Artículo de método

Aislamiento de subpoblaciones subcelulares de ribosomas basadas en biotinilación potenciada por iluminación restringida por etiquetas péptidas específicas de péptidos recombinantes

DOI:

10.3791/66881

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24 de julio de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Stanford School of Medicine

En este artículo

Resumen

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La Biotinilación Mejorada por Iluminación Restringida por Localización específica (ALIBi) es un método novedoso activado optogenéticamente desarrollado para marcar y purificar afinidad poblaciones subcelulares de ribosomas para secuenciación posterior y análisis proteómico.

Resumen

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Cada vez hay más evidencia que sugiere que la traducción de ARNm es un proceso altamente compartimentado dentro de una célula, y que el tráfico subcelular y la localización de ARNm específicos son clave para garantizar que las proteínas con funciones específicas de compartimento se produzcan en el entorno ideal y en cantidades adecuadas. Sin embargo, las técnicas para el aislamiento subcelular y la caracterización de los ribosomas que traducen estos ARNm han sido limitadas hasta la fecha, de modo que aún se desconoce mucho sobre cómo la composición de la maquinaria traduccional contribuye a la regulación de la traducción localizada de ARNm.

Aquí demostramos Biotinilación Iluminada Restringida por Ubicación específica (ALIBi) específica para etiquetas de AviTag, un método que combina el marcado de epítopos, una ligasa de biotina dividida optogenéticamente activada recientemente desarrollada y purificación por afinidad para marcar y aislar ribosomas localizados de forma rápida y específica en cualquier compartimento subcelular de interés. Primero, la edición CRISPR/Cas9 se utiliza para fusionar un péptido AviTag, un sitio de corte proteasa del virus del grabado de tabaco (TEV) y una etiqueta de epítopo FLAG con una proteína ribosómica. La ligasa de biotina dividida, fusionada con un dominio dirigido a orgánulos, se expresa en esta línea celular y está inactiva bajo concentraciones normales de biotina. Al activarse mediante biotina suplementaria e iluminación con luz azul, la ligasa biotinila ribosomas AviTag en las inmediaciones, permitiendo la purificación de afinidad de ribosomas biotinilados y proteínas y ARNm asociados en perlas recubiertas de estreptavidina. La elución no desnaturalizante mediante la clivación de la proteasa TEV proporciona muestras adecuadas para la caracterización posterior de proteínas ribosómicas centrales, proteínas asociadas a ribosomas y ARNm unidos a ribosomas mediante secuenciación de ARN o proteómica por espectrometría de masas.

En este protocolo, revisamos los principios de diseño para fusionar AviTag con una proteína ribosómica y dirigir la enzima ligasa de biotina dividida al orgánulo de interés. Demostramos la activación del sistema ALIBi, la lisis celular, la purificación de afinidad y la elución de muestras. Por último, hablamos de los resultados típicos y la resolución de problemas.

Introducción

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Existe una necesidad importante de herramientas que puedan aislar muestras biológicas de compartimentos subcelulares específicos para investigar mejor cómo la organización subcelular y el tráfico influyen en los procesos celulares. La traducción de ARNm es un ejemplo clave de este proceso: cada vez más evidencias sugieren que la traducción está altamente compartimentada y, en particular, que muchos ARNm están localizados en los orgánulos donde residirán sus proteínascodificadas 1,2. Sin embargo, se sabe menos sobre la localización subcelular de la maquinaria traslacional. Los ribosomas comienzan su existencia en el nucleolo y núcleo, donde comienza el ensamblaje a partir de proteínas ribosómicas (RP) y ARN ribosómicos (ARNr). Luego se exportan al citoplasma para las etapas finales de ensamblaje, tras lo cual comienzan a traducir losARNm 3,4. Los sitios canónicos de traducción incluyen el citoplasma y el retículo endoplásmico; este último es donde se sintetizan proteínas integrales de membrana y proteínas destinadas a orgánulos unidos a membranas o secreciónextracelular 5. Los sitios de traducción localizada identificados más recientemente incluyen las mitocondrias, los peroxisomas y los procesosneuronales 6,7,8,9,10,11,12. Curiosamente, también están surgiendo evidencias de que características de la maquinaria traslacional, como proteínas asociadas a ribosomas, modificaciones postraduccionales, modificaciones de ARNr y estequiometría no canónica de proteínas ribosómicas centrales, están implicadas en mecanismos reguladores que rigen la traducción de ARNm específicos y parámetros como la fidelidad y tasa de traducción 13,14,15,16,17.18, 19, 20. Por ejemplo, se han identificado cientos de proteínas que interactúan con el ribosoma y podrían potencialmente provocar diferencias en la composición subcelular delribosoma 13. Sin embargo, las técnicas para aislar poblaciones subcelulares de ribosomas han sido limitadas hasta la fecha; por tanto, mucho sigue siendo desconocido sobre cómo la composición de la maquinaria traduccional contribuye a regular la traducción localizada de ARNm. La llegada de métodos versátiles para aislar poblaciones de ribosomas subcelulares, especialmente aquellas compatibles con sistemas modelo de mamíferos, permitirá explorar estas características de la maquinaria de traducción a nivel subcelular.

