Aquí, reportamos un método barato y reproducible que demuestra el transporte de membrana de histidina en un intestino de cabra. Este proceso se produce mediante el cotransporte de iones de histidina y sodio habilitados por el gradiente de sodio a través de la membrana de los enterocitos. Este método explota la pedagogía del aprendizaje experiencial para comprender mejor el movimiento de solutos a través de las membranas biológicas.
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Artículo de método
Demostración del transporte de histidina por membrana utilizando sacos invertidos intestinales de cabra: una herramienta pedagógica experiencial para estudiantes universitarios
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Resumen
Resumen
La histidina es un aminoácido esencial que también es precursor de metabolitos implicados en el sistema inmunitario, la ventilación pulmonar y la circulación vascular. La absorción de histidina en la dieta depende en gran medida del transporte de aminoácidos neutros acoplado al sodio por el transportador de aminoácidos neutros Broad (B0AT) presente en la membrana apical del enterocito. Aquí, demostramos la absorción de histidina por los enterocitos de las vellosidades intestinales desde la luz utilizando sacos invertidos yeyunales de cabra. Los sacos yeyunales expuestos a concentraciones variables de sodio e histidina se analizaron para determinar la concentración de histidina dentro de los sacos en función del tiempo. Los resultados muestran una absorción activa de histidina. El aumento de la concentración de sal resultó en una mayor absorción de histidina, lo que sugiere un simporte de absorción de sodio e histidina en los sacos invertidos intestinales de las cabras. Este protocolo se puede aplicar para visualizar la movilidad intestinal de aminoácidos u otros metabolitos con las modificaciones adecuadas. Proponemos este experimento como una herramienta pedagógica experiencial que puede ayudar a los estudiantes de pregrado a comprender el concepto de transporte por membrana.
Introducción
Las células biológicas están rodeadas por una bicapa lipídica de membrana que separa el citosol intracelular del contenido extracelular. La membrana sirve como una barrera semipermeable que regula el movimiento de los solutos1. El transporte a través de las membranas biológicas se ve afectado por el coeficiente de permeabilidad de un soluto, que depende de varios factores, incluida la concentración y la carga del soluto. En general, los solutos se mueven a través de la membrana utilizando tres mecanismos (Figura 1): difusión pasiva, difusión facilitada y transporte activo2. La difusión simple es el proceso por el cual los solutos solubles, sin carga y no polares pasan por su gradiente de concentración a través de una membrana semipermeable (Figura 1A). Las proteínas de membrana no ayudan en este proceso, ya que implica el movimiento de solutos de una región de mayor concentración a una región de menor concentración. La tasa de difusión se basa en la Ley de Fick3. Por otro lado, la difusión facilitada es un transporte dependiente de proteínas en el que la membrana permite que solo solutos selectivos pasen a lo largo de un gradiente de concentración sin el gasto de energía (Figura 1B). Este tipo de transporte es específico y difiere de la difusión simple en que exhibe una cinética de saturación.
El transporte activo es un transporte de moléculas dependiente de proteínas contra su gradiente de concentración, es decir, de la región de menor concentración a una región de mayor concentración con el uso de ATP o gradientes iónicos (Figura 1C). Cuando el transportador hidroliza ATP, el transporte se denomina transporte activo primario (Figura 1C; panel izquierdo). Otra forma de transporte activo es el transporte activo secundario (Figura 1C; panel derecho). En el transporte activo secundario, los solutos se mueven en función de un gradiente electroquímico. Tiene lugar cuando una proteína transportadora acopla el movimiento de un ion (normalmente Na+) a lo largo de su gradiente de concentración con el movimiento de otra molécula o un ion contra su gradiente de concentración. Este tipo de movimiento del soluto puede ser un co-transporte (Symport) en el que tanto el soluto como el ion se mueven en la misma dirección o un intercambio (Antiport), en cuyo caso el soluto y el ion se mueven en direcciones opuestas.
Los aminoácidos dietéticos y los monosacáridos de las fuentes alimentarias se absorben en el intestino delgado. El intestino delgado se puede dividir funcionalmente en tres segmentos: duodeno, yeyuno e íleon (Figura 2). La absorción de soluto se produce en todo el intestino delgado, con la máxima absorción en el yeyuno y en el extremo proximal del íleon. Los enterocitos intestinales son células polarizadas, y las uniones estrechas que conectan dos células adyacentes crean dos sitios de membrana distintos: el sitio de membrana basolateral y el sitio de membrana apical (Figura 2). La absorción de solutos luminales generados por la digestión ocurre en el sitio de la membrana apical4.
