dentro de una matriz de hidrogel con tres compartimentos aislados para permitir el aislamiento fluídico temporal de neuritas y cuerpos celulares DRG11. Este modelo ofrece relevancia tanto fisiológica como anatómica, que tiene el potencial de estudiar la sensibilización periférica de las neuronas in vitro.

El creciente interés en el uso de explantes de DRG en un cultivo 3D se debe a su capacidad para facilitar el crecimiento robusto de neuritas, lo que sirve como un indicador indirecto de la viabilidad de DRG12. Si bien los explantes primarios de DRG neonatales o embrionarios se utilizan predominantemente en las plataformas actuales de cultivo in vitro 13,14, el uso de explantes de roedores adultos proporciona un mejor modelo de la fisiología neuronal madura, que imita de cerca la fisiología humana de DRG en comparación con los explantes de roedores neonatos o embrionarios15. Los explantes de DRG se refieren a la preservación del tejido celular y molecular del tejido nativo de DRG, principalmente mediante el mantenimiento de células de soporte nativas no neuronales. En este documento, se describe la metodología para cosechar y cultivar explantes de DRG de ratas Sprague Dawley adultas en un dispositivo multicompartimento (MC) (Figura 1).

Se ha demostrado eficacia en el cultivo de GRD de la columna cervical, torácica y lumbar sin diferencias observables en el crecimiento de neuritas. Para esta aplicación, el objetivo era provocar el crecimiento de neuritas en los compartimentos exteriores del dispositivo; por lo tanto, este artículo no discriminó entre los niveles de GRD. Sin embargo, si es necesario para un experimento específico, el nivel de DRG se puede adaptar para satisfacer las necesidades de los experimentadores. Actualmente existen otros modelos de cultivo compartimentados para el cultivo 3D de DRGs16, sin embargo, estos dispositivos no contienen células de soporte no neuronales nativas preservadas, lo que puede limitar la traducción. La preservación de la estructura nativa de las DRG recolectadas es importante porque asegura la retención de las células de soporte no neuronales, cuyas interacciones con las neuronas DRG son esenciales para mantener las propiedades funcionales de estas neuronas. Varios estudios co-cultivaron DRGs disociadas con células neuronales no nativas, como las células de Schwann, para promover la mielinización de las neuronas 17,18,19.

Protocolo

La cosecha de DRG se realizó de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Nebraska-Lincoln. Para el estudio se utilizaron ratas hembra Sprague Dawley de 12 semanas (~250 g). Los detalles de los animales, reactivos y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Fabricación y montaje de dispositivos multicompartimentos

  1. Diseño asistido por ordenador e impresión 3D del dispositivo multicompartimento
    NOTA: El dispositivo MC consta de tres compartimentos para el aislamiento de cuerpos celulares DRG y neuritas (Figura 2A). El dispositivo MC no está disponible comercialmente; sin embargo, el archivo STL se proporciona aquí (Archivo de codificación suplementario 1) para permitir la impresión 3D. La impresión del MC tarda un (1) día en completarse.
  2. Sube el archivo STL del MC a una impresora 3D de resina utilizando un software compatible.
    NOTA: El material ideal para la impresión es una resina de alta temperatura. Una ventaja clave de usar resina de alta temperatura es que es biocompatible y se puede esterilizar en autoclave y reutilizar. También se puede utilizar una impresora 3D de procesamiento digital de luz (DLP) u otras impresoras 3D para imprimir el dispositivo.
  3. Transfiera los dispositivos impresos a una solución de lavado durante 30 minutos en isopropanol (>96%) para eliminar la resina residual de la superficie del dispositivo MC impreso.
  4. Fotocure los dispositivos a 80 °C durante 120 min utilizando un agente de curado disponible en el mercado (consulte la tabla de materiales). El agente de curado mejora las propiedades mecánicas del dispositivo MC impreso al exponerlo a la temperatura y a los rayos UV.
  5. Cura térmicamente los dispositivos MC en un horno a 160 °C durante 180 min.
  6. Esterilice los dispositivos utilizando un autoclave durante 45 minutos en un ciclo de gravedad.

