Artículo de método

Desarrollo de terapias combinatorias para la lesión de la médula espinal mediante la administración de células madre

DOI:

10.3791/66872

⸱

7 de junio de 2024

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este estudio, se desarrollaron y caracterizaron hidrogeles compuestos miméticos nerviosos que se pueden utilizar para investigar y capitalizar el comportamiento pro-regenerativo de las células madre derivadas del tejido adiposo para la reparación de lesiones de la médula espinal.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La lesión traumática de la médula espinal (LME) induce un déficit sensoriomotor permanente por debajo del sitio de la lesión. Afecta aproximadamente a un cuarto de millón de personas en los Estados Unidos y representa un problema de salud pública inconmensurable. Se han llevado a cabo investigaciones para proporcionar una terapia eficaz; sin embargo, la lesión de la médula espinal todavía se considera incurable debido a la naturaleza compleja del sitio de la lesión. Se investigan diversas estrategias, como la administración de fármacos, el trasplante de células y los biomateriales inyectables, pero una sola estrategia limita su eficacia para la regeneración. Como tal, recientemente han ganado atención las terapias combinatorias que pueden dirigirse a las características multifacéticas de la lesión. Se ha demostrado que las matrices extracelulares (MEC) pueden aumentar la eficacia del trasplante de células para la LME. Para ello, se desarrollaron y caracterizaron hidrogeles 3D formados por médula espinal descelularizada (dSCs) y nervios ciáticos (dSNs) en diferentes proporciones. El análisis histológico de los dSCs y dSNs confirmó la eliminación de componentes celulares y nucleares, y las arquitecturas de los tejidos nativos se mantuvieron después de la descelularización. Posteriormente, se crearon hidrogeles compuestos en diferentes proporciones volumétricas y se sometieron a análisis de turbidez, cinética de gelificación, propiedades mecánicas y viabilidad de células madre derivadas del tejido adiposo humano (hASC) incrustadas. No se encontraron diferencias significativas en las propiedades mecánicas entre las diferentes proporciones de hidrogeles y matrices de médula espinal descelularizadas. Las ASC humanas incrustadas en los geles permanecieron viables durante los 14 días de cultivo. Este estudio proporciona un medio para generar hidrogeles combinatorios de ingeniería tisular que presentan ECM específica del nervio y células madre mesenquimales pro-regenerativas. Esta plataforma puede proporcionar nuevos conocimientos sobre las estrategias neuro-regenerativas después de la LME con futuras investigaciones.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aproximadamente 296,000 personas sufren de LME traumática, y cada año hay alrededor de 18,000 nuevos casos de LME en los EE. UU.1. La lesión traumática de la médula espinal suele ser causada por caídas, heridas de bala, accidentes automovilísticos y actividades deportivas y, a menudo, provoca la pérdida permanente de la función sensoriomotora por debajo del lugar de la lesión. Los gastos estimados de por vida para el tratamiento de la LME oscilan entre uno y cinco millones de dólares por individuo, con una esperanza de vida significativamente más baja. Sin embargo, la LME sigue siendo poco conocida y en gran medida incurable, principalmente debido a las complejas consecuencias fisiopatológicas después de la lesión2. Se han investigado varias estrategias, entre ellas el trasplante de células y los andamios basados en biomateriales. Si bien el trasplante de células y biomateriales ha demostrado potencial, la naturaleza multifacética de la LME sugiere que los enfoques combinatorios pueden ser más beneficiosos3. Como resultado, se han investigado muchas estrategias combinatorias y se ha demostrado una mejor eficacia terapéutica que los componentes individuales. Sin embargo, se necesitan más estudios para proporcionar nuevos biomateriales para la administración de células y fármacos3.

Un enfoque prometedor para la fabricación de hidrogeles naturales es la descelularización de tejidos. El proceso de descelularización utiliza métodos iónicos, no iónicos, físicos y combinatorios para eliminar todos o la mayoría de los materiales celulares y nucleicos mientras se conservan los componentes de la MEC. Al eliminar todos o la mayoría de los componentes celulares, los hidrogeles derivados de la MEC son menos inmunorreactivos para el huésped después de la implantación/inyección4. Hay varios parámetros que se deben medir para evaluar la calidad de los tejidos descelularizados: eliminación del contenido celular/nucleico, propiedades mecánicas y conservación de la MEC. Se han establecido los siguientes criterios para evitar respuestas inmunitarias adversas: 1) menos de 50 ng de ADN bicatenario (dsDNA) por mg de peso seco de ECM, 2) menos de 200 pb de longitud del fragmento de ADN, y 3) casi o ningún material nuclear visible teñido con 4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)5. Las propiedades mecánicas pueden cuantificarse mediante ensayos de tracción, compresión y/o reología, y deben ser similares al tejido original6. Además, la conservación de proteínas puede evaluarse mediante proteómica o ensayos cuantitativos centrados en los componentes principales de los tejidos descelularizados, por ejemplo, laminina, glicosaminoglicano (GAG) y proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG) para la médula espinal 7,8. Los hidrogeles verificados derivados de la MEC pueden recelularizarse con diferentes tipos de células para ayudar a la terapia basada en células9.