El transporte de histidina en los enterocitos intestinales en la membrana apical es un ejemplo de un simpuerto activo secundario que es dependiente del sodio. En el extremo basolateral, la histidina que ingresa al enterocito se mueve por el gradiente de concentración hacia la circulación portal hepática. Las concentraciones intracelulares de sodio dentro del enterocito se mantienen en 12 mmoles/L1, que es menor que las concentraciones extracelulares/luminales, debido al bombeo activo de sodio fuera de la célula por Na+ K+ATPasa localizada en la membrana basolateral (Figura 3). En la membrana apical de los enterocitos, el AT B0y el transportador de aminoácidos neutros en sodio (SNAT) 5 son los principales transportadores que no solo transportan histidina sino también aminoácidos como la asparagina y la glutamina en un cotransporte dependiente de sodio 5,6. Otra proteína transportadora llamada Transportador de Grandes Aminoácidos (LAT)1 presente en la membrana basolateral de los enterocitos transporta grandes aminoácidos neutros como leucina, triptófano, tirosina y fenilalanina a través de la membrana7.
Con el objetivo de enseñar el concepto de transporte de membranas integrado con técnicas como la espectrofotometría y los ensayos bioquímicos de rutina a través de la pedagogía del aprendizaje experiencial, es imperativo desarrollar metodologías que no solo puedan demostrar el concepto en términos fáciles de entender, sino que también permitan el aprendizaje participativo para los estudiantes de pregrado. Actualmente, hay recursos limitados disponibles para que los estudiantes se involucren de manera práctica para aprender dichos conceptos de bioquímica. Aquí, reportamos un protocolo simple para demostrar el transporte de histidina a través de la membrana intestinal de cabra que es fácil de reproducir en laboratorios de pregrado y también se puede adaptar para evaluar el transporte de otros metabolitos. Más importante aún, el método utiliza materiales económicos en un laboratorio de pregrado, lo que permite el aprendizaje experiencial incluso en los entornos de laboratorio más simples.
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Protocolo
Todo el protocolo con todos los pasos se representa como un diagrama esquemático en la Figura 4. El método es una adaptación de un estudio previo con intestinos de rata8. El experimento se realizó de acuerdo con los lineamientos institucionales. Las muestras utilizadas en este estudio se adquirieron de un proveedor comercial.
PRECAUCIÓN: Use guantes durante este experimento.
1. Preparación de los sacos de yeyuno invertidos
- Tratar previamente y limpiar el yeyuno de cabra.
- Consigue las entrañas de una cabra sana recién sacrificada de un vendedor autorizado.
- Coloque las entrañas en suficiente solución salina tampón de fosfato (PBS) 1x para que se sumerjan completamente para su limpieza.
- Separe el intestino delgado del intestino grueso y asegúrese de que el tejido conectivo externo se extraiga con unas tijeras.
- Enjuague suavemente el intestino delgado con 1x PBS usando una jeringa de 10 mL, asegurando la eliminación del material alimenticio no digerido para obtener una bolsa hueca de intestino delgado. Repita este proceso al menos tres veces para una limpieza efectiva.
NOTA: Evite usar fuerza excesiva o agujas mientras enjuaga. El uso de la fuerza puede provocar la perforación de las paredes intestinales y, por lo tanto, dañar los enterocitos intestinales. - Mida la longitud completa del intestino delgado usando una regla para obtener las tres partes: duodeno (1/4 del intestino delgado) y el resto dividido uniformemente en yeyuno e íleon.
- Continúe con el experimento usando la parte de Jejunum.
- Prepara el yeyuno invertido.
- Limpie la parte del yeyuno retirando todo el tejido conectivo con una cuchilla.
- Cortar el yeyuno en porciones de 12-15 cm de largo, lavar con 1x PBS y colocar en una placa de Petri que contenga PBS.
- Invierta las porciones de yeyuno con una varilla de vidrio para permitir que la porción de vellosidades quede expuesta en el exterior.
PRECAUCIÓN: Evite usar una varilla de vidrio con bordes afilados. Además, el diámetro de la varilla de vidrio no debe ser mayor que el diámetro del saco.
NOTA: En este punto, se pueden visualizar las vellosidades bajo un microscopio óptico (Figura 4). - Enjuague suavemente las porciones de yeyuno invertido con 1x PBS.
- Compruebe si hay fugas por los lados del yeyuno invertido.
- Corta las porciones de yeyuno invertido en sacos de 5 cm de largo.
- Ate un extremo con un cordel y vuelva a verificar si hay fugas visuales en el extremo atado llenando los sacos con PBS.
- Ata el otro extremo para crear un saco invertido vacío con vellosidades en la superficie externa.
- Vuelva a verificar si hay fugas externas dando golpecitos en el saco invertido sobre papel de filtro.
- Equilibre los sacos invertidos en 1x PBS.
- Continúe con el experimento el mismo día o almacene los sacos durante la noche en 1x PBS a 4 °C.
2. Configuración experimental para el transporte de histidina
- Ensamble dos juegos de tres tubos de 50 mL de acuerdo con las diferentes concentraciones de cloruro de sodio como se indica en la Tabla 1.
- Sumerja los sacos intestinales preparados en los tubos especificados durante 30 min y 60 min para cada una de las series.
- Después del tiempo designado, vacíe la solución dentro del saco en un tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mL y determine el volumen.
- Aspire el líquido dentro del saco con una jeringa de 2 ml. Alternativamente, desate un extremo del saco y recoja el contenido en un tubo nuevo de 1,5 ml.
- Ensaye 0,1 mL de las muestras recogidas para la estimación de histidina y calcule la concentración utilizando el gráfico estándar.
