Artículo de método

Electropenetrografía AC-DC para el estudio de los comportamientos de sondaje e ingestión de mosquitos Culex tarsalis en manos humanas

DOI:

10.3791/66877

⸱

29 de noviembre de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, Kansas State University, 2Department of Pathobiology, Auburn University, 3National Bio and Agro-Defense Facility, USDA Agricultural Research Service

En este artículo

Resumen

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Se describen procedimientos para estudiar los comportamientos de sondeo e ingestión de mosquitos Culex tarsalis en manos humanas utilizando electropenetrografía AC-DC.

Resumen

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Los mosquitos transmiten patógenos que afectan negativamente a la salud humana y animal. Una mayor comprensión de su biología de alimentación sanguínea y de sus interacciones con huéspedes y patógenos podría aprovecharse para desarrollar nuevos objetivos para el control de enfermedades transmitidas por mosquitos. Desafortunadamente, los comportamientos de sondeo (es decir, picaduras) de los mosquitos son poco conocidos porque ocurren dentro de los tejidos del huésped. Aquí, se describe un procedimiento no invasivo para el uso de electropenetrografía AC-DC (EPG) para visualizar y cuantificar indirectamente los comportamientos de alimentación de los mosquitos mediante el registro de cambios en las señales eléctricas generadas al sondear e ingerir en manos humanas. Se unen delgados cables de oro a los mosquitos con pegamento conductor de plata y se conectan al instrumento EPG. El huésped humano sostiene una sonda de voltaje de sustrato en su mano. El sondeo del huésped por el mosquito conectado completa el circuito eléctrico, y las señales eléctricas se registran en una computadora como "formas de onda" que luego se pueden medir y enumerar para su análisis. Esta metodología se ha utilizado para caracterizar los comportamientos de sondaje e ingestión de los mosquitos Aedes aegypti y Culex tarsalis y puede aplicarse a otras especies de mosquitos. La EPG se puede utilizar para estudiar los efectos de patógenos, insecticidas y otros factores en los comportamientos de alimentación de los mosquitos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los mosquitos causan sufrimiento y pérdidas económicas en todo el mundo debido a su papel como vectores de enfermedades y plagas molestas1. Los mosquitos Anopheles transmiten la malaria, que anualmente causa aproximadamente 219 millones de casos en todo el mundo, más de 400.000 muertes2 y 12 mil millones de dólares estadounidenses en costos directos3. Los mosquitos Aedes son los vectores más notables de importancia para la salud pública porque tienen una presencia casi global y transmiten agentes de chikungunya, dengue, filariasis linfática, fiebre del Valle del Rift, fiebre amarilla y zika, que se cobran vidas, abruman los sistemas de salud y provocan sufrimiento crónico, morbilidad de por vida y discapacidad4,5. Además, los mosquitos Culex transmiten agentes de encefalitis equina, encefalitis japonesa, filariasis linfática, encefalitis de San Luis y fiebre del Nilo Occidental, que afectan tanto a la salud humana como a la animal3,4.

El control de vectores con enfoques basados en insecticidas es el principal método para controlar las enfermedades transmitidas por vectores a nivel mundial6,7. Sin embargo, el número de insecticidas disponibles para el control de mosquitos es limitado. Además, la resistencia a los insecticidas está evolucionando en muchas especies, especialmente en los mosquitos Aedes, lo que afecta nuestra capacidad para combatir las enfermedades transmitidas por vectores e impulsa la necesidad de nuevas estrategias de control6,8. Una mejor comprensión de la biología de los mosquitos, las interacciones mosquito-huésped-patógeno y los procesos que regulan la transmisión de patógenos puede facilitar el desarrollo de nuevas herramientas para el control de vectores6.

Los comportamientos de sondeo e ingestión en los tejidos del huésped pueden afectar la transmisión de patógenos y la patología de la enfermedad9,10,11,12. Por ejemplo, se ingirieron más microfilarias cuando el Aedes aegypti se alimentó directamente de los capilares en lugar de acumular sangre fuera de los vasos rotos13. Por lo tanto, la investigación fundamental y aplicada sobre este tema puede ayudar a desarrollar, refinar y evaluar estrategias de control de mosquitos y otras contramedidas para la transmisión de patógenos. Sin embargo, existen brechas de conocimiento significativas en los detalles de los comportamientos crípticos de alimentación de sangre que ocurren debajo de la superficie de la piel del huésped porque estos comportamientos a menudo requieren procedimientos invasivos en modelos animales vivos o emplean sustratos artificiales transparentes o dietas líquidas9,11,14,15. Las técnicas de electropenetrografía no invasiva (EPG; también llamada gráfico de penetración eléctrica) se han utilizado para estudiar los comportamientos alimenticios de los insectos que se alimentan de plantas relacionados con la transmisión de patógenos de plantas, la resistencia de la planta huésped y los modos de acción de los insecticidas, ya que permiten a los investigadores observar, registrar y cuantificar indirectamente los movimientos y comportamientos de las piezas bucales que ocurren dentro de los tejidos del huésped10,12.

Desde la década de 1950, se han aplicado técnicas electrónicas de monitoreo de penetración a los artrópodos que se alimentan de sangre, incluidos los mosquitos16,17,18,19,20. Sin embargo, la EPG nunca fue ampliamente adoptada para los artrópodos hematoalimentadores porque las actividades biológicas correspondientes a las formas de onda nunca fueron verificadas21. Además, los diseños y la electrónica de los primeros instrumentos dieron lugar a un énfasis excesivo en algunas señales eléctricas, altas relaciones ruido-señal, baja resolución y distorsión de las formas de onda, e irritación para los huéspedes vertebrados12,22. Un instrumento más reciente, el monitor AC-DC EPG 23, tiene configuraciones variables y un procesamiento de señal mejorado, lo que lo hace más adecuado para registrar artrópodos que se alimentan de sangre y descifrar los orígenes biológicos de las formas de onda en estudios experimentales de correlación10,12.

Para EPG, se aplica una señal eléctrica al host a través de una sonda de voltaje de sustrato (es decir, un electrodo de referencia). El artrópodo se conecta a un electrodo de registro y se coloca en el huésped. Cuando el artrópodo inserta sus piezas bucales (es decir, estiletes) en el huésped, la señal eléctrica se transmite al monitor AC-DC EPG para el procesamiento de la señal. Luego, las señales eléctricas se muestran en una computadora como "formas de onda" que corresponden a comportamientos específicos como los movimientos de las piezas bucales, la ingestión, la salivación y la adquisición/inoculación de patógenos10,12. Las variables de respuesta secuenciales y no secuenciales relacionadas con la duración y el recuento de las formas de onda24,25 en diferentes niveles jerárquicos (familias, tipos y subtipos) se pueden calcular en función de la frecuencia y la duración de las formas de onda para obtener información sobre los comportamientos de alimentación que ocurren dentro y entre las especies, y en respuesta a factores bióticos y abióticos, como huéspedes, patógenos, pesticidas y condiciones ambientales10,12.

Hasta ahora, el monitor AC-DC EPG se ha utilizado para caracterizar los comportamientos de sondeo e ingestión de Ae. aegypti26 y Culex tarsalis27 mosquitos alimentándose de manos humanas, y las garrapatas Dermacentor variabilis y Amblyomma americanum alimentándose de terneros bovinos28. Además, recientemente se desarrolló un modelo murino para EPG29 para facilitar los estudios de patógenos utilizando este instrumento. Las manos humanas son ideales para la caracterización inicial de la forma de onda del mosquito porque los huéspedes humanos pueden informar cuándo sienten el sondeo del mosquito, así como otros comportamientos, lo que facilita la correlación de las formas de onda con los comportamientos (Tabla 1). Además, una mejor comprensión de la plasticidad en los comportamientos alimentarios entre los mosquitos en diferentes poblaciones humanas podría contribuir al desarrollo de intervenciones de manejo más especializadas para los mosquitos y los patógenos que transmiten.

