Aislamiento de células inmunitarias del cerebro y el cráneo de ratones

El cerebro, el eje central del sistema nervioso, está protegido por el cráneo. Debajo del cráneo hay tres capas de tejido conectivo conocido como meninges: la duramadre, la aracnoides y la piamadre. El líquido cefalorraquídeo (LCR) circula en el espacio subaracnoideo entre la aracnoidea y la piamadre, amortiguando el cerebro y también eliminando los desechos a través del sistema glinfático ^1,2. En conjunto, esta arquitectura única proporciona un entorno seguro y de apoyo que mantiene la estabilidad del cerebro y lo protege de posibles lesiones.

Durante mucho tiempo se ha considerado que el cerebro es inmunoprivilegiado. Sin embargo, esta noción ha sido parcialmente abandonada ya que la creciente evidencia indica que, además de la microglía residente en el parénquima, los bordes del cerebro, incluyendo el plexo coroideo y las meninges, albergan una amplia gama de células inmunitarias³. Estas células desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis, la vigilancia de la salud del cerebro y el inicio de la respuesta inmunitaria a las lesiones cerebrales. En particular, los hallazgos recientes indican que el cráneo está involucrado en la inmunidad de las meninges y puede contribuir a la respuesta inmune en el cerebro después de una lesión. En 2018, Herisson et al. realizaron un descubrimiento seminal de los canales vasculares directos que unen la médula ósea del cráneo con las meninges, estableciendo así una ruta anatómica para la migración de leucocitos ^4,5. Más tarde, Cugurra et al. demostraron que muchas células mieloides (por ejemplo, monocitos y neutrófilos) y células B en las meninges no se originan en la sangre⁶. Utilizando técnicas como el trasplante de colgajo óseo de calvaria y los regímenes de irradiación selectiva, los autores proporcionaron pruebas convincentes de que la médula ósea del cráneo sirve como fuente local de células mieloides en las meninges, así como del parénquima del SNC después de una lesión del SNC⁶. Además, otro estudio propuso que las células B meníngeas son suministradas constantemente por la médula ósea del cráneo⁷. Más recientemente, se ha identificado una nueva estructura, denominada salida del manguito aracnoideo (ECA), como una puerta de entrada directa entre la duramadre y el cerebro para el tráfico de células inmunitarias⁸.

Estos emocionantes hallazgos tienen implicaciones importantes para el origen de la infiltración de células inmunitarias en el cerebro lesionado (por ejemplo, después de un accidente cerebrovascular isquémico). Una gran cantidad de evidencia ha indicado que después de un accidente cerebrovascular, muchas células inmunitarias se infiltran en el cerebro, contribuyendo tanto al daño cerebral agudo como a la recuperación crónica del cerebro. La noción convencional es que estas células son leucocitos circulantes en la sangre que se infiltran en el cerebro, lo que se ve facilitado en gran medida por el daño de la barrera hematoencefálica inducido por un accidente cerebrovascular. Sin embargo, esta noción ha sido cuestionada. En un estudio, las células inmunitarias en el cráneo y la tibia de los ratones se etiquetaron de manera diferente, y a las 6 horas después del accidente cerebrovascular, se encontró una disminución significativamente mayor de neutrófilos y monocitos en el cráneo en comparación con el cráneo. la tibia y más neutrófilos derivados del cráneo estaban presentes en el cerebro isquémico. Estos datos sugieren que en la fase aguda del accidente cerebrovascular, los neutrófilos en el cerebro isquémico se originan principalmente en la médula ósea del cráneo⁴. Curiosamente, la peste porcina clásica puede guiar esta migración. De hecho, dos informes recientes demostraron que el LCR puede transmitir directamente señales de señalización desde el cerebro a la médula ósea del cráneo a través de los canales del cráneo, e instruir la migración celular y la hematopoyesis en la médula ósea del cráneo después de una lesión del SNC ^9,10.

A la luz de estos hallazgos recientes, se ha vuelto importante analizar los cambios en las células inmunitarias tanto en el cerebro como en la médula ósea del cráneo, al estudiar la respuesta inmunitaria a los trastornos cerebrales. En este tipo de investigaciones, se necesita un número suficiente de células inmunitarias de alta calidad para los análisis posteriores, como la clasificación de células, el análisis de citometría de flujo y la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq). Aquí, el objetivo general es presentar dos procedimientos optimizados para preparar suspensiones unicelulares a partir de tejido cerebral y médula ósea del cráneo. Es importante tener en cuenta que la calvaria (hueso frontal, hueso occipital y huesos parietales) del cráneo se utiliza normalmente para extraer la médula ósea, y esta médula ósea se conoce específicamente como médula ósea del cráneo a lo largo de este estudio.

