Hemos establecido un ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para monitorear los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas. Con este ensayo, describimos un protocolo para medir cuantitativamente el nivel de estos acoplamientos interorgánulos en HEK293T células, bajo la condición de tratamiento químico.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para medir los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Los sitios de contacto entre el retículo endoplásmico (RE) y las mitocondrias desempeñan un papel fundamental en la salud y la homeostasis celular, como la regulación del Ca2+ y la homeostasis lipídica, la dinámica mitocondrial, la biogénesis de autofagosomas y mitofagosomas y la apoptosis. La falta de mantenimiento del acoplamiento normal entre el RE y la mitocondria está implicada en muchas enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica y la paraplejia espástica hereditaria. Es de considerable importancia explorar cómo la desregulación de los contactos ER-mitocondriales podría conducir a la muerte celular y si la reparación de estos contactos al nivel normal podría mejorar las condiciones neurodegenerativas. Por lo tanto, los ensayos mejorados que miden el nivel de estos contactos podrían ayudar a esclarecer los mecanismos patogénicos de estas enfermedades. En última instancia, el establecimiento de ensayos sencillos y fiables facilitará el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Aquí describimos un ensayo de luciferasa dividida para medir cuantitativamente el nivel de contactos ER-mitocondrias en células vivas. Este ensayo se puede utilizar para estudiar el papel fisiopatológico de estos contactos, así como para identificar sus moduladores en el cribado de alto rendimiento.
Introducción
Las interacciones entre el RE y las mitocondrias son vitales para la homeostasis celular y la supervivencia 1,2,3,4. La evidencia previa indica que cualquier tipo de interrupción o desregulación en los sitios de contacto entre el RE y las mitocondrias puede contribuir a varias enfermedades neurodegenerativas, metabólicas y cardiovasculares, así como al cáncer 5,6,7,8,9,10. Por ejemplo, un aumento anormal de la absorción de Ca2+ en las mitocondrias puede conducir a la muerte celular al abrir los poros de transición de permeabilidad de las mitocondrias, que se observan comúnmente en algunos modelos de enfermedad de Alzheimer 5,11. Del mismo modo, la reducción de los contactos entre el RE y las mitocondrias puede dar lugar a una disminución de la producción de ATP y a un deterioro de la ingesta de Ca2+, como se observa en modelos de esclerosis lateral amiotrófica 5,11,12. A medida que se realizan más estudios en el ámbito de los contactos entre el RE y las mitocondrias, se descubren proteínas y genes adicionales relacionados con la enfermedad que podrían afectar a estos contactos. A pesar de los conocimientos y las pruebas actuales que muestran el papel de los sitios de contacto entre el RE y las mitocondrias, aún se necesita mucho trabajo para dilucidar cómo estos contactos podrían conducir a la pérdida de la función celular y, en última instancia, a la muerte celular.
Se han desarrollado varios métodos para evaluar la proximidad de las dos membranas, la morfología estructural y la distancia entre los dos sitios de contacto de los orgánulos 3,4,13. Los enfoques para monitorear el acoplamiento ER-mitocondrias incluyen imágenes basadas en marcadores de fluorescencia 14,15, imágenes basadas en reporteros FRET16 e imágenes basadas en sondas de fluorescencia dividida17,18, que utilizan epifluorescencia y microscopía confocal. La microscopía de superresolución y la microscopía de resolución atómica también son herramientas poderosas para visualizar con precisión los contactos entre orgánulos, aunque su utilización en el análisis de sitios de contacto es todavía limitada, ya que requieren microscopios altamente dedicados y experiencia técnica19. Además, la microscopía electrónica de transmisión (TEM), la microscopía electrónica de barrido (SEM) y otras técnicas de EM como la tomografía electrónica (ET) y la criomicroscopía electrónica, se utilizan comúnmente, ya que proporcionan imágenes ultraestructurales de alta resolución de los sitios de contacto, que a menudo son imposibles de explorar utilizando otros enfoques experimentales 20,21,22. Sin embargo, estos métodos basados en EM son una técnica de muy bajo rendimiento que también puede verse afectada por los procedimientos de fijación química. Más recientemente, se han utilizado métodos basados en el marcaje de proximidad para detectar sitios de contacto, así como para identificar nuevas proteínas en el sitio de contacto. Por ejemplo, se ha utilizado el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) para cuantificar las proximidades de los orgánulos23,24, mientras que una versión revisada del ensayo de ascorbato peroxidasa (APEX) se ha utilizado para identificar nuevas proteínas en el sitio de contacto25,26. Es importante reconocer que todos estos métodos descritos anteriormente tienen fortalezas y limitaciones intrínsecas en la detección de los contactos entre los orgánulos. Por lo tanto, se requiere el emparejamiento de diferentes técnicas para obtener una interpretación completa de los sitios de contacto de los orgánulos.