Se han estudiado diversos tipos de células, como las células de Schwann, las células de la envoltura olfativa, las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea (MSC) y las células madre/progenitoras neurales, para la reparación de la LME 10,11,12. Sin embargo, el uso clínico de estas células es limitado debido a preocupaciones éticas, escasa integración con células/tejidos vecinos, falta de fuentes de tejidos de alto rendimiento, incapacidad para autorrenovarse y/o capacidad proliferativa limitada 13,14,15. A diferencia de estos tipos de células, las MSCs derivadas del tejido adiposo humano (hASCs) son candidatas atractivas porque se aíslan fácilmente de forma mínimamente invasiva mediante lipoaspirados, y se puede obtener un gran número de células16. Además, las hASC tienen la capacidad de segregar factores de crecimiento y citocinas que tienen potencial de neuroprotección, angiogenética, cicatrización de heridas, regeneración de tejidos e inmunosupresión 17,18,19,20,21.

Como se ha descrito, se han realizado múltiples estudios 22,23,24 y se ha aprendido mucho de ellos, pero las características heterogéneas de la LME han limitado su eficacia para promover la recuperación funcional. Como tal, se han propuesto enfoques combinatorios para aumentar la eficacia del tratamiento para la LME. En este estudio, se desarrollaron hidrogeles compuestos combinando médula espinal descelularizada y nervios ciáticos para un cultivo tridimensional (3D) de hASC. El éxito de la descelularización se confirmó mediante análisis histológicos y de ADN, y se caracterizaron diferentes proporciones de hidrogeles compuestos nerviosos mediante cinética de gelificación y pruebas de compresión. Se investigó la viabilidad de las hASC en los hidrogeles compuestos nerviosos para demostrar que este hidrogel puede utilizarse como plataforma de cultivo celular en 3D.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los tejidos porcinos se obtuvieron comercialmente, por lo que no se requirió la aprobación del comité de ética animal.

1. Descelularización de la médula espinal porcina (Tiempo estimado: 5 días)

NOTA: Realizar la descelularización utilizando protocolos previamente establecidos con modificaciones25,26. Todos los procedimientos deben realizarse en una cabina de bioseguridad estéril a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario. Todas las soluciones deben filtrarse estérilmente utilizando un filtro superior de botella (tamaño de poro de 0,2 μm) en botellas esterilizadas en autoclave. Los procedimientos que se llevarán a cabo a 37 °C se pueden realizar dentro de una incubadora o en un horno limpio ajustado a 37 °C.

  1. Preparación de soluciones de descelularización
    NOTA: Todas las soluciones están calculadas para 1 L. Es posible que los usuarios deban ajustar el volumen final requerido de acuerdo con sus necesidades experimentales.
    1. Diluya 500 mL de tripsina/ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,05% con 500 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para producir tripsina/EDTA al 0,025%.
    2. Diluya 300 mL de Triton X-100 al 10% con 700 mL de PBS para hacer Triton X-100 al 3%. Mezcle 0,56 g de NaCl, 1,31 g de NaH2PO4H2O y 10,85 g de HNa2O4P·7H2O en 1 L de agua desionizada para hacer 100 mM de Na/50 mM de tampón phos.
    3. Mezclar 32,4 g de sacarosa en 1 L de agua desionizada para hacer 1 M de sacarosa. Mezcle 40 g de desoxicolato de sodio (SD) en 1 L de agua desionizada para hacer una solución de SD al 4%. Diluir 6,7 mL de ácido peracético al 15% con 993,3 mL de etanol al 4%.
  2. Preparación de la médula espinal porcina
    NOTA: La médula espinal se envió congelada sin ninguna solución y se mantuvo a -80 °C hasta su uso.
    1. Descongelar la médula espinal a 4 °C en la nevera durante 18-24 h antes de la descelularización. Use tijeras estériles para quitar la duramadre con cuidado.
    2. Corta la médula espinal en trozos pequeños (de aproximadamente 1 cm de largo). Coloque una pieza en un tubo de 15 mL o un máximo de tres piezas en un tubo de 50 mL.
  3. Descelularización de la médula espinal
    NOTA: Después de cada paso, las soluciones de descelularización se vierten manualmente en un vaso de precipitados grande para desecharlas. Se puede utilizar un pequeño colador de acero inoxidable esterilizable en autoclave para ayudar a desechar las soluciones de descelularización sin perder los tejidos necesarios para cada paso. La médula espinal se agitó a 83 rpm a menos que se indique lo contrario.
    1. Enjuague la médula espinal con agua desionizada durante 18-24 h a 4 °C y 60 rpm.
    2. Enjuague la médula espinal con tripsina al 0,025%/EDTA durante 1 h a 37 °C y 40 rpm. Luego, enjuague la médula espinal con PBS durante 15 minutos, 2 veces.
    3. Enjuague la médula espinal con Triton X-100 al 3% durante 2 h. Enjuague la médula espinal con 100 mM de Na/50 mM de tampón phos durante 15 min, 2 veces.
    4. Enjuague la médula espinal con sacarosa 1 M durante 1 h. A continuación, enjuague la médula espinal con agua desionizada durante 1 h.
    5. Enjuague la médula espinal con 4% SD durante 2 h. A continuación, enjuague la médula espinal con 100 mM de Na/50 mM de tampón phos durante 15 min, 2 veces.
    6. Enjuague la médula espinal con ácido peracético al 0,1% en etanol al 4% durante 4 h. A continuación, enjuague la médula espinal con PBS durante 1 h.
    7. Enjuague la médula espinal con agua desionizada durante 1 h, 2 veces. A continuación, enjuague la médula espinal con PBS durante 1 h.
    8. Liofilizar la médula espinal a 0,01 mbar y -56 °C durante 3 días y almacenar en seco hasta su uso.