Los primeros métodos para aislar fracciones subcelulares que contenían ribosomas se basaron en principios de lisis secuencial ycentrifugación 21,22. Normalmente, estos métodos se limitan a ciertos orgánulos y a menudo requieren largos tiempos de procesamiento. Un método más reciente se basa en la ligasa de biotina BirA, que biotinila específicamente un sustrato peptídicoAviTag 10,23,24. La BirA puede localizarse genéticamente en el orgánulo de interés en células donde los ribosomas han sido marcados con AviTag. Sin embargo, dado que BirA está activo en concentraciones fisiológicas de biotina, es necesario cultivar células bajo condiciones de agotamiento de biotina para evitar la biotinilación constitutiva e inespecífica de los ribosomas portadores deAviTags 10,24. Esto limita el uso de BirA en tipos celulares sensibles a la depleción debiotina 25. Finalmente, se han desarrollado métodos de biotinilación promiscua que utilizan enzimas modificadas como BioID, TurboID yAPEX 26,27,28. Al inducirse, estas enzimas producen un intermedio de biotina reactivo que modifica covalentemente cualquier residuo de lisina dentro de un radio alrededor de la enzima. Los métodos de biotinilación promiscua son muy útiles para mapear proteomas subcelulares, pero menos informativos para distinguir proteínas en la proximidad general de ribosomas localizados en comparación con proteínas que están más cerca de ellos.

Aquí demostramos nuestro método recientemente desarrollado para marcar y aislar poblaciones subcelulares de ribosomas, llamado Biotinilación Mejorada por Iluminación Restringida por Localización específica de AviTag (ALIBi). Este método aprovecha un BirA dividido diseñado fusionado con interruptores de imán optogenéticamente mejorados (eMag) (Figura 1A) que heterodimerizan bajo iluminación de luzazul 29; y una etiqueta peptídica compuesta por el epítopo FLAG, el sitio de corte de la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) y AviTag (FTA) fusionado con la proteína ribosómica Rpl31 (Figura 1B). La enzima dividida puede dirigirse genéticamente a orgánulos seleccionados, es inactiva a concentraciones fisiológicas de biotina y puede reconstituirse en minutos tras la iluminación de luz azul y la adición de biotina suplementaria (Figura 1C-E). La posterior lisis celular, purificación de afinidad y elución enzimática no desnaturalizante mediante la escisión de la proteasa TEV produce ribosomas y moléculas copurificadoras como ARNm y proteínas asociadas a ribosomas, que son adecuadas para métodos analíticos posteriores como la secuenciación de ARN y la proteómica por espectrometría de masas (Figura 1A). Por lo tanto, este método revela no solo la composición de los ribosomas, sino también los ARNm a los que están ligados los ribosomas. En un artículo reciente que describe la aplicación fundamental de ALIBi para caracterizar poblaciones de ribosomas subcelulares, dirigimos con éxito la enzima dividida al citoplasma, nucleolo, núcleo, retículo endoplasmático, membrana plasmática y mitocondrias (Tabla 1)30. La comparación resultante de la maquinaria traslacional entre estos compartimentos subcelulares condujo a hallazgos novedosos e inesperados respecto a la traducción en el retículo endoplássmico y las mitocondrias, así como posibles pistas para futuras investigaciones de los factores de biogénesis del ribosoma en el núcleo y el nucleolo.