Previamente hemos establecido el ensayo de reensamblaje de Renilla luciferasa 8 dividido (ensayo Split-Rluc) para monitorizar el nivel de contactos entre el RE y las mitocondrias en la membrana (Figura 1A)24,26,27. En resumen, cada mitad dividida de Renilla luciferasa se conjuga con una secuencia dirigida a RE o mitocondrias. Cuando se transfectan juntas, cada mitad dividida de la enzima se expresa en el RE o en la membrana mitocondrial. Cuando el RE y las mitocondrias se colocan muy cerca uno del otro, las mitades divididas se unen y reconstituyen toda la enzima con actividad luciferasa. Para la construcción split-Rluc, utilizamos Renilla luciferasa 8 (Rluc8) en pBAD/Myc-His27 para la plantilla inicial. El sitio de división (entre aminoácidos 91 y 92) se determinó con base en reportes previos27. Para la mitad N-terminal de la Rluc8, las secuencias de ADN de los aminoácidos 1-91 de la Rluc8 se fusionaron con el extremo 3' de la etiqueta FLAG y la secuencia de diana mitocondrial AKAP1 del ratón en el vector TOPO pcDNA3.1 mediante PCR27. Para la mitad C-terminal dirigida al RE, las secuencias de ADN que codifican los aminoácidos 92-311 se fusionaron con el extremo 5' de la etiqueta myc y la secuencia de localización del ER UBC6 de la levadura. Aquí, hemos mejorado la construcción del plásmido Rluc dividido de modo que las mitades divididas de la luciferasa Renilla se expresan en un solo vector (pCAG) bajo el mismo promotor y posteriormente se dividen en dos fragmentos a medida que T2A, una secuencia de péptido 2A autoescindido del virus Thosea asigna, se inserta entre las dos mitades divididas (Figura 1B). El mapa y las secuencias de ADN plasmídico se proporcionan en el Archivo Suplementario 1 y en la Figura Suplementaria S1. Utilizando este sistema, hemos medido los efectos de tres sustancias químicas (inhibidoras de las GTPasas implicadas en la polimerización de actina) en los contactos ER-mitocondrias. Este ensayo Split-Rluc es un sistema de ensayo simple pero robusto para el cribado de alto rendimiento para moduladores de contacto entre orgánulos24.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Mantenimiento de celdas y siembra (Día 1)
- Mantener HEK293T células en medios de cultivo celular que contengan el medio Eagle Modified de Dulbecco (DMEM) con un 10% de suero fetal bovino (FBS) (en placas de cultivo de 100 mm) en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2.
- Antes de comenzar, verifique la confluencia de la placa observándola bajo el microscopio. Cuando las células alcancen aproximadamente el 80-90% de confluencia, prepárese para sembrar las células en una placa de cultivo de 6 pocillos retirando el medio y lavando con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.
- Retire el DPBS de la placa de cultivo y trate las células con 1 mL de rojo fenol de tripsina-EDTA al 0,05%. Incubar durante 3 minutos, luego sacar la placa de la incubadora y agregar 9 mL de medio de cultivo (DMEM con 10% de FBS) para detener la reacción de tripsina. Pipetea lentamente hacia arriba y hacia abajo para asegurarte de que se desprendan las células que aún estén adheridas a la placa. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 mL.
- Centrifugar a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Retire el medio y vuelva a suspender los gránulos celulares con 1 mL de medio fresco (DMEM + 10% FBS).
- Cuente el número de células con un hemocitómetro.
