Demostración del transporte de histidina por membrana utilizando sacos invertidos intestinales de cabra: una herramienta pedagógica experiencial para estudiantes universitarios

Resumen

Aquí, reportamos un método barato y reproducible que demuestra el transporte de membrana de histidina en un intestino de cabra. Este proceso se produce mediante el cotransporte de iones de histidina y sodio habilitados por el gradiente de sodio a través de la membrana de los enterocitos. Este método explota la pedagogía del aprendizaje experiencial para comprender mejor el movimiento de solutos a través de las membranas biológicas.

Resumen

La histidina es un aminoácido esencial que también es precursor de metabolitos implicados en el sistema inmunitario, la ventilación pulmonar y la circulación vascular. La absorción de histidina en la dieta depende en gran medida del transporte de aminoácidos neutros acoplado al sodio por el transportador de aminoácidos neutros Broad (B⁰AT) presente en la membrana apical del enterocito. Aquí, demostramos la absorción de histidina por los enterocitos de las vellosidades intestinales desde la luz utilizando sacos invertidos yeyunales de cabra. Los sacos yeyunales expuestos a concentraciones variables de sodio e histidina se analizaron para determinar la concentración de histidina dentro de los sacos en función del tiempo. Los resultados muestran una absorción activa de histidina. El aumento de la concentración de sal resultó en una mayor absorción de histidina, lo que sugiere un simporte de absorción de sodio e histidina en los sacos invertidos intestinales de las cabras. Este protocolo se puede aplicar para visualizar la movilidad intestinal de aminoácidos u otros metabolitos con las modificaciones adecuadas. Proponemos este experimento como una herramienta pedagógica experiencial que puede ayudar a los estudiantes de pregrado a comprender el concepto de transporte por membrana.

Introducción

Las células biológicas están rodeadas por una bicapa lipídica de membrana que separa el citosol intracelular del contenido extracelular. La membrana sirve como una barrera semipermeable que regula el movimiento de los solutos¹. El transporte a través de las membranas biológicas se ve afectado por el coeficiente de permeabilidad de un soluto, que depende de varios factores, incluida la concentración y la carga del soluto. En general, los solutos se mueven a través de la membrana utilizando tres mecanismos (Figura 1): difusión pasiva, difusión facilitada y transporte activo². La difusión simple es el proceso por el cual los solutos solubles, sin carga y no polares pasan por su gradiente de concentración a través de una membrana semipermeable (Figura 1A). Las proteínas de membrana no ayudan en este proceso, ya que implica el movimiento de solutos de una región de mayor concentración a una región de menor concentración. La tasa de difusión se basa en la Ley de Fick³. Por otro lado, la difusión facilitada es un transporte dependiente de proteínas en el que la membrana permite que solo solutos selectivos pasen a lo largo de un gradiente de concentración sin el gasto de energía (Figura 1B). Este tipo de transporte es específico y difiere de la difusión simple en que exhibe una cinética de saturación.

El transporte activo es un transporte de moléculas dependiente de proteínas contra su gradiente de concentración, es decir, de la región de menor concentración a una región de mayor concentración con el uso de ATP o gradientes iónicos (Figura 1C). Cuando el transportador hidroliza ATP, el transporte se denomina transporte activo primario (Figura 1C; panel izquierdo). Otra forma de transporte activo es el transporte activo secundario (Figura 1C; panel derecho). En el transporte activo secundario, los solutos se mueven en función de un gradiente electroquímico. Tiene lugar cuando una proteína transportadora acopla el movimiento de un ion (normalmente Na⁺) a lo largo de su gradiente de concentración con el movimiento de otra molécula o un ion contra su gradiente de concentración. Este tipo de movimiento del soluto puede ser un co-transporte (Symport) en el que tanto el soluto como el ion se mueven en la misma dirección o un intercambio (Antiport), en cuyo caso el soluto y el ion se mueven en direcciones opuestas.