2. Descelularización del nervio ciático porcino (Tiempo estimado: 5 días)

NOTA: Realizar la descelularización utilizando un protocolo previamente establecido27. Todos los procedimientos deben realizarse en una cabina de bioseguridad estéril a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario. Todas las soluciones deben filtrarse estérilmente utilizando un filtro superior de botella (tamaño de poro de 0,2 μm) en botellas esterilizadas en autoclave. Los procedimientos que se llevarán a cabo a 37 °C se pueden realizar dentro de una incubadora o en un horno limpio ajustado a 37 °C.

  1. Preparación de soluciones de descelularización
    NOTA: Todas las soluciones están calculadas para 1 L. Es posible que los usuarios deban ajustar el volumen final requerido de acuerdo con sus necesidades experimentales.
    1. Prepare 50 mM de Na/10 mM de tampón phos mezclando 1,86 g de NaCl, 0,262 g de d NaH2PO4H2O y 2,17 g de HNa2O4P·7H2O en 1 L de agua desionizada.
    2. Prepare una solución de sulfobetaína-10 (SB-10) de 125 mM mezclando 38,4 g de SB-10 en 1 L de tampón de 50 mM de Na/10 mM de fósforo.
    3. Prepare una solución de sulfobetaína-16 (SB-16) al 3 % de SD/0,6 mM mezclando 30 g de SD y 0,24 g de SB-16 en 1 L de tampón de 50 mM Na/10 mM de fosfato.
  2. Preparación del nervio ciático porcino
    NOTA: Los nervios ciáticos se enviaron congelados con PBS y se mantuvieron a -80 °C hasta su uso.
    1. Descongelar el nervio ciático a 4 °C en la nevera 18-24 h antes de la descelularización.
    2. Cortar el nervio ciático en trozos pequeños (aproximadamente 1 cm de largo). Coloque una pieza en un tubo de 15 mL o un máximo de tres piezas en un tubo de 50 mL.
  3. Descelularización del nervio ciático
    NOTA: Después de cada paso, las soluciones de descelularización se vierten manualmente en un vaso de precipitados grande para desecharlas, y se puede usar un pequeño colador de acero inoxidable esterilizable en autoclave para ayudar a desechar las soluciones de descelularización sin perder los tejidos necesarios para cada paso. El nervio ciático se agitó a 15 rpm a menos que se indique lo contrario.
    1. Enjuague el nervio ciático con agua desionizada durante 7 h. A continuación, enjuague el nervio ciático con 125 mM de sulfobetaína-10 (SB-10) en tampón phos de 50 mM Na/10 mM durante 18 h.
    2. Enjuague el nervio ciático con 100 mM de Na/50 mM de tampón phos durante 15 min. A continuación, enjuague el nervio ciático con 3% SD/0,6 mM de sulfobetaína-16 (SB-16) en tampón phos de 50 mM Na/10 mM durante 2 h.
    3. Enjuague el nervio ciático con 100 mM de Na/50 mM de tampón de fosfato durante 15 min, 3 veces. A continuación, enjuague el nervio ciático con 125 mM SB-10 en tampón de 50 mM Na/10 mM phos durante 7 h.
    4. Enjuague el nervio ciático con 100 mM de Na/50 mM de tampón phos durante 15 min. A continuación, enjuague el nervio ciático con SD al 3%/0,6 mM SB-16 en tampón 50 mM Na/10 mM phos durante 1,5 h.
    5. Enjuague el nervio ciático con 50 mM de Na/10 mM de tampón phos durante 15 min, 3 veces. A continuación, enjuague el nervio ciático con 75 U/mL de desoxirribonucleasa (DNasa) durante 3 h sin agitar.
    6. Enjuague el nervio ciático con 50 mM de Na/10 mM de tampón de fosfato durante 1 h, 3 veces. A continuación, enjuagar el nervio ciático con 0,2 U/mL de condroitinasa ABC durante 16 h sin agitar a 37 °C.
    7. Enjuague el nervio ciático con PBS durante 3 h, 3 veces. Liofilizar el nervio ciático a 0,01 mbar y -56 °C durante 3 días y almacenar en seco hasta su uso.

3. Digestión de tejidos descelularizados y fabricación de hidrogeles compuestos (Tiempo estimado: 4 días)

  1. Picar o moler los tejidos descelularizados hasta convertirlos en polvo con unas tijeras o un homogeneizador. Esterilizar las herramientas para picar o triturar los tejidos utilizando un autoclave a 121 °C durante 45 min. El método del óxido de etileno también es aplicable.
  2. Digiera los tejidos por separado en una solución de ácido clorhídrico (HCl) 0,01 N que contenga 1 mg/ml de pepsina a una concentración de 15 mg/mL. Los pesos estimados de la médula espinal descelularizada y el nervio ciático son 50-100 mg y 100-150 mg por pieza, respectivamente.
  3. Coloque la barra magnética y agite a 500 rpm y 4 °C durante al menos 4 días para generar soluciones de pregel.
  4. Mezcle el pregel del nervio ciático y la médula espinal en las siguientes proporciones volumétricas: 2:1, 1:1 y 1:2. Ajuste el pH 7,4 con hidróxido de sodio (NaOH) 1 N y HCl y diluya hasta la concentración deseada con medios M199 y 1x PBS. Incubar a 37 °C durante 30 min.
    NOTA: Agregue NaOH 1 μL a la vez. Los medios M199 se pueden usar como indicadores de pH, ya que se vuelven de color rosa claro cuando el pH es de 7.4, pero se deben usar tiras de pH para confirmar el nivel de pH.