- Asegure una distribución uniforme de las células girando suavemente el tubo. Saque inmediatamente 10 μL de la suspensión celular y colóquela en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Agregue 90 μL de medio al mismo tubo.
- Después de mezclar suavemente las células y los medios, tome la suspensión celular y aplique 10 μL en cada una de las cámaras del hemocitómetro pipeteando suavemente por debajo del cubreobjetos.
- Usando un objetivo 10x, enfoque las líneas de la cuadrícula del hemocitómetro bajo un microscopio. Una vez enfocado, cuente el número de celdas en un conjunto de 16 cuadrados (4 x 4 cuadrados) usando un contador de cuentas. Repita hasta que se cuenten los cuatro conjuntos de 16 cuadrados.
- Calcule el número total de células/ml tomando el recuento promedio de células (de cada uno de los 16 cuadrados de las esquinas) y multiplicándolo por 105.
NOTA: En lugar de usar un hemocitómetro para contar células, se puede usar un contador de células automatizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Una vez completado el conteo de células, prepárese para colocar las células en una placa de 6 pocillos a 7,5 × 105 celdas/pocillo de densidad con 2 mL de medio/pocillo. En un tubo de 50 mL, agregue el volumen necesario de células junto con 13 mL de medio. Dispense 2 mL de la suspensión celular diluida en cada uno de los 6 pocillos.
- Antes de colocar la siembra, calcule el número de celdas necesarias para 7.5 × 105 celdas/pocillo usando C1V1 = C2V2 donde C1 es el recuento inicial de células (número de celdas/mL), V1 es el volumen necesario de la suspensión celular inicial, C2 es la densidad de celdas objetivo deseada (número de celdas/mL), y V2 es el volumen final necesario para la siembra de células.
- Después de la dispensación, golpee suavemente la placa por todos los lados para esparcir las células y luego colóquela en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2 durante la noche.
2. Transfección celular mediada por polietileneimina (PEI) y siembra celular posterior a la transfección (Día 2)
- Retire la placa de 6 pocillos de la incubadora y aspire los medios de cultivo existentes de cada pocillo. Agregue 2 mL de medio fresco por pocillo.
- Transfecte las células con ADN plasmídico Rluc dividido (pCAG-Mito,Rluc, N-T2A-R,luc CER-IRES-mCherry) disuelto en tampón TE (pH 8.0).
- Para cada pocillo, mezcle el ADN (750 ng) y el PEI (proporción de ADN/PEI = 1:3) en 200 μL de DMEM en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Agite rápidamente el ADN/PEI en el nivel 8 durante aproximadamente 2 s para asegurarse de que se mezclan bien y forman un complejo. Después de eso, gírelo hacia abajo en una mini centrífuga brevemente (<3 s).
- Deje que la mezcla de ADN/PEI se incube a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego agregue la mezcla (dejándola caer) a la superficie del medio de cultivo en la placa de 6 pocillos que contiene las células. Golpee suavemente la placa (para distribuir uniformemente la mezcla) e incube en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2 durante 6 h.
- Durante la incubación, prepare una placa de 96 pocillos recubierta de poli-D-lisina (PDL) añadiendo primero 70 μL de PDL (50 μg/mL en DPBS) a cada pocillo e incubando en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2 durante al menos 1 h. Retire la solución de PDL y luego lave cada pocillo 2 veces con 100 μL de DPBS. Al final del segundo lavado, asegúrese de que se hayan eliminado todos los DPBS restantes.
- A las 6 h después de la transfección, prepárese para sembrar las células transfectadas en una placa de 96 pocillos recubierta de PDL.
- Extraiga la placa de 6 pocillos que contiene las células transfectadas de la incubadora, aspire el medio y lave cada pocillo con 2 ml de DPBS. Después de retirar el DPBS, añadir 350 μL de rojo de fenol Trypsin-EDTA al 0,05% e incubar durante 1-2 min. Para detener la reacción de tripsina, agregue 1,7 mL de medio a cada pocillo.
- Después de transferir las células junto con el medio a un tubo de 50 ml, haga girar el tubo a 300 × g durante 5 minutos en una centrífuga de mesa. Aspire el medio y vuelva a suspender el pellet celular con 1 mL de medio fresco. Cuente el número de células usando un hemocitómetro (como se describe en el paso 1.5).