Este protocolo contiene una demostración detallada de la transfección y activación del sistema ALIBi, lisis celular, purificación de afinidad y elución de muestras. También discutimos cómo verificar la purificación exitosa de afinidad mediante western blot y formulamos recomendaciones para realizar análisis proteómicos posteriores de secuenciación de ARN o espectrometría de masas (EM) (véase Archivo Suplementario 1). Este protocolo está escrito para experimentos que utilizan células madre embrionarias de ratón (mESCs) que expresan Rpl31 fusionado con FTA (L31-FTA) de forma homocigífica desde el locus endógeno de Rpl31; Esta línea celular está disponible por los autores a petición. La estrategia para generar esta línea celular se describe en el Archivo Suplementario 1 y en la Figura Suplementaria S1 y la Figura Suplementaria S2. Los plásmidos que codifican las enzimas divididas dirigidas a varios orgánulos están disponibles en Addgene (números de catálogo #235608 a 235643). Los principios de diseño para dirigir las enzimas divididas a estos orgánulos se describen en el Archivo Suplementario 1. El protocolo asume que cada muestra se origina a mESCs cultivados en una placa de 10 cm. Hemos comprobado que la escala de 10 cm proporciona material suficiente para la proteómica de espectrometría de masas, mientras que la escala de 6 pozos es suficiente para la secuenciación de western blots o ARN.

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Protocolo

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1. cultivo celular de mESC

NOTA: Antes de la activación de ALIBi y la lisis celular, los mESC deben manejarse mediante la técnica estéril estándar para el cultivo celular. La centrifugación de mESCs intactos debe realizarse a 200 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente, salvo que se especifique lo contrario. Precalentar el medio a 37 °C en baño maria antes de usarlo, salvo que se especifique lo contrario. Los mESCs deben pasarse a una placa de cultivo de tejido fresca que haya sido gelatinizada durante la noche (véase el paso 1.1).

  1. El día anterior al descongelamiento de los mESCs L31-FTA, recubre la parte inferior de una placa de 10 cm con 5 mL de gelatina al 0,1%. Incubar a 37 °C durante la noche.
  2. Combina los componentes del medio mESC (Tabla 2) y pasa por un filtro de 0,2 μm. Guárdalos a 4 °C hasta un mes.
  3. El día del descongelado, calienta una alicuota de 5 mL de medio para diluir las células descongeladas y una alicuota de 10 mL para emplatarlas.
  4. Recuperar un cryovial que contiene ~5 × 106 MESCs L31-FTA del almacenamiento de nitrógeno líquido. Descongela inmediatamente haciendo girar el fondo del vial en un baño maria a 37 °C.
  5. Mezcla suavemente entre 0,5 y 1 mL de medio de la alicuota de 5 mL con el contenido criovial según lo permita la capacidad del vial, y luego transfiere el contenido criovial de nuevo a la alicuota del medio de 5 mL.
  6. Pelleta las células mediante centrifugación. Aspira el sobrenadante.
  7. Resuspende el pellet celular con la alícuota de 10 mL de medio.
  8. Aspira la gelatina de la placa de 10 cm y transfiere inmediatamente la suspensión celular a la placa. Incubar a 37 °C.
  9. Cada 24 horas (excepto en días de paso), aspira material viejo de la placa y sustituye por 10 mL de material fresco.
  10. Cuando las colonias estén entre un 70% y un 80% de confluencia (normalmente 48 horas después del placado), aspira el medio antiguo y enjuaga dos veces con 10 mL de suero salino fosfatado (DPBS) de Dulbecco.
  11. Tras aspirar el DPBS, recubre la placa con 2 mL de tripsina al 0,05% (Tabla 2). Incubar a 37 °C durante 5 minutos.
  12. Neutraliza la tripsina añadiendo 4 mL de medio mESC frío a la placa. Inmediatamente usa una pipeta serológica de 5 o 10 mL para picar 15 veces más en la placa y disociar las colonias en una suspensión unicelular.
  13. Transfiere la suspensión a un tubo cónico. Opcionalmente, retira una alicuota para contar células usando un hemotómetro.
  14. Pelleta las células mediante centrifugación. Aspira el sobrenadante.
  15. Resuspende la pelota celular en medio fresco. La placa 5 × 106células (normalmente una relación de paso de 1:6) en una placa gelatinizada fresca de 10 cm e incuban a 37 °C. Repite los pasos 1.9–1.15 según sea necesario hasta estar listo para proceder con la transfección.
  16. Para fabricar stocks celulares congelados, tripsiniza una placa de mESCs (como en los pasos 1.10–1.14). Resuspende la pelota celular en medios congelantes (250–500 μL por 5 × 106 celdas), alicuota en crioviales y congélación lentamente en un recipiente de congelación de celdas a -80 °C durante la noche antes de transferirla al almacenamiento de nitrógeno líquido.

