Artículo de método

Ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para medir los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas

2.8K vistas

⸱

DOI:

10.3791/66862

⸱

11 de octubre de 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Science Education, College of Medicine, Charles R. Drew University of Medicine and Science

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Hemos establecido un ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para monitorear los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas. Con este ensayo, describimos un protocolo para medir cuantitativamente el nivel de estos acoplamientos interorgánulos en HEK293T células, bajo la condición de tratamiento químico.

Resumen

Los sitios de contacto entre el retículo endoplásmico (RE) y las mitocondrias desempeñan un papel fundamental en la salud y la homeostasis celular, como la regulación del Ca2+ y la homeostasis lipídica, la dinámica mitocondrial, la biogénesis de autofagosomas y mitofagosomas y la apoptosis. La falta de mantenimiento del acoplamiento normal entre el RE y la mitocondria está implicada en muchas enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica y la paraplejia espástica hereditaria. Es de considerable importancia explorar cómo la desregulación de los contactos ER-mitocondriales podría conducir a la muerte celular y si la reparación de estos contactos al nivel normal podría mejorar las condiciones neurodegenerativas. Por lo tanto, los ensayos mejorados que miden el nivel de estos contactos podrían ayudar a esclarecer los mecanismos patogénicos de estas enfermedades. En última instancia, el establecimiento de ensayos sencillos y fiables facilitará el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Aquí describimos un ensayo de luciferasa dividida para medir cuantitativamente el nivel de contactos ER-mitocondrias en células vivas. Este ensayo se puede utilizar para estudiar el papel fisiopatológico de estos contactos, así como para identificar sus moduladores en el cribado de alto rendimiento.

Introducción

Las interacciones entre el RE y las mitocondrias son vitales para la homeostasis celular y la supervivencia 1,2,3,4. La evidencia previa indica que cualquier tipo de interrupción o desregulación en los sitios de contacto entre el RE y las mitocondrias puede contribuir a varias enfermedades neurodegenerativas, metabólicas y cardiovasculares, así como al cáncer 5,6,7,8,9,10. Por ejemplo, un aumento anormal de la absorción de Ca2+ en las mitocondrias puede conducir a la muerte celular al abrir los poros de transición de permeabilidad de las mitocondrias, que se observan comúnmente en algunos modelos de enfermedad de Alzheimer 5,11. Del mismo modo, la reducción de los contactos entre el RE y las mitocondrias puede dar lugar a una disminución de la producción de ATP y a un deterioro de la ingesta de Ca2+, como se observa en modelos de esclerosis lateral amiotrófica 5,11,12. A medida que se realizan más estudios en el ámbito de los contactos entre el RE y las mitocondrias, se descubren proteínas y genes adicionales relacionados con la enfermedad que podrían afectar a estos contactos. A pesar de los conocimientos y las pruebas actuales que muestran el papel de los sitios de contacto entre el RE y las mitocondrias, aún se necesita mucho trabajo para dilucidar cómo estos contactos podrían conducir a la pérdida de la función celular y, en última instancia, a la muerte celular.

Se han desarrollado varios métodos para evaluar la proximidad de las dos membranas, la morfología estructural y la distancia entre los dos sitios de contacto de los orgánulos 3,4,13. Los enfoques para monitorear el acoplamiento ER-mitocondrias incluyen imágenes basadas en marcadores de fluorescencia 14,15, imágenes basadas en reporteros FRET16 e imágenes basadas en sondas de fluorescencia dividida17,18, que utilizan epifluorescencia y microscopía confocal. La microscopía de superresolución y la microscopía de resolución atómica también son herramientas poderosas para visualizar con precisión los contactos entre orgánulos, aunque su utilización en el análisis de sitios de contacto es todavía limitada, ya que requieren microscopios altamente dedicados y experiencia técnica19. Además, la microscopía electrónica de transmisión (TEM), la microscopía electrónica de barrido (SEM) y otras técnicas de EM como la tomografía electrónica (ET) y la criomicroscopía electrónica, se utilizan comúnmente, ya que proporcionan imágenes ultraestructurales de alta resolución de los sitios de contacto, que a menudo son imposibles de explorar utilizando otros enfoques experimentales 20,21,22. Sin embargo, estos métodos basados en EM son una técnica de muy bajo rendimiento que también puede verse afectada por los procedimientos de fijación química. Más recientemente, se han utilizado métodos basados en el marcaje de proximidad para detectar sitios de contacto, así como para identificar nuevas proteínas en el sitio de contacto. Por ejemplo, se ha utilizado el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) para cuantificar las proximidades de los orgánulos23,24, mientras que una versión revisada del ensayo de ascorbato peroxidasa (APEX) se ha utilizado para identificar nuevas proteínas en el sitio de contacto25,26. Es importante reconocer que todos estos métodos descritos anteriormente tienen fortalezas y limitaciones intrínsecas en la detección de los contactos entre los orgánulos. Por lo tanto, se requiere el emparejamiento de diferentes técnicas para obtener una interpretación completa de los sitios de contacto de los orgánulos.