4. Verificación de la descelularización

  1. Tinción con hematoxilina y eosina (H&E; Tiempo estimado: 8 días)
    NOTA: Después de cada paso de enjuague, las soluciones se vierten manualmente en un vaso de precipitados grande para desecharlas.
    1. Fijar la médula espinal y el nervio ciático frescos y descelularizados en formaldehído al 3,7% a 4 °C durante 18 h. Coloque una pieza en un tubo de 15 ml.
    2. Retire el formaldehído y coloque los pañuelos en sacarosa al 10% durante 1 día. Retirar el 10% de sacarosa y colocar los tejidos en sacarosa al 30% durante 6 días.
    3. Llene un molde criomónico de tamaño adecuado con una temperatura de corte óptima (OCT) hasta la mitad. Coloque los tejidos descelularizados, cúbralos con OCT y deje que absorban la OCT durante 1 día.
    4. Después de 1 día, congele los tejidos durante la noche a -80 °C. Crioseccionar los tejidos a 10 μm de espesor utilizando un criostato.
    5. Enjuague con 1x PBS durante 5 min, 2x. Luego, enjuague con agua del grifo durante 5 minutos.
    6. Teñir con solución de hematoxilina durante 1 min. Enjuague con agua del grifo durante 1 min, 3 veces.
    7. Teñir con solución de eosina durante 1 min. Enjuague con etanol al 95 % durante 1 min, 2 veces y con etanol al 100 % durante 1 min, 3 veces.
    8. Enjuague con xileno durante 1 min, 2 min, y luego 1 min. Deja que los portaobjetos se sequen durante 5 min.
    9. Use un hisopo de algodón para gotear de 3 a 4 gotas de solución de montaje de dibutilftalato de poliestireno xileno (DPX) en los portaobjetos. Coloque los cubreobjetos encima de los portaobjetos cubiertos por DPX. Deja que los portaobjetos se sequen durante la noche.
  2. Análisis de ADN (Tiempo estimado: 1 h)
    1. Pesar tejidos descelularizados y liofilizados. Aísle y cuantifique el ADN utilizando kits disponibles en el mercado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

5. Caracterización de hidrogeles compuestos

  1. Prueba de turbidez de gelificación (Tiempo estimado: 1 h)
    1. Coloque 100 μL de soluciones de pregel en cada pocillo de una placa de 96 pocillos sobre hielo. Lea la absorbancia a 405 nm cada 2 minutos durante 45 minutos utilizando un lector de placas.
    2. Calcule la absorbancia normalizada utilizando la siguiente ecuación:
      (Absorbancia - Absorbanciainicial) / (Absorbanciamáxima - Absorbanciainicial)
    3. Calcular la pendiente de la curva y el tiempo para lograr una gelificación del 50% y 95%, t1/2 y t95, respectivamente.
  2. Prueba de compresión (Tiempo estimado: 1 min por hidrogel)
    1. Fabricar hidrogeles compuestos a una concentración de 12 mg/mL con 8 mm de diámetro y 2 mm de altura.
    2. Utilice un reómetro para comprimir las muestras con una carga de 250 N entre placas paralelas de acero inoxidable a una velocidad de deformación del 10% de la altura de la muestra/min. El software que proporciona las lecturas del reómetro proporcionará una curva de tensión-deformación aplicando la fuerza y midiendo la deformación hasta que los hidrogeles se rompan.
    3. Calcule el módulo de Young a partir de la pendiente de la región lineal de las curvas tensión-deformación.

6. Cultivo tridimensional de ASCs humanas en hidrogeles compuestos nerviosos

  1. Preparación de plataforma tridimensional (3D) (Tiempo estimado: 3 h)
    1. Grabe oblea de silicio con fotorresistencia SU-8 para generar patrones circulares de 200 μm de profundidad y 4 mm de diámetro.
    2. Mezcle la base de polidimetilsiloxano (PDMS) y el agente de curado en una proporción de 10:1. Vierta la mezcla sobre la oblea de silicona y déjela reposar durante 20 minutos para eliminar todas las burbujas que surgen al mezclar la base de PDMS y el agente de curado.
    3. Introducirlo en el horno y curar durante 2 h a 70 °C. Desmoldar la lámina de PDMS curada y perforarla con un punzón de biopsia de 8 mm de diámetro para hacer micropocillos de PDMS.
    4. Coloque los micropocillos en una placa de 96 pocillos y coloque la placa de pocillos en un limpiador de aire-plasma para esterilizar los micropocillos de PDMS.
    5. Funcionalizar micropocillos de PDMS con 1% de polietileneimina (PEI) y 0,1% de glutaraldehído (GA) durante 10 min y 20 min, respectivamente. Lave los micropocillos con agua destilada, 2 veces.
  2. Preparación de hASCs (Tiempo estimado: 7 días)
    1. Cultive células de paso de 2 a 5 conductos en medios de crecimiento de hASCs (medios basales de hASCs suplementados con suero fetal bovino (FBS) y penicilina/estreptomicina (Pen-strep)) hasta que confluenten. Pase y calcule el número de células mediante el uso de un hemacitómetro o contador de células.
  3. Hidrogeles compuestos nerviosos cargados de ASC (Tiempo estimado: 2 h)
    1. Mezcle el pregel para el nervio ciático y la médula espinal en una proporción volumétrica de 2:1, 1:1, 1:2 y prepare hidrogel solo para la médula espinal sin mezclar ningún pregel para el nervio ciático.
    2. Agregue el medio M199 y ajuste el pH 7.4 usando 1 N NaOH y HCl. Vuelva a suspender los hASC con el medio de crecimiento en el pregel a una densidad de 1 x 106 células/mL.
      NOTA: La cantidad de M199 y suspensión celular debe ser del 10% de pregel.
    3. Diluya el pregel a 12 mg/mL usando 1x PBS. Coloque el pregel en micropocillos e incube durante 30 minutos. Cultivo de hidrogeles cargados de ASC en medios de crecimiento de hASCs.
  4. Test de viabilidad celular (Tiempo estimado: 4 h al día)
    1. Prepare las soluciones de las pruebas de viabilidad utilizando los reactivos disponibles en el mercado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Aspire los medios en los días 1, 4, 7 y 14. Añadir reactivo a los pocillos e incubar a 37 °C durante 3 h siguiendo las instrucciones del fabricante.
    3. Lea la fluorescencia a una excitación/emisión de 560/590 nm utilizando un lector de placas. Calcula la diferencia porcentual usando la siguiente ecuación:
      [(muestra de fluorescencia-fluorescencia en blanco) /fluorescencia en blanco] x 100

