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Electropenetrografía AC-DC para el estudio de los comportamientos de sondaje e ingestión de mosquitos Culex tarsalis en manos humanas

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DOI:

10.3791/66877

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29 de noviembre de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, Kansas State University, 2Department of Pathobiology, Auburn University, 3National Bio and Agro-Defense Facility, USDA Agricultural Research Service

En este artículo

Resumen

Se describen procedimientos para estudiar los comportamientos de sondeo e ingestión de mosquitos Culex tarsalis en manos humanas utilizando electropenetrografía AC-DC.

Resumen

Los mosquitos transmiten patógenos que afectan negativamente a la salud humana y animal. Una mayor comprensión de su biología de alimentación sanguínea y de sus interacciones con huéspedes y patógenos podría aprovecharse para desarrollar nuevos objetivos para el control de enfermedades transmitidas por mosquitos. Desafortunadamente, los comportamientos de sondeo (es decir, picaduras) de los mosquitos son poco conocidos porque ocurren dentro de los tejidos del huésped. Aquí, se describe un procedimiento no invasivo para el uso de electropenetrografía AC-DC (EPG) para visualizar y cuantificar indirectamente los comportamientos de alimentación de los mosquitos mediante el registro de cambios en las señales eléctricas generadas al sondear e ingerir en manos humanas. Se unen delgados cables de oro a los mosquitos con pegamento conductor de plata y se conectan al instrumento EPG. El huésped humano sostiene una sonda de voltaje de sustrato en su mano. El sondeo del huésped por el mosquito conectado completa el circuito eléctrico, y las señales eléctricas se registran en una computadora como "formas de onda" que luego se pueden medir y enumerar para su análisis. Esta metodología se ha utilizado para caracterizar los comportamientos de sondaje e ingestión de los mosquitos Aedes aegypti y Culex tarsalis y puede aplicarse a otras especies de mosquitos. La EPG se puede utilizar para estudiar los efectos de patógenos, insecticidas y otros factores en los comportamientos de alimentación de los mosquitos.

Introducción

Los mosquitos causan sufrimiento y pérdidas económicas en todo el mundo debido a su papel como vectores de enfermedades y plagas molestas1. Los mosquitos Anopheles transmiten la malaria, que anualmente causa aproximadamente 219 millones de casos en todo el mundo, más de 400.000 muertes2 y 12 mil millones de dólares estadounidenses en costos directos3. Los mosquitos Aedes son los vectores más notables de importancia para la salud pública porque tienen una presencia casi global y transmiten agentes de chikungunya, dengue, filariasis linfática, fiebre del Valle del Rift, fiebre amarilla y zika, que se cobran vidas, abruman los sistemas de salud y provocan sufrimiento crónico, morbilidad de por vida y discapacidad4,5. Además, los mosquitos Culex transmiten agentes de encefalitis equina, encefalitis japonesa, filariasis linfática, encefalitis de San Luis y fiebre del Nilo Occidental, que afectan tanto a la salud humana como a la animal3,4.

El control de vectores con enfoques basados en insecticidas es el principal método para controlar las enfermedades transmitidas por vectores a nivel mundial6,7. Sin embargo, el número de insecticidas disponibles para el control de mosquitos es limitado. Además, la resistencia a los insecticidas está evolucionando en muchas especies, especialmente en los mosquitos Aedes, lo que afecta nuestra capacidad para combatir las enfermedades transmitidas por vectores e impulsa la necesidad de nuevas estrategias de control6,8. Una mejor comprensión de la biología de los mosquitos, las interacciones mosquito-huésped-patógeno y los procesos que regulan la transmisión de patógenos puede facilitar el desarrollo de nuevas herramientas para el control de vectores6.

Los comportamientos de sondeo e ingestión en los tejidos del huésped pueden afectar la transmisión de patógenos y la patología de la enfermedad9,10,11,12. Por ejemplo, se ingirieron más microfilarias cuando el Aedes aegypti se alimentó directamente de los capilares en lugar de acumular sangre fuera de los vasos rotos13. Por lo tanto, la investigación fundamental y aplicada sobre este tema puede ayudar a desarrollar, refinar y evaluar estrategias de control de mosquitos y otras contramedidas para la transmisión de patógenos. Sin embargo, existen brechas de conocimiento significativas en los detalles de los comportamientos crípticos de alimentación de sangre que ocurren debajo de la superficie de la piel del huésped porque estos comportamientos a menudo requieren procedimientos invasivos en modelos animales vivos o emplean sustratos artificiales transparentes o dietas líquidas9,11,14,15. Las técnicas de electropenetrografía no invasiva (EPG; también llamada gráfico de penetración eléctrica) se han utilizado para estudiar los comportamientos alimenticios de los insectos que se alimentan de plantas relacionados con la transmisión de patógenos de plantas, la resistencia de la planta huésped y los modos de acción de los insecticidas, ya que permiten a los investigadores observar, registrar y cuantificar indirectamente los movimientos y comportamientos de las piezas bucales que ocurren dentro de los tejidos del huésped10,12.

Desde la década de 1950, se han aplicado técnicas electrónicas de monitoreo de penetración a los artrópodos que se alimentan de sangre, incluidos los mosquitos16,17,18,19,20. Sin embargo, la EPG nunca fue ampliamente adoptada para los artrópodos hematoalimentadores porque las actividades biológicas correspondientes a las formas de onda nunca fueron verificadas21. Además, los diseños y la electrónica de los primeros instrumentos dieron lugar a un énfasis excesivo en algunas señales eléctricas, altas relaciones ruido-señal, baja resolución y distorsión de las formas de onda, e irritación para los huéspedes vertebrados12,22. Un instrumento más reciente, el monitor AC-DC EPG 23, tiene configuraciones variables y un procesamiento de señal mejorado, lo que lo hace más adecuado para registrar artrópodos que se alimentan de sangre y descifrar los orígenes biológicos de las formas de onda en estudios experimentales de correlación10,12.

Para EPG, se aplica una señal eléctrica al host a través de una sonda de voltaje de sustrato (es decir, un electrodo de referencia). El artrópodo se conecta a un electrodo de registro y se coloca en el huésped. Cuando el artrópodo inserta sus piezas bucales (es decir, estiletes) en el huésped, la señal eléctrica se transmite al monitor AC-DC EPG para el procesamiento de la señal. Luego, las señales eléctricas se muestran en una computadora como "formas de onda" que corresponden a comportamientos específicos como los movimientos de las piezas bucales, la ingestión, la salivación y la adquisición/inoculación de patógenos10,12. Las variables de respuesta secuenciales y no secuenciales relacionadas con la duración y el recuento de las formas de onda24,25 en diferentes niveles jerárquicos (familias, tipos y subtipos) se pueden calcular en función de la frecuencia y la duración de las formas de onda para obtener información sobre los comportamientos de alimentación que ocurren dentro y entre las especies, y en respuesta a factores bióticos y abióticos, como huéspedes, patógenos, pesticidas y condiciones ambientales10,12.

Hasta ahora, el monitor AC-DC EPG se ha utilizado para caracterizar los comportamientos de sondeo e ingestión de Ae. aegypti26 y Culex tarsalis27 mosquitos alimentándose de manos humanas, y las garrapatas Dermacentor variabilis y Amblyomma americanum alimentándose de terneros bovinos28. Además, recientemente se desarrolló un modelo murino para EPG29 para facilitar los estudios de patógenos utilizando este instrumento. Las manos humanas son ideales para la caracterización inicial de la forma de onda del mosquito porque los huéspedes humanos pueden informar cuándo sienten el sondeo del mosquito, así como otros comportamientos, lo que facilita la correlación de las formas de onda con los comportamientos (Tabla 1). Además, una mejor comprensión de la plasticidad en los comportamientos alimentarios entre los mosquitos en diferentes poblaciones humanas podría contribuir al desarrollo de intervenciones de manejo más especializadas para los mosquitos y los patógenos que transmiten.

Tabla 1: Descripción de las familias de formas de onda utilizadas para clasificar las señales eléctricas registradas de Culex tarsalis en manos humanas utilizando AC-DC EPG. La fase de sondeo y las actividades biológicas correspondientes a cada familia de formas de onda. Consulte Cooper et al.27 para obtener más información. Abreviatura: CA = corriente alterna, CC = corriente continua, EPG = electropenetrógrafo. Por favor, haga clic aquí para descargar esta tabla.