- Siembre las células en una placa de 96 pocillos recubierta de PDL a una densidad de 4 × 104 células/pocillo en 100 μL de medio de cultivo. Para esto, en un tubo de 50 mL, agregue el volumen necesario de células (consulte a continuación el cálculo) junto con el volumen apropiado de medio (12 mL de volumen total). Con una pipeta multicanal, dispense 100 μL de la suspensión celular diluida en cada uno de los 96 pocillos. Incubar las células durante 18 h en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2.
- Calcule el número de celdas necesarias para 4 × 104 celdas/pocillo usando C1V1 = C2V2 donde C1 es el recuento inicial de células (número de células/mL), V1 es el volumen necesario de la suspensión celular inicial, C2 es la densidad celular objetivo deseada (número de células/mL) y V2 es el volumen final necesario para la siembra de células.
3. Tratamiento químico y ensayo de luciferasa en células vivas (Día 3)
- En un tubo de microfuga de 1,7 mL, prepare las tres soluciones frescas de 50 μM de Rhosin (50 mM de caldo en DMSO), 25 μM de Ehop-016 (25 mM de caldo en DMSO) y 50 μM de ZCL278 (50 mM de caldo en DMSO) diluyendo cada solución madre (50 mM de Rhosin, 25 mM de Ehop-016 y 50 mL de ZCL278; todas en DMSO) 1:1.000 en la cantidad requerida (50 μL/pocillo × número de pocillos) de medios de cultivo. A cada solución, añadir sustrato de células vivas (50 mM de stock en DMSO) para Renilla luciferasa diluido 1:2.000 hasta una concentración final de 25 μM. Para hacer soluciones de ZCL278 de 0,5, 5 y 50 μM, realice diluciones en serie utilizando los 50 μM iniciales de ZCL278 en medios de cultivo.
NOTA: Si se desea que el tiempo de incubación del producto químico sea inferior a 1-1,5 h, las células pueden preincubarse con sustrato de células vivas (para la luciferasa Renilla ) durante 1-1,5 h antes de tratarlas con cada producto químico. Añadimos productos químicos y sustrato de células vivas simultáneamente para optimizar el protocolo de cribado de fármacos de alto rendimiento. - Retire el medio de cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene las células transfectadas y agregue 50 μL de mezcla de medio químico y de sustrato a cada pocillo.
- Después de incubar las células durante 1 h, 2 h o 5 h, saque la placa de cultivo de la incubadora, cárguela en el lector de placas de luminiscencia y mida la luminiscencia.
- Antes de comenzar, asegúrese de que el lector de placas esté encendido. Acceda al software del lector de microplacas y cree un nuevo archivo haciendo clic en Nueva sesión. Establezca la temperatura del lector de placas en 37 °C haciendo clic en Incubadora, marcando la opción de temperatura y escribiendo 37 °C. En Diseño de placa, elija la opción Desconocido y especifique los pozos que se van a medir haciendo clic y arrastrando.
- En Protocolo, haga clic en Luminiscencia y mantenga la configuración predeterminada. Una vez que haya terminado con la configuración, cargue la placa sin la tapa en el lector de placas y elija Run Plate In. Haga clic en Iniciar y aparecerá la ventana de guardar archivo. Guarde el archivo en su escritorio cambiándole el nombre y haciendo clic en Guardar.
NOTA: La luminiscencia continuará produciéndose durante >24 h después de la adición del sustrato de celda viva.
- Una vez completada la lectura, retire la placa del lector de placas y, a continuación, haga clic en Ejecutar placa para volver a colocar el lector. Una vez completado, vuelva a colocar la placa en la incubadora humidificada (37 °C, 5% CO2) hasta la siguiente lectura.
- Cuando termine, transfiera los datos de luminiscencia a un programa gráfico para trazar la unidad de luminiscencia relativa (RLU) (eje y) para cada variable (por ejemplo, productos químicos o concentraciones) (eje x) y analizar los datos.