2. Transfección

NOTA: Realiza la transfección el día en que los mESCs estén listos para el paso. Los plásmidos pueden empezar a expresarse tan pronto como 3-5 horas después de la transfección. Una vez exprimidos, recomendamos manipular las células en la oscuridad y minimizar la exposición a temperaturas inferiores a 37 °C para evitar una activación prematura, ya que trabajos previos han demostrado que los dominios optogenéticos magnéticos se dimerizan no solo bajo luz azul, sino también al exponerse al frío31. Guarda los platos en una incubadora dedicada o protege una estantería en una incubadora compartida de la luz con papel de aluminio. Al manipular celdas fuera de la incubadora, apaga o bloquea todas las luces y ventanas de la habitación con antelación, y usa un faro de luz roja para ver. No dejes la puerta de la incubadora abierta más tiempo del necesario. Saca solo pequeños lotes de placas de la incubadora a la vez, y apoya las placas sobre una superficie aislante (es decir, una tapa limpia de una caja de poliestireno) mientras las manipulas para minimizar el contacto con superficies de trabajo a temperatura ambiente. Calienta completamente el material antes de usarlo. No inspecciones las placas bajo un microscopio emisor de luz.

  1. El día antes de la transfección, gelatiniza una placa de 10 cm.
  2. El día de la transfección, aspira la gelatina de la placa y añade 7,5 mL de medio para precalentar a 37 °C. Precalentar el medio sérico reducido a 37 °C para las células en suspensión resuspendida.
  3. Diluir 18,75 μL del reactivo de transfección en 250 μL de medio sérico reducido. Golpea suavemente para mezclar e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  4. Si se coexpresan dos plásmidos que codifican los fragmentos N y C, añadir 3,75 μg de cada plásmido a 250 μL de medio sérico reducido. Si solo se expresa un plásmido (es decir, un control negativo GFP o un control positivo de longitud completa para BirA), añadir 7,5 μg del plásmido individual en su lugar.
  5. Añade la mezcla de plásmidos y medio sérico reducido a la mezcla de reactivos de transfección y medio suero reducido y pincha/invierte para mezclar. Incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos.
  6. Mientras tanto, tripsinizar y pelletar los mESCs (pasos 1.10–1.14). Resuspende el pellet en un medio suero reducido calentado hasta una concentración de 10 × 106 células/mL.
  7. Añadir 7,5 × 10células resuspendidas de 6 (750 μL) a la mezcla de plásmido/reactivo de transfección/medio sérico reducido. Invierte el tubo para mezclar. Incuba durante 10 minutos en RT, invirtiendo los tubos de vez en cuando para mantener las células suspendidas.
  8. Invierte los tubos brevemente y añade la mezcla mESC/plásmido/reactivo de transfección/medio sérico reducido a la placa que contiene el medio calentado. Balancea suavemente la placa para distribuir las células de forma uniforme.
  9. Incubar la placa a 37 °C durante 3–5 horas, permitiendo que las células se adhieran en este tiempo.
    NOTA: A partir de este momento, recomendamos respetar las precauciones anteriores contra la exposición a la luz y temperaturas por debajo de 37 °C.
  10. Aspira suavemente los medios antiguos. Añade medios frescos y calientes, pipeteando por el lateral de la placa para evitar que las células se desalojen. Reanudar la incubación a 37 °C.
  11. Si se activa/lisa a las 24 horas después de la transfección, procede a la sección 3. Si planeas activar/lisar a las 48 horas de la transfección, cambia el medio ~24 horas después de placar las células transfectadas.

3. Activación de ALIBi y lisis celular

NOTA: Sigue manipulando células/muestras en la oscuridad hasta el inicio de la elución (paso 5.4). Una vez que las células han sido enfriadas sobre hielo (paso 3.15), mantener las muestras frías y usar solo reactivos refrigerados hasta el inicio de la elución. Asegúrate de que las superficies de trabajo, equipos, reactivos y plásticos estén libres de ARN utilizando objetos recién abiertos y limpiando o enjuagando superficies duras con una solución descontaminante de ARN y etanol al 70%. Lleva guantes siempre que manipules muestras o equipo. Para muestras destinadas a la proteómica de EM, también se minimiza la contaminación por queratina manteniendo el espacio de trabajo libre de polvo; Cubre la piel desnuda y recoge el pelo largo.