2. Preparación del hidrogel

  1. Sintetizar ácido hialurónico metacrilato (MAHA, metacrilación 85%-115%) y caracterizar mediante un protocolo descrito por Seidlits et al.20.
    NOTA: Para apoyar el crecimiento de DRG, se usan comúnmente hidrogeles triples compuestos de ácido hialurónico metacrilato, colágeno tipo I y laminina. Los resultados indican que los GRD crecen comúnmente en MAHA, oscilando entre 1,25 y 2,5 mg/mL y el colágeno entre 2,0 y 4,5 mg/mL. En el caso de la laminina, se ha comprobado que 0,75 mg/mL es suficiente para garantizar un crecimiento robusto de los GRD. En este artículo, se detallan los métodos para crear un gel triple con 1,25 mg/mL de MAHA, 4,5 mg/mL de colágeno y 0,75 mg/mL de laminina. La preparación del hidrogel debe realizarse en una cabina de flujo laminar para proporcionar un espacio de trabajo aséptico.

3. Preparación de la solución del fotoiniciador

NOTA: Es necesario un fotoiniciador para la reticulación del MAHA bajo luz ultravioleta. Se utiliza habitualmente en porcentajes de 0,3% a 0,6%.

  1. Prepare la solución fotoiniciadora 3 días antes de la cosecha de DRG.
  2. Precalentar el baño de agua sonicante a 37 °C antes de preparar la solución del fotoiniciador.
  3. Trabajando con la técnica estéril en una campana de flujo, prepare una solución de bicarbonato de sodio (NaHCO3) de 23,125 mg/mL disolviendo NaHCO3 en 5 veces la solución Modified Eagle Medium (DMEM)-HEPES de Dulbecco.
  4. En un vial de vidrio, mezcle el fotoiniciador al 0,6 % en peso/volumen (p/v) en una solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) al 20 % vol/vol 1x y una solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril al 80 % vol/vol 5x.
  5. Para protegerlo de la luz, envuelva el frasco de vidrio en papel de aluminio. Sin embargo, asegúrese de retirar el papel de aluminio antes de transferir el vial al baño de agua de sonicación calentado a 37 °C con sonicación entre 30 y 40 min.
    NOTA: La solución del fotoiniciador debe protegerse de la luz porque puede descomponerse en radicales e iniciar el proceso de polimerización cuando se expone a la luz21.
  6. Filtre la solución estéril con un filtro de jeringa de 0,22 μm en un nuevo vial de vidrio estéril.

4. Disolución de ácido hialurónico metacrilato

  1. Disolver el ácido hialurónico metacrilato (preparado en el paso 2) el mismo día que se prepara la solución fotoiniciadora (paso 3).
  2. Coloque el MAHA liofilizado congelado en un desecador durante 15 minutos para que alcance la temperatura ambiente.
  3. Trabajando en una campana de flujo laminar y utilizando la técnica de pesaje estéril, pese el MAHA liofilizado en un vial de vidrio.
  4. Añada a MAHA el volumen necesario de solución de fotoiniciador filtrada para alcanzar la concentración deseada de MAHA. La concentración final común de gel es de 1,25 mg/mL de MAHA y 4,5 mg/mL de colágeno.
  5. Selle la tapa con una película de sellado de laboratorio, envuelva el frasco de vidrio con papel de aluminio y colóquelo en una placa agitadora orbital a temperatura ambiente hasta que se disuelva por completo (generalmente 3 días). De vez en cuando, vórtice la solución para separar grandes grupos de MAHA para garantizar una disolución uniforme de MAHA.

5. Montaje del dispositivo

  1. Coloque el dispositivo MC en una placa de 48 pocillos un día antes de la cosecha de DRG.
  2. Aplique una línea delgada de gel de silicona en la ranura debajo del dispositivo MC (Figura 2B) con una jeringa de 3 ml. Esto ayudará a que el dispositivo se adhiera de forma segura a la placa del pocillo.
  3. Con la ayuda de las pinzas #3, coloque suavemente el dispositivo MC en el pocillo de una placa de 48 pocillos, como se muestra en la Figura 2C.
    NOTA: El tamaño del dispositivo se puede modificar para adaptarse a la aplicación prevista, y se puede usar una placa de un tamaño diferente si se desea. Los dispositivos se pueden reutilizar. Para reutilizarlo, el hidrogel debe lavarse suavemente de todos los túneles, y la ranura de carga debajo del dispositivo debe usarse con etanol al 70% con agitación suave. Una vez completado, los dispositivos se pueden volver a esterilizar en autoclave antes de su uso.

