Este protocolo presenta una técnica optimizada de perfusión hepática de colagenasa en dos pasos en un modelo de rata y muestra el uso de hepatocitos aislados para el cultivo in vitro a largo plazo de organoides 3D.
Artículo de método
Perfusión hepática de rata y aislamiento primario de hepatocitos: un antiguo procedimiento crucial para el cultivo de organoides 3D de última generación
En este artículo
Resumen
Resumen
Los hepatocitos primarios son una herramienta comúnmente utilizada para estudios in vitro relacionados con el hígado. Sin embargo, el mantenimiento de estas células siempre ha sido un desafío debido a la rápida pérdida de morfología, viabilidad y funcionalidad en cultivo. Un enfoque reciente para el cultivo a largo plazo es la generación de organoides tridimensionales (3D), una herramienta in vitro que puede recapitular tejidos en un plato basándose en la maravillosa capacidad del hígado para regenerarse a sí mismo. Los protocolos publicados han sido diseñados para obtener organoides 3D funcionales a largo plazo a partir de hepatocitos adultos primarios (Hep-Orgs). La herramienta de vanguardia para organoides 3D requiere la capacidad de aislar las células del tejido adulto, y este paso inicial es crucial para obtener un resultado final de alta calidad. La perfusión de colagenasa en dos etapas, introducida en la década de 1970, sigue siendo un procedimiento válido para obtener hepatocitos individuales. El presente artículo tiene como objetivo describir todos los pasos cruciales del procedimiento quirúrgico, optimizando así el procedimiento de aislamiento de hepatocitos primarios en el modelo de rata. Además, se presta especial atención a las directrices PREPARE para aumentar la probabilidad de éxito de los procedimientos y garantizar resultados de alta calidad. Un protocolo detallado permite a los investigadores acelerar y optimizar el trabajo posterior para establecer organoides 3D a partir de hepatocitos primarios de ratas adultas. En comparación con los hepatocitos 2D, las Hep-Orgs seguían siendo viables y estaban en proliferación activa en el día 15, lo que demuestra un potencial a largo plazo.
Introducción
Los hepatocitos primarios son una herramienta importante y ampliamente utilizada para los estudios in vitro relacionados con el hígado. Sin embargo, su expansión y mantenimiento han sido históricamente desafiantes, ya que pierden morfología y funcionalidad después de unos días en el cultivo1. El cultivo 2D es una condición limitante, en particular, para los hepatocitos que tienen una forma poligonal y una estructura polarizada con membranas apicales y basolaterales diferenciadas. De hecho, la adhesión de los hepatocitos a la placa interfiere con su actividad normal, ya que conduce a un citoesqueleto plano con interacción limitada entre las células y entre las células y la matriz extracelular (MEC), reduciendo la polarización y las vías de señalización involucradas2.
Para eludir las limitaciones de este método, Dunn y sus colegas3 utilizaron primero la doble capa de colágeno. Este método de cultivo, conocido como "método de cultivo en sándwich", se basa en la siembra de hepatocitos primarios entre las dos capas de la matriz. Este método tiene muchas ventajas, incluyendo el cultivo a largo plazo, el mantenimiento de la morfología poligonal y las actividades transcripcionales comparables a las de los hepatocitos recién aislados4. Un método similar, basado en el mismo principio, en el que la capa subyacente está compuesta por Matrigel mientras que la capa está compuesta por colágeno, ha evidenciado la presencia de una red canalicular bien establecida5.
A pesar de la fiabilidad del método de cultivo en sándwich para el crecimiento de hepatocitos, el presente trabajo espera establecer un cultivo de organoides en 3D, una herramienta in vitro utilizada para recapitular tejidos en una placa y formar un puente potencial hacia la medicina personalizada, permitiendo la generación de conocimientos biológicos específicos de enfermedades, la identificación de objetivos moleculares, la prueba de fármacos, el establecimiento de biobancos y la apertura de nuevos horizontes para tecnologías innovadoras como el órgano en chip6. Los hepatocitos primarios se incrustaron en gotas de la matriz hemisférica conocidas como "cúpulas" para permitir un crecimiento robusto de organoides dentro de las cúpulas y garantizar el flujo de los factores solubles, incluidos el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF), desde el medio de cultivo. Estos factores de crecimiento activan directamente las vías de señalización para asegurar la supervivencia de los hepatocitos7. Los organoides hepáticos generalmente se obtienen a partir de células madre/progenitoras aisladas de etapas embrionarias o de ratas adultas, ratones, hígado humano (y también de perros y gatos)8. A pesar de que la conformación 3D mejora la diferenciación de las células madre a hepatocitos adultos, esta herramienta aún carece de la madurez del tejido primario original9. Para superar este problema, en 2018, dos grupos diferentes 9,10 publicaron simultáneamente un protocolo para obtener un cultivo a largo plazo de organoides hepáticos 3D a partir de hepatocitos primarios de ratón adultos (denominados Hep-Orgs). Sus protocolos recapitulan la respuesta al daño proliferativo de la regeneración hepática, cultivando hepatocitos con un alto nivel de citocinas inflamatorias, tal y como se produce tras una hepatectomía parcial. De hecho, los estudios anteriores demuestran que los hepatocitos pueden cambiar a un estado ductal después de una lesión12 o cuando se suprime la proliferación de colangiocitos13. Su capacidad bipotente permite la plasticidad celular, que es importante para estructuras complejas como los organoides. Por lo tanto, estos protocolos superan el problema de la incapacidad de expandir los hepatocitos primarios in vitro.