Los aminoácidos dietéticos y los monosacáridos de las fuentes alimentarias se absorben en el intestino delgado. El intestino delgado se puede dividir funcionalmente en tres segmentos: duodeno, yeyuno e íleon (Figura 2). La absorción de soluto se produce en todo el intestino delgado, con la máxima absorción en el yeyuno y en el extremo proximal del íleon. Los enterocitos intestinales son células polarizadas, y las uniones estrechas que conectan dos células adyacentes crean dos sitios de membrana distintos: el sitio de membrana basolateral y el sitio de membrana apical (Figura 2). La absorción de solutos luminales generados por la digestión ocurre en el sitio de la membrana apical⁴.

El transporte de histidina en los enterocitos intestinales en la membrana apical es un ejemplo de un simpuerto activo secundario que es dependiente del sodio. En el extremo basolateral, la histidina que ingresa al enterocito se mueve por el gradiente de concentración hacia la circulación portal hepática. Las concentraciones intracelulares de sodio dentro del enterocito se mantienen en 12 mmoles/L¹, que es menor que las concentraciones extracelulares/luminales, debido al bombeo activo de sodio fuera de la célula por Na⁺ K⁺ATPasa localizada en la membrana basolateral (Figura 3). En la membrana apical de los enterocitos, el AT B⁰y el transportador de aminoácidos neutros en sodio (SNAT) 5 son los principales transportadores que no solo transportan histidina sino también aminoácidos como la asparagina y la glutamina en un cotransporte dependiente de sodio ^5,6. Otra proteína transportadora llamada Transportador de Grandes Aminoácidos (LAT)1 presente en la membrana basolateral de los enterocitos transporta grandes aminoácidos neutros como leucina, triptófano, tirosina y fenilalanina a través de la membrana⁷.

Con el objetivo de enseñar el concepto de transporte de membranas integrado con técnicas como la espectrofotometría y los ensayos bioquímicos de rutina a través de la pedagogía del aprendizaje experiencial, es imperativo desarrollar metodologías que no solo puedan demostrar el concepto en términos fáciles de entender, sino que también permitan el aprendizaje participativo para los estudiantes de pregrado. Actualmente, hay recursos limitados disponibles para que los estudiantes se involucren de manera práctica para aprender dichos conceptos de bioquímica. Aquí, reportamos un protocolo simple para demostrar el transporte de histidina a través de la membrana intestinal de cabra que es fácil de reproducir en laboratorios de pregrado y también se puede adaptar para evaluar el transporte de otros metabolitos. Más importante aún, el método utiliza materiales económicos en un laboratorio de pregrado, lo que permite el aprendizaje experiencial incluso en los entornos de laboratorio más simples.

Protocolo

Todo el protocolo con todos los pasos se representa como un diagrama esquemático en la Figura 4. El método es una adaptación de un estudio previo con intestinos de rata⁸. El experimento se realizó de acuerdo con los lineamientos institucionales. Las muestras utilizadas en este estudio se adquirieron de un proveedor comercial.

PRECAUCIÓN: Use guantes durante este experimento.