Previamente hemos establecido el ensayo de reensamblaje de Renilla luciferasa 8 dividido (ensayo Split-Rluc) para monitorizar el nivel de contactos entre el RE y las mitocondrias en la membrana (Figura 1A)24,26,27. En resumen, cada mitad dividida de Renilla luciferasa se conjuga con una secuencia dirigida a RE o mitocondrias. Cuando se transfectan juntas, cada mitad dividida de la enzima se expresa en el RE o en la membrana mitocondrial. Cuando el RE y las mitocondrias se colocan muy cerca uno del otro, las mitades divididas se unen y reconstituyen toda la enzima con actividad luciferasa. Para la construcción split-Rluc, utilizamos Renilla luciferasa 8 (Rluc8) en pBAD/Myc-His27 para la plantilla inicial. El sitio de división (entre aminoácidos 91 y 92) se determinó con base en reportes previos27. Para la mitad N-terminal de la Rluc8, las secuencias de ADN de los aminoácidos 1-91 de la Rluc8 se fusionaron con el extremo 3' de la etiqueta FLAG y la secuencia de diana mitocondrial AKAP1 del ratón en el vector TOPO pcDNA3.1 mediante PCR27. Para la mitad C-terminal dirigida al RE, las secuencias de ADN que codifican los aminoácidos 92-311 se fusionaron con el extremo 5' de la etiqueta myc y la secuencia de localización del ER UBC6 de la levadura. Aquí, hemos mejorado la construcción del plásmido Rluc dividido de modo que las mitades divididas de la luciferasa Renilla se expresan en un solo vector (pCAG) bajo el mismo promotor y posteriormente se dividen en dos fragmentos a medida que T2A, una secuencia de péptido 2A autoescindido del virus Thosea asigna, se inserta entre las dos mitades divididas (Figura 1B). El mapa y las secuencias de ADN plasmídico se proporcionan en el Archivo Suplementario 1 y en la Figura Suplementaria S1. Utilizando este sistema, hemos medido los efectos de tres sustancias químicas (inhibidoras de las GTPasas implicadas en la polimerización de actina) en los contactos ER-mitocondrias. Este ensayo Split-Rluc es un sistema de ensayo simple pero robusto para el cribado de alto rendimiento para moduladores de contacto entre orgánulos24.

Protocolo

1. Mantenimiento de celdas y siembra (Día 1)

  1. Mantener HEK293T células en medios de cultivo celular que contengan el medio Eagle Modified de Dulbecco (DMEM) con un 10% de suero fetal bovino (FBS) (en placas de cultivo de 100 mm) en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2.
  2. Antes de comenzar, verifique la confluencia de la placa observándola bajo el microscopio. Cuando las células alcancen aproximadamente el 80-90% de confluencia, prepárese para sembrar las células en una placa de cultivo de 6 pocillos retirando el medio y lavando con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.
  3. Retire el DPBS de la placa de cultivo y trate las células con 1 mL de rojo fenol de tripsina-EDTA al 0,05%. Incubar durante 3 minutos, luego sacar la placa de la incubadora y agregar 9 mL de medio de cultivo (DMEM con 10% de FBS) para detener la reacción de tripsina. Pipetea lentamente hacia arriba y hacia abajo para asegurarte de que se desprendan las células que aún estén adheridas a la placa. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 mL.
  4. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Retire el medio y vuelva a suspender los gránulos celulares con 1 mL de medio fresco (DMEM + 10% FBS).
  5. Cuente el número de células con un hemocitómetro.
    1. Asegure una distribución uniforme de las células girando suavemente el tubo. Saque inmediatamente 10 μL de la suspensión celular y colóquela en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Agregue 90 μL de medio al mismo tubo.
    2. Después de mezclar suavemente las células y los medios, tome la suspensión celular y aplique 10 μL en cada una de las cámaras del hemocitómetro pipeteando suavemente por debajo del cubreobjetos.
    3. Usando un objetivo 10x, enfoque las líneas de la cuadrícula del hemocitómetro bajo un microscopio. Una vez enfocado, cuente el número de celdas en un conjunto de 16 cuadrados (4 x 4 cuadrados) usando un contador de cuentas. Repita hasta que se cuenten los cuatro conjuntos de 16 cuadrados.
    4. Calcule el número total de células/ml tomando el recuento promedio de células (de cada uno de los 16 cuadrados de las esquinas) y multiplicándolo por 105.
      NOTA: En lugar de usar un hemocitómetro para contar células, se puede usar un contador de células automatizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  6. Una vez completado el conteo de células, prepárese para colocar las células en una placa de 6 pocillos a 7,5 × 105 celdas/pocillo de densidad con 2 mL de medio/pocillo. En un tubo de 50 mL, agregue el volumen necesario de células junto con 13 mL de medio. Dispense 2 mL de la suspensión celular diluida en cada uno de los 6 pocillos.
    1. Antes de colocar la siembra, calcule el número de celdas necesarias para 7.5 × 105 celdas/pocillo usando C1V1 = C2V2 donde C1 es el recuento inicial de células (número de celdas/mL), V1 es el volumen necesario de la suspensión celular inicial, C2 es la densidad de celdas objetivo deseada (número de celdas/mL), y V2 es el volumen final necesario para la siembra de células.
  7. Después de la dispensación, golpee suavemente la placa por todos los lados para esparcir las células y luego colóquela en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2 durante la noche.