Para facilitar el uso de EPG para estudiar la biología de los mosquitos y las interacciones huésped-vector, aquí se presenta la metodología para cuantificar los comportamientos alimentarios de los mosquitos Cx. tarsalis en manos humanas utilizando el monitor AC-DC EPG. Estos protocolos se basan en los procedimientos fundamentales de AC-DC EPG descritos en los recursos en línea30 y asumen que los usuarios tienen un conocimiento práctico básico de AC-DC EPG y el software asociado31. Los procedimientos descritos pueden modificarse para otras especies de mosquitos y huéspedes y proporcionan una base para facilitar la investigación basada en hipótesis sobre los comportamientos de alimentación de los mosquitos.

Tabla 2: Definiciones de la terminología común de AC-DC EPG. Las definiciones se basan en las que se dan en los recursos en línea30,31 y en la literatura científica32. Abreviatura: CA = corriente alterna, CC = corriente continua, EPG = electropenetrógrafo. Por favor, haga clic aquí para descargar esta tabla.

Protocolo

Este protocolo (IRB-10729) fue aprobado por la Junta Institucional de Revisión (IRB) para Investigación con Seres Humanos de la Universidad Estatal de Kansas27 y está destinado únicamente para su uso con mosquitos libres de patógenos. Los voluntarios humanos dieron su consentimiento informado para participar en el estudio y publicar sus datos. Antes de iniciar cualquier trabajo con animales, seres humanos o riesgos biológicos, asegúrese de que todos los procedimientos hayan sido revisados y aprobados por los comités reguladores institucionales pertinentes o por las personas encargadas de la supervisión. Consulte la Tabla de Materiales para obtener detalles sobre todos los equipos y materiales utilizados en este protocolo.

1. Preparación inicial y configuración

  1. Configure el monitor EPG de CA-CC (Figura 1A), la jaula de Faraday (Figura 1B,C) y el software como se describió previamente30,31, utilizando las modificaciones descritas a continuación (pasos 1.1.1-1.1.5). Consulte los recursos en línea30 para tutoriales paso a paso sobre la instalación y el uso del equipo y el software. Guarde la configuración deseada como predeterminada en el software de gestión de hardware y revisión de formas de onda. Consulte la Tabla 2 para obtener una lista de la terminología común del EPG de CA-CC y sus definiciones.
    1. Conecte un amplificador de etapa inicial (amplificador de cabeza) y una sonda de voltaje del sustrato al canal 1 de la caja de control.
      NOTA: Se presenta la grabación desde un solo canal, aunque el monitor de CA-CC puede acomodar simultáneamente cuatro insectos y sus hospedadores.
    2. Asegúrese de que el canal 1 de la caja de control esté encendido y de que los canales Pre-1 y Post-1 correspondientes en la caja de interfaz de conmutación también estén encendidos.
      NOTA: Los canales que no se utilicen deben permanecer apagados.
    3. Utilice el software de gestión de hardware para habilitar los canales 1 y 3 en la tarjeta A/D DI-710 (pero no otros) con el fin de grabar las señales previas y posteriores a la rectificación.
    4. Configure el software de gestión de hardware para visualizar/superponer las formas de onda previas y posteriores a la rectificación (por ejemplo, 1 = 1 para la señal previa y 2 = 3 para la señal posterior).
    5. Establezca la frecuencia de muestreo en el software de gestión de hardware en 100 muestras por segundo por canal (es decir, S/s/CHAN: 100).
  2. Construya los soportes para insectos26,27,29,30:
    1. Caliente previamente el soldador a la temperatura recomendada para la soldadura específica con núcleo de resina.
    2. Utilice una herramienta cortadora y peladora de cables para retirar el recubrimiento plástico aproximadamente 6 cm desde el extremo de un rollo de alambre de cobre calibre 20 AWG, evitando cortar o marcar el haz de alambre de cobre en el interior (Figura 2A). Luego, corte el haz de alambre de cobre expuesto y desenrede los hilos individuales (Figura 2B).
    3. Utilice pinzas de punta fina para enrollar un hilo del alambre de cobre alrededor del vástago de un pasador escutcheon adecuado, justo debajo de la cabeza (es decir, la parte plana), de modo que la mayor parte del alambre de cobre sobresalga por encima de la cabeza del pasador. Doble el extremo del alambre sobre la cabeza del pasador para asegurarlo en su lugar (Figura 2C).
      NOTA: Pruebe varios pasadores escutcheon para identificar aquellos que encajen firmemente en la entrada del amplificador de cabeza (cuando esté apagado, desconectado y configurado en 106 Ohmios (Ω)).
    4. Sujete el vástago del pasador escutcheon en la ayuda para soldar con pinzas de sujeción, de modo que el alambre de cobre quede orientado hacia arriba. Luego, aplique una pequeña cantidad (~0,2 cm de diámetro) de flux soluble en agua en la unión entre el pasador escutcheon y el alambre de cobre (Figura 2D).
      ADVERTENCIA: El flux es tóxico y debe manipularse con cuidado.
    5. Desenrolle aproximadamente 10 cm de soldadura y enderécelo. Aplique el soldador caliente contra la cabeza del pasador durante unos segundos hasta que el flux se derrita y el metal esté caliente. Luego, presione la punta de la soldadura contra la cabeza del pasador, junto al soldador, hasta que la soldadura se derrita y cubra completamente la unión, fusionando el pasador y el alambre en un soporte para insecto.
    6. Mientras el soporte para insecto se enfría, limpie la punta del soldador con lana de acero y una esponja húmeda.
    7. Una vez frío, retire el soporte para insecto de las pinzas de sujeción. Enjuáguelo con etanol al 70 % y luego con agua para eliminar el flux residual. Recorte el alambre de cobre a la longitud deseada (~3 cm, Figura 2E).
    8. Repita los pasos 1.2.3-1.2.7 hasta construir entre 20 y 30 soportes para insectos.
  3. Monte un aspirador para insectos26,27:
    1. Pase la punta de una pipeta Pasteur de vidrio por una llama, girando ligeramente la pipeta. Repita el procedimiento hasta que el extremo de la pipeta tenga el tamaño adecuado para ajustarse firmemente alrededor del abdomen del insecto.
    2. Cubra el extremo más ancho de la pipeta Pasteur modificada con malla para mosquitos, luego insértela directamente en el tubo de silicona conectado a un aspirador de laboratorio y asegure la unión con cinta aislante para formar un aspirador para insectos (Figura 2H).
      NOTA: La pipeta Pasteur y la malla pueden insertarse en un tramo corto de tubo plástico equipado con un conector rápido para facilitar el cambio entre diferentes tamaños (Figura 2H).

Configuración del laboratorio de electrofisiología para la grabación de EEG; incluye amplificador, computadora, jaula de Faraday y sensores.
Figura 1: Configuración del equipo del monitor EPG AC-DC para grabaciones en manos humanas. (A) Componentes del EPG, incluyendo la (1) caja de control, (2) caja de interfaz de interruptor, (3) fuente de alimentación, (4) tarjeta A/D DI-710, (5) computadora, (6) regulador de potencia, y (B) jaula de Faraday que contiene (C) un microscopio digital (7) sobre un soporte flexible, (8) espuma de burbujas y almohadillas de aire, (9) sonda de voltaje del sustrato y (10) amplificador de cabezal montado en un soporte de laboratorio. Abreviaturas: AC = corriente alterna, DC = corriente continua, EPG = electropenetrógrafo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Proceso de ensamblaje del catéter con tubo, alambre y herramientas; diagrama del montaje experimental para la transferencia de fluidos.
Figura 2: Electrodos de grabación para conectar mosquitos y un aspirador de insectos para manipular mosquitos durante la conexión. (A) Alambre de cobre 20 AWG con 6 cm del revestimiento plástico retirado para exponer el haz de alambres de cobre interno. (B) Hebras individuales del haz de alambre de cobre. (C) Una hebra de alambre de cobre enrollada alrededor de la cabeza de un pasador de latón con la punta del alambre doblada sobre la cabeza del pasador. (D) Una pequeña cantidad de fundente en la unión entre el pasador de latón y el alambre de cobre, sostenido por una ayuda para soldar tipo "manos auxiliares", en preparación para la soldadura. (E) Un estilete para insectos terminado, construido a partir de una puntilla de latón soldada a un alambre de cobre. (F) Un electrodo de grabación construido con un alambre de oro enrollado alrededor de la punta del alambre de cobre del estilete para insectos y fijado en su lugar con adhesivo de plata. (G) Un acercamiento al bucle de oro en la punta del electrodo de grabación. (H) Un aspirador de insectos ensamblado (arriba) y desarmado (abajo), fabricado a partir de pipetas Pasteur modificadas, malla para mosquitos, tubo plástico, cinta aislante y conectores rápidos macho, junto al tubo de aspirador de laboratorio equipado con el conector rápido hembra (arriba a la derecha). Barras de escala = 1 cm (A-F), 200 µm (G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Cableado de mosquitos