1. Preparación de los sacos de yeyuno invertidos

1. Tratar previamente y limpiar el yeyuno de cabra.
   1. Consigue las entrañas de una cabra sana recién sacrificada de un vendedor autorizado.
   2. Coloque las entrañas en suficiente solución salina tampón de fosfato (PBS) 1x para que se sumerjan completamente para su limpieza.
   3. Separe el intestino delgado del intestino grueso y asegúrese de que el tejido conectivo externo se extraiga con unas tijeras.
   4. Enjuague suavemente el intestino delgado con 1x PBS usando una jeringa de 10 mL, asegurando la eliminación del material alimenticio no digerido para obtener una bolsa hueca de intestino delgado. Repita este proceso al menos tres veces para una limpieza efectiva.
      NOTA: Evite usar fuerza excesiva o agujas mientras enjuaga. El uso de la fuerza puede provocar la perforación de las paredes intestinales y, por lo tanto, dañar los enterocitos intestinales.
   5. Mida la longitud completa del intestino delgado usando una regla para obtener las tres partes: duodeno (1/^{4 del intestino} delgado) y el resto dividido uniformemente en yeyuno e íleon.
   6. Continúe con el experimento usando la parte de Jejunum.
2. Prepara el yeyuno invertido.
   1. Limpie la parte del yeyuno retirando todo el tejido conectivo con una cuchilla.
   2. Cortar el yeyuno en porciones de 12-15 cm de largo, lavar con 1x PBS y colocar en una placa de Petri que contenga PBS.
   3. Invierta las porciones de yeyuno con una varilla de vidrio para permitir que la porción de vellosidades quede expuesta en el exterior.
      PRECAUCIÓN: Evite usar una varilla de vidrio con bordes afilados. Además, el diámetro de la varilla de vidrio no debe ser mayor que el diámetro del saco.
      NOTA: En este punto, se pueden visualizar las vellosidades bajo un microscopio óptico (Figura 4).
   4. Enjuague suavemente las porciones de yeyuno invertido con 1x PBS.
   5. Compruebe si hay fugas por los lados del yeyuno invertido.
   6. Corta las porciones de yeyuno invertido en sacos de 5 cm de largo.
   7. Ate un extremo con un cordel y vuelva a verificar si hay fugas visuales en el extremo atado llenando los sacos con PBS.
   8. Ata el otro extremo para crear un saco invertido vacío con vellosidades en la superficie externa.
   9. Vuelva a verificar si hay fugas externas dando golpecitos en el saco invertido sobre papel de filtro.
3. Equilibre los sacos invertidos en 1x PBS.
   1. Continúe con el experimento el mismo día o almacene los sacos durante la noche en 1x PBS a 4 °C.

2. Configuración experimental para el transporte de histidina

1. Ensamble dos juegos de tres tubos de 50 mL de acuerdo con las diferentes concentraciones de cloruro de sodio como se indica en la Tabla 1.
2. Sumerja los sacos intestinales preparados en los tubos especificados durante 30 min y 60 min para cada una de las series.
3. Después del tiempo designado, vacíe la solución dentro del saco en un tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mL y determine el volumen.
4. Aspire el líquido dentro del saco con una jeringa de 2 ml. Alternativamente, desate un extremo del saco y recoja el contenido en un tubo nuevo de 1,5 ml.
5. Ensaye 0,1 mL de las muestras recogidas para la estimación de histidina y calcule la concentración utilizando el gráfico estándar.

3. Estimación de histidina mediante la reacción de Pauly

1. Prepare una curva estándar para la histidina.
   1. Prepare soluciones con concentraciones variables de histidina, como se indica en la Tabla 2 , utilizando soluciones madre de histidina (5 mM) y agua.
   2. Agregue ácido sulfanílico (0,5 mL) y nitrato de sodio (0,5 mL) a cada tubo.
   3. Incube los tubos durante 5 minutos a temperatura ambiente, luego agregue 1 ml de carbonato de sodio y 1 ml de etanol a cada tubo.
   4. Incubar los tubos durante 20 minutos a temperatura ambiente (~20 °C) y observar la absorbancia a una longitud de onda de 490 nm.
   5. Traza una curva estándar de absorbancia frente a la concentración de histidina.
      NOTA: Esta prueba de histidina se basa en la propiedad de la histidina de formar un compuesto diazo (Figura 5).

Resultados

El flujo de trabajo experimental para demostrar la movilidad intestinal de la histidina a través de la absorción de histidina por las vellosidades intestinales en la luz de los sacos invertidos se ilustra en la Figura 4, Tabla 1 y Tabla 2. Se realizaron tres configuraciones experimentales independientes y se presentan datos representativos en la Figura 6.