  1. Preenfría la centrífuga a 4 °C.
  2. Con las luces apagadas, traslada las placas transfectadas a una incubadora temporal a 37 °C para que no se expongan a fluctuaciones de temperatura en la incubadora principal después de colocar el transiluminador en su interior.
  3. Limpia el transiluminador de luz azul con etanol al 70% y conéctalo a la corriente. Coloque el transiluminador en la incubadora principal y permita que las condiciones de la incubadora se reequilibren mientras continúan con la instalación.
  4. Calienta una alicuota de medio para dosificar con biotina y cicloheximida (CHX) (10 mL de medio por placa de 10 cm) a 37 °C. Si se analizan muestras de control sin biotina suplementaria, calienta también una aalícuota separada para dosificar solo con CHX.
    NOTA: Algunos componentes del tampón pueden mezclarse el día antes de su uso y almacenarse durante la noche a 4 °C (véase la Tabla 2). Cabe señalar que se utilizaron diferentes recetas de lisis y tampón de lavado para experimentos destinados a la proteómica western blot o MS y para la secuenciación de ARN.
  5. Enfría una alitera de DPBS para ser dosificada con CHX (20 mL por placa de 10 cm).
  6. Preparar el tampón de eliminación de RNAsa, el lavado de sal, el tampón de lisis y el tampón de lavado (véase la Tabla 2). Para buffers con componentes densos/viscosos como glicerol y Triton X-100, haz un pipete en el buffer terminado para asegurar una mezcla uniforme. Enfría los buffers sobre hielo antes de usarlos.
    NOTA: Para los pasos de lavado de cuentas, gira brevemente el tubo que contiene las perlas en su buffer actual en una centrífuga de bolsillo para recoger el contenido en la parte inferior. Coloca el tubo en un soporte magnético durante 1 minuto o hasta que las cuentas hayan migrado completamente. Aspira el sobrenadante sin tocar la bolita de cuentas. Sin dejar secar la bola, añade el siguiente amortiguador. Para volver a suspender la perla de cuentas, puede hacer un pipeteo suave o hacer rodar el tubo cerrado entre los dedos mientras lo sostienes contra la rejilla magnética, de modo que las cuentas se tiren rápidamente en múltiples direcciones por el imán. Por último, invierte varias veces las perlas resuspendidas para asegurarte de que se lavan las paredes interiores del tubo.
  7. Vuelve a suspender la botella original de cuentas de estreptavidina pipeteando suavemente o meciéndola. Transfiere 450 μL de perlas a un tubo de baja unión proteica para cada placa de 10 cm de mESC.
  8. Siguiendo la NOTA anterior sobre el lavado de bolas, descarta el buffer de almacenamiento de perlas y lava las perlas 2 veces con 900 μL de buffer de eliminación de RNAse.
    NOTA: Proceda al siguiente paso sin demora; el tiempo prolongado en el buffer de eliminación de ARNasa puede disminuir la capacidad de unión de las perlas.
  9. Lava las perlas 1 vez con 900 μL de lavado con sal.
  10. Lava las perlas 2 veces con 900 μL de Wash I Buffer. Después de volver a suspender las perlas en la segunda ronda del buffer Wash I, guarda las perlas en el buffer Wash I a 4 °C mientras se realiza la activación y la lisis celular.
  11. Añadir biotina (concentración final de 50 μM; dilución 1:1.000 de material de 50 mM) y CHX (concentración final de 100 μg/mL; dilución 1:1.000 de material de 100 mg/mL) según corresponda a la(s) alicuota(s) calentada(s) del medio. Mantenlo a 37 °C hasta el uso.
  12. Añadir CHX (concentración final de 100 μg/mL; dilución 1:1.000 de 100 mg/mL) a la alitería fría de DPBS y mantenerla refrigerada hasta su uso.
    NOTA: Los dos pasos siguientes describen la activación de ALIBi mediante biotina suplementaria e iluminación con luz azul. Una duración ideal de activación es lo suficientemente larga para proporcionar una cantidad adecuada de biotinilación de ribosomas para ensayos posteriores, pero lo suficientemente corta para preservar la resolución espaciotemporal. El tiempo ideal de activación puede variar en función de parámetros como el tipo celular, la escala del experimento, el nivel de expresión de las enzimas escindidas, la abundancia de ribosomas cerca del orgánulo de interés y la sensibilidad de la técnica de análisis. Recomendamos 15 minutos como punto de partida, que es el tiempo de activación utilizado en nuestros resultados representativos (Figura 2) y en nuestro trabajoacompañante 30.
  13. Aspira medios de las placas transfectadas. Añade inmediatamente 10 mL del medio caliente que contiene CHX ± biotina por placa.
  14. Para que las placas de control negativas no se iluminen, colócalas en una incubadora oscura. Para que las placas se iluminen, colócalas directamente sobre el transiluminador, enciéndelo y incuba durante 15 minutos.
  15. Cuando termine la iluminación, lava inmediatamente las placas dos veces con 10 mL de DPBS en frío + CHX por placa. Coloca los platos sobre hielo entre y después de los lavados. Después de aspirar el segundo lavado, inclina la placa y aspira cualquier DPBS residual.
  16. Manteniendo cada placa lo más plana posible sobre hielo, procede a la lisis añadiendo 2 mL de tampón de lisis helado. Incuba la placa sobre hielo durante 5 minutos, golpeando la placa para desalojar las células 2–3 veces durante ese tiempo.
    NOTA: si se mantiene oscuro bajo papel de aluminio y sobre hielo, las placas pueden moverse fuera del área de cultivo celular a otro espacio oscuro durante este tiempo.
  17. Desaloja cualquier célula restante usando una micropipeta para pipetear el lisato arriba y abajo sobre la superficie de la placa, evitando la formación de burbujas, y luego transfiere el lisato a un tubo de baja unión proteico refrigerado y marcado.
    NOTA: OPCIONAL: Para algunos orgánulos difíciles de lisar, como el núcleo y el nucléolo, la sonicación puede ayudar.
  18. En el caso de orgánulos difíciles de lisar, sonicar todas las muestras del experimento durante 45 s a 4 °C (ajuste de potencia de 3 vatios). Si el diseño del sonicador requiere la inserción de una sonda en un tubo de muestra abierto, transfiere el lisato inicialmente desde la placa a un tubo más grande para evitar el desbordamiento durante la sonicación; luego, transfirirlo a un tubo de 2 mL.
  19. Incuba el lisado sobre hielo durante 15 minutos.
  20. Centrifuga el lisado a 17.000 × g durante 3 minutos a 4 °C. Transfiere el sobrenadante (lisato clarificado) a un tubo de baja unión proteica refrigerado sin alterar el pellet de restos celulares.
    NOTA: Si se pretende un análisis de RNA-seq, ahora se puede recoger una alitería del lisato clarificado como la fracción total de ARN (véase el Archivo Suplementario 1, "Recomendaciones para la secuenciación de ARN" paso 1.1) para más detalles.
    NOTA: Si las cantidades celulares, las condiciones de transfección/cultivo y las condiciones de lisis han sido uniformes en todas las muestras, normalmente asumimos que las concentraciones de lisado son comparables entre muestras y procedemos sin cuantificar la concentración total de proteínas. Esto minimiza el tiempo transcurrido entre la activación y la purificación de afinidad.

