Este protocolo describe metodologías para establecer un modelo de implantación embrionaria in vitro simple y eficiente para evaluar las moléculas relevantes que afectan el proceso de implantación embrionaria.
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Artículo de método
Establecimiento de un modelo de implantación embrionaria in vitro
En este artículo
Resumen
Resumen
La implantación embrionaria es el primer paso para el establecimiento de un embarazo exitoso. Un modelo in vitro para la implantación de embriones es fundamental para la investigación biológica básica, el desarrollo de fármacos y el cribado. En este trabajo se presenta un modelo in vitro sencillo, rápido y altamente eficiente para la implantación de embriones. En este protocolo, primero introducimos la adquisición de blastocisto de ratón y la preparación de células de adenocarcinoma de endometrio humano (Ishikawa) para la implantación, seguido del método de cocultivo para embriones de ratón y células de Ishikawa. Por último, realizamos un estudio para evaluar el impacto de concentraciones variables de 17-β-estradiol (E2) y progesterona (P4) en las tasas de adhesión embrionaria basadas en este modelo. Nuestros hallazgos revelaron que las altas concentraciones deE2 redujeron significativamente la adhesión embrionaria, mientras que la adición de progesterona podría restaurar la tasa de adhesión. Este modelo ofrece una plataforma sencilla y rápida para evaluar y cribar las moléculas implicadas en el proceso de adhesión, como las citocinas, los fármacos y los factores de transcripción que controlan la implantación y la receptividad endometrial.
Introducción
La implantación del embrión, el paso inicial de un embarazo exitoso, es crucial para comprender su base biológica y abordar los desafíos de la infertilidad. Sin embargo, las restricciones éticas plantean limitaciones significativas en la recolección de muestras clínicas de embriones humanos, lo que dificulta la investigación sobre las intrincadas interacciones entre los embriones humanos y el endometrio durante el embarazo temprano1. Una comprensión profunda de estos complejos mecanismos es vital para avanzar en la investigación biológica fundamental, el descubrimiento de fármacos y la salud reproductiva.
Los modelos in vitro anteriores empleaban modelos de adhesión en los que las células epiteliales endometriales humanas monocapa (RL95-2)2 se cocultivaban con sustitutos embrionarios, como las células de coriocarcinoma BeWo, JAr o Jeg-33 . Sin embargo, la selección del tamaño de los esferoides, que oscilaba entre 70 y 100 μm, fue crucial, ya que los agregados de células más grandes o más pequeños podrían comprometer la precisión del experimento. En particular, solo el 25% de los esferoides en cada preparación cumplieron con el estándar para el tamaño4 adecuado, y hubo diferencias significativas en comparación con las condiciones fisiológicas de los blastocistos.
Además, los sistemas de cultivo tridimensional (3D) para el endometrio y el blastocisto ofrecen un entorno fisiológicamente más relevante5, pero requieren una gran experiencia técnica, un crecimiento celular lento, altos costos de recursos y mantenimiento, dificultad en la estandarización y baja reproducibilidad6.
En este protocolo, presentamos un modelo in vitro rentable y rápido de implantación de embriones que puede desarrollarse y utilizarse en la mayoría de los laboratorios. El objetivo general de este método es proporcionar una plataforma fiable y reproducible para estudiar las interacciones entre los embriones y el endometrio en un entorno controlado. Al simular eventos clave de la implantación de embriones in vitro, este modelo tiene como objetivo cerrar la brecha entre los modelos animales y los entornos clínicos, lo que permite una investigación más precisa y específica.
En comparación con los sustitutos embrionarios, el uso de blastocistos de ratón ofrece una representación fisiológicamente más relevante del proceso de implantación embrionaria in vivo7. Además, la línea celular de Ishikawa, derivada del adenocarcinoma de endometrio humano, posee características mixtas de epitelio glandular y epitelio lumínicouterino 1, lo que le permite expresar enzimas, proteínas estructurales y receptores de esteroides funcionales similares a los que se encuentran en el endometrio normal, proporcionando así un sustrato fisiológicamente relevante para la implantación del embrión. La simplicidad y rapidez del sistema de cocultivo permite el cribado y la realización de pruebas de drogas de alto rendimiento 8,9,10. Al proporcionar una plataforma robusta y reproducible, este método ofrece una oportunidad para avanzar en nuestra comprensión de la implantación de embriones y su impacto en la salud humana.
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Protocolo
El manejo de ratones y los estudios experimentales se realizaron bajo protocolos aprobados por el Comité Animal del Instituto de Tecnologías Biomédicas y Farmacéuticas de Shanghai. Garantice los procedimientos de seguridad: Siempre use el equipo de protección personal (EPP) adecuado cuando manipule productos químicos o materiales biológicos.