2. Transfección celular mediada por polietileneimina (PEI) y siembra celular posterior a la transfección (Día 2)

  1. Retire la placa de 6 pocillos de la incubadora y aspire los medios de cultivo existentes de cada pocillo. Agregue 2 mL de medio fresco por pocillo.
  2. Transfecte las células con ADN plasmídico Rluc dividido (pCAG-Mito,Rluc, N-T2A-R,luc CER-IRES-mCherry) disuelto en tampón TE (pH 8.0).
    1. Para cada pocillo, mezcle el ADN (750 ng) y el PEI (proporción de ADN/PEI = 1:3) en 200 μL de DMEM en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Agite rápidamente el ADN/PEI en el nivel 8 durante aproximadamente 2 s para asegurarse de que se mezclan bien y forman un complejo. Después de eso, gírelo hacia abajo en una mini centrífuga brevemente (<3 s).
    2. Deje que la mezcla de ADN/PEI se incube a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego agregue la mezcla (dejándola caer) a la superficie del medio de cultivo en la placa de 6 pocillos que contiene las células. Golpee suavemente la placa (para distribuir uniformemente la mezcla) e incube en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2 durante 6 h.
  3. Durante la incubación, prepare una placa de 96 pocillos recubierta de poli-D-lisina (PDL) añadiendo primero 70 μL de PDL (50 μg/mL en DPBS) a cada pocillo e incubando en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2 durante al menos 1 h. Retire la solución de PDL y luego lave cada pocillo 2 veces con 100 μL de DPBS. Al final del segundo lavado, asegúrese de que se hayan eliminado todos los DPBS restantes.
  4. A las 6 h después de la transfección, prepárese para sembrar las células transfectadas en una placa de 96 pocillos recubierta de PDL.
    1. Extraiga la placa de 6 pocillos que contiene las células transfectadas de la incubadora, aspire el medio y lave cada pocillo con 2 ml de DPBS. Después de retirar el DPBS, añadir 350 μL de rojo de fenol Trypsin-EDTA al 0,05% e incubar durante 1-2 min. Para detener la reacción de tripsina, agregue 1,7 mL de medio a cada pocillo.
    2. Después de transferir las células junto con el medio a un tubo de 50 ml, haga girar el tubo a 300 × g durante 5 minutos en una centrífuga de mesa. Aspire el medio y vuelva a suspender el pellet celular con 1 mL de medio fresco. Cuente el número de células usando un hemocitómetro (como se describe en el paso 1.5).
  5. Siembre las células en una placa de 96 pocillos recubierta de PDL a una densidad de 4 × 104 células/pocillo en 100 μL de medio de cultivo. Para esto, en un tubo de 50 mL, agregue el volumen necesario de células (consulte a continuación el cálculo) junto con el volumen apropiado de medio (12 mL de volumen total). Con una pipeta multicanal, dispense 100 μL de la suspensión celular diluida en cada uno de los 96 pocillos. Incubar las células durante 18 h en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2.
    1. Calcule el número de celdas necesarias para 4 × 104 celdas/pocillo usando C1V1 = C2V2 donde C1 es el recuento inicial de células (número de células/mL), V1 es el volumen necesario de la suspensión celular inicial, C2 es la densidad celular objetivo deseada (número de células/mL) y V2 es el volumen final necesario para la siembra de células.

