Artículo de método

Transformación mitocondrial en Baker

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DOI:

10.3791/66856

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7 de junio de 2024

 ,  , 
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este trabajo explica cómo transformar las mitocondrias de la levadura utilizando un método biolístico. También mostramos cómo seleccionar y purificar los transformantes y cómo introducir la mutación deseada en la posición objetivo dentro del genoma mitocondrial.

Resumen

La levadura de panadería Saccharomyces cerevisiae se ha utilizado ampliamente para comprender la biología mitocondrial durante décadas. Este modelo ha proporcionado conocimiento sobre las vías mitocondriales esenciales y conservadas entre los eucariotas y las vías específicas de hongos o levaduras. Una de las muchas habilidades de S. cerevisiae es la capacidad de manipular el genoma mitocondrial, que hasta ahora solo es posible en S. cerevisiae y el alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii. La transformación biolística de las mitocondrias de levadura nos permite introducir mutaciones dirigidas al sitio, hacer reordenamientos genéticos e introducir reporteros. Estos enfoques se utilizan principalmente para comprender los mecanismos de dos procesos altamente coordinados en las mitocondrias: la traducción por mitoribosomas y el ensamblaje de complejos respiratorios y ATP sintasa. Sin embargo, la transformación mitocondrial puede utilizarse potencialmente para estudiar otras vías. En el presente trabajo, mostramos cómo transformar las mitocondrias de levadura mediante bombardeo de microproyectiles a alta velocidad, seleccionar y purificar el transformador deseado e introducir la mutación deseada en el genoma mitocondrial.

Introducción

La levadura Saccharomyces cerevisiae es un modelo ampliamente reconocido que se utiliza para estudiar la biogénesis mitocondrial. Dado que la levadura es un organismo anaeróbico y facultativo, es posible estudiar ampliamente las causas y consecuencias de la introducción de mutaciones que perjudican la respiración. Además, este organismo posee herramientas genéticas y bioquímicas amigables para estudiar las vías mitocondriales. Sin embargo, uno de los recursos más poderosos para explorar los mecanismos de ensamblaje del complejo respiratorio y la síntesis de proteínas mitocondriales es la capacidad de transformar las mitocondrias y modificar el genoma del orgánulo. Anteriormente, ha sido útil introducir en el ADN mitocondrial (ADNmt) mutaciones puntuales o pequeñas deleciones/inserciones 1,2,3,4,5, eliminar genes 6,7, hacer reordenamientos genéticos 7,8, agregar epítopos a las proteínas mitocondriales 9,10, reubicar genes del núcleo a las mitocondrias11,12, e introducir genes reporteros como BarStar13, GFP14,15, luciferasa16 y el ARG8m17,18 más utilizado. Las modificaciones del genoma mitocondrial nos han permitido diseccionar e identificar mecanismos que de otro modo habrían sido difíciles de comprender. Por ejemplo, el gen reportero ARG8m insertado en el locus COX1 en el ADN mitocondrial fue crucial para comprender que Mss51 tiene un doble papel en la biogénesis de Cox1. En primer lugar, es un activador traduccional del ARNm de COX1 y, en segundo lugar, es una chaperona de ensamblaje para la proteína Cox1 7,19 recién creada. En este trabajo se presenta un método detallado para transformar las mitocondrias de S. cerevisiae. A pesar de que el protocolo de transformación mitocondrial fue publicado anteriormente 16,20,21,22,23, un abordaje visual a través de un video es esencial para comprender a fondo las diferentes etapas y detalles del método. El método consta de varios pasos y se divide en cuatro etapas generales:

Diagrama del proceso de edición de genes; partículas de tungsteno, recubrimiento de ADN, pasos de integración del genoma mitocondrial.
Figura 1: Descripción general del procedimiento de transformación mitocondrial por bombardeo de microproyectiles a alta velocidad: 1) Las partículas de tungsteno se esterilizan y preparan antes del recubrimiento del ADN. 2) Dos plásmidos diferentes se precipitan en la superficie de los WPs. Uno es un plásmido bacteriano que contiene la construcción que se dirigirá a la matriz mitocondrial. El otro es un vector de expresión de levadura nuclear portador de un marcador de auxotrofia. 3) Una cepa de levadura receptora que carece de ADN mitocondrial (rho0) se cultiva en una fuente de carbono fermentativo como la galactosa o la rafinosa, que no ejerce ninguna represión de la glucosa en la expresión génica mitocondrial34,35. El cultivo se propaga en placas de Petri que contienen el medio de bombardeo. 4) Los WP recubiertos con plásmidos son disparados a la cepa receptora mediante un bombardeo de microproyectiles de alta velocidad. 5) Las colonias de rho- colonies sintéticas positivas que contienen el plásmido mitocondrial se seleccionan mediante el apareamiento con una cepa de prueba. 6) La construcción mitocondrial se integra en el genoma mitocondrial en el locus deseado mediante el acoplamiento de la cepa sintética (donante) con la cepa aceptora mediante un proceso conocido como citoducción. 7) El receptor positivo, cepa haploide portadora de la construcción mitocondrial, se selecciona y purifica en diferentes medios. Abreviaturas: WPs = partículas de tungsteno; ADNmt = ADN mitocondrial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Transformación de células con la construcción de ADN destinada a integrarse en el genoma mitocondrial (Figura 1, pasos 1-4)
Aunque es posible transformar directamente una levadura que contiene un genoma mitocondrial completo (rho+), la transformación es 10-20 veces más eficiente si las células carecen de ADN mitocondrial (rho0)24. Las partículas de tungsteno (WP) están recubiertas con dos plásmidos diferentes que se cotransformarán. El primero es un vector de expresión de μ levadura 2 portador de un marcador de auxotrofia, como LEU2 o URA3 (por ejemplo, YEp351 o YEp352, respectivamente). Si la introducción biológica del ADN en las células de levadura tiene éxito, los transformadores crecerán en el medio auxotrofia (es decir, un medio que carece de leucina o uracilo). Este plásmido es útil para hacer la primera selección de las células que adquirieron el plásmido nuclear; De lo contrario, el número de colonias resultantes saturaría la placa. El segundo plásmido es un plásmido bacteriano (como pBluescript o similar) que contiene la construcción mitocondrial destinada a integrarse en el genoma mitocondrial. El constructo debe contener al menos 100 nt de secuencias mitocondriales flanqueantes de 5' y 3' para su recombinación con la región mitocondrial de interés. En nuestra experiencia, es más probable que las secuencias flanqueantes más grandes se recombinen con éxito con el locus objetivo en el genoma mitocondrial.