El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Duke (IACUC). En el presente estudio se utilizaron ratones machos C57Bl/6 (3-4 meses de edad; 22-28 g). Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Suspensión unicelular del cerebro de ratón

NOTA: La Figura 1 ilustra la descripción general del protocolo de aislamiento de células cerebrales.

1. Anestesia, intubar y asegurar el ratón, como se demostró anteriormente¹¹.
2. Haz una incisión en la parte superior del abdomen a través de la piel y las capas musculares subyacentes, y corta con cuidado el diafragma y las costillas para crear la abertura en la cavidad torácica.
3. Llene una jeringa de 30 ml con PBS frío y conéctela a la aguja de perfusión roma a través de un tubo de silicona. Inserte con cuidado la aguja de perfusión en el ventrículo izquierdo.
4. Realice una pequeña incisión en la aurícula derecha para permitir el drenaje de la sangre y luego perfunda¹² el ratón a un caudal de ~ 10 mL/min durante 3-4 min.
   NOTA: Para mejorar la eliminación de sangre en el cerebro, se puede considerar aumentar el volumen de la solución de perfusión y agregar heparina.
5. Decapita al ratón y haz una incisión en la línea media a través de la piel en la parte superior de la cabeza para exponer el cráneo.
6. Raspe con cuidado cualquier tejido conectivo que cubra el cráneo con pinzas romas.
7. Use tijeras de disección afiladas para cortar cuidadosamente las suturas del cráneo a lo largo de la línea media y en ambos lados, creando un colgajo.
8. Levanta suavemente el colgajo del cráneo para exponer el cerebro y usa pinzas romas para extraer cuidadosamente el cerebro de la cavidad craneal.
9. Sumerja el cerebro en una placa de Petri que contenga PBS helado y elimine los tejidos meningales restantes.
   NOTA: Para preservar mejor la viabilidad celular, se recomienda realizar todos los pasos siguientes en hielo o a 4 °C.
10. Coloque el cerebro en un homogeneizador Dounce de vidrio preenfriado de 15 mL que contiene 20 mL (cerebro entero) o 12 mL (medio cerebro) de tampón HBSS viejo como hielo.
11. Use el mortero suelto Dounce para disociar suave y lentamente el tejido cerebral con alrededor de 100-120 golpes en hielo.
    NOTA: Este paso es fundamental para obtener una gran cantidad de células cerebrales sanas. Este paso dura aproximadamente 10 min. Detenga la homogeneización cuando no haya trozos sustanciales de tejido cerebral visibles en la suspensión. En este punto, el mortero puede moverse fácilmente hacia abajo sin ninguna fuerza.
12. Filtre la suspensión de tejido cerebral resultante a través de un filtro de células de 70 μm en un tubo de centrífuga de 50 mL.
13. Enjuague el tubo Dounce con 5 mL de HBSS y proceda con la filtración para maximizar la recolección de células.
14. Centrifugar la suspensión de tejido filtrado a 550 x g durante 6 min a 4 °C.
15. Retire el sobrenadante con un aspirador de vacío y vuelva a suspender el pellet de células en 1 ml de solución de gradiente de densidad isotónica al 30%.
    NOTA: Para hacer 15 mL de solución de gradiente de densidad isotónica al 30%, mezcle 4.5 mL de medio de gradiente de densidad 100% de stock, 1.5 mL de PBS al 10× y 9 mL de ddH₂O.
16. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 mL y agregue 9 mL (cerebro completo) o 6 mL (medio cerebro) de solución de gradiente de densidad al 30%.
17. Invierta suavemente el tubo para asegurar una mezcla completa.
18. Centrifugar inmediatamente el tubo a 845 x g con la aceleración y el freno ajustados en el nivel 3, durante 20 min a 4 °C.
19. Retire suavemente el tubo de la centrífuga sin agitar y aspire con cuidado la capa superior de mielina con una punta de 1 ml conectada al vacío.
    NOTA: Es de vital importancia no alterar esta capa. Cualquier mielina restante puede afectar negativamente a la salud celular y comprometer los análisis posteriores.
20. Aspire el sobrenadante, dejando atrás 1-2 mL, y vuelva a suspender el pellet celular con un mínimo de 10 mL de HBSS frío.
21. Centrifugar a 550 x g durante 6 min a 4 °C.
22. Lavar una vez más con un mínimo de 7 mL de HBSS frío.
23. Extraer la mayor cantidad posible de sobrenadante y volver a suspender las células para el análisis de citometría de flujo utilizando 100-200 μL de tampón de citometría de flujo.
    NOTA: El tampón FACS de citometría de flujo utilizado para este estudio contiene 0,5% de BSA y 2 mM de EDTA en 1× PBS. Se recomienda una placa inferior en V de 96 pocillos para la tinción celular para minimizar la pérdida de células durante los pasos de lavado.
24. Realizar análisis de citometría de flujo utilizando un protocolo estándar establecido en laboratorios individuales¹³.
    1. Brevemente, mezcle 80 μL de suspensión celular con 20 μL de la mezcla de anticuerpos en una placa inferior en V de 96 pocillos e incube durante 25 minutos a 4 °C.
    2. Lavar con 200 μL de tampón FACS y luego resuspender las células con 100 μL de HBSS más reactivo de tinción de viabilidad celular.
    3. Después de una incubación de 15 minutos a 4 °C, lavar con tampón FACS y resuspender las células en 200 μL de tampón FACS para el análisis de citometría de flujo.