La herramienta de vanguardia para organoides 3D requiere la capacidad de aislar las células del tejido adulto, y este paso inicial es crucial para obtener un resultado final de alta calidad. Si bien la preparación de organoides en 3D podría considerarse una técnica reciente y en desarrollo (porque la definición de organoide fue acuñada por Lancaster14 y Huch15 hace solo diez años), la perfusión de colagenasa en dos pasos es un procedimiento antiguo introducido por Seglen en la década de 197016. Centrándonos en las publicaciones más recientes en la materia, los protocolos de Ng17 y Shen18 podrían considerarse el estándar de oro para realizar el procedimiento en ratas, mientras que los de Cabral19 y Charni-Natan20 para ratones. No es inusual que los investigadores se centren en elegir la mejor matriz extracelular (MEC) y factores de crecimiento para desarrollar organoides 3D, pero se encuentren con fracasos como un procedimiento quirúrgico inadecuado, baja viabilidad y rendimiento de los hepatocitos o altos niveles de contaminación bacteriana. Estos problemas alargan los experimentos posteriores y aumentan el número de animales necesarios para los siguientes experimentos. Por el contrario, si los procedimientos quirúrgicos y de aislamiento están bien establecidos, el alto número de hepatocitos viables obtenidos permite preparar una gran cantidad de organoides, limitando así el uso de animales. El presente protocolo aborda principalmente estos problemas utilizando soluciones comerciales y optimizando una canulación precisa de la vena porta que garantiza pasos óptimos de perfusión y digestión con el hígado in situ.
Con el fin de mejorar la calidad, la reproducibilidad y la traducibilidad de nuestra investigación con animales, consideramos cuidadosamente las directrices de PREPARE: Planificación de la investigación y los procedimientos experimentales en animales: Recomendaciones para la excelencia21. Estas pautas de presentación de informes intentan aumentar la probabilidad de éxito a través de la planificación y representan un paso importante en la implementación de las 3R de Russel y Burch (reemplazo, reducción y refinamiento). Las directrices de PREPARE abarcan 15 temas principales que deben abordarse de acuerdo con cada proyecto de investigación individual. Describiremos los temas en los que nos enfocamos durante la planificación y preparación del proyecto.
El presente trabajo tiene como objetivo describir, en un protocolo exhaustivo, detallado y consecuente, los pasos cruciales de la cirugía en el modelo de rata para permitir a los investigadores acelerar y optimizar el trabajo posterior. Cuando abordamos estos protocolos al principio, experimentamos problemas de contaminación bacteriana, baja eficiencia de digestión hepática, bajo rendimiento de hepatocitos primarios y baja viabilidad de hepatocitos que pueden afectar fácilmente el éxito de la técnica. Al mostrar cómo abordar y resolver características críticas, este protocolo optimizó el procedimiento para el aislamiento primario de hepatocitos de rata. La perfusión hepática de rata y el posterior aislamiento primario de hepatocitos adultos son los principales pasos preliminares para diferentes aplicaciones. En particular, este protocolo es adecuado para todos los procedimientos que requieren un buen rendimiento de hepatocitos adultos de alta calidad y alta viabilidad. Los resultados del protocolo son apropiados para establecer modelos in vitro para estudiar la fisiología y patología hepática.
Protocolo
Todos los procedimientos y el alojamiento de los animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Ley italiana y la directiva de la Comunidad Europea. El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Cuidado Animal local y por el Ministerio de Salud italiano (permiso n° 321/2022-PR) de acuerdo con el art.31 del decreto 26/2014.
1. Preparación para el procedimiento con animales
NOTA: Consulte la Tabla 1 para conocer la composición del medio y el tampón y la Tabla de Materiales para obtener detalles comerciales.
- Calentar el baño de agua a 42 °C y, a continuación, colocar el tampón de perfusión y 1x PBS en el baño de agua durante unos 20 minutos.
NOTA: Debido a la sensibilidad de las enzimas, el tampón de digestión se calienta solo cuando el procedimiento de perfusión se ha iniciado con éxito. Durante el procedimiento de perfusión, mantenga las soluciones en el baño de agua. - Coloque el medio completo de William y PBS + 3% P/S en hielo.