4. Purificación de afinidad

  1. Pelleta las cuentas de estreptavidina lavadas usando la rejilla magnética. Aspira el buffer Wash I.
  2. Transfiere 1.200 μL de lisato clarificado al tubo que contiene las perlas lavadas. Haz un pipete suave para volver a suspender las cuentas. Almacenar el resto del lisato clarificado a -80 °C.
  3. Incuba el lisado con perlas a 4 °C en la oscuridad durante 1 hora en el rotador tubo.
  4. Durante esta incubación, preparar el tampón de elución TEV (Tabla 2).

5. Elución

  1. Siguiendo las notas sobre el lavado de perlas en la sección 3, aplica las perlas en un soporte magnético y transfiere el sobrenadante a un tubo frío de baja unión proteica. Guarda el sobrenadante a -80 °C.
  2. Lava las perlas 2 veces con 900 μL de buffer Wash I.
  3. Lava las perlas 1 vez con 900 μL de buffer Wash II.
    NOTA: Tras completar este paso, las muestras ya no necesitan ser manipuladas a oscuras.
  4. Añade 450 μL de buffer de elución TEV a las cuentas.
  5. Incubar las perlas en el buffer de elución TEV durante 1 hora a temperatura ambiente en el rotador del tubo. Para experimentos a menor escala que usan bajos volúmenes de buffer de elución TEV, incubar los tubos en un shaker a 1.000–2.000 rpm.
  6. Pelleta las cuentas en el soporte magnético. Transfiere el eluato a un tubo de baja unión proteica. Si se pretende un análisis proteómico o western blot, almacenar el eluato a -80 °C. Si se pretende un análisis de RNA-seq, consulte el Archivo Suplementario 1 "Recomendaciones para la secuenciación de ARN" paso 1.2 para las instrucciones de almacenamiento de eluados.
  7. OPCIONAL: Para determinar preliminarmente si la purificación de afinidad ha dado un rRNA/ARNm apreciable (indicando que los ribosomas han sido aislados), analizar eluados en un espectrofotómetro de microvolumen utilizando el tampón de elución TEV como un blank.
    NOTA: Los eluados de células que contienen el sistema activado deberían tener mayor absorbancia a 260 nm que los eluados de células que carecen de enzimas escindidas, luz azul/biotina o L31-FTA.