2. Preparación de suspensión unicelular de médula ósea a partir de calvaria de ratón

NOTA: La Figura 2 muestra la descripción general del procedimiento de aislamiento de médula ósea del cráneo.

1. Perfunda el ratón como se describe en el paso 1.4.
2. Decapita al ratón y haz una incisión en la piel de la línea media del cuero cabelludo para exponer el cráneo.
3. Corte a través del cráneo, comenzando desde el foramen magnum y avanzando a lo largo de los lados laterales de la calvaria con tijeras afiladas. Luego, levante y retire la calvaria.
   NOTA: El cerebro se puede extraer del mismo ratón y procesar mediante el paso 1, lo que permite el análisis de células inmunitarias tanto del cerebro como de la médula ósea del cráneo.
4. Retire con cuidado la duramadre del cráneo bajo un microscopio de disección con pinzas romas.
   NOTA: Es más fácil comenzar en los bordes del hueso occipital, desprenderse lentamente y progresar constantemente hacia el área frontal, trabajando hacia adentro.
5. Coloque la calvaria en el plato sobre hielo y use una pipeta de 1 mL para enjuagar la calvaria, asegurando la eliminación de los residuos de sangre de su superficie.
6. Transfiera el calvario a un plato nuevo con PBS fresco y frío suficiente para sumergir el calvario.
7. Use tijeras estériles para cortar la pantorrilla en fragmentos de aproximadamente 3 mm x 3 mm en PBS frío.
   NOTA: Los métodos de cultivo pueden afectar la eficiencia de la extracción de médula ósea de calvaria. Se recomienda utilizar el mismo método de cultivo para minimizar la variabilidad. También es importante cortar las suturas. La figura 2B ilustra un enfoque.
8. Haga un agujero en el fondo de un tubo de microcentrífuga de 500 μL con una aguja de 18 G.
9. Inserte este tubo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contenga 20 μL de PBS frío.
10. Transfiera los fragmentos de calvaria al tubo de 500 μL.
    NOTA: Los fragmentos óseos deben empaquetarse sin apretar para aumentar la eficiencia de la extracción.
11. Centrífuga a 10.000 x g durante 30 s a 4 °C.
    NOTA: Para maximizar la recuperación celular, use una aguja de 18 G para agitar suavemente los fragmentos de calvaria y repita este paso 1-2 veces más.
12. Vuelva a suspender las células de médula ósea de calvaria recogidas en 500 μL de tampón de lisis de glóbulos rojos e incube a temperatura ambiente durante 30 s.
13. Transfiera la suspensión a un tubo de centrífuga de 15 mL que contenga 4 mL de PBS frío.
14. Centrifugar a 400 x g durante 6 min a 4 °C.
15. Lavar una vez más con 5 mL de PBS frío.
16. Vuelva a suspender el pellet de celda en un tampón adecuado. Para la citometría de flujo, normalmente utilizamos 500 μL de tampón FACS.
17. Para el análisis de citometría de flujo, realice el recuento de células y utilice aproximadamente 1 x 10⁶ células para la tinción de anticuerpos.
    NOTA: Asegúrese de incluir el paso de bloqueo Fc antes de la tinción de anticuerpos¹³.