6. Preparación animal

  1. Autoclave todas las herramientas de disección necesarias antes del inicio de la cosecha.
  2. Consigue una rata Sprague Dawley macho o hembra adulta de 12 a 20 semanas. El sexo de la rata no afecta el crecimiento de la GRD.
  3. Eutanasia de la rata de acuerdo con el protocolo aprobado de la IACUC utilizando la sobredosis de CO2 como método primario de eutanasia y la punción bilateral del neumotórax como método secundario de eutanasia de acuerdo con las Directrices de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria22.
  4. Coloque a la rata en una almohadilla estéril en una mesa de disección con el lado ventral hacia abajo. Rocía el pelaje con etanol al 70%.

7. Cosecha de ganglios de raíz dorsal (DRG)

  1. Prepare medios de recorte que contengan 86 % de medios Neurobasal A, 10 % de suero fetal bovino (FBS), 1 % de penicilina-estreptomicina (PS), 1 % de glutamina y 2 % de B27 más 50x y transfiéralos a una placa de 24 pocillos. Este medio y la placa de pocillo se utilizarán para el almacenamiento temporal de los GRD cosechados antes de incrustarlos en el hidrogel.
  2. Use una bata de laboratorio, mascarilla quirúrgica, gorro, gafas de seguridad y guantes.
  3. Con unas tijeras grandes de punta roma, corte la piel en la base de la columna cervical y luego a lo largo de la columna.
  4. Para drenar aún más la sangre del canal espinal, corte por debajo de los omóplatos y hacia abajo a través del músculo para cortar los vasos sanguíneos principales.
  5. Use tijeras grandes y de punta afilada para cortar el músculo de la columna vertebral. Despeja la mayor cantidad de músculo posible para visualizar la columna vertebral.
  6. Extirpar los segmentos dorsal y lateral de las vértebras. Use un Rongeur recto y unas tijeras de punta afilada para eliminar las apófisis espinosas y transversales de las vértebras, comenzando en el extremo cervical y avanzando hacia el extremo lumbar.
  7. Extirpar la médula espinal. Use tijeras pequeñas de punta afilada para cortar cuidadosamente las raíces nerviosas conectadas a los DRG a lo largo de ambos lados de la médula espinal. Corte el extremo cervical de la médula espinal y levántelo con cuidado fuera del canal espinal gradualmente, cortando a través de las raíces nerviosas restantes conectadas a los DRG.
    NOTA: Las habilidades motoras finas son esenciales para garantizar que el cuerpo de DRG no se corte en el proceso.
  8. Para exponer los DRG, use el Rongeur curvo para eliminar más partes laterales de las vértebras. Tira hacia afuera desde la línea media, alternando los lados. Tenga cuidado de no cortar el cuerpo DRG, ya que puede causar daño a los cuerpos celulares y a los axones.
  9. Usando las pinzas # 3 y las tijeras de resorte de borde recto, retire los DRG entre cada nivel de las vértebras. Agarre las raíces del nervio espinal del DRG, sáquelas con cuidado del bolsillo y corte el otro extremo del nervio espinal. Tenga cuidado de no agarrar el cuerpo del DRG directamente.
  10. Coloque los GRD en pocillos de una placa de 24 pocillos (que contiene medios de recorte, paso 7.1) sobre hielo.
  11. Después de recolectar todos los DRG, limpie el espacio de trabajo, coloque el cadáver en una bolsa de autoclave y guárdelo/deséchelo adecuadamente de acuerdo con el protocolo de IACUC.