- Prepare la bomba peristáltica y conecte el tubo con la botella de vidrio y la trampa de burbujas, ambas llenas de tampón de perfusión.
- Mientras ceba la bomba, llene el tubo con tampón de perfusión tibio para eliminar el aire y lavar el etanol residual (baja velocidad de la bomba). Este paso también es importante para comprobar el correcto funcionamiento de la bomba y las posibles fugas en los tubos.
2. Preparación para el aislamiento de hepatocitos
- Durante el procedimiento con animales, exponga los siguientes instrumentos a la luz ultravioleta: placa de Petri de 100 mm, colador de células de 100 μm, raspador tamaño M, pinzas grandes, vaso de precipitados para hielo, bandeja para hielo.
3. Procedimiento inicial con el animal y anestesia
- Anestesiar a la rata adulta (250-350 g de peso corporal; 10-12 semanas de edad) mediante inyección intraperitoneal de mezcla de anestésicos (concentración final para xilacina: 22,5 mg/kg; para ketamina: 112,5 mg/kg; volumen final aprox.: 0,8-1,0 mL).
- Controle la profundidad de la anestesia pellizcando los dedos de los pies hasta que la rata ya no responda a los estímulos nocivos. Por lo general, tarda 5 minutos. La dosis anestésica garantiza una anestesia quirúrgica profunda que minimiza el riesgo de sufrimiento o angustia durante el procedimiento
NOTA: La exanguinación es el método secundario de eutanasia en ratas utilizado en este experimento, y asegura que el animal ha sido sacrificado de manera efectiva. - Afeitar el abdomen y limpiarlo con etanol al 70% para reducir la contaminación bacteriana durante la cirugía.
NOTA: Esta es una cirugía que no es de supervivencia, por lo que no se mantiene una asepsia completa. - Coloque la rata en el centro de la bandeja de disección y asegure las extremidades con agujas.
- Haz una incisión en forma de U a través de la piel y el músculo desde el centro de la parte inferior del abdomen hasta la caja torácica, sujeta la piel y dóblala hasta la cabeza, exponiendo los intestinos.
- Mueva con cuidado el intestino hacia el lado izquierdo del animal, fuera de la cavidad abdominal, y exponga la vena porta hepática y la vena cava.
- Con unos alicates, pase un hilo de algodón por debajo de la vena porta y prepare 2 nudos, a 1 cm uno del otro, que rodeen la vena misma.
NOTA: Un hilo negro es más fácil de visualizar. - Inyectar 100-150 UI de heparina disuelta en 1x PBS (volumen total 300 μL) en la vena cava para prevenir la coagulación de la sangre.
4. Canulación y perfusión hepática
- Encienda la bomba a baja velocidad (menos de 1 mL/min de flujo).
- Inserte el angiocath de 18 G en la vena porta a nivel de la rosca en un ángulo plano con respecto a la vena.
- Retire manualmente la aguja interna para dejar la cánula en la vena. La sangre fluirá en su interior, llenando el tapón y evitando las burbujas de aire atrapadas en el siguiente paso.
- Mientras el tampón de perfusión fluye en el tubo, conecte la cánula presionando el botón C al extremo de salida usando un conector de bloqueo Luer.
- En este punto, ate los nudos, uno alrededor del catéter dentro de la vena y otro alrededor del catéter, antes de ingresar a la vena para estabilizar el tubo en la posición correcta.
- Corta la vena cava para dejar salir la sangre. Asegúrese de que el hígado comience a hincharse y blanquearse rápidamente (segundos) en 2-3 s. Esto confirma que el tampón de perfusión fluye correctamente a través del hígado.
NOTA: Si algunos lóbulos permanecen rojos, el angiocatéter se coloca demasiado profundo. Si solo hay puntos rojos, golpear ligeramente el hígado puede ayudar a la perfusión en los puntos específicos. Vierta un poco de PBS 1x sobre el abdomen abierto para ayudar a mover la sangre y verificar si hay fugas. - Aumente lentamente el caudal de la bomba a 10 mL/min y manténgalo durante al menos 10 min para permitir la limpieza del hígado de la sangre.
- Durante la perfusión, aplique presión sobre la vena cava con un bastoncillo de algodón durante intervalos de 10 s: Asegúrese de que el hígado se hinche al pinzar y se relaje al soltarlo. Repita la presión periódicamente (5-10 veces) y compruebe si hay hinchazón y relajación del hígado.
NOTA: Este paso sirve como un punto de control crucial para validar visiblemente la perfusión. Ha sido esencial para garantizar una alta vitalidad de los hepatocitos y maximizar el rendimiento final. Al verificar activamente este proceso, el tampón puede llegar eficazmente a todas las partes de la vasculatura hepática, lo que la limpieza pasiva de la sangre por sí sola no lograría.
5. Digestión hepática
- Después de la perfusión, cambie al tampón de digestión precalentado sin interrumpir el flujo y evitando burbujas de aire en el tubo.