Un ejemplo específico se muestra en la Figura 225. En este ejemplo, el objetivo era eliminar la región del gen mitocondrial COX1 que codifica para los últimos 15 aminoácidos de la proteína correspondiente (Cox1ΔC15) (Figura 2A). El plásmido bacteriano portador de la mutación COX1ΔC15 contenía 395 nt y 990 nt de las regiones no traducidas 5' y 3' del gen, respectivamente. El plásmido se derivó de pBluescript (pXPM61) y, junto con el plásmido 2 μ YEp352, se coprecipitaron en la superficie de los WP (Figura 2B). A continuación, los WP se introdujeron mediante bombardeo de microproyectiles en la cepa receptora seleccionada (Figura 2C). Esta cepa, denominada NAB6926, es una cepa MATa, rho0 que contiene los alelos kar1-1 y ade2 (la importancia de estas características se discute a continuación). Las células se sembraron en medios de bombardeo carentes de uracilo para seleccionar aquellas que adquirieron el plásmido 2 μ (Figura 2C). Las células se cultivaron durante 5-7 noches a 30 °C.

Selección de las células que adquirieron el plásmido bacteriano que contiene la construcción mitocondrial y el plásmido nuclear 2 μ portador del marcador de auxotrofia (Figura 1, paso 5)
Las colonias positivas mantendrán muchas copias del plásmido bacteriano en sus mitocondrias22. Dado que las células transformadas son originalmente rho0, no hay secuencias mitocondriales que apoyen la traducción de la construcción mitocondrial presente en el plásmido; por lo tanto, el gen mitocondrial transformado no se expresará. Es necesario acoplar los transformantes con una cepa probadora para detectar las colonias de levadura que adquirieron el plásmido mitocondrial. El genoma mitocondrial de la cepa de prueba contiene una versión mutada no funcional del gen de interés. Después del apareamiento, las mitocondrias se fusionarán y la secuencia mitocondrial incluida en el plásmido transformado se recombinará con el gen mitocondrial mutado de la cepa del probador; en consecuencia, la recuperación del gen WT reconstituirá la función. El diploide resultante tendrá un fenotipo positivo detectable (generalmente la capacidad de crecer en un medio respiratorio o en un medio que carezca de arginina). Las células positivas que transportan el plásmido bacteriano en las mitocondrias se denominan "células rho sintéticas". En el ejemplo específico de la Figura 2D, las células rho- sintéticas que llevaban la construcción COX1ΔC15 (llamada XPM199) se replicaron en un medio que carecía de uracilo (esta es la placa maestra a partir de la cual se purificaron las colonias positivas). También se replicaron en un césped de la cepa L4527 de la cepa de prueba, que contiene la mutación no funcional cox1D369N. Después de aparearse durante dos noches, el genoma mitocondrial de L45 y XPM199 se recombinó, lo que resultó en un gen COX1 funcional; Por lo tanto, los diploides recuperaron la capacidad de crecer en medios respiratorios. De la placa maestra, elegimos las colonias positivas. Se rayaron en placas que carecían de uracilo y se repitieron las pruebas selectivas para obtener células ro - das sintéticas puras (Figura 2E). Es importante tener en cuenta que la placa de prueba es solo para la identificación de colonias de rho sintéticas, y los mutantes no se pueden recuperar de estas placas.

Integración del constructo en el genoma mitocondrial de la cepa prevista
Este paso se logra mediante un proceso llamado citoducción28,29 (Figura 1, paso 6). En este enfoque, la cepa ro- sintética (cepa donante) se acopla a la cepa aceptora prevista del tipo de apareamiento opuesto. Un requisito esencial es que al menos una de las dos cepas de apareamiento sea portadora de la mutación kar1-1 para impedir la fusión nuclear30. Por lo tanto, el apareamiento de las dos células produce un cigoto binucleado (Figura 3). La red mitocondrial de las células parentales (donante y aceptor) se fusiona y las moléculas de ADN mitocondrial se recombinan. Los cigotos binucleados se incuban/recuperan para permitir la gemación, que producirá células haploides. Estos haploides llevan el fondo nuclear de una de las células parentales. De manera similar, los haploides pueden transportar el ADN mitocondrial de la célula parental o del ADN mitocondrial recombinado de interés. Sin embargo, la mutación kar1-1 no es 100% efectiva, y algunos diploides verdaderos se formarán durante el apareamiento 28,29. La cepa sintética (donante, XPM199) portaba el alelo kar1-1 en el ejemplo. Como marcador selectivo, presentaba el alelo ade2, lo que lo convierte en un auxótrofo de la adenina (Figura 4). La cepa aceptora fue XPM10, una cepa rho+ portadora de la construcción cox1Δ::ARG8m, donde el reporte ARG8m reemplazó a los codones COX1 en el genoma mitocondrial7. La mezcla de ambos cultivos celulares se añadió a una placa YPD como gota para permitir el apareamiento. Después de 3-5 h, las células se observaron bajo un microscopio óptico para detectar la formación de shmoos (Figura 3B), una forma celular asociada con el apareamiento. Después del tiempo de incubación/recuperación, los cigotos binucleares se sembraron en un medio que carecía de adenina para evitar el crecimiento de las células donantes.

Selección de la cepa haploide portadora del genoma mitocondrial de interés (Figura 1, paso 7)
Después de la citoducción hay una mezcla de células donantes, aceptoras y diploides. Por lo tanto, después de la incubación/recuperación de los cigotos binucleados, las células deben cultivarse en diferentes medios selectivos para identificar y purificar los haploides de interés. Los medios selectivos dependen de los genotipos del donante, las cepas aceptoras y la construcción mitocondrial prevista. Sin embargo, en general, el razonamiento para elegir el medio selectivo es: i) después de la incubación/recuperación, la mezcla de citoducción se cultiva en un medio selectivo donde la cepa parental donante no puede crecer. En el ejemplo específico de la Figura 4A,B, el donante (cepa sintética) es portador del alelo ade2 no funcional. Por lo tanto, la mezcla de citoducción debe incubarse en una placa mediana que carezca de adenina. Esta es la placa maestra. ii) Una vez que las colonias crecen, la placa maestra se replica nuevamente en un medio que carece de adenina (para generar una nueva placa maestra a partir de donde se purificarán las colonias positivas de interés), y a continuación, en un medio donde solo pueden crecer diploides. Esto es necesario para evitar una mayor purificación inadvertida de las colonias diploides. En el caso del ejemplo de la Figura 4C, solo los diploides pueden crecer en medios que carecen de leucina. iii) La placa maestra también se replica en medios donde solo crecerán aquellos haploides aceptores que incorporaron el ADN mitocondrial de interés. En el ejemplo de la Figura 4C, los haploides crecen en medios respiratorios que contienen etanol/glicerol como fuente de carbono, ya que la proteína Cox1ΔC15 es funcional. La cepa rho+ resultante que contiene el ADNmt de interés se denominó XPM20925. Las cepas utilizadas en la Figura 2 y la Figura 4 se enumeran en la Tabla 1.