8. Recorte y corte DRG

  1. Llene una placa de Petri de 60 mm en un banco limpio con medios de corte (paso 7.1). Configure el endoscopio de disección y el esterilizador de perlas de vidrio y coloque una caja de herramientas esterilizada en autoclave con herramientas de recorte (pinzas # 3 y tijeras de resorte de borde recto) junto al endoscopio.
  2. Bajo el endoscopio de disección, retire el exceso de tejido alrededor del DRG y recorte las raíces nerviosas cerca del cuerpo del DRG (por lo general, un poco más oscuras que los nervios circundantes).
  3. Llene una segunda placa de Petri de 60 mm con medios nuevos. Bajo el endoscopio de disección, corte los DRG recortados a aproximadamente 0,5 mm (o entre 0,5 mm y 0,8 mm). Se coloca una regla debajo de la placa de Petri durante el corte para tener el tamaño estimado correcto de los DRG cortados.
  4. Transfiera los DRG cortados a una placa nueva de 24 pocillos con el medio en hielo.
    NOTA: El recorte, el corte y la inclusión de DRG deben realizarse en una cabina de flujo laminar para proporcionar un espacio de trabajo aséptico. En ausencia de una cabina de flujo laminar, se deben observar técnicas asépticas, con el equipo de protección personal (EPP) mínimo adecuado recomendado (bata de laboratorio, mascarillas, gafas y guantes) y todas las herramientas esterilizadas durante todo el proceso para mitigar la posible contaminación.

9. Neutralización de colágeno

  1. Neutralizar el colágeno el mismo día de la cosecha de DRG después de recortar y cortar los DRG.
  2. Trabajando con hielo, pipetee ~8,16 % de agua ultrapura, ~1,84 % de hidróxido de sodio (NaOH) 1 M, ~10 % 10x PBS y ~ 80 % de colágeno del volumen total de solución en un vial de vidrio.
  3. Mezcle lentamente con una punta de pipeta estéril de baja retención para pipetear el colágeno (generalmente agregado al final) en la mezcla. Asegúrese de mantener la punta de la pipeta en la solución mientras mezcla para evitar la formación de burbujas. Verifique el pH del colágeno neutralizado usando tiras de pH para asegurarse de que sea ~7.
    NOTA: El colágeno neutralizado se puede mantener en hielo durante 2-3 h sin gelificarse; Por lo tanto, la fabricación de hidrogel debe llevarse a cabo de manera expedita una vez que se neutraliza el colágeno.

10. Fabricación de hidrogel

  1. Trabajando con hielo, pipetee laminina (hasta una concentración final de 0,75 mg/mL) y 1x PBS en un vial de vidrio.
  2. Utilizando puntas de pipeta estériles de baja retención, pipeteó el colágeno neutralizado y la solución de MAHA en la mezcla para llegar a la concentración deseada.
  3. Mezclar lentamente y comprobar el pH del hidrogel resultante (debe ser de ~7).

11. Incrustación de DRG

  1. Realizar la incrustación de varios compartimentos.
    1. Pipetear 65,1 μL y 52,8 μL del hidrogel premezclado en los compartimentos del soma y de la neurita, respectivamente.
      NOTA: Esto supone el uso de dispositivos MC en una placa de 48 pocillos. Estos volúmenes se pueden cambiar en función del tamaño del dispositivo MC utilizado.
    2. Incruste suavemente los DRG cortados en el compartimento del soma (Figura 2A), asegurándose de que no rayen el fondo de la placa del pocillo. Coloque el DRG en el centro para que las neuritas puedan crecer hacia los compartimentos adyacentes a través de los túneles.
    3. Reticulación térmica del hidrogel en la incubadora a 37 °C durante 30 min. Mientras esto ocurre, encienda la lámpara UV para calentarse.
    4. Después de la reticulación térmica, reticulación UV el hidrogel durante 90 s.
    5. Agregue el medio de crecimiento DRG al hidrogel y al DRG y realice un cambio completo del medio después de una hora para eliminar los rastros no reaccionados o restantes del fotoiniciador que persisten en el medio.
    6. Realice un cambio de medio medio cada 3 días y controle el crecimiento de los DRG observándolos bajo el microscopio.
    7. Después de ~ 4 semanas, cuando las neuritas DRG comiencen a crecer (Figura 3A), capture imágenes con el generador de imágenes de placa fluorescente y cuantifique la longitud de las neuritas usando FIJI (ImageJ).