Tabla 1: Descripción de las familias de formas de onda utilizadas para clasificar las señales eléctricas registradas de Culex tarsalis en manos humanas utilizando AC-DC EPG. La fase de sondeo y las actividades biológicas correspondientes a cada familia de formas de onda. Consulte Cooper et al.27 para obtener más información. Abreviatura: CA = corriente alterna, CC = corriente continua, EPG = electropenetrógrafo. Por favor, haga clic aquí para descargar esta tabla.

Para facilitar el uso de EPG para estudiar la biología de los mosquitos y las interacciones huésped-vector, aquí se presenta la metodología para cuantificar los comportamientos alimentarios de los mosquitos Cx. tarsalis en manos humanas utilizando el monitor AC-DC EPG. Estos protocolos se basan en los procedimientos fundamentales de AC-DC EPG descritos en los recursos en línea30 y asumen que los usuarios tienen un conocimiento práctico básico de AC-DC EPG y el software asociado31. Los procedimientos descritos pueden modificarse para otras especies de mosquitos y huéspedes y proporcionan una base para facilitar la investigación basada en hipótesis sobre los comportamientos de alimentación de los mosquitos.

Tabla 2: Definiciones de la terminología común de AC-DC EPG. Las definiciones se basan en las que se dan en los recursos en línea30,31 y en la literatura científica32. Abreviatura: CA = corriente alterna, CC = corriente continua, EPG = electropenetrógrafo. Por favor, haga clic aquí para descargar esta tabla.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo (IRB-10729) fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) para la Investigación Humana de la Universidad Estatal de Kansas27 y está diseñado para su uso solo con mosquitos libres de patógenos. Los voluntarios humanos dieron su consentimiento informado para participar en el estudio y publicar sus datos. Antes de iniciar cualquier trabajo con animales, seres humanos o riesgos biológicos, asegúrese de que todos los procedimientos hayan sido revisados y aprobados por los comités reguladores institucionales o las personas supervisoras correspondientes. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los equipos y materiales utilizados en este protocolo.

1. Preparación inicial y configuración

  1. Configure el monitor AC-DC EPG (Figura 1A), la jaula de Faraday (Figura 1B,C) y el software como se describió anteriormente30,31 utilizando las modificaciones que se describen a continuación (pasos 1.1.1-1.1.5). Consulte los recursos en línea30 para obtener tutoriales paso a paso sobre la configuración y el uso del equipo y el software. Guarde la configuración deseada como predeterminada en el software de gestión de hardware y revisión de formas de onda. Consulte la Tabla 2 para obtener una lista de la terminología común de AC-DC EPG y sus definiciones.
    1. Conecte un amplificador de etapa principal (amplificador principal) y una sonda de voltaje de sustrato al canal 1 de la caja de control.
      NOTA: La grabación de un solo canal se presenta aunque el monitor AC-DC pueda acomodar simultáneamente cuatro insectos y huéspedes.
    2. Asegúrese de que el canal 1 de la caja de control esté activado y de que los canales Pre-1 y Post-1 correspondientes de la caja de interfaz del conmutador estén encendidos.
      NOTA: Los canales que no se utilicen deben permanecer apagados.
    3. Utilice el software de administración de hardware para habilitar los canales 1 y 3 en la placa DI-710 A/D (pero no otros) para registrar las señales pre y post rectificadas.
    4. Formatee el software de gestión de hardware para ver/superponer las formas de onda pre y post-rectificadas (por ejemplo, 1 = 1 para la pre-señal y 2 = 3 para la post-señal).
    5. Establezca la frecuencia de muestreo en el software de administración de hardware a 100 muestras por segundo por canal (es decir, S/s/CHAN: 100).
  2. Construir trozos de insectos26,27,29,30:
    1. Precaliente el soldador a la temperatura recomendada para la soldadura específica con núcleo de colofonia.
    2. Utilice una herramienta cortador-peladora de alambre para pelar el recubrimiento de plástico a ~ 6 cm del extremo de un rollo de alambre de cobre de 20 AWG, pero evite cortar o marcar el haz de alambre de cobre en el interior (Figura 2A). A continuación, corte el haz de alambre de cobre expuesto y desenrede en hebras individuales (Figura 2B).
    3. Use alicates de punta fina para envolver una hebra del alambre de cobre alrededor del eje de un pasador de escudo adecuado debajo de la cabeza (es decir, la parte superior plana) de modo que la mayor parte del alambre de cobre se extienda más allá de la cabeza del alfiler. Doble la cola del cable sobre la cabeza del alfiler para asegurar el cable en su lugar (Figura 2C).
      NOTA: Ajuste los pines del escudo para identificar los que encajan perfectamente en el puerto del amplificador principal (cuando está apagado, desenchufado y ajustado a 106 ohmios (Ω)).
    4. Sujete el eje del pasador del escudo en las manos de ayuda para soldar de modo que el alambre de cobre apunte hacia arriba. A continuación, aplique un pequeño toque (~0,2 cm de bola) de fundente soluble en agua en la unión del pasador del escudo y el alambre de cobre (Figura 2D).
      PRECAUCIÓN: El fundente es tóxico y debe manipularse con cuidado.
    5. Desenrolle ~ 10 cm de soldadura y enderécela. Sostenga el soldador caliente contra la cabeza del pasador durante unos segundos hasta que el fundente se derrita y el metal esté caliente. Luego, presione la punta de la soldadura contra la cabeza del pin junto al soldador hasta que la soldadura se derrita y cubra completamente la unión, fusionando el pin y el cable en un trozo de insecto.
    6. Mientras el trozo de insecto se enfría, limpie la punta del soldador con lana de acero y una esponja húmeda.
    7. Una vez que se enfríe, retire el trozo de insecto de las manos amigas. Enjuague el trozo de insecto con etanol al 70% y luego con agua para eliminar el fundente residual. Recorte el alambre de cobre a la longitud deseada (~3 cm, Figura 2E).
    8. Repita los pasos 1.2.3-1.2.7 hasta que se construyan 20-30 trozos de insectos.
  3. Montar un aspirador de insectos26,27:
    1. Pase la punta de una pipeta Pasteur de vidrio a través de una llama, girando ligeramente la pipeta. Repita hasta que el extremo de la pipeta tenga el tamaño adecuado para que quepa cómodamente alrededor del abdomen del insecto.
    2. Cubra el extremo grande de la pipeta Pasteur modificada con una mosquitera, luego insértela directamente en el tubo de silicona conectado a un aspirador de laboratorio y asegure la unión con cinta aislante para formar un aspirador de insectos (Figura 2H).
      NOTA: La pipeta y la red Pasteur se pueden insertar en un trozo corto de tubo de plástico equipado con un seccionador rápido para cambiar fácilmente entre diferentes tamaños (Figura 2H).

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Figura 1: La configuración del equipo de monitor AC-DC EPG para grabar en manos humanas. (A) Componentes de la EPG, incluyendo (1) caja de control, (2) caja de interfaz de interruptor, (3) fuente de alimentación, (4) placa DI-710 A/D, (5) computadora, (6) regulador de potencia y (B) jaula de Faraday que contiene (C) un microscopio digital (7) en un soporte de cuello de cisne, (8) plástico de burbujas y almohadas de aire, (9) sonda de voltaje de sustrato y (10) amplificador de etapa de cabeza en un soporte de laboratorio. Abreviaturas: CA = corriente alterna, CC = corriente continua, EPG = electropenetrógrafo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Electrodos de grabación para el cableado de mosquitos y un aspirador de insectos para manipular mosquitos durante el cableado. (A) Alambre de cobre de 20 AWG con 6 cm de recubrimiento de plástico retirado para exponer el haz de alambre de cobre en el interior. (B) Hilos individuales del haz de alambre de cobre. (C) Una hebra de alambre de cobre envuelta alrededor de la cabeza de un pasador de escudo de latón con la cola del cable doblada sobre la cabeza del pasador. (D) Un poco de fundente en la unión del pasador del escudo de latón y el alambre de cobre sostenido por una ayuda de soldadura de manos amigas en preparación para soldar. (E) Un trozo de insecto completo construido a partir de un clavo de latón soldado a un alambre de cobre. (F) Un electrodo registrador construido a partir de un alambre de oro envuelto alrededor de la punta del alambre de cobre de un trozo de insecto y asegurado en su lugar con pegamento de plata. (G) Un primer plano del bucle de oro en la punta del electrodo de registro. (H) Un aspirador de insectos ensamblado (arriba) y desmontado (abajo) hecho de pipetas Pasteur modificadas, mosquitero, tubo de plástico, cinta aislante y seccionadores rápidos macho, junto al tubo del aspirador de laboratorio equipado con el seccionador rápido hembra (arriba a la derecha). Barras de escala = 1 cm (A-F), 200 μm (G). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Cableado de mosquitos