Proceso de edición de genes de levadura, diagrama con ADNmt y COX1ΔC15, plásmido URA3, cepa sintética rho⁻.
Figura 2: Diagrama que describe un ejemplo específico de transformación mitocondrial y selección de células rho positivas. (A) La modificación prevista del genoma mitocondrial fue una deleción de la región que codifica los últimos 15 aminoácidos de la subunidad Cox1 (Cox1ΔC15). (B) Los WP se recubrieron con dos plásmidos para transformar las células de levadura. Uno de ellos fue el plásmido de 2 μ Yep352 que se dirigió y expresó en el núcleo. El otro fue el plásmido pXPM61, que contiene el alelo COX1ΔC15 más 395 nt y 990 nt de las COX1 5' y 3'-UTRs, respectivamente. (C) Los WP se introdujeron en células de la cepa NAB69, que carece de ADN mitocondrial (cepa rho0). Las colonias transformantes obtenidas de las placas de bombardeo se replicaron en un medio que carecía de uracilo, el marcador auxotrófico del plásmido nuclear YEp352. (D) Para seleccionar las colonias de rho positivas, se replicó la placa -URA en un medio que carecía de uracilo. Esta era la placa maestra de la que se recogían y aislaban las colonias positivas. También se replicó en placas con medios enriquecidos (YPD) y un césped de una cepa de prueba. Durante el apareamiento, el ADN romomitocondrial sintético se recombinó con el ADN mitocondrial de la cepa de prueba, L4527, que porta una mutación en el gen COX1 (D369N). Los diploides que crecían en los medios respiratorios contenían el ADN transformado. Las colonias correspondientes se recogían de la placa maestra para refrescarlas y purificarlas. Para ayudar a identificar las colonias positivas en la placa maestra a lo largo de todas las réplicas de placas, se hicieron marcas con un marcador permanente en los bordes de las placas (líneas verdes). (E) Las colonias positivas seleccionadas se volvieron a rayar en un medio que carecía de uracilo. Esta era la nueva placa maestra. Al igual que en D, se llevaron a cabo dos rondas más de pruebas para purificar las colonias de rho sintéticas. Abreviaturas: WPs = partículas de tungsteno; ADNmt = ADN mitocondrial; -URA/Sorb = sin uracilo/ que contiene Sorbitol; WT = tipo salvaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Proceso de fusión de células de levadura; diagrama e imagen de microscopio; transferencia rho+; etapas de apareamiento; biología celular.
Figura 3: Diagrama que describe el procedimiento de citoducción. (A) Descripción general de cómo se aparean las células durante la citoducción. Durante la citoducción, las mitocondrias de las cepas donante y aceptora se fusionan para que el ADN mitocondrial de ambas cepas se recombine. Dado que la fusión nuclear se reduce debido a la mutación kar1-1 30, se forman cigotos binucleares. Después de un tiempo de incubación/recuperación, se seleccionan los cigotos binucleares y los aceptores haploides que contienen la mutación mitocondrial prevista. (B) El apareamiento de la cepa sintética (donante) y la cepa aceptora a través de la citoducción permite la formación de shmoos (flechas rojas), una forma característica de la levadura de apareamiento. La imagen fue tomada bajo un microscopio óptico con un objetivo de 100x. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagrama de cruce genético de levadura que muestra el donante XPM199 y el aceptor XPM10, destacando el recubrimiento maestro ADE y el proceso de crecimiento recombinante para la integración del ADN.
Figura 4: Diagrama que describe un ejemplo específico de citoducción para integrar la mutación COX1ΔC15 en el genoma mitocondrial. (A) Se mezclaron cultivos líquidos de la cepa sintética rho- (donante, XPM199) y la cepa de interés (aceptor, XPM10) para aparearse. Después de la formación de shmoo, la mezcla se recuperó en un cultivo líquido durante 2-4 h. A continuación, la mezcla de citoducción se extendió en una placa con un medio que carecía de adenina para evitar el crecimiento de las células donantes. (B) Representación esquemática de los eventos de recombinación del ADN mitocondrial del donante (XPM199) y del aceptor (XPM10) durante la citoducción. (C) La placa maestra se replicó en diferentes medios selectivos para identificar y purificar aquellos haploides que integraban el gen mitocondrial previsto en el ADN del orgánulo (XPM209)25. Abreviaturas: -ADE = falta adenina; -LEU = falta de leucina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

NOTA: Recomendamos realizar seis transformaciones para cada constructo, ya que la eficiencia de la transformación mitocondrial suele ser baja. La composición de los diferentes medios de crecimiento se muestra en la Tabla 2.

1. Preparación de partículas de tungsteno

  1. Pesar 30 mg de partículas de tungsteno de 0,7 μm (WP, microportadores) en un microtubo. Añadir 1,5 mL de etanol al 70% (EtOH) para esterilizar. Agita los WP y déjalos reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
  2. Centrifugar a 13.200 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Lave los WP añadiendo 1,5 mL de agua estéril a las partículas, vórticándolas y centrifugando a 13.200 × g durante 15 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante.
  3. Añadir 500 μL de glicerol estéril al 50% (la concentración final es de 60 μg de WPs/μL).
    NOTA: Los WP pueden almacenarse a -20 °C durante al menos 6 meses. De este caldo, se toma la cantidad necesaria para seis transformaciones (100 μL).

2. Recubrimiento de ADN WP

  1. Añadir 5 μg del plásmido de 2 μ y 15 μg del plásmido bacteriano que contiene la secuencia mitocondrial a un microtubo en hielo.
    NOTA: El volumen final no debe exceder los 50 μL para evitar diluir aún más los reactivos necesarios para el recubrimiento del ADN.
  2. Añadir 100 μL de la suspensión WP y el vórtice durante 5 s (6 mg de WPs).
  3. Añadir 4 μL de espermidina 1 M. Breve vórtice.
  4. Añadir 100 μL de CaCl2 2,5 M helado, brevemente en vórtice. Incubar en hielo durante 10 min; Agita brevemente la mezcla cada 3 min.
    NOTA: La solución de CaCl2 está esterilizada por filtro y no debe esterilizarse en autoclave.
  5. Centrifugar los WP durante 30 s a 13.200 × g a 4 °C y desechar el sobrenadante. Lave las partículas resuspendiéndolas suavemente en 200 μL de EtOH al 100% a -20 °C.
  6. Centrifugar los WP durante 30 s a 13.200 × g a 4 °C y desechar el sobrenadante. Repite el lavado.
  7. Vuelva a suspender los WP en 60-70 μL de EtOH 100% a temperatura ambiente con una punta de pipeta; No haga vórtice.
    NOTA: Para garantizar la calidad de los plásmidos, el recubrimiento de ADN debe realizarse el mismo día que la transformación biológica.

