Hemos establecido un ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para monitorear los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas. Con este ensayo, describimos un protocolo para medir cuantitativamente el nivel de estos acoplamientos interorgánulos en HEK293T células, bajo la condición de tratamiento químico.
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Artículo de método
Ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para medir los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas
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En este artículo
Resumen
Resumen
Los sitios de contacto entre el retículo endoplásmico (RE) y las mitocondrias desempeñan un papel fundamental en la salud y la homeostasis celular, como la regulación del Ca2+ y la homeostasis lipídica, la dinámica mitocondrial, la biogénesis de autofagosomas y mitofagosomas y la apoptosis. La falta de mantenimiento del acoplamiento normal entre el RE y la mitocondria está implicada en muchas enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica y la paraplejia espástica hereditaria. Es de considerable importancia explorar cómo la desregulación de los contactos ER-mitocondriales podría conducir a la muerte celular y si la reparación de estos contactos al nivel normal podría mejorar las condiciones neurodegenerativas. Por lo tanto, los ensayos mejorados que miden el nivel de estos contactos podrían ayudar a esclarecer los mecanismos patogénicos de estas enfermedades. En última instancia, el establecimiento de ensayos sencillos y fiables facilitará el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Aquí describimos un ensayo de luciferasa dividida para medir cuantitativamente el nivel de contactos ER-mitocondrias en células vivas. Este ensayo se puede utilizar para estudiar el papel fisiopatológico de estos contactos, así como para identificar sus moduladores en el cribado de alto rendimiento.
Introducción
Las interacciones entre el RE y las mitocondrias son vitales para la homeostasis celular y la supervivencia 1,2,3,4. La evidencia previa indica que cualquier tipo de interrupción o desregulación en los sitios de contacto entre el RE y las mitocondrias puede contribuir a varias enfermedades neurodegenerativas, metabólicas y cardiovasculares, así como al cáncer 5,6,7,8,9,10.
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Protocolo
1. Mantenimiento de celdas y siembra (Día 1)
- Mantener HEK293T células en medios de cultivo celular que contengan el medio Eagle Modified de Dulbecco (DMEM) con un 10% de suero fetal bovino (FBS) (en placas de cultivo de 100 mm) en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2.
- Antes de comenzar, verifique la confluencia de la placa observándola bajo el microscopio. Cuando las células alcancen aproximadamente el 80-90% de confluencia, prepárese para sembrar las células en una placa de cultivo de 6 pocillos retirando el medio y lavando con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato....
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Resultados
Hemos utilizado el protocolo descrito anteriormente para medir el nivel de contactos ER-mitocondrias tras la adición de tres compuestos conocidos por inhibir GTPasas específicas. CDC42, Rho y RAC son GTPasas que promueven la polimerización de actina28 cuando se activan y son inhibidas por ZCL278, Rhosin y Ehop-016, respectivamente24. HEK293T células transfectadas con Split-Rluc se trataron con DMSO (control), ZCL278 (50 μM), Rhosin (50 μM) o Ehop-016 (25 μM) y se i.......
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Discusión
Hemos utilizado un ensayo de reensamblaje de Renilla luciferasa 8 dividido (ensayo Rluc dividido) para cuantificar el nivel de acoplamientos RE-mitocondrias. En este estudio, hemos modificado el constructo 24 original de split-Rlucgenerando un único vector, pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry, que codifica cada componente split-Rluc (MitoRlucN y Rluc.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Dr. Jeffrey Golden (Cedars-Sinai Medical Center) por la revisión crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado en parte por el Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS, R01NS113516).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo de microcentrífuga SafeSeal de 1,7 ml | Sorenson | 16070 | |
| tratada TC | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| 10 mL Puntas de pipeta OneTip | USA Scientific | 1110-3700 | |
| 10 μ L puntas de pipeta OneTip | USA Scientific | 1110-3700 | |
| 20-200 μ L Puntas biseladas OneTip | USA Scientific | 1111-1210 | |
| 50 mL Tubo cónico de polipropileno | Falcon | 352070 | |
| Bastidores de microtubos con aletas de 96 pocillos | ThermoFisher Scientific | 8770-11 | |
| Placa de 96 pocillos TC Tratados | USA Scientific | CC7682-7596 | |
| 100 mm x 20 mm Plato tratado con TC | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 1250 μ L Tips OneTip | USA Scientific | 1112-1720 | |
| Centrífuga 5910 Ri - Centrífuga refrigerada | Eppendorf | 5943000131 | |
| dimetilsulfóxido, anhidro, ≥ 99.9% | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| DMEM, alto contenido de glucosa | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DPBS, sin calcio, sin magnesio | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| EHop 016 | Bio-Techne Tocris | 6248 | Disolver en DMSO; almacenar a -70 °C C |
| EnduRen Sustrato de celda viva | Promega | E6481 | Almacene alícuotas a -70 ° C |
| Eppendorf 2-20 μ L pipeta | Eppendorf | 3123000039 | |
| Eppendorf Research plus 100-1000 μ Pipeta L | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research Plus 1-10 µ Pipeta L | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus 12 canales | Eppendorf | 3125000028 | |
| Eppendorf Research plus 200 μ Pipeta L | Eppendorf | ||
| Suero fetal bovino, calificado, regiones aprobadas por el USDA | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubadora, 184 L, acero inoxidable pulido | ThermoFisher Scientific | 381 | |
| Contador manual | Sigma-Aldrich | HS6594 | |
| HEK 293T Celdas | ATCC | CRL-3216 | |
| Hemacitómetro - Neubauer Bright Line, cámara de doble recuento | LW Scientific | CTL-HEMM-GLDR | |
| Tampón Invitrogen TE | ThermoFisher Scientific | 8019005 | |
| Microscopio | Zeiss | Axiovert 25 CFL | |
| Mini centrífuga | Benchmark Scientific | C1012 | |
| Rack Multi Tube para tubos cónicos de 50 ml, cónicos de 15 ml y microcentrífugas | Boekel Scientific | 120008 | |
| PEI MAX - Clorhidrato de polietileno lineal de grado de transfección (MW 40,000) | Polysciences | 24765-100MG | |
| Pipet-Aid XP | USA Scientific | 4440-0101 | |
| Hidrobromuro de poli-D-lisina | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Clorhidrato de rosina | Bio-Techne Tocris | 5003 | Disolver en DMSO; almacenar a -70 & grados; C |
| Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Varioskan LUX lector de microplacas multimodo | ThermoFisher Scientific | VL0000D0 | |
| Vortex | ThermoFisher Scientific | 2215365 | nivel 8 |
| Sistema de aspiración al vacío VWR | VWR 75870-734 | ||
| ZCL 278 | Bio-Techne Tocris | 4794 | Disolver en DMSO; almacenar a -70 °C; C |
Referencias
- Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs. Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).
- Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. ER-mitoc....
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