  1. Prepare los mosquitos y el pegamento de plata (la tarde/noche antes de EPG):
    1. Cría y mantiene los mosquitos de la cepa KNWR de Cx. tarsalis como se describió anteriormente27.
    2. Mosquitos hembra adultos rápidos, 5-17 días después de la eclosión, durante 8-12 h para mejorar las tasas de sondaje pero permitir el acceso al agua para evitar la mortalidad.
    3. Prepare pegamento de plata fresco26,27,28,29,30:
      1. Añadir 510 mg de copos de plata de 4-8 μm a un vaso de precipitados de 20 mL. Rompe la balanza y añade 1.100 mg de pegamento escolar no tóxico al vaso de precipitados sobre la escama de plata.
      2. Tara la balanza, agregue 510 mg de copo de plata de 8-10 μm al vaso de precipitados sobre el pegamento y luego agregue 1,000 μL de agua con una pipeta.
      3. Agregue suavemente una barra de agitación al vaso de precipitados y colóquela en la placa de agitación. Comience a revolver lentamente, aumente gradualmente a la configuración 'rápida' y revuelva durante 4 minutos. Asegúrese de que todos los contenidos estén incorporados.
      4. Utilice una pipeta de transferencia (con la punta cortada) para transferir el pegamento de plata a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
      5. Envuelva la parte superior de los tubos de pegamento plateado con Parafilm y guárdelo en la mesa de trabajo hasta su uso.
        NOTA: El pegamento de plata tiene la consistencia correcta hasta por 2 días, pero se recomienda hacer pegamento fresco la noche antes de usarlo30.
  2. Preparar electrodos de grabación26,27,29,30:
    1. Agite vigorosamente el pegamento de plata antes de usarlo.
    2. Envuelva un bloque de espuma con una envoltura de plástico fresco para sujetar los trozos de insectos preparados y los mosquitos alambrados.
      NOTA: La espuma debe ser lo suficientemente grande como para permitir que los mosquitos conectados se paren en la superficie sin tocarse entre sí, pero lo suficientemente pequeña como para caber dentro de una caja de almacenamiento. PRECAUCIÓN: Las gotitas excretoras liberadas después de la alimentación con sangre pueden contener patógenos. Deseche la envoltura de plástico/bloque de espuma adecuadamente después de usarla.
    3. Retira el deslustre (y el pegamento de plata viejo si vas a utilizar trozos de insectos) de la punta del alambre de cobre raspando el 1 cm superior del alambre de cobre con una cuchilla de afeitar hasta que esté brillante por todos lados. Prepare un trozo de insecto para cada mosquito, además de algunos extras.
    4. Corta alambre de oro de 0,025 mm de diámetro en trozos de 4-5 cm de largo. Sujete siempre el alambre en pinzas de cierre automático enmascaradas con cinta adhesiva para evitar abolladuras en el alambre.
      NOTA: El alambre dorado es mucho más fácil de ver sobre un fondo negro.
    5. Coloque el extremo del alambre de oro a lo largo de la punta limpia del alambre de cobre del trozo de insecto y envuelva suavemente el alambre de oro 3 veces alrededor del alambre de cobre.
    6. Usa una sonda de disección para aplicar pegamento de plata para mantener el alambre de oro en su lugar. Asegúrese de que no haya cola ni cabo suelto. Coloca el trozo de insecto en la espuma hasta que el pegamento se seque.
    7. Acaricie suavemente el alambre de oro unido al trozo de insecto para alisarlo y darle forma de un arco largo y suave (Figura 2F). Recorta el alambre a la longitud deseada (~2,5-3 cm).
    8. Trabajando bajo un microscopio de disección, use pinzas de punta fina para hacer un lazo de oro en la punta del alambre de oro y doble el lazo en un ángulo de 90° como se describe a continuación (pasos 2.2.8.1-2.2.8.4; Figura 2E,F). Asegúrese de que el lazo dorado esté completamente cerrado. Regrese el trozo de insecto al bloque de espuma.
      1. Con la mano no dominante, sostenga el trozo de insecto por el clavo de latón, con la punta del alambre dorado tocando la platina del microscopio. Con la mano dominante, agarre el extremo del alambre de oro con pinzas de punta fina.
      2. Con las pinzas de punta fina, cruza la punta del alambre de oro sobre el alambre de cobre del trozo de insecto cerca de donde está pegado el alambre de oro. Toque el extremo de las pinzas de punta fina y el alambre de oro contra la platina del microscopio.
      3. Tire suavemente del trozo de insecto hasta que el alambre de oro forme un pequeño lazo de oro alrededor de la punta de las pinzas de punta fina (no tire demasiado apretado). Suelta el alambre de oro y retira con cuidado las pinzas.
      4. Mientras aún sostiene el trozo de insecto en la mano no dominante, agarre el lazo de oro con las pinzas de punta fina de modo que las pinzas queden en un ángulo perpendicular al cuello del alambre y la punta de las pinzas abarquen el centro del anillo de oro, agarrando así ambos lados del bucle. Tire suavemente de la muñón del insecto mientras gira ligeramente las pinzas alejándolas del muñón del insecto hasta que el lazo se doble en un ángulo de 90° con respecto al cuello del alambre (Figura 2G).
  3. Conecte electrodos de grabación a mosquitos26,27,29,30 (la mañana de EPG):
    1. Anestesiar a los mosquitos en ayunas con gas CO2 hasta que se detenga todo movimiento. Coloque a los mosquitos boca arriba en la almohadilla de anestesia, con el abdomen mirando hacia el investigador.
    2. Coloque un trozo de cinta de laboratorio de ~2 cm debajo de un microscopio de disección, con el lado adhesivo hacia abajo. Coloque una gota de 0,5 cm (~ 10 μL) de pegamento de plata sobre la cinta.
    3. Aspire el abdomen de un mosquito anestesiado en la pipeta Pasteur modificada usando la succión solo el tiempo suficiente para asentar el abdomen en su lugar. Sostenga el mosquito debajo del telescopio de disección sobre el pegamento de plata con el aspirador.
      NOTA: Las alas pueden estar dentro o fuera de la punta de la pipeta Pasteur modificada, pero tenerlas dentro ayudará a evitar que el mosquito se caiga. Evite doblar o dañar las alas.
    4. Trabajando rápidamente, sumerja un alfiler en el pegamento de plata y aplique una capa delgada en el pronoto del mosquito (es decir, la superficie dorsal del tórax). Proceda inmediatamente al siguiente paso si es posible (o vuelva a anestesiar al mosquito si es necesario).
      NOTA: Se recomienda eliminar las escamas del pronoto frotando el alfiler hacia adelante y hacia atrás para ayudar a garantizar la penetración del pegamento en los poros de la cutícula. Evite que el pegamento entre en contacto con cualquier otra parte del mosquito.
    5. Sumerja rápidamente el bucle de oro en la punta del electrodo de registro en el pegamento de plata y colóquelo en el punto de pegamento de plata en el pronoto del mosquito. Balancea el lazo hacia adelante y hacia atrás para asegurarte de que quede al ras del pronoto. Sostenga el alambre hasta que el pegamento se seque (~20-25 s).
    6. Vuelva a colocar el trozo de insecto en la espuma en un ángulo que permita que el mosquito conectado se pare cómodamente cuando se despierte. Proceda con el cableado del siguiente mosquito.
      NOTA: Es recomendable tomar notas sobre la calidad de cada trabajo de cableado.
    7. Una vez que se haya conectado la cantidad deseada de mosquitos, coloque el bloque de espuma en una caja de almacenamiento. Mantenga los mosquitos en condiciones normales de cría hasta su uso.

