Establecimiento de un modelo de implantación embrionaria in vitro

La implantación del embrión, el paso inicial de un embarazo exitoso, es crucial para comprender su base biológica y abordar los desafíos de la infertilidad. Sin embargo, las restricciones éticas plantean limitaciones significativas en la recolección de muestras clínicas de embriones humanos, lo que dificulta la investigación sobre las intrincadas interacciones entre los embriones humanos y el endometrio durante el embarazo temprano¹. Una comprensión profunda de estos complejos mecanismos es vital para avanzar en la investigación biológica fundamental, el descubrimiento de fármacos y la salud reproductiva.

Los modelos in vitro anteriores empleaban modelos de adhesión en los que las células epiteliales endometriales humanas monocapa (RL95-2)² se cocultivaban con sustitutos embrionarios, como las células de coriocarcinoma BeWo, JAr o Jeg-3³ . Sin embargo, la selección del tamaño de los esferoides, que oscilaba entre 70 y 100 μm, fue crucial, ya que los agregados de células más grandes o más pequeños podrían comprometer la precisión del experimento. En particular, solo el 25% de los esferoides en cada preparación cumplieron con el estándar para el tamaño⁴ adecuado, y hubo diferencias significativas en comparación con las condiciones fisiológicas de los blastocistos.

Además, los sistemas de cultivo tridimensional (3D) para el endometrio y el blastocisto ofrecen un entorno fisiológicamente más relevante⁵, pero requieren una gran experiencia técnica, un crecimiento celular lento, altos costos de recursos y mantenimiento, dificultad en la estandarización y baja reproducibilidad⁶.

En este protocolo, presentamos un modelo in vitro rentable y rápido de implantación de embriones que puede desarrollarse y utilizarse en la mayoría de los laboratorios. El objetivo general de este método es proporcionar una plataforma fiable y reproducible para estudiar las interacciones entre los embriones y el endometrio en un entorno controlado. Al simular eventos clave de la implantación de embriones in vitro, este modelo tiene como objetivo cerrar la brecha entre los modelos animales y los entornos clínicos, lo que permite una investigación más precisa y específica.

En comparación con los sustitutos embrionarios, el uso de blastocistos de ratón ofrece una representación fisiológicamente más relevante del proceso de implantación embrionaria in vivo⁷. Además, la línea celular de Ishikawa, derivada del adenocarcinoma de endometrio humano, posee características mixtas de epitelio glandular y epitelio lumínico^{uterino 1}, lo que le permite expresar enzimas, proteínas estructurales y receptores de esteroides funcionales similares a los que se encuentran en el endometrio normal, proporcionando así un sustrato fisiológicamente relevante para la implantación del embrión. La simplicidad y rapidez del sistema de cocultivo permite el cribado y la realización de pruebas de drogas de alto rendimiento ^8,9,10. Al proporcionar una plataforma robusta y reproducible, este método ofrece una oportunidad para avanzar en nuestra comprensión de la implantación de embriones y su impacto en la salud humana.

El manejo de ratones y los estudios experimentales se realizaron bajo protocolos aprobados por el Comité Animal del Instituto de Tecnologías Biomédicas y Farmacéuticas de Shanghai. Garantice los procedimientos de seguridad: Siempre use el equipo de protección personal (EPP) adecuado cuando manipule productos químicos o materiales biológicos.

1. Adquisición de embriones de ratón

NOTA: Esta sección describe el proceso de obtención de embriones de ratón. Los ratones hembra adultos (6-8 semanas de edad, híbridos C57BL/6 y DBA/2) se mantuvieron en condiciones ambientales estándar de 12 h de luz y 12 h de oscuridad a 20-25 °C y 40-60% de humedad con alimento y agua proporcionados ad libitum.