3. Preparación de materiales biológicos

  1. Antes del bombardeo, esterilice seis soportes de macroportadores (Figura 5) en un autoclave y séquelos completamente. Alternativamente, sumérjalos en EtOH y esterilícelos con una llama con la ayuda de pinzas. Colócalos en un plato de vidrio estéril.
  2. Durante la precipitación del ADN (10 minutos de incubación en hielo en el paso 2.4), inserte seis macroportadores (o discos voladores) en cada uno de los seis soportes de macroportadores con la ayuda de pinzas estériles.
    NOTA: No esterilice los macroportadores.
  3. Mezcle los WP recubiertos de ADN con la pipeta. Añadir 10 μL de los WP a cada superficie del macroportador y distribuir por toda la superficie con la punta de la pipeta. Si es necesario, agregue algunos microlitros adicionales de 100% EtOH a la superficie del macroportador para hacer una distribución uniforme de los WP. Deje que la suspensión se seque a temperatura ambiente durante ~ 20 min.

4. Preparación de células de levadura y placas de bombardeo

  1. Inocular la cepa del receptor rho0 en 2 mL de medio YPR (Tabla 2). Cultivar durante una noche a 30 °C en una rueda giratoria.
  2. Diluir 300 μL del cultivo en 30 mL de medio YPR fresco. Cultivar a 30 °C y 200 rpm en un agitador rotativo durante dos noches hasta que el cultivo esté saturado.
  3. Centrifugar las células de levadura a 600 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células de levadura en 600 μL de medio YPD (Tabla 2).
  4. Con un mango de vidrio estéril, extienda 100 μL de la suspensión de células de levadura en una placa sólida de medio de bombardeo.
    NOTA: El medio de bombardeo debe carecer del marcador de selección del plásmido de 2 μ que se utilizará para la transformación.
  5. Repita el paso 4.4 para los otros cinco platos.
  6. Incube durante 1-3 h a temperatura ambiente antes del bombardeo para asegurarse de que el medio líquido se absorba completamente en la superficie de la placa.

5. Generación de una cepa sintética por transformación biológica

NOTA: Antes de comenzar, asegúrese de leer el manual del usuario del equipo biológico. Describiremos el protocolo de los equipos referenciados (Tabla de Materiales y Figura 5).

  1. Limpie la cámara del sistema de suministro de partículas biológicas con etanol al 70% para evitar la contaminación y déjela reposar durante al menos 10 minutos. Justo antes del bombardeo, limpie la superficie con una toalla de papel limpia.
  2. Abra las válvulas del tanque de helio para ajustar alrededor de 2,000 psi.
  3. Encienda el equipo y encienda la fuente de vacío.
  4. Con pinzas, coloque el macroportador boca abajo en el soporte del macroportador.
    NOTA: No utilice la pantalla de parada que viene con el equipo.
  5. Enrosque la tapa del macroportador en la parte superior del macroportador. Todas las partes juntas constituyen el sistema de lanzamiento de microportadores (Figura 5).
  6. Coloque el sistema de lanzamiento de microportadores dentro de la cámara de vacío en el quinto nivel desde la parte inferior.
  7. Coloque una de las placas que contienen el césped de cepa rho0 en el segundo nivel desde el fondo de la cámara. Asegúrese de que el plato esté hacia arriba y sin la tapa.
  8. Con pinzas estériles, coloque un disco de ruptura en la tapa de retención. Enrosque la tapa de retención en el tubo de aceleración; Asegúrese de que la tapa de retención esté ajustada.
    NOTA: No tratar los discos rotos con isopropanol como se sugiere en el manual ya que hemos observado que la eficiencia de transformación disminuye.
  9. Cierre la puerta de la cámara de vacío.
  10. Coloque el interruptor VAC/VENT/HOLD en la posición VAC . Cuando se alcance un vacío de 25-28 inHg , cambie el interruptor VAC/VENT/HOLD a la posición HOLD .
    NOTA: Tenga en cuenta que el vacío alcanzable puede variar según el nivel del mar. Encontramos éxito alcanzando 25 inHg.
  11. Presione el interruptor FIRE para disparar los WP. Espere a que la presión se acumule en el tubo de aceleración hasta que alcance los 1,300 psi, momento en que el disco de ruptura se romperá, haciendo un sonido de estallido.
  12. Inmediatamente después de que se rompe el disco de ruptura, el interruptor FIRE y el vacío se liberan cambiando el interruptor VAC/VENT/HOLD a la posición VENT .
  13. Con cuidado, con pinzas estériles, retire cualquier residuo del disco de ruptura presente en la superficie de la placa y cubra la placa con su tapa.
  14. Repita el procedimiento para las cinco placas restantes, colocando un nuevo disco de ruptura y un macroportador en cada ronda.
  15. Al final, cierre la válvula principal del tanque de helio.
  16. Cierre la cámara y construya un vacío llevando el interruptor VAC/VENT/HOLD a la posición VAC . Libere el sistema de cualquier presión de helio presionando y soltando el interruptor FIRE varias veces. Repita con la puerta abierta.
  17. Apague la bomba de vacío y el equipo de bombardeo.
  18. Limpie el sistema de suministro con 70% de EtOH. Lave los soportes del macroportador con una solución SDS al 0,1%; enjuague con agua destilada estéril y 100% EtOH.