3. Configuración y preparación de EPG (la mañana antes de EPG)

  1. Encienda el monitor AC-DC EPG (accionando el interruptor de la fuente de alimentación) al menos 30 minutos antes de la grabación para permitir el equilibrio del instrumento y cualquier solución >
  2. Encienda la computadora y abra el software de administración de hardware.
    NOTA: Si las señales no aparecen como líneas delgadas planas, es necesario solucionar el problema (consulte la sección de discusión).
  3. Realice la prueba táctil27,30 para verificar la funcionalidad del equipo:
    1. Mientras está conectado a tierra (es decir, tocando la jaula de Faraday con la piel desnuda), gire el dial del amplificador principal a 106 Ω e inserte el eje de un trozo de insecto en el puerto><. NOTA: Realizar la prueba de tacto a un nivel de resistencia de entrada (Ri) más alto puede dañar el amplificador principal.
    2. Mientras está conectado a tierra, encienda el amplificador principal y sujete firmemente el cable de cobre del trozo de insecto entre el dedo índice y el pulgar tres veces. Si el EPG funciona correctamente, aparecerán tres grandes picos tanto en la señal previa como en la posterior en la pantalla. Si este no es el caso, es necesario solucionar el problema (consulte la sección de discusión).
  4. Ajuste la configuración del instrumento a una corriente alterna (CA) de 150 mV con un Ri de 107 Ω, una ganancia de hardware de 20-40x, un desplazamiento negativo, una línea de base nativa y una ganancia de software de 8-16x27,30, como se describe a continuación (pasos 3.4.1-3.4.3).
    1. Configure el voltaje, el tipo de corriente, la ganancia de hardware (rango, ganancia y multiplicador), el desplazamiento y la línea de base (cero) usando los interruptores y diales en el canal 1 de la caja de control.
      NOTA: La configuración de ganancia de hardware adecuada depende de la calidad del trabajo de cableado y del pegamento de plata, por lo que se espera una variación en la configuración de ganancia óptima de un mosquito a otro y del día a día. Es posible que sea necesario ajustar la ganancia de hardware a mitad de la grabación si la señal alcanza su punto máximo (definido en la Tabla 2 y mostrado en Figura 3A,C) o es demasiado pequeño para visualizar. Cualquier cambio en la ganancia de hardware afectará permanentemente a la grabación (se muestra en Figura 3A,C).
    2. Ajuste el nivel de Ri con el dial del amplificador principal.
    3. Establezca y ajuste la ganancia del software utilizando el software de gestión de hardware (por ejemplo, seleccione la señal previa o posterior y luego haga clic con el botón izquierdo para aumentar la ganancia del software o haga clic con el botón derecho para reducir la ganancia del software).
      NOTA: Cualquier cambio de ganancia realizado en el software NO afectará permanentemente la grabación.
  5. Configure una nueva grabación en el software de administración de hardware, pero no comience a grabar hasta el paso 4.3 en la siguiente sección.

4. EPG en manos humanas26,27 :

  1. Después de obtener el consentimiento informado (según lo especificado por el IRB de la institución de origen), haga que el anfitrión se siente junto a la jaula de Faraday con un brazo adentro mientras agarra la sonda de voltaje del sustrato y la sostiene debajo del amplificador principal><. NOTA: El brazo debe descansar cómodamente sobre plástico de burbujas o un sustrato similar no conductor. La sonda de voltaje manual y subestatal no debe entrar en contacto con la jaula de Faraday o el amplificador principal durante la grabación. Para evitar daños, es imperativo que el voluntario no toque el amplificador principal una vez que esté encendido. Si el amplificador principal se toca accidentalmente, realice la prueba táctil descrita anteriormente para evaluar su funcionalidad.
  2. Una vez que el host esté en posición, gire el amplificador principal hacia un lado. Retire un mosquito con cable de la caja de almacenamiento y conéctelo al instrumento insertando el pin de latón del trozo de insecto en el puerto del amplificador principal. Deja el mosquito colgando.
    NOTA: Mantenga cerca una botella rociadora de etanol al 70% para controlar cualquier mosquito que se desprenda del cable.
  3. Inicie la grabación utilizando el software de gestión de hardware. Coloque el amplificador principal por encima de la mano para que el mosquito pueda pararse cómodamente y sondear.
  4. Encienda el amplificador principal mientras está conectado a tierra. Inicie un temporizador de 10 minutos. Ajuste la posición de la mano del anfitrión según sea necesario para ayudar a sondear el éxito.
    NOTA: Cuando use mosquitos inclinados a sondear inmediatamente, encienda el amplificador principal antes de colocar el mosquito en la mano. Se puede usar una clavija de madera delgada o un mango de pincel no conductor para doblar el alambre de cobre del trozo de insecto para ajustar aún más la posición del mosquito. Una lupa o un microscopio digital en un soporte de cuello de cisne puede ayudar a observar al mosquito durante la EPG, especialmente para los estudios de correlación de comportamiento.
  5. Utilice el software de gestión de hardware para realizar observaciones con marca de tiempo (por ejemplo, marcadores de eventos) durante la grabación con respecto a las respuestas del huésped, los comportamientos de los mosquitos, los cambios de ganancia, etc.). Ajuste la posición de las señales en la pantalla y la ganancia del software según sea necesario para mantener ambas señales claramente visibles en la pantalla. Ajuste la ganancia del hardware si la(s) señal(es) alcanza(n) su punto máximo (Figura 3A,C y Tabla 2) o si las ondas parecen demasiado pequeñas cuando la ganancia del software está al máximo. Ajuste el desplazamiento si se observa el pliegue del rectificador (Figura 3C,C' y Tabla 2). Consulte el manual de software31 y los recursos en línea30 para obtener instrucciones detalladas sobre cómo realizar estos ajustes.
    1. Para ajustar la posición de las señales en la pantalla, seleccione la señal pre o post (por ejemplo, haciendo clic en
      1 = 1       o 2 = 3) y luego arrastre la señal a la posición deseada en la pantalla (idealmente cerca del centro de la pantalla, pero no superpuesta).
    2. Para ajustar la ganancia de software, utilice el software de gestión de hardware descrito en el paso 3.4.3.
    3. Para ajustar la ganancia del hardware, comience girando el dial de ganancia para el canal 1 hacia la derecha o la izquierda para aumentar o disminuir la ganancia, respectivamente. Si ese ajuste no es suficiente para eliminar el pico (ganancia demasiado alta; Figura 3A,C) o permitir que los detalles de la señal se visualicen claramente (ganancia demasiado baja), gire los interruptores de rango y multiplicador del canal 1 para ajustar aún más la ganancia.
      NOTA: Se recomienda el uso de marcadores de eventos para registrar cuándo se ajustó la ganancia del hardware para ayudar a la interpretación de los datos de forma de onda.
    4. Para ajustar el desplazamiento, gire el interruptor de compensación del canal 1 en la caja de control a negativo, luego gire el dial de compensación del canal 1 hasta que los picos en las señales previas y posteriores ocurran en la misma dirección en la pantalla de la computadora. Si el dial de compensación se gira demasiado, la señal posterior se volteará nuevamente.
  6. Si el mosquito no sondea dentro de los 10 minutos (u otro punto de tiempo definido), apague el amplificador principal. Si el mosquito está a mitad de la sonda en la marca de tiempo, deje que termine de sondear antes de apagar el amplificador principal. Pídele al huésped que se quite la mano con cuidado y luego retira el mosquito con el trozo de insecto adjunto. Vuelva a colocar el mosquito en la caja de almacenamiento.
  7. Detenga/cierre la grabación utilizando el software de gestión de hardware. Proceda con EPG en el siguiente mosquito (Paso 4.2).
    NOTA: Recuerde cambiar el nombre del archivo después de cada mosquito.
  8. Apague el amplificador principal y la fuente de alimentación al final de la sesión y cierre el software.
  9. Revise la Declaración de Debriefing del Participante o similar con el voluntario según lo especificado en el IRB aprobado.
  10. Deseche los mosquitos según los requisitos del protocolo. Retire la envoltura de plástico del bloque de espuma y deséchela adecuadamente.
  11. Una vez completada toda la recopilación de datos, revise y mida las formas de onda y analice los datos como se describió anteriormente24,25,26,27,29,30. Consulte los recursos en línea30 para obtener tutoriales paso a paso para usar el software de revisión de formas de onda, hacer figuras que representan las formas de onda, medir las formas de onda, exportar los datos para el análisis, realizar el análisis estadístico y una explicación detallada de las variables comunes de respuesta de la forma de onda.