3. Tratamiento químico y ensayo de luciferasa en células vivas (Día 3)

  1. En un tubo de microfuga de 1,7 mL, prepare las tres soluciones frescas de 50 μM de Rhosin (50 mM de caldo en DMSO), 25 μM de Ehop-016 (25 mM de caldo en DMSO) y 50 μM de ZCL278 (50 mM de caldo en DMSO) diluyendo cada solución madre (50 mM de Rhosin, 25 mM de Ehop-016 y 50 mL de ZCL278; todas en DMSO) 1:1.000 en la cantidad requerida (50 μL/pocillo × número de pocillos) de medios de cultivo. A cada solución, añadir sustrato de células vivas (50 mM de stock en DMSO) para Renilla luciferasa diluido 1:2.000 hasta una concentración final de 25 μM. Para hacer soluciones de ZCL278 de 0,5, 5 y 50 μM, realice diluciones en serie utilizando los 50 μM iniciales de ZCL278 en medios de cultivo.
    NOTA: Si se desea que el tiempo de incubación del producto químico sea inferior a 1-1,5 h, las células pueden preincubarse con sustrato de células vivas (para la luciferasa Renilla ) durante 1-1,5 h antes de tratarlas con cada producto químico. Añadimos productos químicos y sustrato de células vivas simultáneamente para optimizar el protocolo de cribado de fármacos de alto rendimiento.
  2. Retire el medio de cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene las células transfectadas y agregue 50 μL de mezcla de medio químico y de sustrato a cada pocillo.
  3. Después de incubar las células durante 1 h, 2 h o 5 h, saque la placa de cultivo de la incubadora, cárguela en el lector de placas de luminiscencia y mida la luminiscencia.
    1. Antes de comenzar, asegúrese de que el lector de placas esté encendido. Acceda al software del lector de microplacas y cree un nuevo archivo haciendo clic en Nueva sesión. Establezca la temperatura del lector de placas en 37 °C haciendo clic en Incubadora, marcando la opción de temperatura y escribiendo 37 °C. En Diseño de placa, elija la opción Desconocido y especifique los pozos que se van a medir haciendo clic y arrastrando.
    2. En Protocolo, haga clic en Luminiscencia y mantenga la configuración predeterminada. Una vez que haya terminado con la configuración, cargue la placa sin la tapa en el lector de placas y elija Run Plate In. Haga clic en Iniciar y aparecerá la ventana de guardar archivo. Guarde el archivo en su escritorio cambiándole el nombre y haciendo clic en Guardar.
      NOTA: La luminiscencia continuará produciéndose durante >24 h después de la adición del sustrato de celda viva.
  4. Una vez completada la lectura, retire la placa del lector de placas y, a continuación, haga clic en Ejecutar placa para volver a colocar el lector. Una vez completado, vuelva a colocar la placa en la incubadora humidificada (37 °C, 5% CO2) hasta la siguiente lectura.
  5. Cuando termine, transfiera los datos de luminiscencia a un programa gráfico para trazar la unidad de luminiscencia relativa (RLU) (eje y) para cada variable (por ejemplo, productos químicos o concentraciones) (eje x) y analizar los datos.

4. Validación del ensayo split-Rluc con otros métodos.

  1. Realizar otros ensayos como el ensayo de ligadura de proximidad (PLA), la microscopía electrónica de transmisión y la monitorización de la absorción de calcio mitocondrial para validar los resultados obtenidos del ensayo de Split-Rluc como se ha descrito anteriormente24.

Resultados

Hemos utilizado el protocolo descrito anteriormente para medir el nivel de contactos ER-mitocondrias tras la adición de tres compuestos conocidos por inhibir GTPasas específicas. CDC42, Rho y RAC son GTPasas que promueven la polimerización de actina28 cuando se activan y son inhibidas por ZCL278, Rhosin y Ehop-016, respectivamente24. HEK293T células transfectadas con Split-Rluc se trataron con DMSO (control), ZCL278 (50 μM), Rhosin (50 μM) o Ehop-016 (25 μM) y se incubaron durante 1 h, 2 h y 5 h. Usando un lector de placas, medimos la actividad de Split-Rluc en puntos de tiempo definidos (Figura 2).

Las células tratadas con rosina (inhibidor de la GTPasa RHO) no mostraron cambios significativos en la actividad de la luciferasa en comparación con las células control tratadas con DMSO a 1 h, 2 h y 5 h del tratamiento (p > 0,9999, p= 0,6956, p > 0,9999) (Figura 2). Estos resultados demuestran que la rhosina no afecta a los contactos entre el RE y las mitocondrias, lo que sugiere que no hay implicación de la actividad de la GTPasa RHO en la regulación de los contactos entre los dos orgánulos.

Por el contrario, el inhibidor de la GTPasa RAC Ehop-016 mostró una actividad de luciferasa significativamente menor que el DMSO a la 1 h, 2 h y 5 h del tratamiento (p = 0,0106, p = 0,0009, p = 0,0024) (Figura 2). Estos datos indican que la actividad de la GTPasa RAC es necesaria para mantener la interacción normal entre el RE y las mitocondrias en la célula.

Finalmente, el inhibidor de CDC42 ZCL278 mostró los cambios más drásticos en la actividad de la luciferasa (Figura 2). Las células tratadas con ZCL278 mostraron una disminución significativa en la actividad de la luciferasa en comparación con el DMSO de control y tuvieron los valores de p más bajos en los tres puntos de tiempo, manteniendo una p < 0,0001 en todo momento. Nuestros datos demuestran una fuerte inhibición del acoplamiento ER-mitocondrias cuando la actividad de la GTPasa CDC42 es bloqueada por ZCL278, lo que es consistente con nuestro informe anterior utilizando el ensayo original de Split-Rluc realizado en células co-transfectadas con dos vectores que codifican cada mitad de la luciferasa dividida por separado24.

Dados los sorprendentes resultados con ZCL278, especialmente en comparación con los otros inhibidores de GTPasa, la actividad de ZCL278 se probó más a fondo a varias concentraciones [0,5 μM, 5 μM, 50 μM] frente a un control DMSO. Las actividades de luciferasa medidas a 1 h, 2 h y 5 h después del tratamiento mostraron una respuesta dependiente de la dosis; 0,5 μM de ZCL278 resultaron en el efecto más débil sobre la actividad de la luciferasa, mientras que 5 μM mostraron una reducción más fuerte y 50 μM mostraron la reducción más fuerte en la actividad de la enzima reconstituida (Figura 3). En conjunto, nuestros resultados muestran que ZCL278 regula a la baja la actividad de Split-Rluc de una manera dependiente de la dosis y, a medida que avanza el tiempo, las concentraciones más altas de ZCL278 (inhibidor de CDC42) aún muestran un cambio significativo en relación con el DMSO de control en comparación con las concentraciones más bajas.