  1. Preparar los mosquitos y el pegamento de plata (la tarde/ noche anterior a la EPG):
    1. Criar y mantener mosquitos de la cepa Cx. tarsalis KNWR tal como se ha descrito previamente27.
    2. Someter a ayuno a hembras adultas de mosquitos, de 5 a 17 días posteriores a la emergencia, durante 8-12 h para aumentar las tasas de sondeo, pero permitir acceso al agua para evitar la mortalidad.
    3. Preparar pegamento de plata fresco26,27,28,29,30:
      1. Añadir 510 mg de escamas de plata de 4-8 µm a un vaso de precipitados de 20 mL. Tarar la balanza y añadir 1.100 mg de pegamento escolar no tóxico al vaso encima de las escamas de plata.
      2. Tarar la balanza, añadir 510 mg de escamas de plata de 8-10 µm al vaso encima del pegamento y luego añadir 1.000 µL de agua utilizando una pipeta.
      3. Añadir suavemente una barra de agitación al vaso y colocarlo en la placa agitadora. Comenzar a agitar lentamente, aumentar gradualmente hasta el ajuste 'rápido' y agitar durante 4 min. Asegurarse de que todos los componentes estén incorporados.
      4. Utilizar una pipeta de transferencia (con la punta cortada) para transferir el pegamento de plata a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
      5. Envolver las tapas de los tubos de pegamento de plata con Parafilm y almacenarlos sobre la mesa de trabajo hasta su uso.
        NOTA: El pegamento de plata mantiene la consistencia adecuada durante hasta 2 días, pero se recomienda prepararlo fresco la noche anterior al uso30.
  2. Preparar los electrodos de registro26,27,29,30:
    1. Vortexar vigorosamente el pegamento de plata antes de usarlo.
    2. Envolver un bloque de espuma con papel plástico nuevo para sostener las bases preparadas para insectos y los mosquitos con cable.
      NOTA: La espuma debe ser lo suficientemente grande para permitir que los mosquitos con cable se mantengan sobre la superficie sin tocarse entre sí, pero lo suficientemente pequeña para caber dentro de una caja de almacenamiento. PRECAUCIÓN: Las gotas excretadas tras la alimentación con sangre pueden contener patógenos. Desechar adecuadamente el papel plástico y el bloque de espuma tras su uso.
    3. Eliminar la oxidación (y el pegamento de plata viejo si se reutilizan las bases para insectos) de la punta del alambre de cobre raspando el primer centímetro del alambre con una cuchilla hasta que quede brillante en todos los lados. Preparar una base para insecto por cada mosquito, más algunas adicionales.
    4. Cortar alambre de oro de 0,025 mm de diámetro en trozos de 4-5 cm de largo. Sostener siempre el alambre con pinzas de cierre automático cubiertas con cinta para evitar marcarlo.
      NOTA: El alambre de oro es mucho más visible sobre un fondo negro.
    5. Colocar el extremo del alambre de oro a lo largo de la punta limpia del alambre de cobre de la base para insectos y envolver suavemente el alambre de oro tres veces alrededor del alambre de cobre.
    6. Utilizar una sonda de disección para aplicar pegamento de plata y fijar el alambre de oro en su lugar. Asegurarse de que no quede ningún extremo suelto ni cola. Colocar la base para insectos en la espuma hasta que el pegamento se seque.
    7. Acicalar suavemente el alambre de oro unido a la base para insectos para alisarlo y darle forma de un arco largo y suave (Figura 2F). Recortar el alambre a la longitud deseada (~2,5-3 cm).
    8. Trabajando bajo un microscopio de disección, utilizar pinzas de punta fina para formar un lazo de oro en la punta del alambre de oro y doblarlo en un ángulo de 90° según se describe a continuación (pasos 2.2.8.1-2.2.8.4; Figura 2E,F). Asegurarse de que el lazo de oro esté completamente cerrado. Devolver la base para insectos al bloque de espuma.
      1. Con la mano no dominante, sostener la base para insectos por el clavo de latón, con la punta del alambre de oro tocando la platina del microscopio. Con la mano dominante, agarrar el extremo del alambre de oro con pinzas de punta fina.
      2. Con las pinzas de punta fina, cruzar la punta del alambre de oro sobre el alambre de cobre de la base para insectos cerca del punto donde el alambre de oro está pegado. Apoyar el extremo de las pinzas y del alambre de oro contra la platina del microscopio.
      3. Tirar suavemente de la base para insectos hasta que el alambre de oro forme un pequeño lazo alrededor de la punta de las pinzas de punta fina (sin apretar demasiado). Soltar el alambre de oro y retirar cuidadosamente las pinzas.
      4. Mientras se sigue sosteniendo la base para insectos con la mano no dominante, agarrar el lazo de oro con las pinzas de punta fina de modo que las pinzas queden en ángulo perpendicular respecto al cuello del alambre y la punta de las pinzas atraviese el centro del lazo de oro, sujetando así ambos lados del lazo. Tirar suavemente de la base para insectos mientras se gira ligeramente las pinzas alejándolas de la base hasta que el lazo quede doblado en un ángulo de 90° respecto al cuello del alambre (Figura 2G).
  3. Colocar los electrodos de registro en los mosquitos26,27,29,30 (la mañana de la EPG):
    1. Anestesiar los mosquitos en ayunas con gas CO2 hasta que cese todo movimiento. Colocar los mosquitos boca arriba sobre la almohadilla de anestesia, con sus abdomens orientados hacia el investigador.
    2. Colocar un trozo de cinta adhesiva de laboratorio de ~2 cm bajo un microscopio de disección, con el lado adhesivo hacia abajo. Colocar una gota de 0,5 cm (~10 µL) de pegamento de plata sobre la cinta.
    3. Aspirar el abdomen de un mosquito anestesiado dentro de una pipeta Pasteur modificada utilizando solo el succión el tiempo suficiente para fijar el abdomen en su lugar. Sostener el mosquito bajo el microscopio estereoscópico sobre el pegamento de plata utilizando el aspirador.
      NOTA: Las alas pueden estar dentro o fuera de la punta de la pipeta Pasteur modificada, pero mantenerlas dentro ayudará a prevenir que el mosquito se caiga. Evitar doblar o dañar las alas.
    4. Trabajando rápidamente, sumergir una aguja minuciosa en el pegamento de plata y aplicar una capa fina sobre el pronoto del mosquito (es decir, la superficie dorsal del tórax). Proceder inmediatamente al siguiente paso si es posible (o reanestesiar el mosquito si es necesario).
      NOTA: Se recomienda eliminar las escamas del pronoto frotando la aguja hacia adelante y hacia atrás para asegurar mejor la penetración del pegamento en los poros de la cutícula. Evitar que el pegamento entre en contacto con cualquier otra parte del mosquito.
    5. Sumergir rápidamente el lazo de oro en la punta del electrodo de registro en el pegamento de plata y colocarlo sobre la gota de pegamento de plata en el pronoto del mosquito. Mover el lazo hacia adelante y hacia atrás para asegurarse de que quede bien asentado contra el pronoto. Sostener el alambre hasta que el pegamento se seque (~20-25 s).
    6. Colocar nuevamente la base para insectos en la espuma en un ángulo que permita al mosquito con cable mantenerse erguido cómodamente cuando despierte. Proceder a conectar el siguiente mosquito.
      NOTA: Es recomendable tomar notas sobre la calidad de cada conexión realizada.
    7. Una vez que se haya conectado el número deseado de mosquitos, colocar el bloque de espuma en una caja de almacenamiento. Mantener los mosquitos en condiciones normales de cría hasta su uso.