figure-protocol-3
Figura 3: Ejemplos de grabaciones subóptimas debido a picos de salida, cambios en la ganancia de la caja de control, cambios de voltaje poco claros del cableado inferior, plegado del rectificador y ruido. Las formas de onda de los mosquitos Culex tarsalis que se alimentan hasta la repleción en las manos humanas, distorsionadas por (A) el pico (flecha horizontal azul) y los cambios posteriores de ganancia de la caja de control de 100x a 80x a 40x a 60x a 40x a 20x (flechas verticales naranjas), (B) cambios de voltaje poco claros y (C) pliegue del rectificador en la señal posterior (negra) en comparación con la señal previa (roja) (consulte la forma de onda J, primer plano mostrado en el panel C'), ruido de línea (onda sinusoidal de 11 Hz visible en la señal de pre-rectificación (roja) solamente, primer plano mostrado en el panel C'), pico (flecha horizontal azul) y un cambio de ganancia de la caja de control de 500x a 200x (flecha vertical naranja). Los nombres de las formas de onda se muestran en la parte superior de cada panel. Las flechas moradas en la esquina inferior derecha del panel C indican cuándo se apagó el amplificador principal después de que se completó la sonda y proporcionan otro ejemplo de plegado del rectificador. Las líneas horizontales rojas asociadas con la señal de pre-rectificación en el panel C indican cuándo se utilizaron los marcadores de evento para registrar notas con marca de tiempo. Los niveles de Ri, las señales aplicadas, las escalas de tiempo y las ganancias de software son (A) 107 Ω, 150 mV DC, 13,2 s/div, 8x; (B) 107 Ω, 150 mV DC, 4,4 s/div, 128x; y (C) 107 Ω, 150 mV AC, 7.4 s/div, 2x; (C') 0,2 s/div, 8x. Abreviaturas: CA = corriente alterna, CC = corriente continua, Ri = resistencia de entrada, mV = milivoltio, Ω = Ohmios, s/div = segundos por división. Esta figura se preparó con datos de Cooper et al.27. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

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Las grabaciones de AC-DC EPG de la sangre de los mosquitos Cx. tarsalis alimentándose de manos humanas (Figura 4) generaron formas de onda interpretables adecuadas para el análisis y la publicación27. Las formas de onda interpretables contenían patrones repetitivos distintos y distinguibles que podían clasificarse en familias de formas de onda (Tabla 1 y Figura 4), tipos y subtipos cuando la compresión (definida en la Tabla 2) y la ganancia del software se ajustaban en el software de revisión de formas de onda27,31. Todas las familias de formas de onda (J, K, L, M, N) y tipos (L1, L2, M1, M2) descritas anteriormente en Ae. aegypti alimentándose de manos humanas26 fueron identificadas en las formas de onda generadas por Cx. tarsalis alimentándose de manos humanas, verificando la validez de los métodos aquí descritos. Además, se identificaron tres nuevos tipos de formas de onda (M3, N1, N2) y numerosos subtipos de L1, L2, M1 y M227. Además, la caída de voltaje a la línea de base cuando las piezas bucales se retiran del host se denominó familia de formas de onda W27.

La variación sistemática de los ajustes del instrumento (tipo de corriente y niveles de Ri) siguiendo los procedimientos aquí descritos permitió determinar los ajustes óptimos para registrar Cx. tarsalis alimentándose de manos humanas, los orígenes eléctricos de cada forma de onda, la duración media en segundos de las sondas completas e incompletas por mosquito, y para la comparación estadística de la duración de la forma de onda en segundos por insecto (WDI), el número de eventos de forma de onda por insecto (NWEI), y la duración de la forma de onda en segundos por evento por insecto (WDEI) en la configuración27. Los mosquitos también se interrumpieron durante diferentes formas de onda y se diseccionaron para determinar qué forma de onda se correlacionaba con la ingesta de sangre27. Se realizó una investigación similar para Ae. aegypti utilizando una metodología comparable26.

Debido a la naturaleza sensible e intrincada de EPG, no todas las grabaciones fueron tan prístinas como las que se muestran en Figura 4. Picos (Figura 3A,C), cambios en la ganancia de hardware (Figura 3A,C), trabajos de cableado inferiores (Figura 3B), pliegue del rectificador en la forma de onda J (Figura 3C,C'), y ruido eléctrico (Figura 3C,C') distorsionaban y enmascaraban ocasionalmente las formas de onda, lo que las hacía inadecuadas para su uso en las cifras de calidad de las publicaciones y dificultaba la puntuación y el análisis. Por lo tanto, se recomienda el esfuerzo del extremo frontal para perfeccionar las habilidades de cableado, optimizar la ganancia y la configuración de voltaje, ajustar la compensación y controlar el ruido eléctrico. Curiosamente, el pliegue del rectificador solo se observó en la familia de formas de onda J para Cx. tarsalis (Figura 3C,C') y no se repitió una vez que el desplazamiento se ajustó inicialmente, incluso cuando se utilizaron otras especies de mosquitos (Ae. aegypti y Culex quinquefasciatus) (datos no mostrados). Además, la resolución de problemas reveló que el ruido eléctrico no controlado que se muestra en Figura 3 (paneles C y C') se debía a una jaula de Faraday defectuosa. Las grabaciones realizadas en la jaula de Faraday defectuosa seguían siendo utilizables, pero los problemas de ruido se resolvieron cuando se construyó una jaula de Faraday mejorada (Figura 1B).

Incluso cuando se tomaron todas las precauciones y optimizaciones del front-end, ligeras variaciones en la calidad de la conexión del electrodo al mosquito y otros factores desconocidos que distorsionaban la señal y alteraban la relación señal-ruido hacían necesario ajustar periódicamente la ganancia del hardware a mitad de la grabación para garantizar que la señal estuviera en el rango visible y que la resolución de los picos en cada forma de onda fuera suficiente para la identificación y caracterización de la forma de onda. Desafortunadamente, el ajuste de la ganancia del hardware a mitad de la grabación puede resultar en cambios bruscos de voltaje (Figura 3A, C), lo que hace que las formas de onda no sean adecuadas para la publicación, pero aún utilizables (en su totalidad o en parte) para la medición y el análisis.

figure-results-1
Figura 4: Formas de onda representativas de una sonda Culex tarsalis en una mano humana registradas con un Ri de 107 Ω utilizando una señal aplicada de 250 mV AC. Los nombres de las formas de onda a nivel de familia (NP, J, K, L, M, W) se muestran en la parte superior de cada panel. Los paneles inferiores muestran las ampliaciones de las regiones seleccionadas en el panel A. Los paneles insertados muestran las ampliaciones de las regiones indicadas. Las escalas de tiempo y las ganancias de software son (A) 7.0 s/div, 16x; (B) 1.0 s/div, 64x; (B') 0,2 s/div, 64x; (C) 1,0 s/div, 64x; (C') 0,2 s/div, 32x; (D) 1.0 s/div, 64x; (D') 0,2 s/div, 64x. Abreviaturas: CA = corriente alterna, Ri = resistencia de entrada, mV = milivoltio, Ω = ohmios, s/div = segundos por división. Esta figura se preparó con datos de Cooper et al.27. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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Al utilizar el AC-DC EPG, es fundamental tener un conocimiento básico del funcionamiento del hardware y el software30 y seguir cuidadosamente los protocolos descritos en este documento para evitar dañar el equipo. En particular, evite tocar el amplificador principal cuando esté encendido a menos que esté conectado a tierra en la jaula de Faraday. Se recomienda grabar lo más atrás posible en la jaula de Faraday30. Las puertas de la jaula no necesariamente necesitan estar cerradas para obtener formas de onda interpretables a menos que se graben en un entorno con ruido eléctrico ambiental excesivo. Nada motorizado puede estar en la jaula de Faraday. Es importante tener en cuenta que la jaula de Faraday en sí debe estar conectada a tierra eléctricamente únicamente a través del amplificador principal para que funcione correctamente. Esto se logra conectando el amplificador de cabeza a un soporte de laboratorio de metal con la pintura lijada de un pie del soporte para permitir una vía conductora para que la electricidad capturada por la jaula de Faraday fluya hacia el soporte de laboratorio, hacia la carcasa de metal del amplificador de cabeza, por el cable hasta la caja de control. a través de la fuente de alimentación en un tomacorriente de pared debidamente conectado a tierra, y en la tierra a través de la tierra del edificio30. Se puede utilizar un multímetro para comprobar la calidad de la conexión entre los componentes del interior de la jaula midiendo la resistividad (que es la inversa de la conductividad) entre varios puntos. También se puede colocar una radio AM inalámbrica dentro de la jaula de Faraday para verificar que el sonido se reduzca significativamente (o idealmente se elimine) cuando las puertas están cerradas, lo que confirma que la jaula de Faraday está capturando adecuadamente las señales eléctricas en el aire (E. Backus per. Comm.).