1. Adquisición de embriones de ratón
NOTA: Esta sección describe el proceso de obtención de embriones de ratón. Los ratones hembra adultos (6-8 semanas de edad, híbridos C57BL/6 y DBA/2) se mantuvieron en condiciones ambientales estándar de 12 h de luz y 12 h de oscuridad a 20-25 °C y 40-60% de humedad con alimento y agua proporcionados ad libitum.
- Inyectar a ratones hembra por vía intraperitoneal 10 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG) y, a continuación, inyectarles 10 UI de gonadotropina coriónica humana (HCG) en un intervalo de 42-48 h.
- Aparea cada ratón hembra con un macho de edad comparable y comprueba si hay un tapón vaginal a la mañana siguiente.
NOTA: El tapón vaginal es un bulto de supositorio de color amarillo claro que se forma después de que el semen se solidifica en la abertura vaginal. - Eutanasia a los ratones hembra con tapones vaginales por inhalación de CO2 .
- Abre el abdomen y localiza los genitales femeninos; estirar el oviducto, el ovario y las almohadillas de grasa con fórceps; cortar el oviducto y el ovario con unas tijeras; y luego, cortar el oviducto y el útero (Figura 1).
- Transfiera el oviducto obtenido a una placa de Petri de 35 mm precargada con medio M2.
NOTA: El medio M2 debe precalentarse en una incubadora (37 °C, 5% deCO2) durante 30 min. - Punción de la ampolla agrandada del oviducto con una aguja de 25 G para liberar o pellizcar el complejo cúmulo-cigoto (Figura 2).
- Utilice fórceps para transferir el complejo cúmulo-cigoto a una solución M2 que contenga 0,5 mg/ml de hialuronidasa e incube durante varios minutos hasta que las células del cúmulo se disocien (Figura 3).
- Recoja los cigotos con una pipeta de transferencia de huevos y lávelos en un medio M2 que contenga 4 mg/ml de BSA para eliminar la hialuronidasa residual, las células del cúmulo y las impurezas.
2. Cultivo in vitro de embrión de ratón
NOTA: En esta sección se detalla el proceso de cultivo in vitro de embriones de ratón desde cigotos hasta blastocistos. Las microgotas de cultivo KSOM deben prepararse con 24 horas de anticipación para garantizar el equilibrio de temperatura y gas.
- Prepare 12 microgotas de medio KSOM, cada una con un volumen de 20 μL, en el fondo de una placa de Petri de 35 mm. Cubra las microgotas con 3-5 mL de aceite mineral (Figura 4) y coloque las placas de Petri en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 para equilibrarlas.
- Transfiera los embriones de ratón del medio M2 al medio KSOM utilizando una pipeta de transferencia para un lavado a fondo.
NOTA: Este paso requiere un microscopio estereoscópico con una etapa de calentamiento de 37 °C. Minimice la duración de la manipulación de los embriones fuera de la incubadora. - Colocar los embriones lavados en las microgotas KSOM preparadas e incubarlos a 37 °C con 5% de CO2 durante 4 días.
NOTA: Para garantizar una nutrición adecuada, cultive de 5 a 10 embriones por microgota de 20 μL. - Seleccione los blastocistos ventajosos según su tamaño (100-130 μm), la masa celular interna (la masa celular interna está compuesta por muchas células que están todas compactadas), el número de células trofoblásticas (la trofoectodermis compuesta por muchas células que están cohesivas y empaquetadas) y el grado de expansión (el blastocoel ocupa el 80-100% del embrión).
3. Preparación de las células endometriales
- Dentro de una cabina de bioseguridad, aspire 1 ml de gelatina al 2% con una pipeta y dispense en una placa de cultivo de 12 pocillos. Gire suavemente el plato para asegurar una cobertura completa del fondo con la gelatina. Coloque la placa en una incubadora a 37 °C durante 30 min. Después, aspira el exceso de gelatina y deja que el fondo del plato se seque por completo.
- Una vez finalizado el proceso de recubrimiento, se cultivan células de adenocarcinoma endometrial humano (Ishikawa) con DMEM/F12 (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles), 1 mM de piruvato de sodio, 2 mM de L-glutamina, 100 μg/mL de estreptomicina y 100 UI/mL de penicilina, se siembran en las placas de 12 pocillos recubiertas de gelatina (2 × 105células/pocillo) e incuban durante 24 h.
4. Fijación del embrión
- Coloque suavemente de 5 a 15 blastocistos frescos en cada pocillo de la placa de 12 pocillos que contiene células de Ishikawa preparadas en el paso anterior para el cocultivo (Figura 5).