6. Western blot

NOTA: Hasta que el lisado y las muestras de flujo directo hayan sido desnaturalizadas en el tampón de Laemmli, recomendamos seguir evitando la exposición a la luz. Utilizamos geles prefabricados, un buffer de transferencia y un buffer de movimiento disponibles comercialmente, y un sistema de transferencia semi-seco (véase la Tabla de Materiales). SDS-PAGE y western blot se realizan según las instrucciones del fabricante para estos componentes, salvo que se indique lo contrario a continuación.

  1. Añadir 6x tampón de Laemmli al lisato, flujo y/o eluado a una concentración final de 1x tampón de Laemmli. Calienta a 95 °C en un bloque de calor o termociclador durante 10 minutos. Si se forma condensación en la tapa o paredes del tubo, haz girar los tubos brevemente.
  2. Coloca un gel con buffer de funcionamiento en el depósito de gel, siguiendo las instrucciones del fabricante del depósito. Carga las muestras y la escalera.
  3. Aplica el gel a 125 V durante 45–75 minutos hasta que el frente del tinte se acerque al fondo del gel. Mientras tanto, prepare PBST y buffers de bloqueo (Tabla 2).
  4. Realiza una transferencia semi-seca según las instrucciones del fabricante del sistema de transferencia.
    NOTA: Para todos los pasos de lavado/incubación de membrana, asegúrate de que la membrana esté completamente sumergida y coloca la bandeja de membrana sobre un balancín orbital o basculante. Para una bandeja de 10 x 15 cm, esto requiere entre 25 y 50 mL de tampón.
  5. Retira la membrana de la pila de transferencia y pasa inmediatamente al siguiente paso para asegurarte de que la membrana no se seque.
    NOTA: OPCIONAL: Las zonas secas en la membrana pueden provocar bloqueos desiguales o unión a la sonda, especialmente en sondas con incubaciones cortas como la estreptavidina-peroxidasa de rábano picante. Para evitar este problema, volvemos a humedecer las membranas tras la transferencia en metanol 100% durante 30 segundos, y luego en agua durante 5 minutos. Esta medida es similar a las recomendaciones generales para volver a humedecer membranas PVDF que se hayan secado tras la transferencia32,33.
  6. Lava la membrana con PBST durante 3 x 10 minutos a temperatura ambiente.
  7. Siguiendo las condiciones especificadas en la Tabla 3 para cada sonda western blot, realiza el bloqueo, lavado, incubación con sonda y incubaciones secundarias de anticuerpos.
  8. Tras el lavado final en el paso 6.7, mezcla los componentes del sustrato ECL según las instrucciones del fabricante y recubre la membrana de forma uniforme con ella. Captura la imagen con un sistema de imagen en gel de quimioluminiscencia.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Western blot (protocolo sección 6) es la forma más expedita de evaluar preliminarmente el éxito de un experimento. Cuando se sondean las membranas con estreptavidina-HRP, el lisado de las células donde estaban presentes todos los componentes del sistema debe contener una banda correspondiente a L31-FTA biotinilada (Figura 2A, carril 20). La misma banda debería estar presente, generalmente a mayor intensidad, si las células fueron transfectadas con BirA de lo...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ALIBi ofrece varias ventajas en comparación con las técnicas existentes para estudiar la traducción subcelular y tiene aplicaciones futuras en biología de ribosomas y más allá. Este protocolo requiere un tiempo similar o menor en comparación con la lisis secuencial y lacentrifugación 21,22 y es potencialmente aplicable a cualquier compartimento subcelular que pueda ser seleccionado genéticamente con una secuencia peptídica locali...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen a los miembros del Barna Lab por sus valiosas conversaciones.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
-80 °C almacenamientoPara cultivo celular
0.1% gelatina en aguaMilliporeSigmaES-006-BPara cultivo celular
Unidades de filtro de 0.2 µmFisher04-977-158Para cultivo celular
0.5% tripsina-EDTA (10X)ThermoFisher15400-054Para cultivo celular