NOTA: La reducción temporal del flujo puede ayudar a realizar este pasaje. El tampón de digestión incluye rojo de fenol, lo que facilita la visualización del cambio del tampón de perfusión al tampón de digestión. - Aumente la velocidad de la bomba a 20 mL/min y presione periódicamente con el hisopo para la hinchazón y relajación del hígado.
- Después de este paso (que dura unos 15 minutos), asegúrese de que el hígado se vuelva cada vez más blando. En este punto, se puede quitar la aguja y la bomba se detiene.
- Como la cápsula hepática es frágil después de la digestión, diseccione el hígado con suavidad y cuidado: agarre el tejido conectivo central entre los lóbulos con pinzas. Corta todas las conexiones con otros órganos y levanta el hígado.
- Lave el hígado, sumergiéndolo en la solución preenfriada de PBS + 3% P/S durante unos segundos. Luego, colóquelo en el tubo completo de contenido medio de William's preenfriado.
NOTA: La exanguinación y la muerte aseguran la perfusión a través de la vena cava. La confirmación de la muerte del animal proviene del neumotórax inducido en el momento en que se explanta el hígado, y el diafragma se diseca por completo, y tras la inspección, la respiración y los latidos del corazón ya no son funcionales.
6. Purificación de hepatocitos
- Bajo el capó biológico, transfiera el hígado a la placa de Petri de 100 mm con los 15 mL de medio completo William's frío sobre una bandeja llena de hielo.
- Presione el órgano vigorosamente con el raspador para liberar las células en el medio.
NOTA: Si la fase de digestión se ejecuta correctamente, la liberación celular debería ser fácil y no requerir mucha presión sobre el hígado. No corte el hígado en trozos; Déjalo intacto. Mantener el hígado sumergido en el medio mejora la liberación de células. - Recoja las células que contienen medio y fíltrelas con el filtro de 100 μm mientras las transfiere a un tubo cónico estéril. La filtración permite la eliminación de tejidos conectivos y fragmentos de tejido no digeridos.
- Vierta aproximadamente 15 ml de medio completo frío de William sobre el hígado triturado en la placa de Petri para ayudar a liberar más células. Repita los pasos 6.2 y 6.3.
- Repita el punto 6.4 al menos una vez, hasta que se liberen todas las celdas. Si es necesario, divida el medio en tubos más cónicos y utilice varios filtros de 100 μm.
NOTA: Después de la liberación de los hepatocitos y antes del filtrado, el medio debe verse opaco debido a la presencia de los hepatocitos. El hígado restante debe tener un aspecto fibroso y se desechará. - Centrifugar el medio filtrado que contiene células hepáticas a 50 x g durante 3 min a 4 °C con un freno de baja velocidad.
NOTA: Los hepatocitos son más densos que otras células hepáticas. Debido a la baja fuerza de centrifugación, solo los hepatocitos estarán en el gránulo, mientras que otras células permanecerán en el sobrenadante. - Deseche el sobrenadante sin alterar la pelletización de la célula. Agregue suavemente unos 40 ml de medio completo William's helado en el tubo y pipetee lentamente hacia arriba y hacia abajo de 2 a 3 veces para resuspender el pellet de celda.
NOTA: El pellet de celda debe resuspenderse con cuidado para evitar dañar las celdas. - Centrifugar a 50 x g durante 3 min a 4 °C.
NOTA: Para los primeros intentos, cuente las células viables con un ensayo de azul de tripán 1:10 después de la segunda centrifugación antes de continuar con los siguientes pasos. Esto puede evitar la pérdida de medios y tiempo si todas las celdas están muertas. - Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 25 mL de medio completo William's helado.
- Agregue 25 ml de solución de gradiente de densidad al 90% en el tubo y mezcle suavemente.
NOTA: Una solución de gradiente de densidad separa los hepatocitos viables de los hepatocitos muertos y los restos celulares en función de su densidad. - Centrifugar a 200 x g durante 10 min a 4 °C. Se debe obtener una bolita visible en la parte inferior del tubo, correspondiente a los hepatocitos viables, y una capa transparente en la parte superior del gradiente compuesta por hepatocitos muertos.
NOTA: Si no hay ningún pellet, intente mezclar la solución nuevamente girando y repita la centrifugación. - Aspire la capa de células muertas desde la parte superior del gradiente y deje 1-2 mL del medio con el pellet.
- Vuelva a suspender el pellet en 30-40 mL del medio completo de William.
NOTA: Para todo el procedimiento, utilice únicamente pipetas serológicas de 25 ml. Las pipetas de menor diámetro pueden reducir la viabilidad de los hepatocitos. Todos los pasos deben realizarse sobre hielo para mantener +4 °C. - Centrifugar a 200 x g durante 10 min a 4 °C y, a continuación, aspirar el sobrenadante.