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los tejidos descelularizados se prepararon utilizando protocolos previamente establecidos con ligeras modificaciones26,27. Después de la descelularización, liofilización y digestión, se fabricaron hidrogeles compuestos nerviosos en proporciones de SN:SC = 2:1, 1:1, 1:2 e hidrogeles solo de la médula espinal (Figura 1). La remoción de componentes nucleares se confirmó mediante tinción de H&E (Figura 2A). Para evaluar cuantitativamente la descelularización, se midió el ADN residual dentro de la ECM. El contenido de dsDNA en la duramadre fresca fue de 132,6 ± 21,3 ng dsDNA/mg de tejido seco, mientras que el parénquima de la médula espinal fresco y descelularizado contenía 22,6 ± 8,3 ng de dsDNA/mg de tejido seco y de 23,74 ± 6,69 ng de dsDNA/mg de tejido seco, respectivamente (Figura 2B). Indicó que la duramadre debía ser removida antes de la descelularización. La cantidad de dsDNA del nervio ciático fresco y descelularizado fue de 222,5 ± 42,65 y 0,63 ng dsDNA/mg de tejido seco, respectivamente (Figura 2C).

Se evaluó la cinética de gelificación de hidrogeles compuestos nerviosos para determinar la velocidad de gelificación (S) y los tiempos para alcanzar el 50% y 95% de la turbidez final (t1/2 y t95). La cinética de gelificación mostró una forma sigmoidal para todos los grupos de hidrogel (Figura 3A). La velocidad de gelificación (S) en todos los grupos de hidrogel no fue significativamente diferente entre sí. El tiempo requerido para alcanzar la mitad de la turbidez final, t1/2, fue de 11,32 ± 0,57 min, 13,33 ± 0,6 min y 15,7 ± 0,92 min, y de 17,23 ± 1,13 min para los hidrogeles SN:SC= 2:1, 1:1, 1:2 y solo de la médula espinal, respectivamente. El tiempo requerido para alcanzar el 95% de la turbidez final, t95, fue de 13,8 ± 0,83 min, 15,53 ± 0,83 min, 18,38 ± 0,79 min y 19,62 ± 1,27 para los hidrogeles SN:SC= 2:1, 1:1, 1:2 y solo de médula espinal, respectivamente. Estos resultados indican que los hidrogeles con más contenido de nervio ciático alcanzan el estado estacionario más rápido, y la MEC del nervio ciático puede promover el ensamblaje de hidrogeles. El resultado de la prueba de compresión mostró una tendencia de que los hidrogeles con mayor contenido de médula espinal proporcionan una mayor rigidez; sin embargo, no fue significativamente diferente en todas las diferentes proporciones de hidrogeles compuestos (Figura 3B).

Por último, para determinar la viabilidad celular de las hASC en todos los grupos de hidrogeles, se establecieron cultivos 3D utilizando micropocillos de PDMS microfabricados, como se muestra en la Figura 4. A lo largo del cultivo de 14 días, la viabilidad de ASC se midió utilizando un ensayo metabólico colorimétrico y de fluorescencia basado en medios de cultivo celular disponible comercialmente, donde las diferencias porcentuales de las lecturas se calcularon en cuatro puntos temporales diferentes: día 1, día 4, día 7 y día 14 (Figura 5). El valor de la diferencia porcentual aumentó a medida que aumentaban los puntos de tiempo, y el del hidrogel solo de la médula espinal fue menor que el del resto de los grupos en los días 1, 4 y 14. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la viabilidad de hASC aumentó a lo largo del período de cultivo debido a la proliferación celular y al incremento en la actividad metabólica celular.