Para preparar células inmunitarias a partir del tejido cerebral del ratón, el protocolo generalmente produce células con alta viabilidad (84,1% ± 2,3% [media ± DE]). Aproximadamente el 70%-80% de estas células son CD45 positivas. En el cerebro normal del ratón, casi todas las células CD45+ son microglía (CD45LowCD11b+), como se esperaba. Este protocolo se ha utilizado en el laboratorio para diversas aplicaciones, incluido el análisis de citometría de flujo, la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y el análisis scRNA-seq. A modo de ejemplo, se realizó un análisis de citometría de flujo en un modelo de ictus (Figura 3). Los ratones fueron sometidos a un modelo de accidente cerebrovascular transitorio, oclusión de la arteria cerebral media (OAMI) con filamento de 30 min14. El día 3 después del accidente cerebrovascular, se prepararon células de cerebros de ratón y se tiñeron con marcadores de superficie de células inmunitarias comunes. La estrategia de compuerta se muestra en la Figura 3A. De acuerdo con investigaciones previas13,15, se observó un marcado aumento de las célulasaltas CD45 en el hemisferio ipsilateral (Figura 3B,C), lo que indica la infiltración de la célula inmunitaria en el cerebro.

Para el protocolo de médula ósea del cráneo, se logró consistentemente un rendimiento sustancial de células de médula ósea del cráneo (alrededor de 2 x 106 células) con una excelente viabilidad (93,8% ± 1,8% [media ± DE]). Como era de esperar, la mayoría de estas células son CD45 positivas. Para ilustrar la utilidad de este protocolo, se realizó un estudio comparativo para caracterizar la composición de células inmunitarias tanto en el fémur como en la médula ósea del cráneo de ratones naïve (Figura 4). Como se muestra en los gráficos representativos, la composición de células inmunitarias fue similar entre el fémur y la médula ósea del cráneo (Figura 4A,B). Curiosamente, la frecuencia de neutrófilos parece ser mayor en el fémur que en el hueso del cráneo (Figura 4C). Sin embargo, este hallazgo requiere una mayor validación, ya que el tamaño de la muestra fue pequeño para este estudio piloto.

Figura 1: Descripción general del protocolo de aislamiento de células cerebrales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Protocolo de aislamiento de células de médula ósea de cráneo. (A) Descripción general del procedimiento. (B) El patrón recomendado para el corte del cráneo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Análisis representativo de citometría de flujo de las células inmunitarias en el cerebro del ictus. (A) Un ejemplo de la estrategia de compuertas. Los gráficos muestran las siguientes poblaciones de células inmunitarias: microglía (CD45LowCD11b+), células NK (CD45HighNK1.1+), neutrófilos (CD45HighLy6G+), células T (CD45HighCD11b-CD3+) y células B (CD45HighCD11b-CD19+). Este ejemplo representa un análisis de las células inmunitarias cerebrales en el hemisferio ipsilateral el día 3 después de un accidente cerebrovascular. (B,C) Infiltración de células inmunitarias en el cerebro del accidente cerebrovascular. Los ratones machos jóvenes se sometieron a una oclusión transitoria de la arteria cerebral media (MCAO). El día 3, se recolectaron los cerebros y se dividieron en hemisferios izquierdo (contralateral) y derecho (ipsilateral). Las células cerebrales se prepararon de acuerdo con el protocolo descrito y luego se sometieron a un análisis de citometría de flujo. Los gráficos representativos ilustran el aumento de las células inmunitarias infiltrantes en el hemisferio ipsilateral (célulasaltas CD45; B). Los datos cuantitativos se muestran en los gráficos de barras (C). El número de células se calculó en función del recuento de células y el volumen registrados en los datos de citometría de flujo. Los datos se presentan como media ± SEM. *p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis representativo de citometría de flujo de las células de la médula ósea del cráneo. Para la comparación, se incluyó el análisis de las células de la médula ósea del fémur. Los gráficos muestran las siguientes poblaciones de células inmunitarias: células NK (CD45+NK1.1+), neutrófilos (CD45+CD11b+Ly6G+), células T (CD45+CD11b-CD3+) y células B (CD45+CD11b-CD19+). (A) Parcelas representativas de la médula ósea del fémur. (B) Parcelas representativas de la médula ósea del cráneo. (C) Comparación de la composición de células inmunitarias entre el fémur y la médula ósea del cráneo. Los datos se presentan como media ± SEM. *p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Ninguno.