3. Configuración y preparación del EPG (la mañana anterior al EPG)

  1. Encienda el monitor EPG de corriente alterna-corriente continua (AC-DC) (activando el interruptor de la fuente de alimentación) al menos 30 minutos antes de la grabación para permitir la estabilización del instrumento y cualquier solución de problemas necesaria.
    NOTA: Los canales en uso en la caja de control y en la caja de interfaz de conmutación pueden dejarse encendidos.
  2. Encienda la computadora y abra el software de gestión del hardware.
    NOTA: Si las señales no aparecen como líneas finas y planas, se requiere solución de problemas (véase la sección de discusión).
  3. Realice la prueba de contacto27,30 para verificar el funcionamiento del equipo:
    1. Mientras esté conectado a tierra (es decir, tocando la jaula de Faraday con la piel desnuda), gire el dial del amplificador de cabeza a 106 Ω e inserte el vástago de un portaobjetos para insectos en el puerto.
      ​NOTA: Realizar la prueba de contacto a un nivel más alto de resistencia de entrada (Ri) podría dañar el amplificador de cabeza.
    2. Mientras esté conectado a tierra, encienda el amplificador de cabeza y sostenga firmemente el alambre de cobre del portaobjetos para insectos entre el dedo índice y el pulgar tres veces. Si el EPG funciona correctamente, aparecerán tres picos grandes en las señales pre y post en la pantalla. Si esto no ocurre, se requiere solución de problemas (véase la sección de discusión).
  4. Ajuste la configuración del instrumento a 150 mV de corriente alterna (AC) con una Ri de 107 Ω, una ganancia de hardware de 20-40x, un desplazamiento negativo, una línea base nativa y una ganancia de software de 8-16x27,30, como se describe a continuación (pasos 3.4.1-3.4.3).
    1. Establezca el voltaje, el tipo de corriente, la ganancia de hardware (rango, ganancia y multiplicador), el desplazamiento y la línea base (cero) utilizando los interruptores y perillas del Canal 1 de la caja de control.
      NOTA: La configuración adecuada de ganancia de hardware depende de la calidad del cableado y del pegamento de plata, por lo que se espera variación en la ganancia óptima entre mosquitos y de un día a otro. La ganancia de hardware puede necesitar ajustes durante la grabación si los picos de señal se saturan (definido en Tabla 2 y mostrado en Figura 3A,C) o si son demasiado pequeños para visualizarse. Cualquier cambio en la ganancia de hardware afectará permanentemente la grabación (mostrado en Figura 3A,C).
    2. Establezca el nivel de Ri utilizando el dial del amplificador de cabeza.
    3. Establezca y ajuste la ganancia de software utilizando el software de gestión del hardware (por ejemplo, seleccione la señal pre o post y luego haga clic izquierdo para aumentar la ganancia de software o clic derecho para disminuirla).
      NOTA: Cualquier cambio de ganancia realizado en el software NO afectará permanentemente la grabación.
  5. Configure una nueva grabación en el software de gestión del hardware, pero no inicie la grabación hasta el paso 4.3 de la siguiente sección.

4. EPG en manos humanas26,27 :

  1. Después de obtener el consentimiento informado (según lo especificado por el comité institucional de revisión de la institución), haga que el sujeto se siente junto a la jaula de Faraday con un brazo dentro, sosteniendo la sonda de voltaje del sustrato y colocándola debajo del amplificador de cabeza.
    NOTA: El brazo debe descansar cómodamente sobre papel de burbujas o un sustrato no conductor similar. La mano y la sonda de voltaje del sustrato no deben tocar la jaula de Faraday ni el amplificador de cabeza durante la grabación. Para evitar daños, es imperativo que el voluntario no toque el amplificador de cabeza una vez que esté encendido. Si el amplificador de cabeza se toca accidentalmente, realice la prueba de contacto descrita anteriormente para evaluar su funcionalidad.
  2. Una vez que el sujeto esté en posición, gire el amplificador de cabeza hacia un lado. Saque un mosquito alambrado de la caja de almacenamiento y conéctelo al instrumento insertando el pasador de latón del soporte del insecto en el puerto del amplificador de cabeza. Deje al mosquito colgando.
    NOTA: Mantenga cerca una botella con pulverizador de etanol al 70 % para controlar cualquier mosquito que se desprenda del alambre.
  3. Inicie la grabación utilizando el software de gestión del hardware. Coloque el amplificador de cabeza sobre la mano de modo que el mosquito pueda posarse y sondear cómodamente.
  4. Encienda el amplificador de cabeza mientras esté conectado a tierra. Inicie un temporizador de 10 minutos. Ajuste la posición de la mano del sujeto según sea necesario para facilitar el éxito del sondeo.
    NOTA: Cuando se utilicen mosquitos propensos a sondear inmediatamente, encienda el amplificador de cabeza antes de colocar al mosquito sobre la mano. Se puede usar una varilla de madera delgada o el mango de un pincel no conductor para doblar el alambre de cobre del soporte del insecto y ajustar aún más la posición del mosquito. Una lupa o un microscopio digital montado en un brazo flexible pueden ayudar a observar al mosquito durante la EPG, especialmente en estudios de correlación conductual.
  5. Utilice el software de gestión del hardware para realizar observaciones con marca de tiempo (por ejemplo, marcadores de eventos) durante la grabación respecto a las respuestas del huésped, comportamientos del mosquito, cambios de ganancia, etc. Ajuste la posición de las señales en la pantalla y la ganancia del software según sea necesario para mantener ambas señales claramente visibles en la pantalla. Ajuste la ganancia del hardware si las señales alcanzan su límite máximo (Figura 3A,C y Tabla 2) o si las ondas parecen demasiado pequeñas cuando la ganancia del software está al máximo. Ajuste el desplazamiento (offset) si se observa inversión del rectificador (Figura 3C,C' y Tabla 2). Consulte el manual del software31 y los recursos en línea30 para obtener instrucciones detalladas sobre cómo realizar estos ajustes.
    1. Para ajustar la posición de las señales en la pantalla, seleccione la señal pre o post (por ejemplo, haciendo clic en
      1 = 1       o 2 = 3) y luego arrastre la señal a la posición deseada en la pantalla (idealmente cerca del centro, pero sin superposición).
    2. Para ajustar la ganancia del software, utilice el software de gestión del hardware descrito en el paso 3.4.3.
    3. Para ajustar la ganancia del hardware, comience girando el selector de ganancia del canal 1 hacia la derecha o hacia la izquierda para aumentar o disminuir la ganancia, respectivamente. Si este ajuste no es suficiente para eliminar el pico (ganancia demasiado alta; Figura 3A,C) o para permitir visualizar claramente los detalles de la señal (ganancia demasiado baja), cambie los interruptores de rango y multiplicador del canal 1 para ajustar aún más la ganancia.
      NOTA: Se recomienda usar marcadores de eventos para registrar cuándo se ajustó la ganancia del hardware, con el fin de facilitar la interpretación de los datos de las formas de onda.
    4. Para ajustar el desplazamiento (offset), cambie el interruptor de desplazamiento del canal 1 en la caja de control a neg, luego gire el selector de desplazamiento del canal 1 hasta que los picos en las señales pre y post ocurran en la misma dirección en la pantalla del ordenador. Si el selector de desplazamiento se gira demasiado, la señal post volverá a invertirse.
  6. Si el mosquito no realiza el sondeo dentro de los 10 minutos (o cualquier otro punto temporal definido), apague el amplificador de cabeza. Si el mosquito está en medio del sondeo en ese momento, permítale terminar antes de apagar el amplificador de cabeza. Pida al sujeto que retire cuidadosamente la mano y luego retire al mosquito con el soporte del insecto adjunto. Devuelva al mosquito a la caja de almacenamiento.
  7. Detenga o cierre la grabación utilizando el software de gestión del hardware. Continúe con la EPG en el siguiente mosquito (Paso 4.2).
    NOTA: Recuerde cambiar el nombre del archivo después de cada mosquito.
  8. Al finalizar la sesión, apague el amplificador de cabeza y la fuente de alimentación, y cierre el software.
  9. Revise la Declaración de Informe al Participante o documento similar con el voluntario según lo especificado en el comité IRB aprobado.
  10. Deseche los mosquitos según los requisitos del protocolo. Retire la lámina de plástico del bloque de espuma y deséchela adecuadamente.
  11. Una vez completada toda la recopilación de datos, revise y mida las formas de onda y analice los datos como se describió previamente24,25,26,27,29,30. Consulte los recursos en línea30 para tutoriales paso a paso sobre el uso del software de revisión de formas de onda, la creación de figuras que representen las formas de onda, la medición de las formas de onda, la exportación de datos para análisis, la realización de análisis estadísticos y una explicación detallada de las variables comunes de respuesta en las formas de onda.