6. Selección de colonias de rho sintéticas

  1. Incubar las placas de bombardeo durante 5-7 noches a 30 °C.
    NOTA: Es importante revisar las placas diariamente para ver si están contaminadas. Si es necesario, la región contaminada se puede cortar con una espátula estéril para evitar una mayor contaminación.
  2. Inocular la cepa de prueba del tipo de apareamiento opuesto en 2 mL de medio YPD durante la noche (vea el ejemplo específico en la Figura 2D, E).
  3. Inocular 150 μL del cultivo de cepa del probador en una placa YPD. Con un mango de vidrio estéril, extienda el probador de manera uniforme sobre la superficie de la placa. Deje que el plato se seque durante al menos 5 minutos.
  4. Haz réplicas de las placas de bombardeo usando almohadillas de terciopelo y un sello de réplica.
    1. Se replica en una placa de medio de abandono correspondiente al marcador de auxotrofia plasmídica 2 μ transformado. El crecimiento requiere una incubación nocturna a 30 °C. Después, conservar a 4 °C hasta su nuevo uso. Esta placa es la placa maestra.
    2. Replique en la placa YPD que contiene el césped del probador del paso 6.3. Incubar a 30 °C durante dos noches. Posteriormente, replicar esta placa en el medio selectivo para detectar la presencia del gen mitocondrial de interés, por ejemplo, un medio respiratorio o un medio que carezca de arginina, e incubar durante la noche a 30 °C. Solo las células que albergaban el plásmido bacteriano sintético en las mitocondrias crecerán en el medio selectivo después de aparearse con la cepa de prueba.
  5. Identifique en la placa maestra (paso 6.4.1) las colonias correspondientes que crecieron en el paso 6.4.2.
    NOTA: Dado que la placa de bombardeo (y, por lo tanto, la placa maestra) está llena de colonias transformantes, puede ser difícil identificar las colonias positivas observadas en la placa de acoplamiento del probador. Por esta razón, es muy recomendable dibujar un par de líneas pequeñas a cada lado de todas las placas con un rotulador permanente. Dibuja líneas similares en el anillo de la estampilla replicante. Estas líneas serán útiles para orientar y ubicar colonias positivas en la placa maestra (vea el ejemplo en la Figura 2D).
  6. Purifique las colonias positivas pasándolas de la placa maestra a una segunda placa de abandono selectivo, como en el paso 6.4.1. Incubar durante dos noches a 30 °C.
    NOTA: Es esencial que el rayado permita el crecimiento de colonias individuales para asegurar una cepa pura.
  7. Repita el proceso de selección (pasos 6.2-6.5) para confirmar la presencia del plásmido bacteriano en las mitocondrias.
    NOTA: Por lo general, este proceso se puede repetir dos veces más para seleccionar cepas sintéticas estables.
  8. Una vez que la cepa sintética mantiene de manera estable el ADN plasmídico en las mitocondrias, seleccione de 3 a 5 colonias positivas diferentes e inocule en 2 mL de YPD. Utilice este cultivo para preparar un stock criovial (mezclando 600 μL de cultivo y 600 μL de glicerol al 50% para conservar a -70 °C) e inserte la secuencia de plásmido en el ADNmt de interés por citoducción (paso 6.7).
    NOTA: Dado que no hay presión selectiva para mantener el plásmido transformado en las mitocondrias a partir de la cepa sintética, el plásmido puede perderse fácilmente. Por lo tanto, recomendamos realizar la citoducción lo antes posible.

7. Integración de la construcción presente en la cepa sintética en el sitio objetivo en el genoma mitocondrial por citoducción

  1. Inocular dos tubos con 3 mL de medio YPD, uno con las células donantes (rho-cells sintéticos) y otro con las células aceptoras (celda de levadura donde se espera la construcción final). Incubar durante la noche a 30 °C.
  2. Mezclar 750 μL de la cepa donante y 250 μL de la cepa receptora en un microtubo estéril (proporción 3:1).
  3. Centrifugar la mezcla durante 1 min a 13.200 × g; Deseche el sobrenadante. Con una punta de pipeta de 1 ml con el extremo cortado, tome una gota del pellet de celda y colóquela en una placa YPD. Incubar a 30 °C durante 2-4 h.
    NOTA: Para evitar la contaminación cruzada, no coloque más de dos suspensiones celulares en una sola placa (vea el ejemplo en la Figura 4A).
  4. Tome una pequeña cantidad de la mezcla de células, vuelva a suspenderla en 15 μL de agua estéril en un portaobjetos y coloque un cubreobjetos. Compruebe bajo un microscopio óptico la presencia de shmoos con un objetivo de 40x o 100x; esta forma característica aparece cuando hay dos tipos de apareamiento presentes (Figura 3B).
  5. Si hay shmoos, vuelva a suspender una pequeña cantidad (~0,5 mm3) de la masa celular en 2 ml de medio YPD. Incubar durante 2 h a 30 °C en una rueda giratoria para permitir que los cigotos binucleares se recuperen.
  6. Agitar la mezcla y diluir 10 μL de la suspensión celular en 990 μL de agua estéril (dilución 1:100). Utilice perlas de vidrio o un mango de vidrio estéril para esparcir 100 μL de la dilución celular en un medio de caída donde solo crece la cepa aceptora (y los diploides esporádicos). Incubar durante 2-3 noches a 30 °C.
  7. Replicar las colonias resultantes en los medios selectivos necesarios como se explica en la introducción (etapa 4; ver Figura 4C para un ejemplo específico).
  8. Después de la identificación de las colonias positivas, vuelva a colocarlas en el mismo medio selectivo para purificar la cepa haploide que lleva el ADNmt de interés.
  9. Seleccione al menos dos colonias positivas y cultívelas en 2 mL de medio YPD a 30 °C durante la noche. Haga una copia de seguridad criogénica mezclando 600 μL de glicerol al 50% con 600 μL del cultivo saturado de YPD. Conservar a -70 °C.
  10. Aislar el ADN de las cepas resultantes 31,32. Amplificar la región deseada por PCR y secuenciar para confirmar la presencia de la mutación mitocondrial.
    NOTA: Cada colonia positiva es una réplica técnica que debe ser confirmada de forma independiente para asegurar la secuencia correcta en el genoma mitocondrial.

Resultados

En esta sección se presentan algunos resultados representativos de las diferentes etapas de la transformación mitocondrial. La figura 6 muestra un procedimiento de bombardeo. Las células rho- sintéticas portaban un plásmido bacteriano con el gen reportero ARG8m, que reemplazará la secuencia codificante de un gen mitocondrial (Figura 6A). Después del bombardeo, la placa se replicó en un medio que carecía de uracilo (-URA); esta es la placa maestra (Figura 6B). Las colonias en crecimiento tienen el vector de expresión de levadura con el marcador de auxotrofia URA3 . De acuerdo con la sección 6 del protocolo, la placa de bombardeo también se replicó en un medio YPD que contenía un césped de la cepa de prueba. En este caso, la cepa evaluadora albergaba un alelo defectuoso del gen ARG8m en el genoma mitocondrial (ARG8m-1)1. Después de 2 noches de incubación, el césped del probador y las células transformantes se aparearon, y las mitocondrias se fusionaron. Esta placa se replicó en un medio que carecía de arginina. Solo los diploides que contenían el plásmido mitocondrial pudieron crecer en este medio selectivo porque el gen ARG8m presente en la cepa rho- sintética reemplazó al ARG8m-1 defectuoso del genoma mitocondrial de la cepa de prueba.