En las condiciones experimentales dadas, la estimación de la histidina utilizando la reacción de Pauly siguió la ley de Lambert Beer hasta 300 μM (Figura 6A). Esta prueba de histidina se basa en el acoplamiento entre los aminoácidos y el ion diazonio en el reactivo. El reactivo de Pauly tiene ácido sulfanílico disuelto en ácido clorhídrico concentrado. Este ácido sufre diazotización en presencia de nitrato de sodio y HCl. La sal de diazonio p-fenildiazosulfonato reacciona con las moléculas de histidina en condiciones alcalinas para formar un complejo de color rojo oscuro/naranja a amarillo, que se puede leer espectrofotométricamente a 490 nm (Figura 5)⁹. Cabe señalar que esta prueba se administra mediante histidina y tirosina. La prueba utilizada en este estudio es una versión ligeramente modificada de la reacción original, de modo que el nitrato de sodio se utiliza directamente a temperatura ambiente (~20 °C) en lugar de utilizar nitrito de sodio en condiciones de refrigeración⁹.

La reacción positiva de Pauly observada con la muestra recuperada del interior de los sacos invertidos ilustra la absorción de histidina a través de las vellosidades intestinales. La Figura 6B muestra una correlación entre la absorción de histidina y las concentraciones de sodio en los enterocitos yeyunales. Un aumento en la absorción de histidina a medida que aumenta el tiempo de incubación de 30 a 60 min es indicativo de transporte activo secundario.

Figura 1: Diferentes tipos de transporte de membranas. Esquema que muestra los distintos tipos de sistemas de transporte de membranas. A) Difusión pasiva. B) Facilitación de la difusión. (C) Transporte activo primario (izquierda) y transporte activo secundario (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Organización de los enterocitos en las vellosidades intestinales. Esta figura se centra en el intestino delgado e ilustra las tres partes distintas, es decir, duodeno, yeyuno e íleon. El intestino delgado tiene además algunas proyecciones en forma de dedos llamadas vellosidades, que aumentan el área de superficie para la absorción de los alimentos ingeridos. Las microvellosidades tienen células llamadas enterocitos que contienen los transportadores específicos para la absorción de aminoácidos. Las uniones estrechas evitan el movimiento de solutos entre las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Un enterocito con transportadores de aminoácidos. La caricatura representa un enterocito que muestra los extremos apical y basolateral. El extremo apical tiene transportadores como las proteínas B⁰AT y SNAT5, y la membrana basolateral contiene el transportador LAT1. Juntas, estas proteínas son responsables de la absorción de histidina desde la luz intestinal hasta la circulación portal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Representación esquemática del protocolo que demuestra el transporte de histidina por membrana utilizando sacos invertidos de intestino de cabra. Los intestinos de cabra se obtuvieron, se trataron previamente y se limpiaron como se describe. Brevemente, se extirpó el yeyuno y se prepararon sacos invertidos. Estos sacos se utilizaron para configurar el experimento para cuantificar la absorción de histidina en varias concentraciones de sal. Las vellosidades se observaron con un aumento de 400x utilizando un microscopio óptico. En el texto se detalla el procedimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Reacción al método de Pauly. La prueba de Pauly implica la formación de iones diazonio en un reactivo que contiene ácido sulfanílico en ácido clorhídrico concentrado. En condiciones alcalinas, la histidina reacciona con la sal de diazonio, lo que da como resultado la formación de un compuesto de color rojo cuya absorbancia se puede medir a 490 nm utilizando un espectrofotómetro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Estimación de histidina por el método de Pauly. (A) Curva estándar para histidina. Concentraciones variables de histidina que oscilaban entre 0 y 300 μM se sometieron a la reacción de Pauly, y el complejo formado se midió a una longitud de onda de 490 nm. (B) Se siguió el transporte de histidina en los sacos intestinales durante 30 min y 60 min en presencia de 150 mM (negro sólido) y 200 mM de solución salina de NaCl (gris sólido). La concentración de histidina en el interior de los sacos invertidos se estimó mediante la curva estándar (Figura 6A). Los valores se reportan con respecto al control (0 mM de NaCl). Se realizaron tres réplicas técnicas y se presentan datos representativos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Configuración experimental para la movilidad intestinal de la histidina. Esta tabla muestra la incubación de los sacos intestinales en diferentes concentraciones de cloruro de sodio en dos puntos temporales. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Preparación de la curva estándar para histidina. Esta tabla muestra los diferentes pasos y componentes de la reacción de Pauly con concentraciones conocidas de histidina que oscilan entre 0 y 300 μM. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