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Figura 1: Fabricación de hidrogeles compuestos para nervios. La médula espinal porcina y los nervios ciáticos se descelularizaron, liofilizaron y digerieron para obtener soluciones de pregel. Se mezclaron soluciones de pregel para el nervio ciático y la médula espinal en una proporción de 2:1, 1:1 y 1:2, y también se preparó pregel solo para la médula espinal. Todas las soluciones de pregel se incubaron a 37 °C para generar hidrogeles compuestos para nervios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Verificación de la descelularización. (A) Tinción de H&E de médula espinal porcina fresca y descelularizada y nervios ciáticos. Las flechas indican la presencia de células en los tejidos. Barras de escala = 1 mm para imágenes de visión amplia y 500 μm para imágenes con zoom (200 μm solo para imágenes de nervio ciático descelularizado con zoom). (B) Análisis de ADN de duramadre fresca, parénquima y médula espinal descelularizada (n = 10, 16 y 6, respectivamente). (C) Análisis de ADN de nervios ciáticos frescos y descelularizados (n = 8 y 3, respectivamente). Las barras de error representan desviaciones estándar. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de un factor con una prueba post-hoc de Tukey para (B) y una prueba t para (C). Abreviaturas: ns = no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Caracterizaciones de hidrogeles compuestos para nervios. (A) Absorbancia normalizada de hidrogeles compuestos para nervios (n = 5). (B) Módulo de Young de hidrogeles compuestos de médula espinal descelularizada y nervios (n = 4 para la médula espinal descelularizada y 3 para cada grupo de hidrogel compuesto, respectivamente). Las barras de error representan desviaciones estándar. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de un factor con la prueba post-hoc de Tukey. Abreviaturas: ns = no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Imagen esquemática del cultivo 3D. (A) Los micropocillos de PDMS se fabricaron en una oblea de silicio recubierta de SU-8. Cada micropocillo se perforó con un punzón de biopsia de 8 mm. (B) Descelularizar la médula espinal y el nervio ciático en diferentes proporciones, ajustar el pH a 7.4, resuspender con hASCs, colocar el pregel en el micropocillo e incubar durante 30 min a 37 °C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Ensayo de viabilidad celular. La diferencia porcentual de hASCs cultivadas en hidrogeles compuestos para nervios a los días 1, 4, 7 y 14 (n = 3). Las barras de error representan desviaciones estándar. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de un factor con la prueba post-hoc de Tukey. * p<0,05; ** p<0,01; P<0,005; P<0,001; NS: No significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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Se cree ampliamente que la fisiopatología de la LME es compleja y multifacética. A pesar de que las terapias individuales, como el trasplante de células, la administración de fármacos y los biomateriales, han proporcionado información valiosa sobre la LME, la naturaleza complicada de la LME puede limitar su eficacia individual 28,29,30,31. Por lo tanto, los esfuerzos para desarrollar terapias combinatorias efectivas han aumentado. Los hidrogeles compuestos nerviosos descritos en este estudio pueden servir como un vehículo eficaz de administración de células o fármacos. Con respecto a las células, las ASC son uno de los candidatos prometedores para el trasplante de células. Las ASC secretan factores inmunomoduladores como la interleucina-10 (IL-10) y el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β), así como factores neurotróficos como el factor de crecimiento nervioso (NGF), el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), el factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF) y la neurotrofina-3 (NT-3) que conducen a un aumento del crecimiento de neuritas de los ganglios de la raíz dorsal in vitro y a la recuperación de la función in vivo 17,19,32,33, Artículo 34. Las ASC administradas en soluciones acuosas promovieron la recuperación funcional después de la lesión de la médula espinal en ratas y humanos; sin embargo, se observaron desafíos para mediar la migración, la diferenciación, la supervivencia y la diferenciación de las ASC 35,36,37. Además, existen informes contradictorios sobre el potencial tumorigénico de las ASC trasplantadas; mientras que algunos estudios indicaron que las ASC pueden contribuir a la proliferación y metástasis de diferentes tipos de cáncer, otros estudios también han demostrado potenciales antitumorales 38,39,40,41 Por lo tanto, es necesario investigar en el futuro un perfil de seguridad a largo plazo de las ASC en hidrogeles compuestos nerviosos. En este caso, la médula espinal descelularizada y los nervios ciáticos se han estudiado por separado para la reparación de la LME.

Se inyectaron médula espinal descelularizada en un modelo de rata de LME y se estimuló el crecimiento axonal en la lesión y se elevó la recuperación funcional; Sin embargo, debido a la rápida degradación, se formó un quiste y la recuperación disminuyó después de 4-8 semanas de tratamiento4, 42. Se inyectó hidrogel acelular descelular del nervio ciático en ratas con LME y promovió la regeneración neuronal, pero la eficacia del hidrogel fue limitada debido a la rápida degradación24. Por lo tanto, los enfoques combinatorios que utilizan tejidos descelularizados han ganado atención recientemente. Se informó que los hidrogeles descelularizados de la médula espinal promovieron la proliferación, migración y diferenciación en neuronas de células madre neurales/células progenitoras4. También facilitó el crecimiento de neuritas en 3D a partir de células de neuroblastoma N1E-115, lo que indica que los hidrogeles descelularizados de la médula espinal podrían ser un andamio atractivo para promover la regeneración axonal26. Los nervios ciáticos descelularizados se han estudiado con encapsulación de Schwann y mostraron potencial como injerto nervioso después de la LME43. En conjunto, se espera que una combinación de médula espinal descelularizada y nervios ciáticos promueva tanto la regeneración axonal como la restauración de tejidos. El estudio actual tampoco incluye la evaluación de los efectos terapéuticos de los hidrogeles nerviosos cargados de ASC. Por lo tanto, es esencial evaluar los potenciales regenerativos, como los efectos proangiogénicos y neurotróficos, de la plataforma a través de estudios in vitro e in vivo . Además, los hidrogeles compuestos nerviosos se pueden aplicar fácilmente para encapsular otros tipos de células, como las células de Schwann, las células madre olfativas y las células madre neurales, para mejorar la eficacia terapéutica del trasplante de células. Sería intrigante investigar la seguridad y eficacia de varios tipos de células dentro del hidrogel compuesto nervioso en diferentes etapas de la LME.