El número de colonias positivas generalmente varía de cero a 20 por placa. En el presente ejemplo, se obtuvieron cuatro colonias de rho- colonies sintéticas positivas, las cuales fueron purificadas mediante rayado en medio carente de uracilo. En la primera ronda de purificación, se obtuvieron muchas colonias negativas junto con las positivas. Sin embargo, después de dos o tres rondas de purificación, es posible obtener la cepa sintética positiva pura. En la Figura 6C, mostramos un par de colonias de rho- positivas sintéticas después de tres rondas de purificación y pruebas. La mayoría de las colonias de la placa maestra -URA son positivas para la sonda del probador. Curiosamente, no todas las células de una colonia positiva contienen el plásmido mitocondrial, lo que indica que el plásmido transformado se perdió en una población de la colonia. Este resultado es esperado ya que no hay presión selectiva para mantener el plásmido mitocondrial, lo que lo hace inestable. Sin embargo, una cepa rotulina sintética como las que se muestran en la Figura 6C puede llevarse al siguiente paso, la citoducción (sección 7 del protocolo), y utilizarse para preparar el material que se almacenará a -70 °C. La Figura 6D también muestra la tercera ronda de purificación de una cepa sintética. Sin embargo, en este caso, como los transformantes eran prácticamente incapaces de mantener el plásmido mitocondrial, se descartaron.

Describimos una estrategia general para seleccionar colonias de rho- colonies sintéticas positivas, que se presenta en la Figura 7A. En este caso, la construcción mitocondrial presente en las células rho- sintéticas tiene varios cientos de nucleótidos para recombinarse con el ADN mitocondrial de la cepa del evaluador (por ejemplo, la construcción COX1ΔC15 en la cepa rho- sintética se recombina con el gen mutado cox1D369N en el ADN mitocondrial del probador (Figura 2D); o la construcción cox1Δ::ARG8m en la cepa rho- sintética con el gen mutado ARG8m-1 en el ADN mitocondrial del evaluador (Figura 6A). Sin embargo, si no se dispone de una cepa de prueba para seleccionar las rho- células sintéticas positivas de interés, existe un enfoque indirecto para seleccionarlas33. En este caso, el plásmido bacteriano también debe contener un fragmento de un gen mitocondrial, como COX2 o COX3. La cepa del evaluador contiene una copia no funcional del gen mitocondrial cox2 o cox3 . En el ejemplo dado, la secuencia del fragmento cox3 presente en el plásmido bacteriano puede complementar la secuencia cox3 presente en las mitocondrias del probador y, después de la recombinación, proporcionar un gen COX3 funcional. Después de cruzar las células rho sintéticas con la cepa de prueba, los diploides pueden respirar solo si las células rho sintéticas contienen el plásmido bacteriano dentro de las mitocondrias (Figura 7B).

La figura 8 ejemplifica el proceso de citoducción. Las cepas donante y aceptora tienen auxotrofia de leucina y adenina, respectivamente. Por lo tanto, después de la citoducción, la mezcla se colocó en un medio que carecía de leucina, lo que impidió el crecimiento de las células del donante. Esta es la placa maestra. En este punto, solo crecerán haploides con el fondo nuclear de la cepa aceptora y diploides esporádicos. Para descartar los diploides, la placa maestra se replicó en medios que carecían de adenina, donde solo los diploides pueden crecer. En este ejemplo, el ADN mitocondrial resultante después de la citoducción está mutado y los haploides previstos no pueden crecer en el medio respiratorio de etanol/glicerol. Por lo tanto, la placa maestra debe replicarse en placas YPD con un césped de una cepa de prueba. La posición de los diploides de respiración positivos indica qué colonias purificar de la placa maestra. Son necesarias dos rondas de purificación para obtener la cepa pura final. La integración mitocondrial suele corroborarse mediante la amplificación por PCR de la región circundante de interés y la secuenciación.

Por último, los genes pueden insertarse en el locus específico del genoma mitocondrial. Por ejemplo, los genes reporteros pueden insertarse en el extremo 3' de la secuencia codificante de un gen mitocondrial o reemplazar la región codificante del gen mitocondrial, entre otras opciones (Figura 9A). Sin embargo, los genes también pueden insertarse en sitios ectópicos dentro de regiones no codificantes del genoma mitocondrial. El sitio comúnmente utilizado es 295 nt aguas arriba del codón de inicio del gen COX2 . La alteración en esta región no codificante es inocua13. Para expresar con éxito el gen en el sitio ectópico, debe estar flanqueado por un promotor y terminador mitocondrial. Las secuencias flanqueantes de COX2 son las más óptimas, ya que COX2 es el gen de las mitocondrias con las secuencias no traducidas 5' y 3' más cortas (73 nt de la UTR 5' y 119 nt de la UTR 3') (Figura 9B). Para esta construcción, el plásmido bacteriano tiene las siguientes características: el molde es un plásmido que contiene la región codificante COX2 , con 1120 nt aguas abajo del codón de parada y 670 nt aguas arriba del codón de inicio AUG , denominado pXPM5025. El gen de interés está diseñado para estar flanqueado por 73 nt de la COX2 5'-UTR y 119 nt de la COX2 3'-UTR. Posteriormente, se insertó, como se indicó anteriormente, a 295 nt aguas arriba del codón de inicio COX2 AUG, que es una región no codificante (Figura 9B). Nótese que este plásmido, y en consecuencia, en el genoma mitocondrial resultante, las UTRs COX2 5' y 3' están duplicadas. Después del bombardeo de este plásmido, las células rho sintéticas se acoplan para la citoducción con una cepa receptora que tiene una deleción extensa de la región COX2 (alelo cox2-62 )1. Durante la citoducción, el plásmido mitocondrial de la cepa ro-cepa sintética se recombina con el ADN mitocondrial del aceptor. El genoma mitocondrial resultante tiene la construcción ectópica y un gen WT COX2 . Por lo tanto, las colonias positivas podrán crecer en un medio respiratorio (Figura 9B).