El transporte por membrana es uno de los conceptos más fundamentales que se enseñan a los estudiantes de pregrado de todas las principales disciplinas de ciencias biológicas, básicas o aplicadas. Tradicionalmente, el movimiento a través de las membranas se ha visualizado utilizando metabolitos marcados con isótopos radiactivos. Sin embargo, estos métodos son extremadamente peligrosos y no son factibles para la enseñanza o el aprendizaje. Si bien el aprendizaje experiencial es la mejor técnica pedagógica para comprender conceptos tan complejos, es un desafío que se ve agravado por la falta de infraestructura, los costosos colorantes/metabolitos basados en fluorescencia y, lo que es más importante, la prohibición de los experimentos de disección con animales. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar herramientas y métodos alternativos que no solo sean seguros, sino también económicos y factibles en un entorno de laboratorio de pregrado. Aquí, se desarrolló un método novedoso para enseñar el transporte de membranas para estudiantes de pregrado. El protocolo reportado, una adaptación de Agar et al. 1954⁸, demuestra el transporte unidireccional de histidina a través de las células del intestino de cabra. Este estudio se llevó a cabo para demostrar el uso de un ensayo basado en colorimetría para visualizar la absorción de histidina a través de las membranas intestinales. Es simple, reproducible y comprensible para los estudiantes y se puede realizar en cualquier entorno de laboratorio.

El modelo de saco intestinal invertido fue desarrollado por Wilson y Wiseman¹⁰, que posteriormente fue mejorado para aumentar la viabilidad de los tejidos. Los mecanismos y la cinética de la absorción del fármaco se han dilucidado utilizando sacos invertidos intestinales¹¹. Las ventajas de este modelo incluyen una gran área de absorción; Sin embargo, la viabilidad tisular es uno de los parámetros limitantes. Se ha reportado que el tejido intestinal permanece viable y metabólicamente activo en condiciones fisiológicas durante ~2 h¹¹. Otra posible advertencia de este enfoque que debe tenerse en cuenta es la incapacidad de eliminar la mucosa muscular y la serosa de las preparaciones del saco invertido. La unión de ciertos compuestos a la capa muscular puede limitar o subestimar el transporte de estos compuestos. Aunque el modelo de saco intestinal invertido es sensible y específico, una variedad de factores podrían afectar los resultados. Algunos de estos factores incluyen la edad, el sexo, la especie, la dieta y el estado de enfermedad del animal, así como el segmento del intestino utilizado para el análisis (íleon, yeyuno, duodeno y colon). Los factores ambientales como el pH, la aireación y la temperatura también impactarían en los resultados¹².

Se ha demostrado que el retraso en la recolección del intestino y el estado animal (vivo/muerto) afecta el transporte activo en los segmentos duodenales del intestino de la rata. La recolección de animales anestesiados garantiza un retraso mínimo, evitando el deterioro del transportador¹³. Sin embargo, a la luz de la prohibición de las disecciones de animales en las universidades, se utilizaron intestinos de animales recién sacrificados en nuestra configuración experimental. Si bien este protocolo se puede utilizar con éxito para establecer una absorción cualitativa de un metabolito a través de los enterocitos, su uso en estudios que involucran cinética de transporte de membrana es limitante. El paso más crítico de este protocolo es la preparación exitosa de sacos intestinales invertidos a prueba de fugas con enterocitos viables. La naturaleza delicada y la viabilidad de las vellosidades y los enterocitos plantean un reto que se puede superar con la práctica. Además, dado que el material de partida no procede de ninguna población animal singénica endogámica, la variabilidad de los resultados entre experimentos es un inconveniente importante. Esto puede superarse con el uso de múltiples réplicas del mismo animal. Teniendo en cuenta estas consideraciones, el método presentado en este estudio debe ser utilizado estrictamente como herramienta pedagógica en la formación práctica de pregrado.