- Después de 48 h de incubación, observe los embriones bajo un microscopio para evaluar su estado de fijación. Para observar la unión del embrión, mueva rápidamente la placa tres veces. Los embriones sueltos exhibirán un movimiento de flotación o rodadura sobre la superficie de las células de Ishikawa.
- Calcular la tasa de implantación embrionaria utilizando la ecuación (1); Utilice la tasa de adhesión del embrión para representar el efecto de implantación.
Tasa de implantación embrionaria = (embriones adjuntos/número total de embriones implantados) × 100% (1)
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Resultados
En el proceso de las técnicas de reproducción asistida, la hiperestimulación ovárica controlada (COH) es un paso crucial, ya que conduce a niveles de estrógeno significativamente elevados en las pacientes en más de 10-20 veces en comparación con los ciclos naturales11. En este contexto, nos preguntamos si las altas concentraciones séricas de estrógenos influyen en la implantación embrionaria durante la transferencia de embriones en fresco. A partir de este modelo de implantación embrionaria, estud...
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Discusión
La simplicidad y rapidez del modelo in vitro propuesto para la implantación embrionaria ofrece ventajas notables para el cribado de fármacos en fase temprana y otras aplicaciones de investigación. El protocolo sencillo, junto con la naturaleza de alto rendimiento de las líneas celulares de Ishikawa, lo convierte en un candidato ideal para pantallas a gran escala, particularmente en las primeras etapas del descubrimiento de fármacos. Liang13 encontró que la eliminación de TAGLN2 disminuyó ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses financieros o de otra índole que declarar.
Agradecimientos
Nuestros estudios fueron apoyados por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82171603), la Fundación de la Comisión Municipal de Salud de Shanghái (202140341), la Comisión de Ciencia y Tecnología de la Municipalidad de Shanghái (23JC1403803) y el Programa de Promoción de la Innovación del NHC y Shanghai Key Labs, SIBPT (RC2023-02).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 17-β-estradiol | SIGMA | 3301 | La hormona estrogénica de mamífero más potente |
| BD Falcon | BD | 353001 | Placas de Petri Bacteriológicas Estilo de 35 x 10 mm con tapa hermética, poliestireno virgen de grado cristalino, estéril |
| Gabinete de Bioseguridad | Clase ESCO |  BSC | Operaciones asépticas, fabricación de placas de cultivo, reactivos de alícuota, etc |
| CO2 Incubadora | Thermo | 8000DH | Cultivo de embriones |
| Placa de cultivo | Corning | 3506 | Cultivo celular |
| DMEM/F12 | Gibco | 1133032 | DMEM/F12 (1x), líquido 1:1,Contiene L-glutamina y 15 mM Tampón HEPES |
| Suero fetal bovino | Gibco | 10099141 | Suero Fetal Bovino, Calificado, Australia Origen |
| Gelatina SIGMA | G9391 | Tipo B, polvo, BioReactivo, apto para cultivo celular | |
| HCG | Nanjing Aibei | M2520 | Reactivo de esterilización, inyección intraperitoneal, 50 UI/mL |
| Hialuronidasa | SIGMA | V900833 | Grado de reactivo, polvo |
| KSOM | Merck | MR-020P-D | (1x), Polvo, sin Rojo de Fenol, 5 x 10 mL |
| L-glutamina | Gibco | 25030081 | L-glutamina-200 mM (100x), líquido |
| M2 | Merck | MR-015-D | EmbryoMax M2 Medio (1x), Líquido, con Aceite Mineral de Rojo Fenólico |
| SIGMA | M8410 | es adecuado para su uso como capa de cobertura para controlar la evaporación y la contaminación cruzada en diversas aplicaciones de biología molecular | |
| Penicilina-estreptomicina, | Gibco | 15140122 | 10,000 unidades de penicilina (base) y 10,000 unidades de estreptomicina (base), utilizando penicilina G (sal de sodio) y sulfato de estreptomicina en solución salina al 0.85% |
| PMSG | Nanjing Aibei | M2620 | Reactivo de esterilización, inyección intraperitoneal, 50 UI/mL |
| Progesterona | SIGMA | 5341 | Hormona esteroide secretada por el cuerpo lúteo durante la segunda mitad del ciclo menstrual |
| Piruvato de sodio | Gibco | 11360070 | El piruvato de sodio se añade habitualmente a los medios de cultivo celular como fuente de carbono además de la glucosa |
| Microscopio estereoscópico | Olympus | SZX7 | Extracción de embriones y observación del desarrollo embrionario |
Referencias
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