Gráfico de datos electrofisiológicos que ilustra cambios transitorios en la amplitud de la señal a lo largo del tiempo.
Figura 3: Ejemplos de grabaciones subóptimas debido a saturación, cambios en la ganancia del caja de control, cambios de voltaje poco claros por cableado deficiente, plegamiento del rectificador y ruido. Formas de onda de mosquitos Culex tarsalis alimentándose hasta saciarse en manos humanas, distorsionadas por (A) saturación (flecha horizontal azul) y cambios subsiguientes en la ganancia de la caja de control de 100x a 80x a 40x a 60x a 40x a 20x (flechas verticales naranjas), (B) cambios de voltaje poco claros y (C) plegamiento del rectificador en la señal posterior (negra) en comparación con la señal previa (roja) (ver forma de onda J, aumento mostrado en el panel C'), ruido de línea (onda senoidal de 11 Hz visible únicamente en la señal previa a la rectificación (roja), aumento mostrado en el panel C'), saturación (flecha horizontal azul) y un cambio en la ganancia de la caja de control de 500x a 200x (flecha vertical naranja). Los nombres de las formas de onda se muestran en la parte superior de cada panel. Las flechas moradas en la esquina inferior derecha del panel C indican cuándo se apagó el amplificador de cabeza tras completar la sonda y proporcionan otro ejemplo de plegamiento del rectificador. Las líneas horizontales rojas asociadas con la señal previa a la rectificación en el panel C indican cuándo se utilizaron Marcadores de Evento para registrar notas con marca de tiempo. Los niveles de Ri, señales aplicadas, escalas de tiempo y ganancias del software son: (A) 107 Ω, 150 mV CC, 13,2 s/div, 8x; (B) 107 Ω, 150 mV CC, 4,4 s/div, 128x; y (C) 107 Ω, 150 mV CA, 7,4 s/div, 2x; (C') 0,2 s/div, 8x. Abreviaturas: CA = corriente alterna, CC = corriente continua, Ri = resistencia de entrada, mV = milivoltio, Ω = ohmios, s/div = segundos por división. Esta figura fue preparada con datos de Cooper et al.27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

Las grabaciones EPG de corriente alterna y continua (AC-DC) de la alimentación con sangre de mosquitos Cx. tarsalis sobre manos humanas (Figura 4) generaron formas de onda interpretables adecuadas para análisis y publicación27. Las formas de onda interpretables contenían patrones repetitivos distintos y diferenciables que podían clasificarse en familias (Tabla 1 y Figura 4), tipos y subtipos cuando se ajustaba la compresión (definida en la Tabla 2) y la ganancia del software en el software de revisión de formas de onda27,31. Todas las familias de formas de onda (J, K, L, M, N) y tipos (L1, L2, M1, M2) descritos previamente en Ae. aegypti alimentándose sobre manos humanas26 se identificaron en las formas de onda generadas por Cx. tarsalis alimentándose sobre manos humanas, lo que verifica la validez de los métodos descritos aquí. Además, se identificaron tres nuevos tipos de formas de onda (M3, N1, N2) y numerosos subtipos de L1, L2, M1 y M227. Asimismo, la caída de voltaje de regreso a la línea base cuando las piezas bucales se retiran del huésped fue denominada familia de formas de onda W27.

La variación sistemática de los ajustes del instrumento (tipo de corriente y niveles de Ri) siguiendo los procedimientos descritos aquí permitió determinar los ajustes óptimos para registrar la alimentación de Cx. tarsalis sobre manos humanas, los orígenes eléctricos de cada forma de onda, la duración promedio en segundos de las punciones completas e incompletas por mosquito, y la comparación estadística de la duración de la forma de onda en segundos por insecto (WDI), el número de eventos de forma de onda por insecto (NWEI) y la duración de la forma de onda en segundos por evento por insecto (WDEI) entre los diferentes ajustes27. Además, se interrumpió a los mosquitos durante diferentes formas de onda y se les realizó disección para determinar qué forma de onda se correlacionaba con la ingestión de sangre27. Se llevó a cabo una investigación similar para Ae. aegypti utilizando una metodología comparable26.

Debido a la naturaleza sensible e intrincada del EPG, no todas las grabaciones fueron tan nítidas como las que se muestran en la Figura 4. En ocasiones, picos (Figura 3A,C), cambios en la ganancia del hardware (Figura 3A,C), conexiones defectuosas (Figura 3B), el plegamiento del rectificador en la familia de ondas J (Figura 3C,C') y el ruido eléctrico (Figura 3C,C') distorsionaron y enmascararon las formas de onda, lo que dificultó su análisis y puntuación y las hizo inadecuadas para su uso en figuras de calidad para publicación. Por lo tanto, se recomienda dedicar esfuerzo inicial a perfeccionar las habilidades de conexión, optimizar la ganancia y los ajustes de voltaje, ajustar el desplazamiento (offset) y controlar el ruido eléctrico. Curiosamente, el plegamiento del rectificador solo se observó en la familia de ondas J para Cx. tarsalis (Figura 3C,C') y no volvió a presentarse una vez que se ajustó inicialmente el desplazamiento, incluso cuando se utilizaron otras especies de mosquitos (Ae. aegypti y Culex quinquefasciatus) (datos no mostrados). Además, el diagnóstico reveló que el ruido eléctrico no controlado mostrado en la Figura 3 (paneles C y C') se debió a una jaula de Faraday defectuosa. Las grabaciones realizadas en la jaula de Faraday defectuosa aún fueron utilizables, pero los problemas de ruido se resolvieron al construir una jaula de Faraday mejorada (Figura 1B).

Aunque se tomaron todas las precauciones y optimizaciones iniciales, ligeras variaciones en la calidad de la conexión del electrodo al mosquito y otros factores desconocidos que distorsionaban la señal y alteraban periódicamente la relación señal-ruido hicieron necesario ajustar la ganancia del hardware durante la grabación, para asegurar que la señal estuviera dentro del rango visible y que la resolución de los picos en cada forma de onda fuera suficiente para su identificación y caracterización. Desafortunadamente, ajustar la ganancia del hardware durante la grabación puede provocar cambios bruscos de voltaje (Figura 3A, C), lo que hace que las formas de onda no sean adecuadas para su publicación, pero aún utilizables (en su totalidad o en parte) para mediciones y análisis.

Diagramas de equilibrio estático que muestran el análisis de fuerzas; las gráficas resaltan las ecuaciones ΣFx=0, ΣFy=0.
Figura 4: Formas de onda representativas de una sonda de Culex tarsalis sobre una mano humana registradas con una Ri de 107 Ω utilizando una señal aplicada de 250 mV AC. Los nombres de las formas de onda a nivel de familia (NP, J, K, L, M, W) se muestran en la parte superior de cada panel. Los paneles inferiores muestran ampliaciones de regiones seleccionadas del panel A. Los paneles insertados muestran ampliaciones de las regiones indicadas. Las escalas de tiempo y las ganancias del software son: (A) 7.0 s/div, 16x; (B) 1.0 s/div, 64x; (B') 0.2 s/div, 64x; (C) 1.0 s/div, 64x; (C') 0.2 s/div, 32x; (D) 1.0 s/div, 64x; (D') 0.2 s/div, 64x. Abreviaturas: AC = corriente alterna, Ri = resistencia de entrada, mV = milivoltio, Ω = ohmios, s/div = segundos por división. Esta figura fue elaborada con datos de Cooper et al.27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Al utilizar el AC-DC EPG, es fundamental tener un conocimiento básico del funcionamiento del hardware y el software30 y seguir cuidadosamente los protocolos descritos en este documento para evitar dañar el equipo. En particular, evite tocar el amplificador principal cuando esté encendido a menos que esté conectado a tierra en la jaula de Faraday. Se recomienda grabar lo más atrás posible en la jaula de Faraday30. Las puertas de la jaula no necesariamente necesitan estar cerradas para obtener formas de onda interpretables a menos que se graben en un entorno con ruido eléctrico ambiental excesivo. Nada motorizado puede estar en la jaula de Faraday. Es importante tener en cuenta que la jaula de Faraday en sí debe estar conectada a tierra eléctricamente únicamente a través del amplificador principal para que funcione correctamente. Esto se logra conectando el amplificador de cabeza a un soporte de laboratorio de metal con la pintura lijada de un pie del soporte para permitir una vía conductora para que la electricidad capturada por la jaula de Faraday fluya hacia el soporte de laboratorio, hacia la carcasa de metal del amplificador de cabeza, por el cable hasta la caja de control. a través de la fuente de alimentación en un tomacorriente de pared debidamente conectado a tierra, y en la tierra a través de la tierra del edificio30. Se puede utilizar un multímetro para comprobar la calidad de la conexión entre los componentes del interior de la jaula midiendo la resistividad (que es la inversa de la conductividad) entre varios puntos. También se puede colocar una radio AM inalámbrica dentro de la jaula de Faraday para verificar que el sonido se reduzca significativamente (o idealmente se elimine) cuando las puertas están cerradas, lo que confirma que la jaula de Faraday está capturando adecuadamente las señales eléctricas en el aire (E. Backus per. Comm.).