1 M MgCl2ThermoFisherAM9010Para lisis & purificación por afinidad
1 M Tris pH 7.5ThermoFisher15567027Para lisis & purificación por afinidad
1 M Tris pH 8ThermoFisherAM9855GOpcional: para insertar FTA en un locus de proteína ribosomal endógena
Tubos de microcentrífuga de 1.5 y 2 mL, esterilizadosPara transfección
Tubos de microcentrífuga de 1.5, 2 mL y 5 mL de unión baja para proteínasEppendorf022431081, 022431102,
0030108302		Para lisis & purificación por afinidad
Placas de cultivo de tejido de 10 cmPara cultivo celular
10 M NaOHMilliporeSigma72068-100MLPara lisis & purificación por afinidad
Concentrado de tampón de funcionamiento Tris/glicina/SDS 10xBio-Rad1610772Para Western blot
Incubadora de cultivo de tejido de 37 °C x 2Para cultivo celular. Uno de estos sirve como incubadora principal para cultivo celular e iluminación de células transfectadas. Se necesita espacio temporal en una segunda incubadora el día de la activación de ALIBi para alojar las células transfectadas mientras se configura el transiluminador en la incubadora principal.
Baño de agua de 37 °CPara cultivo celular
5 M NaClThermoFisherAM9010Para lisis & purificación por afinidad
50 mM biotinaThermoFisherB20656Para lisis & purificación por afinidad
Tampon Laemmli 6xFIsher50-196-784Para Western blot
70% etanolPara desinfección
AcetonitrilFisherA955Opcional: para preparación de muestras de espectrometría de masas
Kit de proteasa AcTEVThermoFisher12575015Para lisis & purificación por afinidad
Plasmid ALIBi C-fragmentAddgene#235615, 235636 – 235641Se requiere escala midi-prep para transfección
Plasmid ALIBi N-fragmentAddgene#235614, 235635, 235642, 235643Se requiere escala midi-prep para transfección
Hoja de aluminioPara lisis & purificación por afinidad
bicarbonato de amonioMilliporeSigma5.3305Opcional: para preparación de muestras de espectrometría de masas
anticuerpo anti-FLAGMilliporeSigmaF3165Para Western blot
anticuerpo anti-GAPDHCell Signaling5174Para Western blot
anticuerpo secundario anti-ratónGE HealthcareNA931VPara Western blot
anticuerpo secundario anti-conejoGE HealthcareNA934VPara Western blot
anticuerpo anti-Rpl12Abcamab175219Para Western blot
anticuerpo anti-Rpl31Abcamab103991Para Western blot
anticuerpo anti-Rpl5ProteinTech15430-1-APPara Western blot
anticuerpo anti-V5ThermoFisherR960-25Para Western blot
ApirasaNEBM0398LPara lisis & purificación por afinidad
Beta-mercaptoetanol (55 mM)ThermoFisher21985-023Para cultivo celular
Transiluminador de luz azulClare Research ChemicalDR46B (pequeño) o DR196 (grande)Para lisis & purificación por afinidad
Albúmina sérica bovina (BSA)FisherBP1600-100Para Western blot
Puntas C18 (punta C18 OMIX)AgilentA57003100Opcional: para preparación de muestras de espectrometría de masas
Contenedor de congelación celularPara cultivo celular
Centrífuga adaptada para tubos cónicos de 15 mL y/o 50 mLPara cultivo celular
Centrífuga para tubos de microcentrífuga de 1.5-2 mLPara lisis & purificación por afinidad. Debe ser capaz de refrigeración hasta 4 C y velocidades de hasta 17,000 g. Idealmente, está ubicado en una habitación que puede oscurecerse temporalmente mientras se transfieren los tubos.
Kit Clarity ECLBio-Rad170-5061Para Western blot
Tanque de gel CriterionBio-Rad1656001Para Western blot
Geles pre-moldeados Criterion TGX, 4-20%Bio-Rad5671095Para Western blot. Se encuentran disponibles tamaños y diseños de pozos adicionales
CicloheximidaMilliporeSigmaC7698-5GPara lisis & purificación por afinidad
DeoxicolatoMilliporeSigmaS1827Para lisis & purificación por afinidad
DitiotreitolThermoFisherPIA39255Opcional: para preparación de muestras de espectrometría de masas
DPBS, sin calcio, sin magnesioThermoFisher14190-250Para cultivo celular
FBS calificado para ESMilliporeSigmaES-009-BPara cultivo celular
EtanolGold Shield412828Para Western blot
EtanolMilliporeSigma459828Opcional: para preparación de muestras de espectrometría de masas
Ácido fórmicoMilliporeSigmaA117Opcional: para preparación de muestras de espectrometría de masas
Analizador de tamaño de fragmentos y consumiblesAgilent

Referencias

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