7. Cultivo de hepatocitos y recolección de ARN
- Agregue una cantidad adecuada de medio para el conteo de células. Cuente la viabilidad de las células con azul de tripano 1:10.
- Cultivo de hepatocitos en 2D
- Placas de células a la concentración de 500.000 células/pocillo de placa de 6 pocillos en una placa de células recubierta de colágeno con medio completo de William precalentado.
- Colocar el cultivo celular en una incubadora humidificada con 95% de aire, 5% de CO2 a 37 °C.
- Después de 4 h, cambie el medio por el nuevo medio completo William's precalentado.
- Mantenga las células en la incubadora. Cambie el medio a diario.
- Recoja los hepatocitos primarios en un reactivo para la extracción de ARN antes de la siembra (día 0) y en los días 1 a 3 de cultivo.
- Extraiga el ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante y transcriba de forma inversa a ADNc para la evaluación de genes marcadores hepáticos mediante RT-qPCR. La lista de cebadores se presenta en la Tabla 2.
- Para el cultivo de hepatocitos a largo plazo en 3D:
- Vuelva a suspender las células en la matriz pura fría a la concentración de 1.000-10.000 células en 20 μL.
NOTA: Trate de evitar hacer burbujas de matriz. - Usando puntas de pipeta preenfriadas, placa las gotas celulares que contienen matriz en placa de cultivo celular precalentada.
- Dale la vuelta a la placa y déjala en la incubadora de cultivos celulares durante 20-30 min.
- Súbelo y añade el medio de hepatocitos 3D a largo plazo precalentado y el medio de cultivo específico según el trabajo de Peng22. Mantenga las células en la incubadora.
- Cambie el medio de hepatocitos a largo plazo 3D cada 2-3 días.
- Al menos después de 14 días de cultivo, las Hep-Orgs se separan de la matriz y las Hep-Orgs viables se evalúan mediante el ensayo de proliferación de Trypan blue y EdU y se pasan de acuerdo con el trabajo de Peng.
- Vuelva a suspender las células en la matriz pura fría a la concentración de 1.000-10.000 células en 20 μL.
Resultados
Al final de los procedimientos de configuración (paso 6.13), obtuvimos un rendimiento celular de hasta 1 x 108 células por aislamiento del hígado de aproximadamente 300 g de una rata. La viabilidad celular entre el 78% y el 97% se estableció mediante el conteo con azul de tripano.
Como ya se ha descrito en estudios previos 1,18,19, los hepatocitos primarios en cultivo pierden su morfología, funciones hepáticas específicas y mueren a los pocos días.
Es bien sabido en la literatura23,24 que los hepatocitos adultos primarios pierden rápidamente la morfología cuboidal-hexagonal, adquieren una forma "similar a la de un fibroblasto" en pocos días y mueren. La Figura 1 muestra las distintas fases: a las 4 h después de la siembra en una placa recubierta de colágeno, los hepatocitos se adhieren a la superficie, se extienden en una monocapa típica que muestra una morfología cuboidal, los bordes de las células están definidos, las uniones entre las células son lineales y la superficie de las células parece lisa (Figura 1A). En el día 1, los hepatocitos primarios adquieren su forma hexagonal típica y las gotas de lípidos se hacen visibles (Figura 1B). En los días 2-3, las gotas de lípidos aumentan (Figura 1C-1D), mientras que en los días 4-5, las células acumulan fibras de estrés de actina (Figura 1E-F). También evaluamos el porcentaje de células viables en cultivo primario 2D desde el día 1 hasta el día 5 y lo comparamos con la viabilidad antes de la siembra en el día 0 (Figura 2). Es posible observar una reducción drástica de la viabilidad ya en los primeros días de cultivo, alcanzando el 49,5% (DE 12,7) el día 1, que baja al 45,2% (DE 18,2) el día 2 y al 33,5% (DE 0,77) el día 3. El porcentaje de células viables en el día 4 ya es del 16,9% (DE 5,4), mientras que en el día 5 alcanza el 9,1% (DE 0,38). Por lo tanto, es evidente que la pérdida de morfología acompaña a una rápida muerte celular progresiva de los hepatocitos adultos en cultivo 2D.
Los hepatocitos aislados, antes de la siembra (día 0), mostraron una alta expresión de ARNm de genes marcadores hepáticos (ABCD3, ALB, KRT18, PCK1, SERPIN, TDO2) evaluados por RT-qPCR (Figura 3). Todos los genes analizados muestran una disminución de la expresión dependiente del tiempo de cultivo ya en el día 1 en cultivo. Los niveles de expresión de ARNm ponen de manifiesto la pérdida funcional y de viabilidad de los hepatocitos primarios durante el tiempo.