12. Controlar la incrustación de DRG

  1. Pipetear 250 μL de hidrogel en una placa de 48 pocillos (sin MC).
  2. Coloque suavemente el DRG cortado en el centro del pocillo y hasta la mitad del hidrogel, asegurándose de que no raye el fondo de la placa del pocillo.
  3. Reticulación térmica del hidrogel en la incubadora a 37 °C durante 30 min.
  4. Reticulación UV del hidrogel durante 90 s.
  5. Agregue el medio de crecimiento DRG al hidrogel y al DRG y realice un cambio completo del medio después de una hora.
  6. Realice el cambio de medio medio cada 3 días y controle el crecimiento del DRG observándolo bajo el microscopio.
  7. Después de ~ 4 semanas, cuando las neuritas DRG comiencen a crecer (Figura 3B), capture imágenes con el generador de imágenes de placa fluorescente.
    NOTA: Cualquier microscopio de campo claro funcionará para la obtención de imágenes. Un microscopio automatizado basado en placas hace que este proceso sea más rápido. La inclusión de control en geles simples sin el dispositivo se realiza para comparar el crecimiento de neuritas DRG en múltiples compartimentos. Una vez que los usuarios validan que los DRG crecen de manera similar en MC y geles de control, es posible que no necesiten repetir los geles de control cada vez.

13. Imágenes DRG

  1. Capture imágenes de campo claro con un aumento de 4x utilizando un generador de imágenes de placa fluorescente en un rango de distancias focales para visualizar todo el dispositivo DRG y MC.
  2. Ajuste el brillo y el contraste de la imagen para facilitar la visualización de las neuritas.
  3. Guarde la imagen como un archivo .tiff.

14. Cuantificación de neuritas DRG

  1. Descargue e instale FIJI (ImageJ).
  2. Abra ImageJ. Abra el archivo de imagen y asegúrese de que el archivo sea monocromático.
  3. Mejore el contraste para que las neuritas más pequeñas sean visibles. Para ello, abre la opción de brillo y contraste con el atajo Ctrl+Shift+C.
  4. Ajuste los controles deslizantes del controlador según sea necesario para visualizar las neuritas y haga clic en Aplicar para obtener el brillo y el contraste deseados.
  5. Abra el trazador de neuritas abriendo el menú Plugins , seleccionando Segmentación y haciendo clic en Tracer de neurita simple.
  6. Inicie un nuevo trazo haciendo clic en un extremo de la neurita justo contra el cuerpo DRG.
  7. Haga clic en otro punto a lo largo de la neurita para agregar un trazo hasta que la neurita se trace de extremo a extremo. Haga clic en Finalizar ruta después de trazar la neurita.
  8. Convierta la longitud trazada a unidades reales y guarde los resultados copiándolos y pegándolos en Excel.
  9. Utilice la herramienta de línea recta en FIJI para dibujar una línea de la misma longitud que la barra de escala (sin soltar el final de la línea) y observe el valor de longitud visible debajo de la barra de herramientas. El valor de longitud se utiliza para la conversión.
  10. Mida la longitud de seis neuritas largas que se extienden desde ambos lados del DRG (Figura 3C, D) y calcule la longitud promedio de estas neuritas para obtener una longitud promedio representativa del DRG, como se muestra en la Figura 4.
    NOTA: La inmunotinción se ha probado en explantes de DRG en geles simples para mostrar la presencia de células de soporte no neuronales7. Los GRD se fijan en paraformaldehído (PFA) al 4% a temperatura ambiente, se lavan tres veces con 1x PBS durante 15 min y se almacenan en 1x PBS a 4 °C hasta la inmunotinción.
  11. En el caso de explantes en dispositivos MC, retire el dispositivo MC y siga el mismo proceso descrito anteriormente7.

Resultados

El presente protocolo describe una técnica para cosechar y cultivar DRG de ratas Sprague Dawley adultas en un dispositivo multicompartimento (MC). Como se muestra en la Figura 1, el DRG cosechado de ratas adultas se recortó y se cortó en ~0,5 mm. A continuación, los DRG recortados y cortados se incrustaron en un hidrogel en la región del soma del dispositivo MC (Figura 2) y se cultivaron durante 27 días antes de la cuantificación de la neurita. El DRG se cultivó en gel simple para que sirviera como control. La concentración de la formulación de hidrogel utilizada para este experimento fue de 4,5/1,25 mg/mL de colágeno: MAHA. En los días 27 y 21 para los geles multicompartimentales y simples, respectivamente, hubo un crecimiento robusto de neuritas (Figura 3). La longitud promedio de las neuritas en MC (894,22 μm ± 308,75 μm) fue comparable a la longitud de las neuritas en geles simples control (864,26 μm ± 362,84 μm) (Figura 4). Esto demuestra la capacidad del dispositivo MC para apoyar el cultivo de DRG y el crecimiento de neuritas. Las longitudes de las neuritas se cuantificaron utilizando el software ImageJ.