La preparación adecuada y estandarizada del pegamento de plata y la fijación de los electrodos de registro a los insectos son fundamentales para obtener registros utilizables. La cutícula de insectos es un aislante y actúa como un condensador si el pegamento plateado no penetra adecuadamente en los poros de la cutícula para crear una vía para que la electricidad viaje desde el interior del insecto hasta el alambre de oro en la superficie del pronoto30. Prepare el pegamento plateado al mismo tiempo antes de cada sesión de EPG, trabaje con pegamento plateado fresco del tubo y reemplácelo con pegamento plateado vigorosamente vórtice con frecuencia durante el procedimiento de cableado. Asegúrese de que el lazo dorado esté colocado contra el tórax para que todo el lazo esté en contacto con la cutícula y no inclinado hacia un lado o separado por una capa gruesa de pegamento plateado y escamas para ayudar a formar una conexión eléctrica fuerte, así como para evitar el desprendimiento y escape del mosquito del cable.

Los protocolos descritos aquí deben optimizarse cuando se trabaja con diferentes especies de mosquitos. Los ajustes óptimos de EPG (nivel de Ri, voltaje, tipo de corriente y ganancia de hardware) para grabar en un artrópodo dado deben determinarse experimentalmente12,30. Sin embargo, una vez que se ajusta el desplazamiento, no será necesario reajustarlo cuando se trabaje con mosquitos similares. Se han determinado ajustes óptimos para AC-DC EPG con Ae. aegypti26 y Cx. tarsalis27. Las bibliotecas de formas de onda (definidas en la Tabla 2) para especies adicionales facilitarán la adopción de EPG para mosquitos. También es necesario optimizar la anestesia para el mosquito de interés, ya que el comportamiento de alimentación de sangre puede verse afectado de manera diferente según la especie de mosquito y la elección de la anestesia. Por ejemplo, Cx. tarsalis requiere un período de recuperación de 4 h después de 15 min de anestesia con CO2, mientras que para Ae. aegypti, un período de recuperación de 15 min es suficiente después de un período de anestesia de 15 min con hielo. Sin embargo, los Culex tarsalis son difíciles de derribar con la exposición al frío, por lo que elCO2 se usa predominantemente a pesar del largo período de recuperación.

Si bien el monitor AC-DC EPG es fácil de usar después de revisar los recursos en línea30,31 o capacitarlo con un usuario experimentado, se requiere cierta solución de problemas. Inicialmente, las grabaciones EPG del autor de las sondas de mosquitos tenían una onda de signo inesperada de 11 Hz en la preseñal que no había sido observada o reportada por Wayadande y sus colegas26. La consulta con E. Backus indicó que la jaula de Faraday probablemente era el problema debido a los bucles de tierra que interferían. Una nueva jaula de Faraday construida a partir de una pantalla de cobre altamente conductora conectada a un marco de aluminio atornillado a una gran placa de piso de aluminio sostenida por pies de goma para aislarla de la tabla a continuación (Figura 1B), resolvió la señal de ruido de 11 Hz (Figura 3C, C '). Además, ocasionalmente, cuando se encendió por primera vez la fuente de alimentación EPG, las señales previas y posteriores a la rectificación aparecían como líneas gruesas y difusas en lugar de líneas rectas, suaves y delgadas. Esto generalmente se solucionaba apagando el instrumento y verificando todas las conexiones del cable. Si eso fallaba, desenchufar el instrumento durante 1-3 minutos generalmente ayudaba. En muy raras ocasiones, las señales previas y posteriores se vuelven gruesas y borrosas durante el funcionamiento, lo que se solucionó apagando el instrumento y enchufándolo a una toma de corriente diferente o usando un regulador de voltaje y un acondicionador de energía para enchufar la EPG antes de conectarla a la pared. Idealmente, una línea dedicada para el monitor EPG eliminaría el ruido de línea proveniente de los refrigeradores y otros equipos conectados al mismo circuito eléctrico que el EPG30.

Actualmente, existen dos limitaciones principales para usar EPG para estudiar mosquitos. En primer lugar, se han realizado pocos estudios de correlación para verificar qué comportamientos de sondeo corresponden a las formas de onda. Si bien existen hipótesis sólidas sobre lo que está sucediendo durante cada familia de formas de onda (Tabla 1) y algunos de los tipos de formas de onda (M1 y M2), pocas de estas hipótesis se han confirmado experimentalmente, excepto que la ingestión de sangre se correlaciona con la familia de formas de onda M26,27. Lo más importante es que se deben identificar las formas de onda correspondientes a los eventos de salivación porque muchos patógenos se transmiten en la saliva. Se requerirá la correlación de las formas de onda de EPG con las actividades biológicas en los mosquitos para interpretar de manera significativa las diferencias significativas en la duración de la forma de onda y los recuentos entre los grupos de tratamiento. En segundo lugar, las tasas de sondaje e ingestión durante la EPG pueden ser mucho más bajas de lo esperado27. Atar individualmente a los mosquitos a cables cortos y colocarlos directamente sobre el huésped podría prevenir los comportamientos de búsqueda de huéspedes y alimentación social a larga distancia, lo que puede afectar los comportamientos de sondeo e ingestión. Los insectos correctamente conectados pueden caminar y volar normalmente. Aún así, los mosquitos a menudo tiran de los cables y, a veces, se enredan o se mantienen en ángulos antinaturales, lo que indica que estar conectado afecta su comportamiento hasta cierto punto. Los autores probaron muchas estrategias para mejorar las tasas de sondeo durante la EPG, y el ayuno de los mosquitos durante la noche, el uso de individuos mayores, la exposición al aliento humano inmediatamente antes de colocarlos en la mano y la aplicación de saliva humana en la mano fueron los más efectivos, así como el uso de huéspedes que constantemente hacían ajustes a escala fina en la posición de su mano para asegurarse de que el mosquito estuviera en la posición ideal para sondear27.

A pesar de estas limitaciones, AC-DC EPG tiene numerosas ventajas sobre otros enfoques para estudiar los comportamientos de sondaje e ingestión. Sistemas como BiteOScope11, flyPAD15 y Automated BiomaterialPlatform 14 que fueron diseñados para cuantificar los comportamientos de sondeo e ingestión y las secreciones salivales durante la alimentación con sangre utilizan sustratos artificiales transparentes y dietas líquidas que carecen de sistemas de tejido huésped normales y señales del huésped. Si bien estas plataformas sintéticas son útiles para muchos propósitos experimentales, una clara ventaja de AC-DC EPG es la capacidad de estudiar estos comportamientos de artrópodos y variables de interés dentro de los sistemas huéspedes naturales. Además, la adaptabilidad definida por el usuario del sistema AC-DC EPG ofrece una ventaja adicional sobre otros instrumentos EPG22,33 y dispositivos de monitoreo electrónico similares a EPG16,21, que no tienen niveles de Ri, tipos de corriente y niveles de voltaje ajustables que se necesitan para obtener formas de onda con la máxima cantidad de información y minimizar los efectos adversos en una amplia gama de huéspedes y artrópodos22, Artículo 23. Las técnicas de electromiografía (EMG) también se utilizan para estudiar la alimentación sanguínea. Sin embargo, el circuito eléctrico generalmente solo incluye el artrópodo y solo se registran los potenciales musculares más cercanos al electrodo de registro, por lo que las formas de onda no proporcionan información sobre las actividades detalladas que ocurren en la interfaz huésped-insecto, como rupturas celulares, ubicaciones y actividades de estilete y potenciales de flujo a través de las piezas bucales28,34. Las técnicas de microscopía intravital se pueden utilizar para visualizar directamente los movimientos y actividades detallados de las piezas bucales en los tejidos vivos del huésped, pero estas técnicas implican procedimientos invasivos en modelos animales vivos9. Solo el monitor AC-DC EPG puede proporcionar información muy detallada en tiempo real sobre los comportamientos de sondeo, ingestión y salivación que ocurren en tejidos vivos opacos del huésped sin la necesidad de procedimientos invasivos y es adaptable para su uso en una amplia variedad de artrópodos10,12.