Los hepatocitos aislados se sembraron en gotas de matriz 3D y se hizo un seguimiento de las estructuras celulares de organoides en 3D a lo largo del tiempo. En el día 1 del cultivo, los hepatocitos individuales se suspenden en las gotas de la matriz (Figura 4A). La concentración celular se mantiene intencionalmente baja para proporcionar a los hepatocitos un amplio espacio para crecer. Además, esto nos permite seguir visualmente el crecimiento de los organoides. Los hepatocitos primarios mostraron división celular en los primeros días de cultivo (Figura 4C). Además, mientras que en el día 0 se midieron 30 μm de Hep-Orgs, en el día 2 las Hep-Orgs casi duplicaron sus dimensiones, lo que subraya el crecimiento de tamaño que se mantuvo hasta el día 15 (33,08 μm el día 1; 64,86 μm el día 2; 45,06 μm el día 5; 55,19 μm el día 7; 51,93 μm el día 10; 62,90 μm el Fay 15). En cuanto a la forma de las Hep-Orgs, mientras que el día 1 eran redondas, en los días siguientes alcanzaron la "forma de racimo de uvas" (típica de los organoides hepáticos).
Los hepatocitos sembrados en una matriz 3D permanecen vivos en cultivo durante semanas mostrando una viabilidad del 23% ±10% después de 15 días utilizando el ensayo de azul de tripán (Figura 4B, primera fila). Para validar la proliferación de Hep-Orgs en ratas, se realizó una prueba de EdU el día 15 (Figura 4D). Sin embargo, la tinción de Hoechst mostró un alto número de células individuales en lugar de Hep-Orgs, una actividad proliferativa de los hepatocitos (células verdes) estaba presente, incluso si la incorporación de EdU fue baja (9% ± 7%) (Figura 4B, segunda fila).
Figura 1: Cultivo 2D de hepatocitos primarios en placas recubiertas de colágeno a lo largo del tiempo. Las imágenes se tomaron con un aumento de 20x con (A) microscopía de contraste de fase a las 4 horas después de la colocación de la placa, (B) Día 1, (C) Día 2, (D) Día 3, (E) Día 4, (F) Día 5. En cada imagen se muestra una barra de escala correspondiente a 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Células primarias viables en cultivo 2D en placas recubiertas de colágeno. El gráfico muestra el porcentaje de células viables desde el día 1 hasta el día 5, en comparación con las células viables sembradas en el día 0, considerado como el 100%. Los resultados se informan como réplicas individuales, promedio y SD de 3 experimentos diferentes (* valor p ≤ 0.05; ** valor p ≤ 0.005). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Expresión de ARNm de marcadores hepáticos medida por RT-qPCR en hepatocitos primarios. Los resultados se normalizaron en β-actina y/o GAPDH (genes de limpieza) y se expresan en relación con los hepatocitos primarios recolectados antes de la siembra en el día 0, considerado como 1. Los resultados se informan como promedio ± SD de, al menos, 3 experimentos diferentes (**+ valor p ≤ 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cultivo 3D de hepatocitos en gotas de matriz a lo largo del tiempo. (A) Hepatocitos aislados sembrados en gotas de matriz para Hep-Orgs a largo plazo: en la imagen, las gotas de matriz son visibles en la superficie del pocillo (círculo rojo = una gota). (B) Porcentaje de células viables por azul de tripán y células proliferativas por EdU el día 15 antes del paso. La cuantificación de las células positivas para EdU se realizó mediante el software ImageJ2. Los resultados se informan en porcentaje como promedio±SD de, al menos, 3 experimentos diferentes. (C) Imágenes de contraste de fase del cultivo 3D de Hep-Orgs de rata en diferentes días de crecimiento en cultivo 3D: día 1, 2, 5, 7, 10, 15. Aumento de la imagen 20X. En cada imagen se muestra una barra de escala correspondiente a 50 μm. (D) Ensayo de incorporación de EdU de Hep-Orgs de rata el día 15. Aumento de la imagen 20X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Búferes y composición de medios. La tabla indica el nombre y los componentes (con su concentración final) de todos los tampones y los medios de celda utilizados en el protocolo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Lista de cebadores para ratas. La tabla muestra la lista de cebadores utilizados para los experimentos de RT-qPCR. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Discusión
Los organoides 3D son una frontera para la medicina personalizada y permiten un cultivo de hepatocitos a largo plazo. La calidad de esta técnica innovadora requiere un buen rendimiento de hepatocitos primarios viables y un buen rendimiento de perfusión hepática y aislamiento de hepatocitos. Este antiguo procedimiento sigue siendo muy utilizado; Sin embargo, comprende diferentes pasos que pueden ser desafiantes. Al abordar el procedimiento, experimentamos problemas críticos como la contaminación bacteriana, la baja eficiencia de la digestión hepática, el bajo rendimiento de hepatocitos primarios y la baja viabilidad de los hepatocitos, todo lo cual puede afectar fácilmente el éxito de la técnica. A partir de los protocolos estándar de oro17,18, aquí destacamos cómo superar problemas comunes, aclaramos los pasos más críticos en el aislamiento primario de hepatocitos de rata y resumimos los consejos dispersos que pueden afectar fácilmente el éxito de la técnica en el modelo de rata. Aunque el procedimiento de perfusión hepática es bastante desafiante y exige una experiencia precisa por parte del operador, garantiza resultados de alta calidad en términos de rendimiento, integridad, viabilidad y funcionalidad de los hepatocitos primarios. Estas características son esenciales para las etapas posteriores.