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Figura 1: Diagrama esquemático que muestra el procedimiento experimental. (A) Ganglios de raíz dorsal (DRG) cosechados de ratas Sprague Dawley adultas. (B) Recorte y corte de DRG cosechado. (C) Formulación de hidrogel, inclusión de DRG y cultivo en hidrogel dentro de MC ajustado en una placa de 48 pocillos. (D) Crecimiento de neuritas DRG después de 21-30 días de cultivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Multicompartimento impreso con tres compartimentos aislados y se puede utilizar en una placa de 48 pocillos. (A) Una imagen representativa que muestra la vista superior del dispositivo MC impreso muestra los compartimentos DRG y neurita (líneas rojas) y el área de incrustación DRG (verde). (B) Vista lateral de MC. (C) Una imagen de MC encajada en una placa de 48 pocillos. Barra de escala = 10 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Crecimiento de neuritas en un dispositivo multicompartimiento (MC) y geles simples de control. (A) Una imagen representativa que muestra el crecimiento de neuritas trazado en un dispositivo multicompartimento (MC) en campo claro. (Abajo) Las neuritas que crecieron a través de los túneles de MC se indican con flechas. (B) Imagen del crecimiento de neuritas en geles simples de control (sin MC). (C) Una imagen representativa que muestra el trazado de neuritas de doce neuritas largas en geles lisos de control (líneas moradas). Se cuantificaron seis neuritas largas a ambos lados del DRG para obtener la longitud media de las neuritas. Las imágenes se capturaron con un generador de imágenes de placas fluorescentes con un aumento de 4x, y las neuritas se cuantificaron utilizando FIJI (ImageJ). Barras de escala = 1000 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Longitud de la neurita en multicompartimento (MC) comparada con la del gel simple (PG). Diagrama de dispersión que muestra las longitudes individuales de las neuritas con medias y desviaciones estándar representadas por barras de error. La longitud media de las neuritas en la MC fue de 1204,40 μm ± 690,43 μm (media ± DE) en comparación con 864,26 μm ± 362,84 μm (media ± DE) en el gel normal, lo que indica el crecimiento de las neuritas de apoyo a la MC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Fichero de codificación suplementario 1: Fichero STL de un dispositivo multicompartimento (MC) generado mediante software de diseño asistido por ordenador. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este protocolo describe un método para cosechar DRG adultos de Sprague Dawley y cultivarlos en hidrogeles naturales 3D. A diferencia de este método, otros enfoques para recolectar GRD de ratones y ratas implican el aislamiento de la columna vertebral. La columna vertebral extirpada se divide a la mitad y se extirpa la médula espinal para exponer los GRD 23,24,25. El daño a la médula espinal limita el suministro de sangre, lo que afecta a los GRD y a las neuronas internas26. Esto reduce la actividad de los GRD, lo que hace que los abordajes quirúrgicos sean más adecuados. Además, se ha esbozado un método para imprimir en 3D un dispositivo MC robusto que permita un cultivo fisiológicamente relevante de los GRD.