Como una forma de validar nuestro ensayo de Split-Rluc, se pueden realizar ensayos independientes bien establecidos, como el ensayo de ligadura de proximidad (PLA), la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y el monitoreo de la absorción de calcio mitocondrial (Figura 4 y datos no mostrados)24. El isoproterenol, un agonista del receptor adrenérgico β2, que es uno de los compuestos identificados en nuestro cribado de promotores de contacto RE-mitocondrias (Figura 4A), se utilizó para confirmar que la actividad de la luciferasa del Split-Rluc tras el tratamiento con isoproterenol aumentó debido al aumento de los contactos ER-mitocondrias, como lo demuestran los cambios en la intensidad de la señal de PLA, así como la absorción de calcio mitocondrial (Figura 4B-E).

figure-results-1
Figura 1: El ensayo de reensamblaje de Split-R luc. (A) Representación esquemática del ensayo Split-R Luc. Cuando no hay contactos de membrana entre las mitocondrias y el retículo endoplásmico, el Mito-Rluc N y el RlucC-ER no interactúan y, por lo tanto, no hay actividad Rluc8. Sin embargo, la interacción entre el Mito-RlucN y el RlucC-ER, donde el RE y las membranas mitocondriales entran en contacto, da lugar a una actividad enzimática completa, que se detecta mediante la conversión del sustrato en luminiscencia. (B) Mapa esquemático de la construcción de ADN split-Rluc (pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry). (C) Diagrama del flujo de trabajo para el ensayo de Split-Rluc en HEK293T celdas. Abreviaturas: Mito = mitocondrias; RE = retículo endoplásmico; IRES: sitio de entrada ribosómica interna; rb_glob pA, señal de poliadenilación de beta-globina de conejo; T2A, una secuencia de péptido 2A que se escinde automáticamente del virus Thosea asigna. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Las actividades de Split-R luc correspondientes a los niveles de contactos ER-Mito en las células tratadas con inhibidores de la GTPasa. (A-C) Actividades de luciferasa reconstituidas a (A) 1 h, (B) 2 h o (C) 5 h después del tratamiento con DMSO (control), Rhosin [50 μM], Ehop-016 [25 μM] o ZCL278 [50 μM] (n = 12 para cada grupo). Todos los datos se analizaron mediante ANOVA de un factor con comparaciones múltiples. Los valores de p se informan como p > 0,05 (ns), p ≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***), p ≤ 0,0001 (****). Las barras de error indican el error medio ± estándar de medición. Abreviaturas: Mito = mitocondrias; RE = retículo endoplásmico; RLU = unidad de luz relativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Las actividades de split-Rluc miden los niveles de contactos ER-Mito en las células tratadas con ZCL278. (A-C) Actividades de luciferasa reconstituidas a (A) 1 h, (B) 2 h o (C) 5 h después de DMSO (control) o ZCL278 a una concentración de [0,5 μM], [5 μM] o [50 μM] (n = 12 para cada grupo). Todos los datos se analizaron mediante ANOVA de un factor con comparaciones múltiples. Los valores de p se informan como p > 0,05 (ns), p ≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***), p ≤ 0,0001 (****). Las barras de error indican el error medio ± estándar de medición. Abreviaturas: Mito = mitocondrias; RE = retículo endoplásmico; RLU = unidad de luz relativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 4: Validación del ensayo split-Rluc. (A) Un ejemplo de cuantificación de la actividad de Split-Rluc después de tratar células HEK293T con 11 fármacos, incluido el isoproterenol, identificado en un cribado compuesto para promotores de contacto ER-mitocondrias. (B) Un ejemplo de ensayo de ligadura de proximidad en células HeLa que fueron tratadas con DMSO o isoproterenol (1 μM). La señal PLA (rojo) indica un contacto cercano entre ER y Mito. Sec61-GFP (verde): para etiquetar ER; DAPI (azul): núcleo. (C) Cuantificación de la señal de PLA en A (n = 4 experimentos con 77-97 células cada uno; Prueba de Mann-Whitney). (D) Absorción de calcio mitocondrial en respuesta a la histamina (100 μM). Cambio en la intensidad fluorescente de Mito-R-GECO1 (el promedio se tomó en múltiples células HeLa) graficado cada 2,5 s en células tratadas con DMSO o isoproterenol. La flecha indica la adición de histamina. (E) Izquierda: Pico máximo de absorción de calcio mitocondrial en A. Prueba t de dos colas no apareadas (n = 10, DMOS; 14, isoproterenol). Derecha: Tasa de absorción de calcio mitocondrial (como en A; 7,5 a 12,5 s). Prueba de Mann-Whitney (n = 12, DMSO; 11, isoproterenol). Esta figura es una modificación de Lim et al.24. Abreviaturas: RLU = unidad de luz relativa; PLA = ensayo de ligadura de proximidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Resumen de las técnicas actuales para los contactos ER-mitocondrias. Lista de ventajas y limitaciones de cada método. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo Suplementario 1: Archivo zip que contiene la secuencia de ADN (formatos PDF y GBK) de pCAG-MitoRluc N-T2A-R luc CER-IRES-mCherry. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S1: Mapa de pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Hemos utilizado un ensayo de reensamblaje de Renilla luciferasa 8 dividido (ensayo Rluc dividido) para cuantificar el nivel de acoplamientos RE-mitocondrias. En este estudio, hemos modificado el constructo 24 original de split-Rlucgenerando un único vector, pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry, que codifica cada componente split-Rluc (MitoRlucN y RlucCER) y una secuencia de péptido 2A autoescindido del virus Thosea asigna para asegurar la expresión de la misma cantidad de cada mitad dividida de luciferasa. Como sustrato para la luciferasa Renilla, en lugar de celenterazina, se utilizó un sustrato de células vivas modificadas (derivado protegido de la celenterazina; ver la Tabla de Materiales) por las siguientes razones. En primer lugar, a diferencia de la celenterazina que genera autoluminiscencia en un ambiente acuoso (especialmente peor en suero), este derivado protegido genera una autoluminiscencia muy baja (a menudo no detectable) en un medio que contiene un 10% de suero, por lo que su relación señal-fondo es mayor que la generada por la celenterazina. En segundo lugar, a diferencia de la celenterazina, donde la luminiscencia es más fuerte poco después de agregar el sustrato pero comienza a disminuir muy rápidamente, la luminiscencia producida por el sustrato vivo modificado llega a su punto más alto alcanzable aproximadamente 1,5 h después de la adición del sustrato y permanece continua durante más de 24 h. Estos cambios en la cinética de reacción facilitan la medición de la luminiscencia en una placa de pocillos múltiples, lo que es muy útil para el cribado de alto rendimiento. Además, la luminiscencia producida por el sustrato protegido que permanece constante a largo plazo permite la medición de un solo conjunto de muestras en múltiples puntos de tiempo, en lugar de medir múltiples conjuntos de muestras utilizados en varios puntos de tiempo (un solo punto por muestra).