Diagrama del sistema de lanzamiento de microportadores, configuración de presión de helio, placa de muestra, tubo de aceleración.
Figura 5: Representación esquemática del equipo de bombardeo de microproyectiles de alta velocidad. Nuestro laboratorio utiliza el sistema de suministro de partículas Biolistic-PDS-1000/He (Tabla de Materiales). Abreviatura: WPs = partículas de tungsteno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagrama de transformación de levadura y resultados de la placa de Petri que muestran la funcionalidad del gen ARG en ADNmt sintético.
Figura 6: Ejemplo de una placa de transformación de microproyectiles de alta velocidad. (A,B) Después del bombardeo, las placas se incubaron durante 5-7 noches a 30 °C. Si un contaminante crece (indicado por una flecha azul), se puede cortar con una espátula estéril. Después de replicar las placas en el medio marcador de selección (-URA en este caso), la placa maestra también se probó para detectar la presencia del plásmido mitocondrial mediante el acoplamiento a una cepa de prueba. En este caso, la cepa del probador tiene el alelo no funcional ARG8m-1 1. Después de aparearse durante 2 noches y replicar la placa en un medio que carecía de arginina (-ARG), surgieron cuatro colonias positivas (indicadas con flechas rojas). (C) Las colonias de rho- colonies sintéticas positivas se purificaron rerayándolas en medio -URA, y se llevaron a cabo pruebas de réplica como se describió anteriormente. Estas placas representan la tercera ronda de purificación. (D) Algunas colonias de rho- colonies sintéticas positivas perdieron la construcción mitocondrial. Abreviaturas: ADNmt = ADN mitocondrial; -URA = falta de uracilo; -ARG = carente de arginina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagrama del proceso de integración de plásmidos bacterianos; transferencia de genes al ADNmt; concepto de ingeniería genética.
Figura 7: Diagrama que muestra cómo seleccionar colonias de rho- positivas sintéticas después del bombardeo. (A) El plásmido bacteriano contiene una versión mutada no funcional de un gen mitocondrial. Para la detección, las colonias rho- sintéticas se acoplan a una cepa de prueba que contiene una mutación no funcional diferente del mismo gen en el ADN mitocondrial. Después del apareamiento, los ADNmt mutantes se recombinan y un gen funcional puede recuperarse mediante complementación. Aquí, el diploide crece en un medio selectivo donde ni la cepa sintética ni el probador pueden crecer. (B) En este caso, el plásmido contiene una secuencia adicional de un gen mitocondrial (es decir, un fragmento de COX3). Después de la transformación, la cepa rho- sintética se selecciona por su capacidad para complementar una mutación COX3 en la cepa del probador, por lo que solo los diploides pueden crecer en un medio selectivo (es decir, medio respiratorio). Este método es útil si no se dispone de una cepa de prueba para el gen de interés. En este caso, la detección de colonias de rho- colonies sintéticas positivas es indirecta. Abreviatura: ADNmt = ADN mitocondrial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

experimento de placa de Petri; proceso de citoducción; observación del crecimiento de levaduras; Evaluación de transferencia genética.
Figura 8: Ejemplo de citoducción para integrar un constructo en el locus diana en el ADN mitocondrial. Después del apareamiento y la recuperación, las células mezcladas y los cigotos binucleares se sembraron en un medio que carecía de leucina. En este caso, como la cepa donante tiene el alelo leu2,3-112, este medio impide el crecimiento del donante. Esta placa se replicó en el mismo medio (placa maestra), en un medio donde solo pueden crecer diploides (-ADE) y en un medio donde el aceptor con la mutación deseada puede crecer (flechas rojas). En este caso, ni el donante ni las células receptoras pueden crecer en medios respiratorios. Solo el diploide resultante después de aparearse con un césped de una cepa de prueba puede crecer en un medio respiratorio. Estas colonias diploides de respiración son una guía para seleccionar y purificar las colonias positivas de la placa maestra. Abreviaturas: -LEU = sin leucina; -ADE = falta de adenina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagrama de transferencia de genes mitocondriales con proceso de donante rho sintético a aceptor de ADNmt.
Figura 9: Diagrama que muestra cómo integrar la construcción mitocondrial mutada (presente en la cepa sintética) en la cepa aceptora. (A) En este ejemplo, la cepa aceptora lleva el gen reportero ARG8m que reemplaza a los codones del gen de interés. El rho-DNA sintético contiene una versión mutada de este gen. El plásmido y el ADN mitocondrial se recombinan a través de las regiones flanqueantes 5' y 3', y el reportero ARG8 m es reemplazado por la secuencia mutada del gen de interés. (B) Genes extraños pueden insertarse ectópicamente en regiones específicas del genoma mitocondrial 7,13,36. En este ejemplo, un gen puede introducirse en una posición de 295 nt aguas arriba del gen COX2. Esta es una región no codificante del ADNmt. Un gen extraño de interés está flanqueado por 73 nt y 119 nt de la COX2 5' UTR y 3' UTR, respectivamente. Esta construcción se inserta en un plásmido que contiene el gen COX2 más 670 nt y 1120 nt de las regiones UTR 5' y 3'. La cepa sintética (donante) lleva esta construcción en las mitocondrias. En este caso, la cepa aceptora (XPM13)7 tiene una deleción significativa del gen cox2 (alelo cox2-62)1. Después de la citoducción, el ADN mitocondrial del donante y del aceptor se recombina. El gen COX2 se restaura y el gen de interés se inserta en el sitio ectópico (295 nt aguas arriba del gen COX2). Abreviaturas: ADNmt = ADN mitocondrial; nt = nucleótidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Cepa de levaduraGenotipoREF
NAB69Mata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho0)1
NB71Matα, ade2-101, ura3-52, leu2-delta, arg8-delta::URA3, kar1-1, (cox3Δ:ARG8m-1)1
XPM10bMatα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG, ura3-52 (rho+ , cox1∆::ARG8m)7
XPM209Matα, lys2, arg8::hisG, ura3-52, leu2-3, 112, (rho+, ΔΣai, COX1ΔC15)26
XPM199Mata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho-, pXPM61)26
XPM13Matα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG,ura3-52, his3-deltaHindIII (rho+,cox2-62, cox1∆::ARG8m)7
L45Matα, ade1, op1 (rho+, cox1-D369N)28

Tabla 1: Ejemplos de cepas de levadura utilizadas en la transformación biolística y la citoducción.