4. Validación del ensayo split-Rluc con otros métodos.
- Realizar otros ensayos como el ensayo de ligadura de proximidad (PLA), la microscopía electrónica de transmisión y la monitorización de la absorción de calcio mitocondrial para validar los resultados obtenidos del ensayo de Split-Rluc como se ha descrito anteriormente24.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Hemos utilizado el protocolo descrito anteriormente para medir el nivel de contactos ER-mitocondrias tras la adición de tres compuestos conocidos por inhibir GTPasas específicas. CDC42, Rho y RAC son GTPasas que promueven la polimerización de actina28 cuando se activan y son inhibidas por ZCL278, Rhosin y Ehop-016, respectivamente24. HEK293T células transfectadas con Split-Rluc se trataron con DMSO (control), ZCL278 (50 μM), Rhosin (50 μM) o Ehop-016 (25 μM) y se i...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Hemos utilizado un ensayo de reensamblaje de Renilla luciferasa 8 dividido (ensayo Rluc dividido) para cuantificar el nivel de acoplamientos RE-mitocondrias. En este estudio, hemos modificado el constructo 24 original de split-Rlucgenerando un único vector, pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry, que codifica cada componente split-Rluc (MitoRlucN y Rluc...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Dr. Jeffrey Golden (Cedars-Sinai Medical Center) por la revisión crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado en parte por el Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS, R01NS113516).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo de microcentrífuga SafeSeal de 1,7 ml | Sorenson | 16070 | |
| tratada TC | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| 10 mL Puntas de pipeta OneTip | USA Scientific | 1110-3700 | |
| 10 μ L puntas de pipeta OneTip | USA Scientific | 1110-3700 | |
| 20-200 μ L Puntas biseladas OneTip | USA Scientific | 1111-1210 | |
| 50 mL Tubo cónico de polipropileno | Falcon | 352070 | |
| Bastidores de microtubos con aletas de 96 pocillos | ThermoFisher Scientific | 8770-11 | |
| Placa de 96 pocillos TC Tratados | USA Scientific | CC7682-7596 | |
| 100 mm x 20 mm Plato tratado con TC | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 1250 μ L Tips OneTip | USA Scientific | 1112-1720 | |
| Centrífuga 5910 Ri - Centrífuga refrigerada | Eppendorf | 5943000131 | |
| dimetilsulfóxido, anhidro, ≥ 99.9% | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| DMEM, alto contenido de glucosa | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DPBS, sin calcio, sin magnesio | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| EHop 016 | Bio-Techne Tocris | 6248 | Disolver en DMSO; almacenar a -70 °C C |
| EnduRen Sustrato de celda viva | Promega | E6481 | Almacene alícuotas a -70 ° C |
| Eppendorf 2-20 μ L pipeta | Eppendorf | 3123000039 | |
| Eppendorf Research plus 100-1000 μ Pipeta L | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research Plus 1-10 µ Pipeta L | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus 12 canales | Eppendorf | 3125000028 | |
| Eppendorf Research plus 200 μ Pipeta L | Eppendorf | ||
| Suero fetal bovino, calificado, regiones aprobadas por el USDA | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubadora, 184 L, acero inoxidable pulido | ThermoFisher Scientific | 381 | |
| Contador manual | Sigma-Aldrich | HS6594 | |
| HEK 293T Celdas | ATCC | CRL-3216 | |
| Hemacitómetro - Neubauer Bright Line, cámara de doble recuento | LW Scientific | CTL-HEMM-GLDR | |
| Tampón Invitrogen TE | ThermoFisher Scientific | 8019005 | |
| Microscopio | Zeiss | Axiovert 25 CFL | |
| Mini centrífuga | Benchmark Scientific | C1012 | |
| Rack Multi Tube para tubos cónicos de 50 ml, cónicos de 15 ml y microcentrífugas | Boekel Scientific | 120008 | |
| PEI MAX - Clorhidrato de polietileno lineal de grado de transfección (MW 40,000) | Polysciences | 24765-100MG | |
| Pipet-Aid XP | USA Scientific | 4440-0101 | |
| Hidrobromuro de poli-D-lisina | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Clorhidrato de rosina | Bio-Techne Tocris | 5003 | Disolver en DMSO; almacenar a -70 & grados; C |
| Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Varioskan LUX lector de microplacas multimodo | ThermoFisher Scientific | VL0000D0 | |
| Vortex | ThermoFisher Scientific | 2215365 | nivel 8 |
| Sistema de aspiración al vacío VWR | VWR 75870-734 | ||
| ZCL 278 | Bio-Techne Tocris | 4794 | Disolver en DMSO; almacenar a -70 °C; C |
Referencias
- Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs. Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).
- Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. ER-mitochondria contact sites; a multifaceted factory for Ca2+ signaling and lipid transport. Front Cell Dev Biol. 10, 988014(2022).
- Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nat Commun. 10 (1), 1287(2019).
- Voeltz, G. K., Sawyer, E. M., Hajnóczky, G., Prinz, W. A. Making the connection: How membrane contact sites have changed our view of organelle biology. Cell. 187 (2), 257-270 (2024).
- Paillusson, S., et al. There's something wrong with my MAM; the ER-mitochondria axis and neurodegenerative diseases. Trends Neurosci. 39 (3), 146-157 (2016).
- Sasi, U. S. S., Sindhu, G., Raj, P. S., Raghu, K. G. Mitochondria associated membranes (MAMs): emerging drug targets for diabetes. Curr Med Chem. 27 (20), 3362-3385 (2019).
- Joshi, A. U., Kornfeld, O. S., Mochly-Rosen, D. The entangled ER-mitochondrial axis as a potential therapeutic strategy in neurodegeneration: A tangled duo unchained. Cell Calcium. 60 (3), 218-234 (2016).
- Moltedo, O., Remondelli, P., Amodio, G. The mitochondria-endoplasmic reticulum contacts and their critical role in aging and age-associated diseases. Front Cell Dev Biol. 7, 172(2019).
- Rieusset, J. The role of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites in the control of glucose homeostasis: an update. Cell Death Dis. 9 (3), 388(2018).
- Bouguerra, M. D., Lalli, E. ER-mitochondria interactions: Both strength and weakness within cancer cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (4), 650-662 (2019).
- Tepikin, A. V. Mitochondrial junctions with cellular organelles: Ca2+ signalling perspective. Pflügers Arch. 470 (8), 1181-1192 (2018).
- Masson, G. L., Przedborski, S., Abbott, L. F. A computational model of motor neuron degeneration. Neuron. 83 (4), 975-988 (2014).
- Giamogante, F., Barazzuol, L., Brini, M., Calì, T. ER-mitochondria contact sites reporters: strengths and weaknesses of the available approaches. Int J Mol Sci. 21 (21), 8157(2020).
- Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).
- Valm, A. M., et al. Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome. Nature. 546 (7656), 162-167 (2017).
- Csordás, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).
- Cieri, D., et al. SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
- Kakimoto, Y., et al. Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle- targeted split-GFP system. Sci Rep. 8 (1), 6175(2018).
- Wu, M. M., Covington, E. D., Lewis, R. S. Single-molecule analysis of diffusion and trapping of STIM1 and Orai1 at ER-plasma membrane junctions. Mol Biol Cell. 25 (22), Mac.E14-06-1107 (2014).
- Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).
- de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456 (7222), 605-610 (2008).
- Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. J Microsc. 259 (2), 80-96 (2015).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Lim, Y., Cho, I. -T., Rennke, H. G., Cho, G. β2-adrenergic receptor regulates ER-mitochondria contacts. Sci Rep. 11 (1), 21477(2021).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).
- Cho, I. -T., et al. Ascorbate peroxidase proximity labeling coupled with biochemical fractionation identifies promoters of endoplasmic reticulum-mitochondrial contacts. J Biol Chem. 292 (39), 16382-16392 (2017).
- Lim, Y., Cho, I. -T., Schoel, L. J., Cho, G., Golden, J. A. Hereditary spastic paraplegia-linked REEP1 modulates endoplasmic reticulum/mitochondria contacts. Ann Neurol. 78 (5), 679-696 (2015).
- Arnold, T. R., Stephenson, R. E., Miller, A. L. Rho GTPases and actomyosin: Partners in regulating epithelial cell-cell junction structure and function. Exp Cell Res. 358 (1), 20-30 (2017).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