Este es el primer procedimiento detallado paso a paso para cablear mosquitos, construir un aspirador de insectos y realizar EPG en huéspedes humanos. Se espera que estos protocolos faciliten la adopción de AC-DC EPG en mosquitos que se alimentan de huéspedes humanos. Ejemplos de futuros esfuerzos de investigación que emplean AC-DC EPG pueden incluir estudios sobre mecanismos fundamentales de alimentación sanguínea y daño tisular del huésped10, incluida la identificación de secuencias estereotipadas de comportamientos de sondeo que preceden a la ingestión de sangre, investigación del flujo sanguíneo a través de piezas bucales y comparación de la plasticidad de la alimentación dentro y entre especies de artrópodos / etapas de desarrollo26. La EPG también se puede utilizar para cuantificar los efectos de insecticidas, antialimenticios y repelentes12. Los procedimientos presentados aquí para usar AC-DC EPG para estudiar mosquitos en manos humanas acelerarán estos estudios y permitirán nuevos conocimientos sobre la biología de los mosquitos que se alimentan de sangre.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar. La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o respaldo por parte del Departamento de Agricultura de EE. UU. Las conclusiones de este informe son las de los autores y no representan necesariamente los puntos de vista del USDA.

Agradecimientos

Estamos agradecidos a la Prof. Astri Wayadande de la Universidad Estatal de Oklahoma por ser pioneros en el procedimiento de cableado para mosquitos, y a la Dra. Elaine Backus en el USDA-ARS en Parlier, CA, y al Sr. Andrew Dowell en EPG Technologies Inc. en Gainesville, FL, por su ayuda en la resolución de problemas del equipo EPG. También agradecemos al Dr. Dustin Swanson y al Sr. William Yarnell del Insectario USDA-ARS en Manhattan, KS, por proporcionar mosquitos, y a la Srta. Miriam Ruhinda de la Universidad Estatal de Kansas en Manhattan, KS por su ayuda con la filmación de los videos de procedimiento. Este trabajo fue posible gracias al acceso al Núcleo Integrado de Entomología Molecular (IEMC) de la Universidad Estatal de Kansas. Esta investigación fue respaldada por el Acuerdo de Desarrollo de la Fuerza Laboral de Investigación, Educación y Economía del USDA (#58-3022-0-002) y el Proyecto Multiestatal Hatch (NE1943). Este manuscrito es la contribución No. 24-194-J de la Estación Experimental Agrícola de Kansas, Universidad Estatal de Kansas, Manhattan, KS, EE.UU.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Instrumentation
AC-DC Electropenetrógrafo de 4 canalesEPG Technologies, Inc.Para EPG, incluye la fuente de alimentación, la caja de control, la caja de interfaz del interruptor, cuatro amplificadores de etapa principal, cuatro sondas de voltaje de sustrato y cables asociados Las
almohadas de aireAmazon.compara que el huésped humano apoye su mano/brazo durante EPG
DI-710 Hardware de adquisición de datos (placa AD)DATAQ Instruments Inc.para digitalizar las señales analógicas de EPG para que puedan visualizarse en un ordenador
Lámpara de aumento LED regulable, lupa grande de 5X manos libres con luz y soporte para lectura Pasatiempos Manualidades Banco de trabajo de costuraAmazon.compara la observación del comportamiento durante la EPG; solo úselo desenchufado durante la EPG o puede resultar ruido
Microscopio digital Dino-Lite Edge (aumento de 250x)Dino-LiteAF4915ZTpara la observación del comportamiento durante EPG
Soporte de escritorio Dino-Lite Flex-armDino-LiteMS22Bpara sujetar y manipular la cámara
Soporte de base de retorta de acero Eisco y juego de varillasFisher ScientificS41740para sujetar el amplificador de la etapa principal y conectar a tierra la jaula de Faraday (debe ser de metal)
Taller en línea EPGUF IFAS Extensionhttps://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022AKA, "recursos en línea" para aprender EPG (configuración de instrumentos, recopilación y análisis de datos, construcción de Faraday, preparación de cola de plata, construcción de talones de insectos, etc.)
Regulador de potencia/acondicionador de potencia Furman P-1800 ARAmazon.compara reducir el ruido de la línea
Envoltura de amortiguación de burbujas pequeñasAmazon.compara usar como barrera entre el anfitrión y la jaula de Faraday
Troemner Talboys Labjaws Soporte de abrazadera regularFisher Scientific02-217-121para sujetar el amplificador de la etapa principal y conectar a tierra la jaula de Faraday (debe estar hecho de metal y no estar recubierto de plástico)
Computadora con WindowsBest Buyfor EPG & statistical analysis
Software
Backus 2.0 Data Analysis SAS program UF IFAS Extensionhttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/para el análisis estadístico de datos de forma de onda
Ebert 1.0 File Manipulator and Error Checker Programas SASUF IFAS Extensionhttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/para la preparación de archivos para el análisis estadístico de datos de forma de onda
SAS versión 9.4SAS Institute Inc.para el análisis estadístico de datos de forma de onda
WinDaq Lite DATAQ Instrumentos, Inc.para el registro y la revisión de los datos de EPG. Incluye el software WinDaq Hardware Manager (AKA, "software de gestión de hardware") y el software WinDaq Waveform Browser (AKA, "software de revisión de forma de onda"). Solo para uso en computadoras con Windows.
jaula de Faraday
marco de pantalla de aluminioHome DepotMSCF5167para las paredes de la jaula de Faraday
Lámina de aluminio, 0,125 (1/8) de espesor 3003-H14Metals DepotS318para la base de la jaula de Faraday
Tirantes de esquina, 1" Home Depot339547para las paredes de la jaula de Faraday
Tornillos de máquina Phillips de cabeza plana, # 6-32 x 1 "Home Depot459999para la construcción de jaulas de Faraday
Arandelas planas, # 6 638977 de Home Depotpara la construcción de jaulas de Faraday
El multímetro digital Fluke 15B+, para aplicaciones eléctricas, mide mediciones de voltaje y corriente CA/CC de hasta 1000 V y 10 A, junto con capacidades de resistencia, continuidad, diodo y capacitanciaAmazon.compara probar la jaula
de FaradayRadio portátil AM FM, Goodes Radio de transistor con altavoz, conector para auriculares, radio a pilas 2AA para recepción de largo alcance, radio de bolsillo para uso en interiores, exteriores y emergenciasAmazon.compara probar la jaula de Faraday
Pantalla de cobre puro, malla 16 x 16 con diámetro de alambre de 0,11, 36" x 12'Obras de pantallaMetro para  las paredes de la jaula de Faraday
Tornillos de máquina combinados de cabeza redonda, #6-32 x 3/4"HomeDepot528466 para la construcción de jaulas de Faraday
Papel de lija, 1/2" por 1", grano 150Home Depot19036-20-CCpara quitar la pintura de la parte inferior del soporte de laboratorio
Esquinas del marco de la pantalla, 5/16" Home DepotWCORN516para las paredes de la jaula de Faraday
Ranura de pantalla, 0.14" Home Depot3034719para las paredes de la jaula de Faraday
Insect Stubs
Brass EscutcheonPins Home Depot801294para construir talones de insectos   
Alambre de cobre, 20 AWGAmazon.compara construir trozos de insectos   
Harris soluble en agua gripe  Home Depot355398para ayudar a soldar a recubrir el alambre de los dientes de insectos y formar una conexión fuerte
Alicates de punta finaHome Depotpara doblar alambre al construir trozos
de insectos Pro's Kit 900-015 Helping Hands AyudaAmazon.compara sujetar los pasadores del escudo durante la soldadura
Soldadura (con núcleo de colofonia)Home Depot296497para la construcción de talones de insectos   