Usando esta versión actualizada de la construcción de luc Rdividida, probamos si las GTPasas RHO, RAC y CDC42 participan en la formación de contacto ER-Mito. Añadimos inhibidores de la GTPasa, Rhosin (inhibidor de RHO), Ehop-016 (inhibidor de RAC) y ZCL278 (inhibidor de CDC42), a las células HEK293T que expresan componentes Rluc divididos. Los resultados de nuestro ensayo indican que ZCL278 es el inhibidor más potente de la formación de contacto ER-mitocondrias y Ehop-016 es el siguiente inhibidor significativo, mientras que la rhosina no afectó a sus contactos. Estos datos sugieren que la polimerización de actina mediada por CDC42 (así como la mediada por RAC en menor medida) es necesaria para mantener los contactos ER-mitocondrias en la célula, mientras que la polimerización de actina mediada por Rho probablemente no sea importante.

Para garantizar la máxima eficiencia, hay muchos pasos críticos que deben tenerse en cuenta para este protocolo. En primer lugar, se debe analizar la cantidad de constructo transfectado, ya que demasiado ADN puede tener un efecto tóxico en las células. En segundo lugar, dado que el número de células puede tener un impacto significativo en los niveles de luciferasa medidos, mantener la densidad de células lo más cerca posible de lo establecido en el protocolo es crucial para garantizar la confluencia ideal y constante del 80% de las células en el momento del ensayo. Puede haber una reducción de la luminiscencia si las células alcanzan la confluencia durante el tiempo de exposición química, ya que las células confluentes producen menos proteínas en general. En tercer lugar, para garantizar que las células no se desprendan durante la adición de productos químicos y sustrato, utilizamos una placa de 96 pocillos prerrecubierta con poli-D-lisina. En cuarto lugar, para los compuestos (incluido el sustrato) utilizados en este protocolo, es importante mantenerlos a -20 °C o menos (-70 °C) en alícuotas y agregarlos a las celdas inmediatamente descongelados. Por último, debido a las posibles fluctuaciones de temperatura que pueden afectar la actividad de la luciferasa, puede ser mejor optar por utilizar los pocillos más internos de la placa e ignorar los pocillos que recubren el exterior de la placa.