1. Inyectar a ratones hembra por vía intraperitoneal 10 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG) y, a continuación, inyectarles 10 UI de gonadotropina coriónica humana (HCG) en un intervalo de 42-48 h.
2. Aparea cada ratón hembra con un macho de edad comparable y comprueba si hay un tapón vaginal a la mañana siguiente.
   NOTA: El tapón vaginal es un bulto de supositorio de color amarillo claro que se forma después de que el semen se solidifica en la abertura vaginal.
3. Eutanasia a los ratones hembra con tapones vaginales por inhalación de CO₂ .
4. Abre el abdomen y localiza los genitales femeninos; estirar el oviducto, el ovario y las almohadillas de grasa con fórceps; cortar el oviducto y el ovario con unas tijeras; y luego, cortar el oviducto y el útero (Figura 1).
5. Transfiera el oviducto obtenido a una placa de Petri de 35 mm precargada con medio M2.
   NOTA: El medio M2 debe precalentarse en una incubadora (37 °C, 5% de_CO2) durante 30 min.
6. Punción de la ampolla agrandada del oviducto con una aguja de 25 G para liberar o pellizcar el complejo cúmulo-cigoto (Figura 2).
7. Utilice fórceps para transferir el complejo cúmulo-cigoto a una solución M2 que contenga 0,5 mg/ml de hialuronidasa e incube durante varios minutos hasta que las células del cúmulo se disocien (Figura 3).
8. Recoja los cigotos con una pipeta de transferencia de huevos y lávelos en un medio M2 que contenga 4 mg/ml de BSA para eliminar la hialuronidasa residual, las células del cúmulo y las impurezas.

2. Cultivo in vitro de embrión de ratón

NOTA: En esta sección se detalla el proceso de cultivo in vitro de embriones de ratón desde cigotos hasta blastocistos. Las microgotas de cultivo KSOM deben prepararse con 24 horas de anticipación para garantizar el equilibrio de temperatura y gas.

1. Prepare 12 microgotas de medio KSOM, cada una con un volumen de 20 μL, en el fondo de una placa de Petri de 35 mm. Cubra las microgotas con 3-5 mL de aceite mineral (Figura 4) y coloque las placas de Petri en una incubadora a 37 °C con 5% de CO₂ para equilibrarlas.
2. Transfiera los embriones de ratón del medio M2 al medio KSOM utilizando una pipeta de transferencia para un lavado a fondo.
   NOTA: Este paso requiere un microscopio estereoscópico con una etapa de calentamiento de 37 °C. Minimice la duración de la manipulación de los embriones fuera de la incubadora.
3. Colocar los embriones lavados en las microgotas KSOM preparadas e incubarlos a 37 °C con 5% de CO₂ durante 4 días.
   NOTA: Para garantizar una nutrición adecuada, cultive de 5 a 10 embriones por microgota de 20 μL.
4. Seleccione los blastocistos ventajosos según su tamaño (100-130 μm), la masa celular interna (la masa celular interna está compuesta por muchas células que están todas compactadas), el número de células trofoblásticas (la trofoectodermis compuesta por muchas células que están cohesivas y empaquetadas) y el grado de expansión (el blastocoel ocupa el 80-100% del embrión).

3. Preparación de las células endometriales

1. Dentro de una cabina de bioseguridad, aspire 1 ml de gelatina al 2% con una pipeta y dispense en una placa de cultivo de 12 pocillos. Gire suavemente el plato para asegurar una cobertura completa del fondo con la gelatina. Coloque la placa en una incubadora a 37 °C durante 30 min. Después, aspira el exceso de gelatina y deja que el fondo del plato se seque por completo.
2. Una vez finalizado el proceso de recubrimiento, se cultivan células de adenocarcinoma endometrial humano (Ishikawa) con DMEM/F12 (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles), 1 mM de piruvato de sodio, 2 mM de L-glutamina, 100 μg/mL de estreptomicina y 100 UI/mL de penicilina, se siembran en las placas de 12 pocillos recubiertas de gelatina (2 × 10⁵células/pocillo) e incuban durante 24 h.