Herramienta peladora de corte de alambreHome Depotpara pelar y cortar alambre de cobre al construir trozos de insectos
YIHUA 928D-III Soldador, 110W de alta potencia, pantalla totalmente digitalAmazon.compara construir trozos de insectos; viene con un soporte, esponja y lana de acero para limpiar
Insect Aspirator
Aspirador de laboratorio Accuris ASPIREInstrumentos AccurisV0020para aplicar succión al aspirador de insectos; incluye el controlador de vacío de mano, el adaptador de acero inoxidable de punta fina (40 mm) y el adaptador de punta de pipeta
Pipetas Pasteur de Chemglass Life Sciences, de 5 3/4" de largoNC0230004 Fisher Scientificpara su uso como aspirador de insectos cuando se cablean mosquitos
Cinta aislante de vinilo de color eléctrico comercialHome Depotpara fijar la pipeta Pasteur modificada a la línea de vacío
Tela utilitaria para mosquiteros, cuadrado de 10 x 10 cmJoann Fabrics16651622para evitar que los mosquitos sean aspirados en la bomba de vacío
Saint Gobain Performance Plastics Tube Tygon 1/4 x 7/16Fisher Scientific50-206-8914para cambiar de forma rápida y sencilla entre diferentes pipetas Pasteur modificadas,
desconectadores rápidos de HDPE Thermo Scientific Nalgene (de 3/8 a 7/16 pulg. Identificación.)Fisher Scientific15-315Bpara un cambio rápido y sencillo entre diferentes pipetas Pasteur modificadas
Silver Glue 
Elmer's Glue-All Multi Purpose White GlueAmazon.compara la preparación de pegamento de plata
Escamas de plata 99.9% pura,  4-8 µ mThermoFisher786.09para la preparación de cola de plata
Flake 99,95% puro, 8-10 y micro; mInframat Advanced Materials47MR-12Fpara la preparación de pegamento de plata
Anesthesia de insectos
CO2 kit de burbujeo, 1000 mL, #9 Rubber StopperFlyStuff59-181para prevenir la desecación de insectos mientras se usa el
flypad Flypad  marco, tamaño estándarFlyStuff59-118para evitar que los mosquitos se caigan de la almohadilla
Flystation BrushFlyStuff59-205para reducir la estática cuando se trabaja en una almohadilla
Flystuff  Flypad  tamaño estándarFlyStuff59-114AKA "almohadilla de anestesia" para anestesiar mosquitos
Embudo (4 pulgadas de diámetro)Amazon.compara gasear tazas de mosquitos antes de transferirlas al flypad
Plexiglás o una tapa de plástico plana (cortada a medida)Home DepotMC-27para cubrir el flypad si los mosquitos comienzan a despertarse
Cierre Abrazaderas de manguera de tubería de plástico de una sola posición y ajustables Apertura (variedad de 1/8" a 1/2")Amazon.compara desviar el gas entre el flypad y el embudo
Regulador de CO2 de una sola etapaFlyStuff59-142para regular el flujo de gas del tanque de CO2
" T” Racor para tubo de 1/8" de diámetro internoFlyStuff59-123para conectar tanto el flypad como el embudo al tanque de CO2
Tubo, transparente FlyStuff59-124Cpara conectar el embudo y la almohadilla al regulador en el tanque de CO2
Insect Wiring
Cartulina negra, (65Lb, 176 g/m2) 8.5" x 11"Michael's Stores Inc.327826para hacer que el alambre de oro sea más fácil de visualizar
Papel de construcción negro cuadrado de 3.5" x 4.0"Grapas956221para hacer que el alambre de oro sea más fácil de visualizar
Bolas de algodónAmazon.compara los mosquitos en ayunas
Bloque de espuma artesanal #12 (3,1 cm x 17,2 cm x 30,2 cm)Tienda de telas y manualidades Joann1941079para sujetar mosquitos con cable
Cinta Deflecto Dispensador, Amazon.compara almacenar hilo de oro
Pinza de entomología de peso plumaFisher ScientificS72110para la manipulación de insectos
Pinzas finas (FST by Dumont: #5 91150-20, Inox-Electronic)Fine Science Tools91150-20para hacer un lazo de oro al cablear mosquitos
Pincel de punta finaAmazon.compara la manipulación de mosquitos durante el cableado y EPG; debe tener un mango de plástico o madera si se usa para EPG
Pipetas de transferencia estándar de punta fina, estrechas, 5,8 mLThomas Scientific7761D21para la preparación de cola de
plata Alambre de oro, 99,99% puro, 0,025 mm de espesorGoodfellowAU005121para el cableado de mosquitos
Pines minutiens, punta 0,2 mm, 1 cmNC9681411 Fisher Scientificpara aplicar pegamento a los mosquitos
Vasos de papel Tubopara mosquitos en ayunas     
Tornillo de bancoFisher Scientific50-996-811para sujetar el alfiler minucioso durante el cableado de insectos
Caja de almacenamiento de plástico con tapa (7 pulgadas x 9 pulgadas x 14 pulgadas)Amazon.compara transportar mosquitos con cable
Plexiglás o una tapa de plástico plana (cortada a medida)Home DepotMC-27para cubrir la almohadilla si los mosquitos comienzan a despertarse
Pinzas de cierre automáticoFisher Scientific08-906para sujetar y manipular el tanque
><<> >< oro< / fuerte>< / em>< / u>
CO2 < / sub>gasMatheson Gaspara anestesiar mosquitos con un flypad
Artículos de laboratorio comunes
Bolsas de autoclave desechables de riesgo biológico, 8 1/2" x 11"Fisher Scientific03-410-591para la eliminación de mosquitos alimentados con sangre Quemador
Bunsen o soplete de propanoAmazon.compara la modificación de pipetas Pasteur Cinta de
laboratorio de coloresDaigger SuppliesEF9763Rpara etiquetar, preparar pegamento de plata y pinzas de enmascarar
Puntas de pipeta desechables, 1000 y micro; LFisher Scientific para alícuota de agua al hacer cola de plata
Microscopio de disecciónLeica Microsystemspara el cableado de mosquitos
Sonda de disecciónFisher ScientificNC9109673para agitar  y aplicar cola de plata
Matraz Erlenmeyer, 1000 mLFisher Scientific para prevenir la desecación de insectos mientras se usa la almohadilla para moscas
Etanol, 70% Fisher Scientific04-355-122para recuperar mosquitos escapados
Placas de Petri de vidrioFisher Scientific08-747Bpara anestesiar mosquitos con hielo
GuantesFisher Scientificpara protección personal
Kimwipes Limpiaparabrisas de la marca KimTech Science para tareas delicadas Fisher Scientific06-666para triturar
mosquitos Batas de laboratorioFisher Scientificpara la protección personal
LiBa Botellas de spray, recargables Botellas de spray vacías (aptas para alcohol isopropílico)Amazon.compara recuperar mosquitos escapados
magnética, 2 cm de largoFisher Scientific para mezclar cola de plata
Pipeta mecánica monocanal, 1000 y micro; LFisher Scientific 13-690-032para alícuotas de agua al hacer pegamento de plata
Tubos de microcentrífuga, 1,5mL Fisher Scientific 780420para el almacenamiento de cola de plata
Parafilm M Fisher Scientific50-998-944para sellar tubos de cola de plata
Envoltura de plásticoAmazon.compara cubrir el bloque de espuma
Pyrex 20 mL Vaso de precipitadosFisher Scientific 07-250-051para mezclar cola
de plata Semi-Micro BalanceFisher Scientific 10-919-370para pesar pegamento y escamas de plata
Rotulador Sharpie, punta finaAmazon.compara etiquetar
Hoja de afeitar de un solo filoMicroscopía electrónica Sciences71980para la limpieza de talones de insectos
Pipetas de transferencia desechables estándar FisherScientific 133-711-7mLpara transferir pegamento de plata a un tubo de almacenamiento 
Plato de agitaciónFisher Scientific para mezclar cola de plata
Temporizador/cronómetroFisher Scientificpara cronometrar cuánto tiempo está expuesto el huésped a cada insecto
Agua ultrapura (18 MΩ)Fisher Scientific para la preparación de cola
de plata Tijeras utilitariasFisher Scientific08-945para cortar alambre de oro
Mezclador de vórticeFisher Scientific para mezclar pegamento
de plataStudy Organisms
Culex tarsalis mosquitosUSDA ARS Center for Grain and Animal Health Research en Manhattan, KSpara su uso como sujetos de estudio
a la soldadura Silver transparente de papel rígido de Barra agitadora

Referencias

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