Este protocolo describe un método para cultivar DRG in vitro, haciendo hincapié en el estudio de la sensibilización periférica de las neuronas en un modelo anatómica y fisiológicamente relevante. Este método de cultivo puede establecer una separación física de las neuritas distales y el cuerpo de la célula DRG en un entorno 3D. El dispositivo MC imita el entorno in vivo , ya que los explantes de DRG con células se conservan y pueden cultivarse conjuntamente con células gliales nativas. El explante DRG contiene células neuronales no nativas, que podrían cultivarse conjuntamente con otras células para imitar las condiciones fisiológicas. Esta relevancia fisiológica promueve estudios sobre cómo las células no neuronales regulan la actividad de las neuritas y ayuda a comprender los mecanismos básicos involucrados en la nocicepción. La incorporación de estas interacciones no neuronales debería producir predicciones más precisas de los resultados de la señalización celular en comparación con los modelos de cultivo simplificados con DRG disociados. La presencia de dos compartimentos de neuritas maximiza la relevancia fisiológica porque los DRG individuales inervan diferentes tejidos in vivo. Este diseño permite el tratamiento de un compartimento de neurita mientras que el otro sirve como control. Los compartimentos de control y tratamiento conectados a un solo soma podrían usarse para estudiar los efectos entre compartimentos, imitando condiciones in vivo en las que las neuritas se extienden a partir de un solo soma y experimentan diferentes estímulos a medida que inervan diferentes tejidos, lo que proporciona información sobre la diafonía entre las neuritas. Si se produce una diafonía entre neuritas en compartimentos adyacentes, los DRG no tratados pueden servir como un verdadero control.

Este dispositivo podría utilizarse para el aislamiento del tratamiento o para estudiar la interacción entre las neuronas y la GRD en el contexto del dolor. Dado que las neuritas distales pueden tratarse selectivamente por separado del soma DRG y de las neuritas proximales, este sistema podría utilizarse para tratamientos periféricos, como la terapéutica articular dirigida, en la que se trata directamente el extremo terminal de las neuronas sensoriales periféricas.

Una ventaja clave del dispositivo MC son los experimentos de alto rendimiento en varios pocillos de la misma placa, ya que el dispositivo MC está diseñado para caber en una placa de 48 pocillos. Un beneficio adicional de la plataforma in vitro es la capacidad de alterar la rigidez del hidrogel dentro del MC mediante el ajuste de las concentraciones de colágeno y MAHA para imitar las propiedades de varios microambientes tisulares. Una posible limitación de este protocolo es que el aislamiento fluídico entre los compartimentos de neurita y soma DRG no es ideal para cultivos más allá de 72 h sin un cambio de medio. Un estudio previo confirmó que el aislamiento fluídico se mantiene en los compartimentos hasta 72 h sin cambios de medio11. Estudios anteriores han demostrado que el aumento de la concentración de ácido hialurónico mejora significativamente la densidad de reticulación del colágeno, restringiendo así la difusividad de las macromoléculas a través de la matriz de hidrogel27. Por lo tanto, para mejorar el aislamiento fluídico en cultivos pasados las 72 h, se puede aumentar la concentración de MAHA, como se demostró en un estudio de Caparaso et al.7, donde un aumento de MAHA resultó en un mejor aislamiento fluídico. La inclusión de control se realiza para garantizar un crecimiento comparable de neuritas DRG en MC y gel natural. Esto es para garantizar que MC no tenga impacto en el crecimiento de DRG. No se recomienda repetir la incorporación de controles con cada experimento una vez que se valida el crecimiento de DRG en MC.

Los autores reconocen que los DRG humanos son más grandes, contienen más células y tienen proporciones variables de subtipo de neurona en comparación con los DRG de rata28. El uso de GRD en roedores es una limitación de este estudio en términos de traslación a la clínica; Sin embargo, este sistema podría ser valioso como plataforma de cribado para identificar compuestos que afectan a la excitabilidad neuronal. Aunque existen diferencias en la composición entre los GRD de roedores y humanos, también existe una gran superposición dentro del proteoma entre los GRD de ratas y humanos29. Esta superposición en el proteoma, y la presencia de los mismos subtipos neuronales, sugiere que el DRG de rata se puede usar para evaluar terapias a un alto nivel, y se pueden realizar pruebas adicionales para determinar si los cambios en el DRG de rata se traducen mecánicamente al DRG humano.

Esta plataforma permite la estimulación farmacológica dirigida y el estudio de neuronas o cuerpos celulares con control temporal. Los cambios en la excitabilidad neuronal y la transmisión de señales pueden medirse fácilmente mediante la manipulación de neuritas o el DRG. Se ha demostrado la capacidad de evaluar la excitabilidad neuronal mediante imágenes de calcio en hidrogeles de control simple con DRG explantes7. Se pueden emplear métodos similares en el dispositivo MC para evaluar la excitabilidad neuronal.