Durante la planificación del proyecto, tuvimos muy en cuenta la lista de verificación de las directrices PREPARE21. Se prestó especial atención a la literatura anterior, comparando diferentes trabajos previos y entrando en contacto con algunos de los autores (lista de verificación de las directrices PREPARE _topic A1). La herramienta de organoides en sí misma es una forma importante de reducir el número de animales, ya que las células se pueden propagar en cultivo hasta por 7 meses (lista de verificación de las pautas PREPARE _topic A3). A través del diálogo con el personal del animalario, seleccionamos a un técnico experimentado que brindó asistencia con el procedimiento y contribuyó a evitar el uso de animales de experimentación excedentes (lista de verificación de las pautas PREPARE _topic B5). Se obtuvo una bomba peristáltica adecuada, necesaria para llevar a cabo la perfusión hepática (lista de verificación de las guías PREPARE _topic B6).
Las publicaciones de Ng17 y Shen18 son las más recientes que describen el procedimiento en ratas. Las principales cuestiones abordadas por el presente protocolo, no tratadas por los anteriores, se refieren al uso de soluciones comerciales y a la optimización de una canulación precisa de la vena porta que asegure los pasos óptimos de perfusión y digestión manteniendo el hígado in situ. Mientras que los protocolos de Shen18 y Ng17 utilizaban soluciones caseras, nuestro protocolo se basa en soluciones comerciales de perfusión y digestión para reducir la variabilidad en la preparación del tampón. Un exceso de concentración de enzimas digestivas podría ser agresivo hacia los hepatocitos y afectar su calidad y viabilidad celular25. El uso de soluciones comerciales es crítico para mejorar la reproducibilidad del protocolo, garantizando la estandarización. Además, el protocolo realizado por Ng17 puede ser desafiante debido a la necesidad de extirpar el hígado antes de la fase de digestión. Nuestro protocolo se basa en la perfusión y digestión del hígado sin extirparlo hasta que se hayan realizado ambas fases, esto simplifica el procedimiento. En términos de rendimiento celular y viabilidad celular, los resultados de nuestro protocolo son comparables a trabajos anteriores.
La limpieza y desinfección de los tubos de perfusión, antes y después del procedimiento, junto con la desinfección de la piel antes de iniciar la cirugía, son muy importantes para limitar la contaminación bacteriana. Además, el secado completo de la tubería después de la limpieza con etanol y el posterior lavado con el medio es crucial para aumentar la viabilidad de la célula. De hecho, incluso una sola inyección de etanol en el hígado causaría la muerte celular durante el procedimiento.
La temperatura de la solución inyectada es importante, pero también hay que tener en cuenta la sensibilidad de la enzima colagenasa a la temperatura. Por esta razón, precalentamos el tampón de perfusión a 42 °C antes de comenzar el procedimiento quirúrgico, mientras que colocamos el tampón de digestión en el baño de calentamiento solo durante el paso de perfusión. La adición de una trampa de burbujas al tubo aguas arriba del catéter evita que las burbujas escapadas lleguen al catéter, así como que el aire ingrese al hígado cuando se agota la solución de perfusión17.
La composición del tampón, la presión de perfusión y el caudal deben estar dentro del rango adecuado17. Experimentamos que la baja presión y el bajo caudal causan un bajo rendimiento e influyen negativamente en la viabilidad de la celda, ya que el tampón no podía llegar a los recipientes pequeños. Por otro lado, el caudal no debe ser demasiado alto para mantener intacta la cápsula de Glisson. Dado que la integridad de la adhesión celular requiere Ca2 + 18, el tampón de perfusión es una solución libre de Ca2+ que contiene EDTA para atacar los puentes que contienen calcio entre las células, por lo que es esencial para eliminar el calcio y lavar la sangre del hígado. El tiempo de perfusión de 8-15 min con un caudal de 10 mL/min es crucial para permitir que todas las células sean alcanzadas por la solución libre de EDTA, Ca2+. Una perfusión subóptima podría conducir a una disminución de la digestión.