Medios de crecimientoComponentes
YPD2% de glucosa, 2% de bactopeptona, 1% de extracto de levadura
YPR2% Rafinosa, 2% bactopeptona, 1% extracto de levadura
YPEG*3% de glicerol, 3% de etanol*1, 2% de bactopeptona, 1% de extracto de levadura
Medios de deserción2 % de glucosa, 6,8 % de levadura a base de nitrógeno con (NH4)2SO4, mezcla de aminoácidos que se eliminan*2
Medios de bombardeo5% de glucosa, 6,8% de levadura nitrogenada base con (NH4)2SO4, 1 M de sorbitol, mezcla de aminoácidos salientes*2,3.
*1 Agregue etanol después de esterilizar en autoclave cuando el medio esté tibio.
*2 La cantidad de mezcla de aminoácidos puede variar en función de las existencias disponibles o de la cantidad indicada por el fabricante.
*3 Para los medios de bombardeo, agregue los aminoácidos y las bases nitrogenadas según sea necesario según la cepa de levadura. Asegúrese de que la composición sea específica para la auxotrofia en el plásmido de 2 μL utilizado para la selección.

Tabla 2: Medios de crecimiento de levadura utilizados en este protocolo.

Discusión

El presente trabajo describe cómo transformar con éxito las mitocondrias de la levadura S. cerevisiae . El proceso, desde el bombardeo de microproyectiles a alta velocidad hasta la purificación de la cepa de levadura prevista, dura ~ 8-12 semanas, dependiendo de cuántas rondas de purificación de la cepa sintética sean necesarias. Algunos de los pasos críticos del método son los siguientes. En primer lugar, cuanto más grandes sean las regiones flanqueantes añadidas alrededor del sitio de la mutación en la construcción del gen mitocondrial, mayor será la probabilidad de una integración exitosa de la mutación objetivo. El tamaño mínimo de las regiones flanqueantes es de ~100 nt; Sin embargo, se recomienda encarecidamente el uso de más de 500 NT a cada lado de la mutación. En segundo lugar, al seleccionar las colonias rho sintéticas después de la transformación, se recomienda que no se realicen más de 3-4 rondas de purificación; De lo contrario, existe un alto riesgo de que eventualmente se pierda la construcción mitocondrial, ya que no hay presión selectiva para mantener el plásmido en las mitocondrias. En tercer lugar, para evitar dañar al usuario o al equipo, debe leer detenidamente el manual de la máquina de bombardeo antes de iniciar el procedimiento. Este equipo es delicado y utiliza alta presión y vacío.

Una limitación de este procedimiento es que, hasta el momento, solo la levadura y el alga verde C. reinhardtii son candidatas a transformar las mitocondrias con este método. Sería relevante si pudiéramos introducir mutaciones dirigidas por sitios en el genoma mitocondrial de otros organismos. Otra limitación es que es difícil transformar muchos constructos diferentes en la misma sesión. Se recomienda realizar seis transformaciones para cada construcción, cada una de las cuales debe ser probada, seleccionada y purificada. Esto da como resultado más de 50 placas de medios solo para obtener colonias puras de rho- de una sola mutación mitocondrial.

A pesar de estas limitaciones, la capacidad de manipular el genoma mitocondrial de la levadura ha contribuido significativamente a la comprensión de muchas vías de la biogénesis de los complejos respiratorios. Este enfoque se puede utilizar para introducir genes reporteros para monitorear y cuantificar la traducción mitocondrial 1,7,36,37, interrumpir los genes mitocondriales 38, identificar chaperonas de ensamblaje de complejos respiratorios39, comprender mejor los mecanismos de traducción y ensamblaje mitocondrial acoplado 7,11,12,36y buscar supresores al seguir la expresión de un gen mitocondrial mutado40. Hasta ahora, aunque ciertos enfoques para manipular el genoma mitocondrial en mamíferos se han reportado anteriormente41, no existe un método generalizado para transformar el ADN mitocondrial para estos organismos.

Divulgaciones

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

Agradecimientos

Esta publicación contó con el apoyo del Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 a XP-M]. La UPD es becaria de CONAHCYT (CVU:883299). Queremos agradecer a la Dra. Ariann Mendoza-Martínez por su ayuda técnica con las imágenes del microscopio óptico. Licencias de Biorender: DU26OMVLUU (Figura 2); BK26TH9GXH (Figura 3); GD26TH80R5 (Figura 4); PU26THARYD (Figura 7); ML26THAIFG (Figura 9).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Puntas de pipeta de 1 mLAxygenT-1000-B
1,5 mL MicrotuboAxygenMCT-150-C
10 μ L puntas de pipetaAxygenT-10-C
15 mL tubo de fondo cónico AxygenSCT-25ML-25-S
200 μ Puntas de pipeta LAxygenT-200-Y
50 mL tubo de fondo cónicoAxygenSCT-50ML-25-S
AfiIINew England BioLabsR0520S
AgarosaSeaKem50004
Balanza analíticaOHAUSARA520
AutoclaveTOMYES-315
Bacto agarBD214010
Bacto peptonaBD 211677
Soporte de macroportadores biolisíticos Quemador Bunsen BIO-RAD1652322
VWR89038-528
Cloruro de calcioFisher ScientificC79-500
CSM -ADEPara medioDCS0049
CSM -ARGPara medioDCS0059
CSM -LEUpara medioDCS0099
CSM -URAPara medio
Matraz de vidriopara cultivo KIMAX KIMBLE25615
Tubo de vidriopara cultivo Pyrex9820
DextrosaBD215520
EtanolJT Baker 9000
PinzasMillipore620006
Cuentas de vidrioSigmaZ265926
Mango de vidrioSigmaS4647
GlicerolJT BAKER2136-01
Tanque de helio grado 5 (99.99 %)--
HSTaq  KitPCR Bio
MicrocentrífugaEppendorf022620100
NdeINew England BioLabsR0111L
Agitador orbitalNew Brunswick scientificNB-G25
Tubos de PCRAxygenPCR-02-C
PDS-1000/He TM Sistema de suministro de partículas biolísticasBIO-RAD165-2257
Placas de Petri (100X10)BD252777
QIAprep Spin MiniprepQiagen27106
RaffinoseFormediumRAF03
Replica platerSciencewareZ363391
Discos de ruptura 1350 PsiBIO-RAD1652330
SorbitolSigmaS7547
EspermidinaSigmaS0266
T4 ADN LigasaThermo ScientificEL0011
Rotador de cultivoMicroportadores
M10BIO-RAD1652266
Bomba de vacío de 100L / min de capacidad--
Almohadillas de terciopeloBel-ArtH37848-0002
Vórtice Scientifc IndustriesSI-0236
Barra aplicadora de maderaPROMA 1820060
Extracto de levaduraBD212750
Levadura Base nitrogenada sin aminoácidosBD291920
DCS0169 de tejidos de tungsteno Thermo Scientific 88882015

Referencias

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