La preparación adecuada y estandarizada del pegamento de plata y la fijación de los electrodos de registro a los insectos son fundamentales para obtener registros utilizables. La cutícula de insectos es un aislante y actúa como un condensador si el pegamento plateado no penetra adecuadamente en los poros de la cutícula para crear una vía para que la electricidad viaje desde el interior del insecto hasta el alambre de oro en la superficie del pronoto30. Prepare el pegamento plateado al mismo tiempo antes de cada sesión de EPG, trabaje con pegamento plateado fresco del tubo y reemplácelo con pegamento plateado vigorosamente vórtice con frecuencia durante el procedimiento de cableado. Asegúrese de que el lazo dorado esté colocado contra el tórax para que todo el lazo esté en contacto con la cutícula y no inclinado hacia un lado o separado por una capa gruesa de pegamento plateado y escamas para ayudar a formar una conexión eléctrica fuerte, así como para evitar el desprendimiento y escape del mosquito del cable.

Los protocolos descritos aquí deben optimizarse cuando se trabaja con diferentes especies de mosquitos. Los ajustes óptimos de EPG (nivel de Ri, voltaje, tipo de corriente y ganancia de hardware) para grabar en un artrópodo dado deben determinarse experimentalmente12,30. Sin embargo, una vez que se ajusta el desplazamiento, no será necesario reajustarlo cuando se trabaje con mosquitos similares. Se han determinado ajustes óptimos para AC-DC EPG con Ae. aegypti26 y Cx. tarsalis27. Las bibliotecas de formas de onda (definidas en la Tabla 2) para especies adicionales facilitarán la adopción de EPG para mosquitos. También es necesario optimizar la anestesia para el mosquito de interés, ya que el comportamiento de alimentación de sangre puede verse afectado de manera diferente según la especie de mosquito y la elección de la anestesia. Por ejemplo, Cx. tarsalis requiere un período de recuperación de 4 h después de 15 min de anestesia con CO2, mientras que para Ae. aegypti, un período de recuperación de 15 min es suficiente después de un período de anestesia de 15 min con hielo. Sin embargo, los Culex tarsalis son difíciles de derribar con la exposición al frío, por lo que elCO2 se usa predominantemente a pesar del largo período de recuperación.

Si bien el monitor AC-DC EPG es fácil de usar después de revisar los recursos en línea30,31 o capacitarlo con un usuario experimentado, se requiere cierta solución de problemas. Inicialmente, las grabaciones EPG del autor de las sondas de mosquitos tenían una onda de signo inesperada de 11 Hz en la preseñal que no había sido observada o reportada por Wayadande y sus colegas26. La consulta con E. Backus indicó que la jaula de Faraday probablemente era el problema debido a los bucles de tierra que interferían. Una nueva jaula de Faraday construida a partir de una pantalla de cobre altamente conductora conectada a un marco de aluminio atornillado a una gran placa de piso de aluminio sostenida por pies de goma para aislarla de la tabla a continuación (Figura 1B), resolvió la señal de ruido de 11 Hz (Figura 3C, C '). Además, ocasionalmente, cuando se encendió por primera vez la fuente de alimentación EPG, las señales previas y posteriores a la rectificación aparecían como líneas gruesas y difusas en lugar de líneas rectas, suaves y delgadas. Esto generalmente se solucionaba apagando el instrumento y verificando todas las conexiones del cable. Si eso fallaba, desenchufar el instrumento durante 1-3 minutos generalmente ayudaba. En muy raras ocasiones, las señales previas y posteriores se vuelven gruesas y borrosas durante el funcionamiento, lo que se solucionó apagando el instrumento y enchufándolo a una toma de corriente diferente o usando un regulador de voltaje y un acondicionador de energía para enchufar la EPG antes de conectarla a la pared. Idealmente, una línea dedicada para el monitor EPG eliminaría el ruido de línea proveniente de los refrigeradores y otros equipos conectados al mismo circuito eléctrico que el EPG30.

Actualmente, existen dos limitaciones principales para usar EPG para estudiar mosquitos. En primer lugar, se han realizado pocos estudios de correlación para verificar qué comportamientos de sondeo corresponden a las formas de onda. Si bien existen hipótesis sólidas sobre lo que está sucediendo durante cada familia de formas de onda (Tabla 1) y algunos de los tipos de formas de onda (M1 y M2), pocas de estas hipótesis se han confirmado experimentalmente, excepto que la ingestión de sangre se correlaciona con la familia de formas de onda M26,27. Lo más importante es que se deben identificar las formas de onda correspondientes a los eventos de salivación porque muchos patógenos se transmiten en la saliva. Se requerirá la correlación de las formas de onda de EPG con las actividades biológicas en los mosquitos para interpretar de manera significativa las diferencias significativas en la duración de la forma de onda y los recuentos entre los grupos de tratamiento. En segundo lugar, las tasas de sondaje e ingestión durante la EPG pueden ser mucho más bajas de lo esperado27. Atar individualmente a los mosquitos a cables cortos y colocarlos directamente sobre el huésped podría prevenir los comportamientos de búsqueda de huéspedes y alimentación social a larga distancia, lo que puede afectar los comportamientos de sondeo e ingestión. Los insectos correctamente conectados pueden caminar y volar normalmente. Aún así, los mosquitos a menudo tiran de los cables y, a veces, se enredan o se mantienen en ángulos antinaturales, lo que indica que estar conectado afecta su comportamiento hasta cierto punto. Los autores probaron muchas estrategias para mejorar las tasas de sondeo durante la EPG, y el ayuno de los mosquitos durante la noche, el uso de individuos mayores, la exposición al aliento humano inmediatamente antes de colocarlos en la mano y la aplicación de saliva humana en la mano fueron los más efectivos, así como el uso de huéspedes que constantemente hacían ajustes a escala fina en la posición de su mano para asegurarse de que el mosquito estuviera en la posición ideal para sondear27.

A pesar de estas limitaciones, AC-DC EPG tiene numerosas ventajas sobre otros enfoques para estudiar los comportamientos de sondaje e ingestión. Sistemas como BiteOScope11, flyPAD15 y Automated BiomaterialPlatform 14 que fueron diseñados para cuantificar los comportamientos de sondeo e ingestión y las secreciones salivales durante la alimentación con sangre utilizan sustratos artificiales transparentes y dietas líquidas que carecen de sistemas de tejido huésped normales y señales del huésped. Si bien estas plataformas sintéticas son útiles para muchos propósitos experimentales, una clara ventaja de AC-DC EPG es la capacidad de estudiar estos comportamientos de artrópodos y variables de interés dentro de los sistemas huéspedes naturales. Además, la adaptabilidad definida por el usuario del sistema AC-DC EPG ofrece una ventaja adicional sobre otros instrumentos EPG22,33 y dispositivos de monitoreo electrónico similares a EPG16,21, que no tienen niveles de Ri, tipos de corriente y niveles de voltaje ajustables que se necesitan para obtener formas de onda con la máxima cantidad de información y minimizar los efectos adversos en una amplia gama de huéspedes y artrópodos22, Artículo 23. Las técnicas de electromiografía (EMG) también se utilizan para estudiar la alimentación sanguínea. Sin embargo, el circuito eléctrico generalmente solo incluye el artrópodo y solo se registran los potenciales musculares más cercanos al electrodo de registro, por lo que las formas de onda no proporcionan información sobre las actividades detalladas que ocurren en la interfaz huésped-insecto, como rupturas celulares, ubicaciones y actividades de estilete y potenciales de flujo a través de las piezas bucales28,34. Las técnicas de microscopía intravital se pueden utilizar para visualizar directamente los movimientos y actividades detallados de las piezas bucales en los tejidos vivos del huésped, pero estas técnicas implican procedimientos invasivos en modelos animales vivos9. Solo el monitor AC-DC EPG puede proporcionar información muy detallada en tiempo real sobre los comportamientos de sondeo, ingestión y salivación que ocurren en tejidos vivos opacos del huésped sin la necesidad de procedimientos invasivos y es adaptable para su uso en una amplia variedad de artrópodos10,12.