El tampón de digestión contiene Ca2+, ya que la colagenasa que digiere la matriz de colágeno es dependiente del Ca2+ . El caudal del tampón de digestión debe mantenerse al menos en 20 mL/min y el tiempo depende de la capacidad de colagenasa. En el caso del tampón de digestión específico que utilizamos, necesitamos perfundir 15 min para un volumen final de 300 mL de solución. Si la digestión es incompleta, se mantienen las uniones célula-célula y la presión mecánica sucesiva dañará las células, reduciendo la viabilidad. El aumento lento del caudal contribuye a la reducción del impacto estresante de la perfusión en las células. Durante la cirugía, nos centramos en el pinzamiento transitorio de la vena cava inferior y la posterior hinchazón del hígado: este paso mejoró significativamente tanto la eficiencia de la digestión como la recuperación celular. Al final de la digestión, el hígado debe tener un aspecto marrón claro y suave. A medida que se completa la resección hepática, el lavado del hígado aislado en PBS +3% P/S reduce el título bacteriano y ayuda a evitar la contaminación en la siguiente parte del procedimiento.
Para los pasos de aislamiento de hepatocitos bajo el capó biológico, el uso de pipetas serológicas de 25 mL evita la reducción de la viabilidad de los hepatocitos mediante pipetas de menor diámetro. Agregamos un paso opcional para aumentar la producción de hepatocitos primarios, que es el vertido de todo el medio de William sobre el hígado aplastado para repetir el paso de raspado debajo del capó. Este paso se realiza después del filtrado del medio liberado por las células del hígado aislado, y ayuda a limpiar la Petri y recuperar más células de la cápsula hepática. Si es necesario aplicar alta presión para mover los hepatocitos a través de los filtros, la viabilidad celular será baja19.
La incapacidad de los hepatocitos para ser cultivados como 2D durante más de 2 días nos llevó a encontrar un modelo alternativo de cultivo a largo plazo. Un modelo adecuado para cultivar hepatocitos durante más tiempo es el Hep-Org adulto. En comparación con los hepatocitos 2D, las Hep-Orgs resultaron ser todavía viables y estar en proliferación activa en el día 15, lo que demuestra un potencial a largo plazo.
La perfusión hepática de rata y el posterior aislamiento primario de hepatocitos adultos son los principales pasos preliminares para diferentes aplicaciones. Aunque la reproducibilidad puede ser una limitación de la técnica, ya que el procedimiento implica muchos pasos y variables, prestar atención a la descripción visual del procedimiento ayuda a replicar el método con una alta tasa de éxito. Señalando las etapas críticas y mostrando cómo abordarlas, este protocolo optimiza el procedimiento para el aislamiento primario de hepatocitos de rata y los resultados adecuados para establecer modelos in vitro , como la generación Hep-Orgs, con el fin de estudiar la fisiología y patología hepática.
Divulgaciones
Todos los autores han revelado todos y cada uno de los conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Davide Selvestrel y al profesor Giovanni Sorrentino del SorrentinoLab de la Universidad de Trieste por ayudarnos a realizar el ensayo de proliferación de EdU. El trabajo contó con el apoyo de una subvención ad hoc de la Banca d'Italia y de subvenciones internas del FIF.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| A83-01- Inhibidor de ALK5 IV | doble hélice | T3031 | |
| B27 | Thermofisher Scientific | 0080085SA | |
| CFX Connect Sistema de detección de PCR en tiempo real | Kit de imagen Bio-Rad | ||
| CHIR99021 | Twin Helix | T2310 | |
| Click EdU Alexa 488 | Thermofisher Scientific | C10499 | |
| Colágeno, Tipo I, solución de cola de rata | Merck | C3867-1VL | |
| Dexametasona | Merck | D4902 | |
| EGF | Merck | E9644 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Euroclone | ECS0180L | |
| GELTREX LDEV FREE RGF BME | Thermofisher Scientific | A1413202 | |
| Heparina Sódica 25000 UI/5 ml | B. Braun Melsungen AG | B01AB01 | |
| HGF | Peprotech | 100-39H | |
| Solución de insulina-transferrina-selenio 100x | Thermofisher Scientific | 41400045 | |
| solución de L-glutamina | Euroclone | ECB3000D | |
| Liver Digest Medium | Thermofisher Scientific | 17703-034 | |
| Medio de perfusión hepática | Thermofisher Scientific | 17701038 | |
| suplemento de N2 | Thermofisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetilcisteína | Merck | A9165 | |
| Nicotinamida | Merck | N-0636 | |
| Aminoácidos no esenciales | Merck | M7145 | |
| Normocin | Aurogene | ant-nr-1 | |
| PBS buffer 1X | PanReac AppliChem | A0964,9050 | |
| Solución de penicilina-estreptomicina 100x | Euroclone | ECB3001D | |
| Percoll | Santa Cruz | sc-296039A | |
| Ismatec&comercio; | MS-4/12 Reglo Bomba Digital TNFa | ||
| Peprotech | 300-01A | ||
| Reactivo TRI | Merck | T9424 | |
| Tubo | Ismatec&comercio; | ID.2,79mm | |
| Williams' E Medium, sin glutamina | Thermofisher Scientific | 31415029 | |
| Y27632 | Twin Helix | T1725 |
Referencias
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