El ensayo split-Rluc8 ofrece un método fácil pero robusto para determinar los contactos ER-mitocondrias, ideal para el cribado de alto rendimiento; Sin embargo, hay algunas limitaciones que deben tenerse en cuenta. Para la fisiología celular, existe el problema de los cambios en el comportamiento celular debido a la sobreexpresión constante del ADN constructivo. Actualmente, estamos trabajando en un constructo con un promotor inducible para combatir los posibles cambios en la fisiología celular debidos a la sobreexpresión constante. Además, cuando este ensayo se utiliza con fines de cribado, debe tenerse en cuenta que los resultados falsos positivos pueden surgir de cualquier efecto indirecto de los fármacos sobre i) los niveles de expresión, ii) la eficacia de la orientación de los orgánulos de dichos fragmentos de proteína, o iii) las actividades enzimáticas de las luciferasas reconstituidas. Debido a estas limitaciones, este ensayo debe probarse junto con otros métodos para validar aún más los resultados. La Tabla 1 se refiere a varios métodos para probar estos sitios de contacto junto con sus ventajas y desventajas. Hemos aprovechado otros métodos, incluyendo pero no limitado a los ensayos de ligadura de proximidad (PLA), que detectan la proximidad entre proteínas, y la microscopía electrónica de transmisión (TEM), que permite una visualización clara de los contactos de orgánulos, junto con el ensayo de luc Rdividido para validar que los cambios resultantes en RLU se deben efectivamente a cambios en los sitios de contacto ER-mitocondrias (Figura 4 y Lim et al.24). También hemos demostrado una correlación entre la alteración en los contactos ER-mitocondrias y parámetros funcionales como la transferencia de calcio y la fisión mitocondrial (Figura 4 y Lim et al.24). Para asegurar que el efecto de los fármacos sobre la actividad de split-Rluc no se deba a un aumento de la expresión del gen split-Rluc, se puede añadir un inhibidor de la transcripción o de la traducción junto con los fármacos, como hemos hecho anteriormente24.

Para la aplicación del sistema split-Rluc en neuronas diferenciadas en cultivo donde la tasa de transfección es baja, la infección viral (con lentivirus que expresa componentes split-Rluc) sería un enfoque alternativo. Su uso puede extenderse para crear un sistema de cribado en el que las células (por ejemplo, las células madre pluripotentes inducidas humanas) se diseñan para expresar de forma estable cada componente del RE Rluc dividido, MitoRlucN y RlucC, ya sea por infección viral o por edición genética mediada por CRSPR. Sin embargo, para un sistema de expresión estable, hay que tener en cuenta que podría haber una presión de selección para las células que toleran mejor el sistema Split-Rluc, que podría no ser representativo del estado fisiológico normal. Esta adaptación o selección podría introducir sesgos en los resultados experimentales.

En resumen, a pesar de algunas de las limitaciones comentadas anteriormente, split-Rluc es un ensayo rápido, sencillo y potente para el cribado de alto rendimiento de moléculas pequeñas o genes que regulan los contactos entre orgánulos en la célula, como se ha demostrado en nuestro estudio previo de cribado de fármacos24.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Dr. Jeffrey Golden (Cedars-Sinai Medical Center) por la revisión crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado en parte por el Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS, R01NS113516).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de microcentrífuga SafeSeal de 1,7 mlSorenson16070
tratada TCUSA ScientificCC7682-7506
10 mL Puntas de pipeta OneTipUSA Scientific1110-3700
10 μ L puntas de pipeta OneTipUSA Scientific1110-3700
20-200 μ L Puntas biseladas OneTipUSA Scientific1111-1210
50 mL Tubo cónico de polipropilenoFalcon352070
Bastidores de microtubos con aletas de 96 pocillosThermoFisher Scientific8770-11
Placa de 96 pocillos TC Tratados USA ScientificCC7682-7596
100 mm x 20 mm Plato tratado con TCUSA ScientificCC7682-3394
1250 μ L Tips OneTipUSA Scientific1112-1720
Centrífuga 5910  Ri - Centrífuga refrigeradaEppendorf5943000131
dimetilsulfóxido, anhidro, ≥ 99.9%Sigma-Aldrich276855-100ML
DMEM, alto contenido de glucosaThermoFisher Scientific11965092
DPBS, sin calcio, sin magnesioThermoFisher Scientific14190144
EHop 016Bio-Techne Tocris6248Disolver en DMSO; almacenar a -70 °C C
EnduRen Sustrato de celda vivaPromegaE6481Almacene alícuotas a -70 ° C
Eppendorf 2-20 μ L pipetaEppendorf3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 μ Pipeta LEppendorf3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 µ Pipeta LEppendorf3123000020
Eppendorf Research plus 12 canalesEppendorf3125000028
Eppendorf Research plus 200 μ Pipeta LEppendorf 
Suero fetal bovino, calificado, regiones aprobadas por el USDAThermoFisher Scientific10437028
Forma Steri-Cycle CO2  Incubadora, 184 L, acero inoxidable pulidoThermoFisher Scientific381
Contador manualSigma-AldrichHS6594
HEK 293T CeldasATCCCRL-3216
Hemacitómetro - Neubauer Bright Line, cámara de doble recuentoLW ScientificCTL-HEMM-GLDR
Tampón Invitrogen TEThermoFisher Scientific8019005
MicroscopioZeissAxiovert 25 CFL
Mini centrífugaBenchmark ScientificC1012
Rack Multi Tube para tubos cónicos de 50 ml, cónicos de 15 ml y microcentrífugasBoekel Scientific120008
PEI MAX - Clorhidrato de polietileno lineal de grado de transfección (MW 40,000)Polysciences24765-100MG
Pipet-Aid XPUSA Scientific4440-0101
Hidrobromuro de poli-D-lisinaSigma-AldrichP6407-5MG
Clorhidrato de rosinaBio-Techne Tocris5003Disolver en DMSO; almacenar a -70 & grados; C
Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenolThermoFisher Scientific25300054
Varioskan LUX lector de microplacas multimodoThermoFisher ScientificVL0000D0
VortexThermoFisher Scientific2215365nivel 8
Sistema de aspiración al vacío VWRVWR 75870-734
ZCL 278Bio-Techne Tocris4794Disolver en DMSO; almacenar a -70 °C; C
Placa de 6 pocillos 3123000055