Este es el primer procedimiento detallado paso a paso para cablear mosquitos, construir un aspirador de insectos y realizar EPG en huéspedes humanos. Se espera que estos protocolos faciliten la adopción de AC-DC EPG en mosquitos que se alimentan de huéspedes humanos. Ejemplos de futuros esfuerzos de investigación que emplean AC-DC EPG pueden incluir estudios sobre mecanismos fundamentales de alimentación sanguínea y daño tisular del huésped10, incluida la identificación de secuencias estereotipadas de comportamientos de sondeo que preceden a la ingestión de sangre, investigación del flujo sanguíneo a través de piezas bucales y comparación de la plasticidad de la alimentación dentro y entre especies de artrópodos / etapas de desarrollo26. La EPG también se puede utilizar para cuantificar los efectos de insecticidas, antialimenticios y repelentes12. Los procedimientos presentados aquí para usar AC-DC EPG para estudiar mosquitos en manos humanas acelerarán estos estudios y permitirán nuevos conocimientos sobre la biología de los mosquitos que se alimentan de sangre.

Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar. La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o respaldo por parte del Departamento de Agricultura de EE. UU. Las conclusiones de este informe son las de los autores y no representan necesariamente los puntos de vista del USDA.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estamos agradecidos a la Prof. Astri Wayadande de la Universidad Estatal de Oklahoma por ser pioneros en el procedimiento de cableado para mosquitos, y a la Dra. Elaine Backus en el USDA-ARS en Parlier, CA, y al Sr. Andrew Dowell en EPG Technologies Inc. en Gainesville, FL, por su ayuda en la resolución de problemas del equipo EPG. También agradecemos al Dr. Dustin Swanson y al Sr. William Yarnell del Insectario USDA-ARS en Manhattan, KS, por proporcionar mosquitos, y a la Srta. Miriam Ruhinda de la Universidad Estatal de Kansas en Manhattan, KS por su ayuda con la filmación de los videos de procedimiento. Este trabajo fue posible gracias al acceso al Núcleo Integrado de Entomología Molecular (IEMC) de la Universidad Estatal de Kansas. Esta investigación fue respaldada por el Acuerdo de Desarrollo de la Fuerza Laboral de Investigación, Educación y Economía del USDA (#58-3022-0-002) y el Proyecto Multiestatal Hatch (NE1943). Este manuscrito es la contribución No. 24-194-J de la Estación Experimental Agrícola de Kansas, Universidad Estatal de Kansas, Manhattan, KS, EE.UU.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Instrumentation
AC-DC Electropenetrógrafo de 4 canalesEPG Technologies, Inc.Para EPG, incluye la fuente de alimentación, la caja de control, la caja de interfaz del interruptor, cuatro amplificadores de etapa principal, cuatro sondas de voltaje de sustrato y cables asociados Las
almohadas de aireAmazon.compara que el huésped humano apoye su mano/brazo durante EPG
DI-710 Hardware de adquisición de datos (placa AD)DATAQ Instruments Inc.para digitalizar las señales analógicas de EPG para que puedan visualizarse en un ordenador
Lámpara de aumento LED regulable, lupa grande de 5X manos libres con luz y soporte para lectura Pasatiempos Manualidades Banco de trabajo de costuraAmazon.compara la observación del comportamiento durante la EPG; solo úselo desenchufado durante la EPG o puede resultar ruido
Microscopio digital Dino-Lite Edge (aumento de 250x)Dino-LiteAF4915ZTpara la observación del comportamiento durante EPG
Soporte de escritorio Dino-Lite Flex-armDino-LiteMS22Bpara sujetar y manipular la cámara
Soporte de base de retorta de acero Eisco y juego de varillasFisher ScientificS41740para sujetar el amplificador de la etapa principal y conectar a tierra la jaula de Faraday (debe ser de metal)
Taller en línea EPGUF IFAS Extensionhttps://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022AKA, "recursos en línea" para aprender EPG (configuración de instrumentos, recopilación y análisis de datos, construcción de Faraday, preparación de cola de plata, construcción de talones de insectos, etc.)
Regulador de potencia/acondicionador de potencia Furman P-1800 ARAmazon.compara reducir el ruido de la línea
Envoltura de amortiguación de burbujas pequeñasAmazon.compara usar como barrera entre el anfitrión y la jaula de Faraday
Troemner Talboys Labjaws Soporte de abrazadera regularFisher Scientific02-217-121para sujetar el amplificador de la etapa principal y conectar a tierra la jaula de Faraday (debe estar hecho de metal y no estar recubierto de plástico)
Computadora con WindowsBest Buyfor EPG & statistical analysis
Software
Backus 2.0 Data Analysis SAS program UF IFAS Extensionhttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/para el análisis estadístico de datos de forma de onda
Ebert 1.0 File Manipulator and Error Checker Programas SASUF IFAS Extensionhttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/para la preparación de archivos para el análisis estadístico de datos de forma de onda
SAS versión 9.4SAS Institute Inc.para el análisis estadístico de datos de forma de onda
WinDaq Lite DATAQ Instrumentos, Inc.para el registro y la revisión de los datos de EPG. Incluye el software WinDaq Hardware Manager (AKA, "software de gestión de hardware") y el software WinDaq Waveform Browser (AKA, "software de revisión de forma de onda"). Solo para uso en computadoras con Windows.
jaula de Faraday
marco de pantalla de aluminioHome DepotMSCF5167para las paredes de la jaula de Faraday
Lámina de aluminio, 0,125 (1/8) de espesor 3003-H14Metals DepotS318para la base de la jaula de Faraday
Tirantes de esquina, 1" Home Depot339547para las paredes de la jaula de Faraday
Tornillos de máquina Phillips de cabeza plana, # 6-32 x 1 "Home Depot459999para la construcción de jaulas de Faraday
Arandelas planas, # 6 638977 de Home Depotpara la construcción de jaulas de Faraday
El multímetro digital Fluke 15B+, para aplicaciones eléctricas, mide mediciones de voltaje y corriente CA/CC de hasta 1000 V y 10 A, junto con capacidades de resistencia, continuidad, diodo y capacitanciaAmazon.compara probar la jaula
de FaradayRadio portátil AM FM, Goodes Radio de transistor con altavoz, conector para auriculares, radio a pilas 2AA para recepción de largo alcance, radio de bolsillo para uso en interiores, exteriores y emergenciasAmazon.compara probar la jaula de Faraday
Pantalla de cobre puro, malla 16 x 16 con diámetro de alambre de 0,11, 36" x 12'Obras de pantallaMetro para  las paredes de la jaula de Faraday
Tornillos de máquina combinados de cabeza redonda, #6-32 x 3/4"HomeDepot528466 para la construcción de jaulas de Faraday
Papel de lija, 1/2" por 1", grano 150Home Depot19036-20-CCpara quitar la pintura de la parte inferior del soporte de laboratorio
Esquinas del marco de la pantalla, 5/16" Home DepotWCORN516para las paredes de la jaula de Faraday
Ranura de pantalla, 0.14" Home Depot3034719para las paredes de la jaula de Faraday
Insect Stubs
Brass EscutcheonPins Home Depot801294para construir talones de insectos   
Alambre de cobre, 20 AWGAmazon.compara construir trozos de insectos   
Harris soluble en agua gripe  Home Depot355398para ayudar a soldar a recubrir el alambre de los dientes de insectos y formar una conexión fuerte