3. Estimación de histidina mediante la reacción de Pauly
- Prepare una curva estándar para la histidina.
- Prepare soluciones con concentraciones variables de histidina, como se indica en la Tabla 2 , utilizando soluciones madre de histidina (5 mM) y agua.
- Agregue ácido sulfanílico (0,5 mL) y nitrato de sodio (0,5 mL) a cada tubo.
- Incube los tubos durante 5 minutos a temperatura ambiente, luego agregue 1 ml de carbonato de sodio y 1 ml de etanol a cada tubo.
- Incubar los tubos durante 20 minutos a temperatura ambiente (~20 °C) y observar la absorbancia a una longitud de onda de 490 nm.
- Traza una curva estándar de absorbancia frente a la concentración de histidina.
NOTA: Esta prueba de histidina se basa en la propiedad de la histidina de formar un compuesto diazo (Figura 5).
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Resultados
El flujo de trabajo experimental para demostrar la movilidad intestinal de la histidina a través de la absorción de histidina por las vellosidades intestinales en la luz de los sacos invertidos se ilustra en la Figura 4, Tabla 1 y Tabla 2. Se realizaron tres configuraciones experimentales independientes y se presentan datos representativos en la Figura 6.
En las condiciones experimentales dadas, la es...
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Discusión
El transporte por membrana es uno de los conceptos más fundamentales que se enseñan a los estudiantes de pregrado de todas las principales disciplinas de ciencias biológicas, básicas o aplicadas. Tradicionalmente, el movimiento a través de las membranas se ha visualizado utilizando metabolitos marcados con isótopos radiactivos. Sin embargo, estos métodos son extremadamente peligrosos y no son factibles para la enseñanza o el aprendizaje. Si bien el aprendizaje experiencial es la mejor té...
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos ni otros conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este estudio ha sido apoyado por el Departamento de Bioquímica del Sri Venkateswara College de la Universidad de Delhi. Los autores agradecen al personal del laboratorio por su apoyo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL | TARSONS | 500020 | |
| Tubos de ensayo de 10 mL | BOROSIL | 9800U04 | |
| Tubos Falcon estériles de 50 mL | TARSONS | 546041 | |
| vaso de precipitados de 500 mL | BOROSIL 10044977 | ||
| matraz cónico de 500 mL | BOROSIL | 691467 | |
| D-Glucose | SRL | 42738 | |
| Espectrofotómetro digital | SYSTRONICS | 2710 | |
| Etanol | EMSURE | 1009831000 | |
| pipetas | THERMOFISHER | 4642090 | |
| Agitador de vidrio Varilla | BOROSIL 9850107 | ||
| L-histidina | SRL | 17849 | |
| NaCl | SRL | 41721 | |
| Guantes de nitrilo | KIMTECH | 112-4847 | |
| Placa de Petri | TARSONS | 460090 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (ph 7.4) | SRL | 95131 | |
| Puntas de pipeta | ABDOS | P10102 | |
| Carbonato de sodio | SRL | 89382 | |
| Nitrato de sodio | SRL | 44618 | |
| Fosfato de Sodio Dibásico (anhidro) | SRL | 53046 | |
| Fosfato de Sodio Monobásico (anhidro) | SRL | 22249 | |
| Ácido Sulfanílico | SRL | 15354 |
Referencias
- Nelson, D. L., Cox, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. 7th Edition. , W.H. Freeman and Company. (2017).
- Stillwell, W. Membrane Transport. An Introduction to Biological Membranes. , Elsevier Science. (2013).
- Fick, A. V. On liquid diffusion. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 10 (63), 30-39 (1855).
- Sherwood, L. Introduction to Human Physiology. , Brooks/Cole Cengage Learning. (2013).
- Bröer, S. Intestinal amino acid transport and metabolic health. Annu Rev Nutr. 43, 73-99 (2023).
- Avissar, N. E., Ryan, C. K., Ganapathy, V., Sax, H. C. Na+-dependent neutral amino acid transporter ATB0 is a rabbit epithelial cell brush-border protein. Am J Physiol Cell Physiol. 281 (3), C963-C971 (2001).
- Bröer, S. Amino acid transport across mammalian intestinal and renal epithelia. Physiol Rev. 88 (1), 249-286 (2008).
- Agar, W. T., Hird, F. J. R., Sidhu, G. S. The uptake of amino acids by the intestine. BBA - Biochim Biophys Acta. 14 (1), 80-84 (1954).
- Pauly, H. Über die Konstitution des Histidins. I. Mitteilung. Biological Chemistry. 42 (5-6), 508-518 (1904).
- Wilson, T. H., Wiseman, G. The use of sacs of everted small intestine for the study of the transference of substances from the mucosal to the serosal surface. J Physiol. 123 (1), 116-125 (1954).
- Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. Eur J Drug Metab Pharmacokinet. 23 (2), 313-323 (1998).
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- Williams, L., Sembiante, S. F. Experiential learning in U.S. undergraduate teacher preparation programs: A review of the literature. Teach Teach Educ. 112, 103630(2022).
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