4. Fijación del embrión

1. Coloque suavemente de 5 a 15 blastocistos frescos en cada pocillo de la placa de 12 pocillos que contiene células de Ishikawa preparadas en el paso anterior para el cocultivo (Figura 5).
2. Después de 48 h de incubación, observe los embriones bajo un microscopio para evaluar su estado de fijación. Para observar la unión del embrión, mueva rápidamente la placa tres veces. Los embriones sueltos exhibirán un movimiento de flotación o rodadura sobre la superficie de las células de Ishikawa.
3. Calcular la tasa de implantación embrionaria utilizando la ecuación (1); Utilice la tasa de adhesión del embrión para representar el efecto de implantación.
   Tasa de implantación embrionaria = (embriones adjuntos/número total de embriones implantados) × 100% (1)

En el proceso de las técnicas de reproducción asistida, la hiperestimulación ovárica controlada (COH) es un paso crucial, ya que conduce a niveles de estrógeno significativamente elevados en las pacientes en más de 10-20 veces en comparación con los ciclos naturales11. En este contexto, nos preguntamos si las altas concentraciones séricas de estrógenos influyen en la implantación embrionaria durante la transferencia de embriones en fresco. A partir de este modelo de implantación embrionaria, estudiamos los efectos de diversas concentraciones deE2 y P4 sobre las tasas de implantación embrionaria12. Después del tratamiento de inanición, las células de Ishikawa se incubaron con E2 (0, 0,1, 1, 10 y 100 nM) o una combinación de E2 y P4 (0-0, 100-0, 100-10 y 100-100 nM) durante 48 h. A continuación, las células se transfirieron a placas de 12 pocillos recubiertas de gelatina y se añadieron de 5 a 15 blastocistos a cada pocillo. Cada grupo se replicó 3 veces y se determinaron las tasas de implantación a las 48 h.

Los resultados demostraron que las concentraciones casi fisiológicas deE2 (10 nM) aumentaron las tasas de implantación embrionaria en comparación con 0 nME2. Sin embargo, las concentraciones ultra altas deE2 (100 nM) redujeron significativamente las tasas de implantación embrionaria. La adición de P4 dependiente de la dosis alivió los efectos negativos de la E2 ultra alta en la implantación (Figura 6). Sobre la base de este modelo in vitro , ilustramos los efectos negativos de las concentraciones ultra altas no fisiológicas de estrógenos en la implantación embrionaria e introducimos la aplicación de este modelo en la investigación científica.

Figura 1: Escisión del oviducto de ratón. Estire el oviducto, el ovario y las almohadillas de grasa con fórceps, y primero corte el oviducto y el ovario con unas tijeras, y luego extirpe el oviducto del útero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Recuperación del cigoto. La ampolla de agrandamiento de la trompa de Falopio se perfora con pinzas para liberar el complejo cúmulo-cigoto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Aislamiento de cigotos desnudos con digestión de hialuronidasa. Con fórceps, transfiera con cuidado el complejo cúmulo-cigoto a una solución M2 que contenga 0,5 mg/ml de hialuronidasa y déjelo actuar durante unos minutos hasta que las células del cúmulo se desprendan de los cigotos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Cultivo in vitro de embrión de ratón. Prepare 12 microgotas de medio KSOM, cada una con un volumen de 20 μL. Cubra las microgotas con 3-5 mL de aceite mineral. Transfiera los embriones de ratón del medio M2 a la mitad superior de las microgotas KSOM para un lavado a fondo, coloque los embriones lavados en la mitad inferior e incube a 37 °C con 5% de CO2 durante 4 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Implantación embrionaria. Coloque suavemente de 5 a 15 blastocistos frescos en cada pocillo de la placa de 12 pocillos que contiene células de Ishikawa para el cocultivo. Después de 48 h de incubación, mueva rápidamente la placa 3 veces. Los embriones sueltos exhibirán un movimiento de flotación o rodadura sobre la superficie de las células de Ishikawa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Efecto de los estrógenos de ultra alta concentración en la tasa de implantación del embrión. El asterisco indica una diferencia estadísticamente significativa, P < 0,05. Abreviaturas: E2 = estradiol; P4 = progesterona. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen conflictos de intereses financieros o de otra índole que declarar.