Referencias

  1. Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs. Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).
  2. Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. ER-mitochondria contact sites; a multifaceted factory for Ca2+ signaling and lipid transport. Front Cell Dev Biol. 10, 988014(2022).
  3. Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nat Commun. 10 (1), 1287(2019).
  4. Voeltz, G. K., Sawyer, E. M., Hajnóczky, G., Prinz, W. A. Making the connection: How membrane contact sites have changed our view of organelle biology. Cell. 187 (2), 257-270 (2024).
  5. Paillusson, S., et al. There's something wrong with my MAM; the ER-mitochondria axis and neurodegenerative diseases. Trends Neurosci. 39 (3), 146-157 (2016).
  6. Sasi, U. S. S., Sindhu, G., Raj, P. S., Raghu, K. G. Mitochondria associated membranes (MAMs): emerging drug targets for diabetes. Curr Med Chem. 27 (20), 3362-3385 (2019).
  7. Joshi, A. U., Kornfeld, O. S., Mochly-Rosen, D. The entangled ER-mitochondrial axis as a potential therapeutic strategy in neurodegeneration: A tangled duo unchained. Cell Calcium. 60 (3), 218-234 (2016).
  8. Moltedo, O., Remondelli, P., Amodio, G. The mitochondria-endoplasmic reticulum contacts and their critical role in aging and age-associated diseases. Front Cell Dev Biol. 7, 172(2019).
  9. Rieusset, J. The role of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites in the control of glucose homeostasis: an update. Cell Death Dis. 9 (3), 388(2018).
  10. Bouguerra, M. D., Lalli, E. ER-mitochondria interactions: Both strength and weakness within cancer cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (4), 650-662 (2019).
  11. Tepikin, A. V. Mitochondrial junctions with cellular organelles: Ca2+ signalling perspective. Pflügers Arch. 470 (8), 1181-1192 (2018).
  12. Masson, G. L., Przedborski, S., Abbott, L. F. A computational model of motor neuron degeneration. Neuron. 83 (4), 975-988 (2014).
  13. Giamogante, F., Barazzuol, L., Brini, M., Calì, T. ER-mitochondria contact sites reporters: strengths and weaknesses of the available approaches. Int J Mol Sci. 21 (21), 8157(2020).
  14. Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).
  15. Valm, A. M., et al. Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome. Nature. 546 (7656), 162-167 (2017).
  16. Csordás, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).
  17. Cieri, D., et al. SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
  18. Kakimoto, Y., et al. Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle- targeted split-GFP system. Sci Rep. 8 (1), 6175(2018).
  19. Wu, M. M., Covington, E. D., Lewis, R. S. Single-molecule analysis of diffusion and trapping of STIM1 and Orai1 at ER-plasma membrane junctions. Mol Biol Cell. 25 (22), Mac.E14-06-1107 (2014).
  20. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).
  21. de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456 (7222), 605-610 (2008).
  22. Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. J Microsc. 259 (2), 80-96 (2015).
  23. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  24. Lim, Y., Cho, I. -T., Rennke, H. G., Cho, G. β2-adrenergic receptor regulates ER-mitochondria contacts. Sci Rep. 11 (1), 21477(2021).
  25. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).
  26. Cho, I. -T., et al. Ascorbate peroxidase proximity labeling coupled with biochemical fractionation identifies promoters of endoplasmic reticulum-mitochondrial contacts. J Biol Chem. 292 (39), 16382-16392 (2017).
  27. Lim, Y., Cho, I. -T., Schoel, L. J., Cho, G., Golden, J. A. Hereditary spastic paraplegia-linked REEP1 modulates endoplasmic reticulum/mitochondria contacts. Ann Neurol. 78 (5), 679-696 (2015).
  28. Arnold, T. R., Stephenson, R. E., Miller, A. L. Rho GTPases and actomyosin: Partners in regulating epithelial cell-cell junction structure and function. Exp Cell Res. 358 (1), 20-30 (2017).

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Ensayo de luciferasa divididacontactos entre el ret culo endopl smico y las mitocondriasimagen de c lulas vivassitios de contacto de membranaenfermedades neurodegenerativascribado de alto rendimientodin mica mitocondrialhomeostasis del calciolector de placas de luminiscenciac lulas HEK293T
Ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para medir los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.