Uno de los pasos críticos en la creación de hidrogeles compuestos es preparar una cantidad adecuada de tejido, especialmente la médula espinal. El rendimiento de la médula espinal descelularizada es significativamente bajo, como se observa en el protocolo (50-100 mg de pieza de médula espinal y 100-150 mg de pieza de nervio ciático); Por lo tanto, no se recomienda recolectar u obtener médula espinal de animales pequeños como ratones y ratas. Se sugiere que al menos los animales de tamaño mediano, como los conejos, obtienen una cantidad sustancial de matrices de la médula espinal. Además, es importante comprobar el pH al digerir los tejidos descelularizados, ya que la adición de tejido puede desplazar el pH más allá del rango de activación de la pepsina requerido, que es de alrededor de 1,5-2. Los tiempos de agitación para la descelularización de la médula espinal son más largos que el método previamente establecido26 debido a que la velocidad de agitación es más lenta en el protocolo actual. El rotador utilizado en este protocolo ofrece hasta 83 rpm, mientras que en los métodos previamente establecidos se utilizaba un máximo de 200 rpm. Por lo tanto, se aumentaron dos veces los tiempos de agitación para lavar a fondo todos los desechos celulares. Para garantizar que todas las soluciones de descelularización puedan penetrar en los tejidos y lavar todo el contenido celular y nuclear, los tiempos de agitación y la velocidad deben optimizarse mediante análisis de histología o ADN por parte del usuario. Se sugiere que la relación entre los tejidos y la solución de descelularización sea de un mínimo de 1:15 [p/v]. Los tejidos descelularizados en el protocolo previamente establecido26 fueron digeridos/agitados a temperatura ambiente; sin embargo, en este protocolo, se digirieron con una barra magnética en una placa de agitación a 4 °C y 500 rpm durante 4 días. El motor de la placa de agitación podría generar calor e introducirlo en la solución de pregel. Por lo tanto, se recomienda digerir a bajas temperaturas o usar una placa de agitación con temperatura controlable.

Como se señaló en el análisis de ADN (Figura 2B), es fundamental extirpar la duramadre de la médula espinal porque se puede encontrar una cantidad significativa de ADN dentro de la duramadre. La duramadre, a diferencia del parénquima de la médula espinal, está formada por tejido fibroso; Por lo tanto, se deben utilizar diferentes métodos de descelularización como se ha documentado anteriormente44,45. Se ha utilizado la tinción de H&E y el análisis de ADN de tejidos descelularizados para verificar la eficacia del proceso de descelularización. Los siguientes criterios deben cumplirse para cumplir con los objetivos de una descelularización exitosa: 1. Menos de 50 ng de dsDNA/mg de peso seco de ECM, 2. Longitud del fragmento de ADN inferior a 200 pb, 3. Falta de material nuclear en secciones de tejido o H&E5. El análisis cualitativo de la tinción de H&E después de la descelularización mostró una falta de tinción de núcleos, lo que sugiere una eliminación exitosa de las células. Además, se retuvieron los componentes de la MEC, como el colágeno y otras proteínas de la matriz, y la intensidad de la tinción se redujo después de la descelularización, lo que refleja la eliminación del material celular. Después de la descelularización, el contenido de ADN fue de 0,63 ng en el nervio ciático y de 23,74 ± 6,69 ng en la médula espinal por mg de peso seco de ECM, que está por debajo del umbral aceptable para la aplicación in vivo.

Las mediciones reológicas de los hidrogeles compuestos deben diseñarse cuidadosamente, ya que los reómetros con alta fuerza de compresión o los probadores de tracción no se pueden utilizar para analizar las propiedades mecánicas de materiales blandos como los hidrogeles compuestos nerviosos creados en este estudio. Las muestras se desgarrarán cuando se agarren en el probador de tracción, y la compresión con alta fuerza no proporcionará datos lo suficientemente sensibles como para analizar. En este estudio, se utilizó un reómetro con una fuerza de compresión de 250 N, y se recomienda encontrar un aparato con una fuerza similar o adecuada para los propósitos de los usuarios. Como alternativa, diferentes mediciones reológicas, como la medición del cizallamiento oscilatorio, pueden ayudar a determinar los módulos de almacenamiento y pérdida. La reducción de las propiedades mecánicas después de la descelularización es una limitación en este estudio. Aunque el módulo de Young de todos los grupos de hidrogel es similar al de la médula espinal descelularizada, es significativamente diferente de la médula espinal fresca (datos no mostrados). Las células madre neurales y las MSCs cultivadas en materiales relativamente blandos mostraron un aumento de la diferenciación neuronal y de la expresión de tubulina β-III, respectivamente46,47. Sin embargo, es posible reforzar o reticular los materiales descelularizados con otros materiales como el alginato, el poli(etilenglicol), la genipina y el glutaraldehído 48,49,50,51. Será necesaria una optimización para garantizar que estas estrategias para mejorar las propiedades mecánicas de los hidrogeles no influyan en el comportamiento o la viabilidad celular.