Este método se puede utilizar para estudiar diversas condiciones de dolor en las que la estimulación de las neuronas sensoriales primarias periféricas es un factor determinante, como el dolor lumbar asociado al disco. El cribado de la hipersensibilidad de los nociceptores puede ser una herramienta prometedora para descubrir nuevos fármacos que reduzcan la hiperexcitabilidad. La reducción de la hiperexcitabilidad tiene el potencial de traducirse clínicamente en una reducción del dolor. Esta plataforma puede cribar fármacos de alto rendimiento para identificar los candidatos más eficaces para la validación in vivo mediante ensayos de comportamiento similar al dolor.

Divulgaciones

Los autores de este estudio declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de una beca de la NSF (2152065) y un premio NSF CAREER (1846857). Los autores desean agradecer a todos los miembros actuales y pasados del Laboratorio Wachs por contribuir a este protocolo. Los diagramas de la Figura 1 se realizaron en Biorender.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
#5 pinzasFine Science Tools11252-00Para recortar y cortar DRG
10x DMEMMilliporeSigmaD2429
1x PBS (autoclave)Preparado en laboratorio7.3 - 7.5 pH
24 placas de pocillosVWR82050-892Para almacenar temporalmente DRG cosechados y cortados
Jeringa de 3 mL estéril, de un solo usoBD309657
Placas de 48 pocillosGreiner Bio-One677180
60 mm Placa de PetriFisher ScientificFB0875713APara sujetar medios de recorte y corte
Papel de aluminioFisherbrand01-213-104
B27 Plus 50xThermoFisher17504044Para medios DRG
Colágeno tipo IIbidi50205
Curvo taza Friedman Pearson RongeurFine Science Tools16221-14Para disección
Pinzas Dumont #3Fine Science Tools11293-00Para disección
Suero fetal bovino (FBS)ThermoFisher16000044Para medios DRG
Curado en formaAgente de curadoForm Labs
formaLabsPara lavar el exceso de resinas de MC
Esterilizador de perlas de vidrioFisher ScientificNC9531961
Viales de vidrio (8 mL)DWK Life Sciences (Wheaton)224724
GlutaMaxThermoFisher35050-061Para medios DRG
HEPES (1M)Millipore SigmaH0887
Resina V2 de alta temperaturaFormLabsFLHTAM02
Ácido hialurónico Sal sódicaMilliporeSigma53747Se utiliza para fabricar MAHA
IrgacureMilliporeSigma410896
LamininR& D Systems344600501
Tijeras grandes de punta romaMilitexEG5-26Para disección
Pinzas grandes (puntas dentadas)Militex9538797Para disección
Tijeras grandes de punta afiladaFine Science Tools14010-15Para disección
Puntas de pipeta de baja retenciónFisher Scientific02-707-017Para pipetear colágeno y MAHA
Ácido hialurónico metacrilato (MAHA)Preparado en laboratorioN/A85 - 115 % metacrilación
Factor de crecimiento nervioso (NGF)R& D Systems556-NG-100Para medios DRG
Medios Neurobasal AThermoFisher10888022Para medios DRG
ParafilmBemisPM996
ParafilmBemisPM996
Penicilina/Estreptomicina (PS)EMD Millipore 516106Para medios DRG
Tiras reactivas de pHVWR InternationalBDH35309.606
Puntas de pipeta (1000 y micro; L)USA Scientific1111-2021
Preform 3.23.1 softwareFormslabPara cargar un archivo STL
RatCharles River
Impresora 3DFormLabs Form3L Dispositivo MC de impresión 3D
Tijeras pequeñas de punta afiladaFine Science Tools14094-11Para disección
Bicarbonatode sodioMilliporeSigmaS6014
Rongeur de copa rectaFine Science Tools16004-16Para disección
Tijeras de resorte de borde rectoFine Science Tools15024-10Para disección
Cuchilla quirúrgica de la cápsula (n.º 10)Fisher Scientific22-079-690
Filtros de jeringa, PES (0.22 y micro; m)Celltreat229747
Tijeras de resorte diminutasWorld Precision Instruments14003Para recortar y cortar DRG
Lámpara UVAnalytik Jena USPara hidrogel de reticulación fotocruzada (15 - 18 mW/cm2)
Lavado en Form Impresora 3D de resina

Referencias

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