Alicates de punta finaHome Depotpara doblar alambre al construir trozos
de insectos Pro's Kit 900-015 Helping Hands AyudaAmazon.compara sujetar los pasadores del escudo durante la soldadura
Soldadura (con núcleo de colofonia)Home Depot296497para la construcción de talones de insectos   
Herramienta peladora de corte de alambreHome Depotpara pelar y cortar alambre de cobre al construir trozos de insectos
YIHUA 928D-III Soldador, 110W de alta potencia, pantalla totalmente digitalAmazon.compara construir trozos de insectos; viene con un soporte, esponja y lana de acero para limpiar
Insect Aspirator
Aspirador de laboratorio Accuris ASPIREInstrumentos AccurisV0020para aplicar succión al aspirador de insectos; incluye el controlador de vacío de mano, el adaptador de acero inoxidable de punta fina (40 mm) y el adaptador de punta de pipeta
Pipetas Pasteur de Chemglass Life Sciences, de 5 3/4" de largoNC0230004 Fisher Scientificpara su uso como aspirador de insectos cuando se cablean mosquitos
Cinta aislante de vinilo de color eléctrico comercialHome Depotpara fijar la pipeta Pasteur modificada a la línea de vacío
Tela utilitaria para mosquiteros, cuadrado de 10 x 10 cmJoann Fabrics16651622para evitar que los mosquitos sean aspirados en la bomba de vacío
Saint Gobain Performance Plastics Tube Tygon 1/4 x 7/16Fisher Scientific50-206-8914para cambiar de forma rápida y sencilla entre diferentes pipetas Pasteur modificadas,
desconectadores rápidos de HDPE Thermo Scientific Nalgene (de 3/8 a 7/16 pulg. Identificación.)Fisher Scientific15-315Bpara un cambio rápido y sencillo entre diferentes pipetas Pasteur modificadas
Silver Glue 
Elmer's Glue-All Multi Purpose White GlueAmazon.compara la preparación de pegamento de plata
Escamas de plata 99.9% pura,  4-8 µ mThermoFisher786.09para la preparación de cola de plata
Flake 99,95% puro, 8-10 y micro; mInframat Advanced Materials47MR-12Fpara la preparación de pegamento de plata
Anesthesia de insectos
CO2 kit de burbujeo, 1000 mL, #9 Rubber StopperFlyStuff59-181para prevenir la desecación de insectos mientras se usa el
flypad Flypad  marco, tamaño estándarFlyStuff59-118para evitar que los mosquitos se caigan de la almohadilla
Flystation BrushFlyStuff59-205para reducir la estática cuando se trabaja en una almohadilla
Flystuff  Flypad  tamaño estándarFlyStuff59-114AKA "almohadilla de anestesia" para anestesiar mosquitos
Embudo (4 pulgadas de diámetro)Amazon.compara gasear tazas de mosquitos antes de transferirlas al flypad
Plexiglás o una tapa de plástico plana (cortada a medida)Home DepotMC-27para cubrir el flypad si los mosquitos comienzan a despertarse
Cierre Abrazaderas de manguera de tubería de plástico de una sola posición y ajustables Apertura (variedad de 1/8" a 1/2")Amazon.compara desviar el gas entre el flypad y el embudo
Regulador de CO2 de una sola etapaFlyStuff59-142para regular el flujo de gas del tanque de CO2
" T” Racor para tubo de 1/8" de diámetro internoFlyStuff59-123para conectar tanto el flypad como el embudo al tanque de CO2
Tubo, transparente FlyStuff59-124Cpara conectar el embudo y la almohadilla al regulador en el tanque de CO2
Insect Wiring
Cartulina negra, (65Lb, 176 g/m2) 8.5" x 11"Michael's Stores Inc.327826para hacer que el alambre de oro sea más fácil de visualizar
Papel de construcción negro cuadrado de 3.5" x 4.0"Grapas956221para hacer que el alambre de oro sea más fácil de visualizar
Bolas de algodónAmazon.compara los mosquitos en ayunas
Bloque de espuma artesanal #12 (3,1 cm x 17,2 cm x 30,2 cm)Tienda de telas y manualidades Joann1941079para sujetar mosquitos con cable
Cinta Deflecto Dispensador, Amazon.compara almacenar hilo de oro
Pinza de entomología de peso plumaFisher ScientificS72110para la manipulación de insectos
Pinzas finas (FST by Dumont: #5 91150-20, Inox-Electronic)Fine Science Tools91150-20para hacer un lazo de oro al cablear mosquitos
Pincel de punta finaAmazon.compara la manipulación de mosquitos durante el cableado y EPG; debe tener un mango de plástico o madera si se usa para EPG
Pipetas de transferencia estándar de punta fina, estrechas, 5,8 mLThomas Scientific7761D21para la preparación de cola de
plata Alambre de oro, 99,99% puro, 0,025 mm de espesorGoodfellowAU005121para el cableado de mosquitos
Pines minutiens, punta 0,2 mm, 1 cmNC9681411 Fisher Scientificpara aplicar pegamento a los mosquitos
Vasos de papel Tubopara mosquitos en ayunas     
Tornillo de bancoFisher Scientific50-996-811para sujetar el alfiler minucioso durante el cableado de insectos
Caja de almacenamiento de plástico con tapa (7 pulgadas x 9 pulgadas x 14 pulgadas)Amazon.compara transportar mosquitos con cable
Plexiglás o una tapa de plástico plana (cortada a medida)Home DepotMC-27para cubrir la almohadilla si los mosquitos comienzan a despertarse
Pinzas de cierre automáticoFisher Scientific08-906para sujetar y manipular el tanque
><<> >< oro< / fuerte>< / em>< / u>
CO2 < / sub>gasMatheson Gaspara anestesiar mosquitos con un flypad
Artículos de laboratorio comunes
Bolsas de autoclave desechables de riesgo biológico, 8 1/2" x 11"Fisher Scientific03-410-591para la eliminación de mosquitos alimentados con sangre Quemador
Bunsen o soplete de propanoAmazon.compara la modificación de pipetas Pasteur Cinta de
laboratorio de coloresDaigger SuppliesEF9763Rpara etiquetar, preparar pegamento de plata y pinzas de enmascarar
Puntas de pipeta desechables, 1000 y micro; LFisher Scientific para alícuota de agua al hacer cola de plata
Microscopio de disecciónLeica Microsystemspara el cableado de mosquitos
Sonda de disecciónFisher ScientificNC9109673para agitar  y aplicar cola de plata
Matraz Erlenmeyer, 1000 mLFisher Scientific para prevenir la desecación de insectos mientras se usa la almohadilla para moscas
Etanol, 70% Fisher Scientific04-355-122para recuperar mosquitos escapados
Placas de Petri de vidrioFisher Scientific08-747Bpara anestesiar mosquitos con hielo
GuantesFisher Scientificpara protección personal
Kimwipes Limpiaparabrisas de la marca KimTech Science para tareas delicadas Fisher Scientific06-666para triturar
mosquitos Batas de laboratorioFisher Scientificpara la protección personal
LiBa Botellas de spray, recargables Botellas de spray vacías (aptas para alcohol isopropílico)Amazon.compara recuperar mosquitos escapados
magnética, 2 cm de largoFisher Scientific para mezclar cola de plata
Pipeta mecánica monocanal, 1000 y micro; LFisher Scientific 13-690-032para alícuotas de agua al hacer pegamento de plata
Tubos de microcentrífuga, 1,5mL Fisher Scientific 780420para el almacenamiento de cola de plata
Parafilm M Fisher Scientific50-998-944para sellar tubos de cola de plata
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de plata Tijeras utilitariasFisher Scientific08-945para cortar alambre de oro
Mezclador de vórticeFisher Scientific para mezclar pegamento
de plataStudy Organisms
Culex tarsalis mosquitosUSDA ARS Center for Grain and Animal Health Research en Manhattan, KSpara su uso como sujetos de estudio
a la soldadura Silver transparente de papel rígido de Barra agitadora

Referencias

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