La variabilidad de un lote a otro de los hidrogeles compuestos para nervios puede observarse debido en parte a las diferencias en la edad, el sexo, el peso y la especie de los animales. El uso controlado y sistemático del mismo tipo de animales puede ayudar a mitigar la variabilidad. La agrupación de las muestras de tejido de diferentes animales también puede ayudar a reducir la variabilidad entre lotes52. Uno de los desafíos potenciales para trasladar este estudio a aplicaciones clínicas es la escalabilidad. El bajo rendimiento de la descelularización de la médula espinal dificultaría la producción de una gran cantidad de tejidos descelularizados. Sería necesario desarrollar/optimizar nuevos métodos para generar más tejidos, o la duramadre podría descelularizarse junto para aumentar el rendimiento después de la descelularización. Otro desafío potencial es la autorización regulatoria. En los Estados Unidos, la FDA es responsable de la aprobación regulatoria de las terapias basadas en células53. La autoridad reguladora de la República de Corea aprobó la entrada en el mercado de CARTISTEM, que es un producto a base de MSC que consiste en MSC alogénicas derivadas de la sangre del cordón umbilical y un 4% de hidrogel de hialuronato para el tratamiento de defectos del cartílago de la rodilla54. Casos precedentes como estos pueden ayudar a agilizar el proceso de revisión regulatoria al proporcionar datos de seguridad y eficiencia.

Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación PhRMA y los Institutos Nacionales de Salud a través del premio número P20GM139768 y R15NS121884 otorgado a YS. Queremos agradecer al Dr. Kartik Balachandran y al Dr. Raj Rao del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Arkansas por permitirnos utilizar sus equipos. Además, queremos agradecer al Dr. Jin-Woo Kim y al Sr. Patrick Kuczwara del Departamento de Ingeniería Biológica y Agrícola de la Universidad de Arkansas por brindar capacitación sobre reómetro.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
3-(Decildimetilamonio)sulfonato de propano sal internaSigma-AldrichD4266Utilizado durante la descelización del nervio ciático, SB-10
3-(N,N-Dimetilpalmitilammonio)sulfonato de propanoSigma-AldrichH6883Usado durante la descelularización del nervio ciático, SB-16
Reactivo AlamarBlueFisher ScientificDAL1100Utilizado durante la prueba de viabilidad de células AlamaBlue
Condroitinasa ABCSigma-AldrichC3667Utilizado durante la descelularización del nervio ciático
CriostatoLeicaCM1860
DesoxirribonucasaSigma-AldrichD4263Utilizado durante la descelularización del nervio ciático
Fosfato de hidrógeno dissódico heptahidratadoVWRBDH9296Químico para 100 mM de Na/50 mM de phos y 50 mM Na/10 mM de phos buffer
DNeasy Blood & Kit de pañuelosQiagen69506Utilizado durante el análisis de ADN
Montaje DPX para histologia, medio de montaje de correderaSigma-Aldrich6522Utilizados durante H& Tinción con E
EosinaSigma-AldrichHT110216Utilizados durante H& Tinción con E
EtanolVWR89125-172
FormaldehídoSigma-Aldrich252549Utilizados durante H& Tinción con E
Glutaraldehído (GA)Sigma-AldrichG6257Utilizado durante la funcionalización de la superficie del PDMS
Medios de crecimiento hASCLonzaPT-4505Se utiliza para cultivar hASCs, que contienen suero bovino fetal y penicilina/estreptomicina
HematoxilinaVWR26041-06Utilizados durante H& Tinción con E
Células madre humanas derivadas del adiposoLonzaPT-5006
Ácido clorhídrico (HCl)Sigma-Aldrich320331Se utiliza para digerir tejidos descelularizados y ajustar soluciones de Pregel
Medios M199Sigma-AldrichM0650Se usa para diluir pregels hasta la concentración deseada
Compuesto de temperatu de corte óptimoTissue-Tek4583
PepsinaSigma-AldrichP7000Usado para digerir tejidos descelularizados
Ácido peracéticoCallejón LabPAA1001Utilizado durante la descelularización de la médula espinal
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)VWR97062-948
Lector de matrículasBioTek InstrumentsSynergy Mx
Polietilenimina (PEI)Sigma-Aldrich181978Utilizado durante la funcionalización de la superficie del PDMS
Nervio ciático porcinoTissue Source LLCCerdos vivos, sin información identificable ni detalles de trazabilidad
Médula espinal porcinaTissue Source LLCCerdos vivos, sin información identificable ni detalles de trazabilidad
Sistema dsDNA QuantiFluorPromegaE2670Utilizado para analizar el contenido de ADN
ReómetroTA InstrumentsDHR 2
Rotador robustoGlas-co099A RD4512Utilizado durante la descelularización de la médula espinal
Cloruro de sodio (NaCl)VWRBDH9286Químico para 100 mM de Na/50 mM de phos y 50 mM Na/10 mM de phos buffer
Desoxicolato de sodioSigma-AldrichD6750
Monohidrato de fosfato de dihidrógeno sódicoVWRBDH9298Químico para 100 mM de Na/50 mM de phos y 50 mM Na/10 mM de phos buffer
Solución de hidróxido de sodio (NaOH)Sigma-Aldrich415443Se usa para ajustar las soluciones de Pregel
SU-8Materiales recomendados por KayakuSU8-100Usado para recubrir obleas de silicio
SacarosaSigma-AldrichS8501Utilizado durante la descelularización de la médula espinal
Kit de elastómero de silicona Sylgard 184DOW1317318Base y agente de curado de polidimetilxiloxano (PDMS)
Triton X-100Sigma-AldrichX100Utilizado durante la descelularización de la médula espinal
Tripsina-EDTA (0,05%), fenol rojoThermo Fisher25300062Utilizado durante trabajos de hASC y durante la descelización de la médula espinal
Rotador de revólver de tuboThermo Fisher88881001Utilizado durante la descelularización del nervio ciático
XilenoVWRMK866816Utilizados durante H& Tinción con E

Referencias

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