Este protocolo presenta una técnica optimizada de perfusión hepática de colagenasa en dos pasos en un modelo de rata y muestra el uso de hepatocitos aislados para el cultivo in vitro a largo plazo de organoides 3D.
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Artículo de método
Perfusión hepática de rata y aislamiento primario de hepatocitos: un antiguo procedimiento crucial para el cultivo de organoides 3D de última generación
En este artículo
Resumen
Resumen
Los hepatocitos primarios son una herramienta comúnmente utilizada para estudios in vitro relacionados con el hígado. Sin embargo, el mantenimiento de estas células siempre ha sido un desafío debido a la rápida pérdida de morfología, viabilidad y funcionalidad en cultivo. Un enfoque reciente para el cultivo a largo plazo es la generación de organoides tridimensionales (3D), una herramienta in vitro que puede recapitular tejidos en un plato basándose en la maravillosa capacidad del hígado para regenerarse a sí mismo. Los protocolos publicados han sido diseñados para obtener organoides 3D funcionales a largo plazo a partir de hepatocitos adultos primarios (Hep-Orgs). La herramienta de vanguardia para organoides 3D requiere la capacidad de aislar las células del tejido adulto, y este paso inicial es crucial para obtener un resultado final de alta calidad. La perfusión de colagenasa en dos etapas, introducida en la década de 1970, sigue siendo un procedimiento válido para obtener hepatocitos individuales. El presente artículo tiene como objetivo describir todos los pasos cruciales del procedimiento quirúrgico, optimizando así el procedimiento de aislamiento de hepatocitos primarios en el modelo de rata. Además, se presta especial atención a las directrices PREPARE para aumentar la probabilidad de éxito de los procedimientos y garantizar resultados de alta calidad. Un protocolo detallado permite a los investigadores acelerar y optimizar el trabajo posterior para establecer organoides 3D a partir de hepatocitos primarios de ratas adultas. En comparación con los hepatocitos 2D, las Hep-Orgs seguían siendo viables y estaban en proliferación activa en el día 15, lo que demuestra un potencial a largo plazo.
Introducción
Los hepatocitos primarios son una herramienta importante y ampliamente utilizada para los estudios in vitro relacionados con el hígado. Sin embargo, su expansión y mantenimiento han sido históricamente desafiantes, ya que pierden morfología y funcionalidad después de unos días en el cultivo1. El cultivo 2D es una condición limitante, en particular, para los hepatocitos que tienen una forma poligonal y una estructura polarizada con membranas apicales y basolaterales diferenciadas. De hecho, la adhesión de los hepatocitos a la placa interfiere con su actividad normal, ya que conduce a un citoesqueleto pl....
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Protocolo
Todos los procedimientos y el alojamiento de los animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Ley italiana y la directiva de la Comunidad Europea. El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Cuidado Animal local y por el Ministerio de Salud italiano (permiso n° 321/2022-PR) de acuerdo con el art.31 del decreto 26/2014.
1. Preparación para el procedimiento con animales
NOTA: Consulte la Tabla 1 para conocer la composición del medio y el tampón y la Tabla de Materiales para obtener detalles comerciales....
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Resultados
Al final de los procedimientos de configuración (paso 6.13), obtuvimos un rendimiento celular de hasta 1 x 108 células por aislamiento del hígado de aproximadamente 300 g de una rata. La viabilidad celular entre el 78% y el 97% se estableció mediante el conteo con azul de tripano.
Como ya se ha descrito en estudios previos 1,18,19, los hepatocitos primarios en cultivo pierden su morfología,.......
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Discusión
Los organoides 3D son una frontera para la medicina personalizada y permiten un cultivo de hepatocitos a largo plazo. La calidad de esta técnica innovadora requiere un buen rendimiento de hepatocitos primarios viables y un buen rendimiento de perfusión hepática y aislamiento de hepatocitos. Este antiguo procedimiento sigue siendo muy utilizado; Sin embargo, comprende diferentes pasos que pueden ser desafiantes. Al abordar el procedimiento, experimentamos problemas críticos como la contam.......
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Divulgaciones
Todos los autores han revelado todos y cada uno de los conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Davide Selvestrel y al profesor Giovanni Sorrentino del SorrentinoLab de la Universidad de Trieste por ayudarnos a realizar el ensayo de proliferación de EdU. El trabajo contó con el apoyo de una subvención ad hoc de la Banca d'Italia y de subvenciones internas del FIF.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| A83-01- Inhibidor de ALK5 IV | doble hélice | T3031 | |
| B27 | Thermofisher Scientific | 0080085SA | |
| CFX Connect Sistema de detección de PCR en tiempo real | Kit de imagen Bio-Rad | ||
| CHIR99021 | Twin Helix | T2310 | |
| Click EdU Alexa 488 | Thermofisher Scientific | C10499 | |
| Colágeno, Tipo I, solución de cola de rata | Merck | C3867-1VL | |
| Dexametasona | Merck | D4902 | |
| EGF | Merck | E9644 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Euroclone | ECS0180L | |
| GELTREX LDEV FREE RGF BME | Thermofisher Scientific | A1413202 | |
| Heparina Sódica 25000 UI/5 ml | B. Braun Melsungen AG | B01AB01 | |
| HGF | Peprotech | 100-39H | |
| Solución de insulina-transferrina-selenio 100x | Thermofisher Scientific | 41400045 | |
| solución de L-glutamina | Euroclone | ECB3000D | |
| Liver Digest Medium | Thermofisher Scientific | 17703-034 | |
| Medio de perfusión hepática | Thermofisher Scientific | 17701038 | |
| suplemento de N2 | Thermofisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetilcisteína | Merck | A9165 | |
| Nicotinamida | Merck | N-0636 | |
| Aminoácidos no esenciales | Merck | M7145 | |
| Normocin | Aurogene | ant-nr-1 | |
| PBS buffer 1X | PanReac AppliChem | A0964,9050 | |
| Solución de penicilina-estreptomicina 100x | Euroclone | ECB3001D | |
| Percoll | Santa Cruz | sc-296039A | |
| Ismatec&comercio; | MS-4/12 Reglo Bomba Digital TNFa | ||
| Peprotech | 300-01A | ||
| Reactivo TRI | Merck | T9424 | |
| Tubo | Ismatec&comercio; | ID.2,79mm | |
| Williams' E Medium, sin glutamina | Thermofisher Scientific | 31415029 | |
| Y27632 | Twin Helix | T1725 |
Referencias
- Heslop, J. A., et al. Mechanistic evaluation of primary human hepatocyte culture using global proteomic analysis reveals a selective dedifferentiation profile. Arch Toxicol. 91 (1), 439-452 (2017).
- Ietto, G., et al.
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Reimpresiones y permisos