El protocolo descrito se utilizó con éxito para demostrar el transporte de histidina. La absorción unidireccional de sodio e histidina en los sacos invertidos indica un tipo de transporte activo secundario. La absorción intestinal de aminoácidos neutros sigue una cinética vectorial que depende del gradiente de concentración establecido por la Na+ K+ ATPasa. Una configuración similar mantiene un potencial de membrana negativo intracelular y una concentración de sodio extracelular de 150 mM. Ambos impulsan el transporte activo de aminoácidos neutros por B⁰AT en el extremo apical y el posterior movimiento fuera del enterocito en el extremo basolateral por LAT1. Curiosamente, a concentraciones de sal más altas (200 mM), no hubo diferencia significativa en la absorción en función del tiempo. En este punto, no podemos comentar la razón de tal observación; sin embargo, la misma configuración experimental puede ampliarse para incluir múltiples concentraciones de sodio con puntos de tiempo variables y controles con cloruro de colina de 150 mM para mostrar el transporte dependiente del sodio y la posible contribución debido a la saturación.

En principio, los sacos de yeyuno invertidos de cabra/cerdo/rata/ratón pueden utilizarse para demostrar la absorción intestinal de una variedad de metabolitos dietéticos, siempre que exista un ensayo bioquímico para su estimación. Además, también se puede analizar el efecto de otros componentes que podrían interferir con la absorción intestinal o los inhibidores del transporte de membrana. Los sacos invertidos se han utilizado eficazmente como herramienta en la investigación farmacéutica para estudiar la absorción de fármacos in vitro , el metabolismo intestinal de los fármacos y el papel del transportador en la absorción de fármacos. Por último, esta técnica es un ejemplo de demostración ex vivo del transporte de membrana y no se basa en un extracto libre de células (in vitro) sino en una muestra de tejido. Sin embargo, esta ventaja se ve contrarrestada por la disponibilidad de intestinos de cabra/cerdo/rata no infectados, que pueden ser un factor limitante.

Entre las muchas herramientas pedagógicas de las que dispone un profesor para mejorar el proceso de aprendizaje, el aprendizaje experiencial o "aprender haciendo" es una filosofía y metodología de enseñanza que es el método de instrucción más progresivo y eficaz que brinda a los estudiantes la oportunidad de obtener una comprensión holística de los temas de las conferencias. El aprendizaje experiencial garantiza la participación práctica de los estudiantes, así como del instructor, quien brinda apoyo y tutoría durante este proceso de aprendizaje activo¹⁴. Sirve como una excelente alternativa a la instrucción teórica tradicional en el aula, particularmente en ciertos conceptos pesados e integradores como el transporte de membranas que los estudiantes a menudo encuentran difíciles de visualizar. Estos ejercicios también fomentarían el aprendizaje interactivo y colaborativo tanto de los compañeros como de los mentores. La presente iniciativa es un paso adelante en la dirección de crear y permitir una experiencia de aprendizaje que no solo sea informativa sino también memorable y que pueda ser transformadora para un estudiante, impactando significativamente la experiencia de aprendizaje en general.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	TARSONS	500020
Tubos de ensayo de 10 mL	BOROSIL	9800U04
Tubos Falcon estériles de 50 mL	TARSONS	546041
vaso de precipitados de 500 mL	BOROSIL 10044977
matraz cónico de 500 mL	BOROSIL	691467
D-Glucose	SRL	42738
Espectrofotómetro digital	SYSTRONICS	2710
Etanol	EMSURE	1009831000
pipetas	THERMOFISHER	4642090
Agitador de vidrio Varilla	BOROSIL 9850107
L-histidina	SRL	17849
NaCl	SRL	41721
Guantes de nitrilo	KIMTECH	112-4847
Placa de Petri	TARSONS	460090
Solución salina tamponada con fosfato (ph 7.4)	SRL	95131
Puntas de pipeta	ABDOS	P10102
Carbonato de sodio	SRL	89382
Nitrato de sodio	SRL	44618
Fosfato de Sodio Dibásico (anhidro)	SRL	53046
Fosfato de Sodio Monobásico (anhidro)	SRL	22249
Ácido Sulfanílico	SRL	15354