Cuantificación del nivel de 8-oxo-dG mediante el ensayo ELISA para evaluar el daño oxidativo del ADN en células MCF-7

Resumen

Este protocolo describe un método eficiente para detectar cuantitativamente el daño oxidativo del ADN en células MCF-7 mediante la tecnología ELISA.

Resumen

La base 8-Oxo-7,8-dihidro-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dG) es la forma predominante de daño oxidativo del ADN comúnmente observado. El deterioro del ADN afecta profundamente la expresión génica y sirve como un factor fundamental en la estimulación de los trastornos neurodegenerativos, el cáncer y el envejecimiento. Por lo tanto, la cuantificación precisa de 8-oxoG tiene importancia clínica en la investigación de las metodologías de detección de daños en el ADN. Sin embargo, en la actualidad, los enfoques existentes para la detección de 8-oxoG plantean desafíos en términos de conveniencia, conveniencia, asequibilidad y mayor sensibilidad. Empleamos la técnica de ensayo de inmunoadsorción enzimática tipo sándwich (ELISA), un método colorimétrico altamente eficiente y rápido, para detectar variaciones en el contenido de 8-oxo-dG en muestras de células MCF-7 estimuladas con diferentes concentraciones de peróxido de hidrógeno (_H2O2). Determinamos la concentración de_H2O2que induce daño oxidativo en las células MCF-7 mediante la detección de su valor de IC₅₀ en las células MCF-7. Posteriormente, tratamos las células MCF-7 con 0, 0,25 y 0,75 mM H_2O2 durante 12 h y extrajimos 8-oxo-dG de las células. Finalmente, las muestras fueron sometidas a ELISA. Después de una serie de pasos, que incluyen la distribución de la placa, el lavado, la incubación, el desarrollo del color, la terminación de la reacción y la recopilación de datos, detectamos con éxito cambios en el contenido de 8-oxo-dG en las células MCF-7 inducidos por_H2O2. A través de estos esfuerzos, nuestro objetivo es establecer un método para evaluar el grado de daño oxidativo del ADN dentro de las muestras celulares y, al hacerlo, avanzar en el desarrollo de enfoques más convenientes y convenientes para la detección de daños en el ADN. Este esfuerzo está preparado para hacer una contribución significativa a la exploración de análisis asociativos entre el daño oxidativo del ADN y varios dominios, incluida la investigación clínica sobre enfermedades y la detección de sustancias tóxicas.

Introducción

El daño oxidativo del ADN es consecuencia de un desequilibrio entre la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el sistema de defensa antioxidante celular¹. Implica principalmente la oxidación de las bases de ADN, purina y pirimidina ^2,3. Esta modificación oxidativa de las bases del ADN no solo compromete la integridad del genoma, sino que también abarca una amplia gama de problemas patológicos, como el cáncer, las enfermedades neurodegenerativas y las enfermedades cardiovasculares ^4,5. La base de guanina en el ADN tiene el menor potencial de reducción y es la más susceptible a la oxidación⁶. Por lo tanto, la 8-oxo-7,8-dihidro-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dG) sirve como marcador primario para evaluar el grado de daño oxidativo del ADN ^7,8. La cuantificación precisa de 8-oxo-dG se ha convertido en una cuestión crítica para abordar diversos aspectos de la aparición de enfermedades, su progresión y la evaluación de la carga oxidativa multifactorial⁹.

Los métodos tradicionales para la detección de 8-oxo-dG, como la cromatografía líquida de alta resolución con detección electroquímica (HPLC-ECD), la espectrometría de masas y las técnicas relacionadas con guiones, presentan una alta sensibilidad y especificidad 10,11,12. Sin embargo, estas técnicas suelen tener requisitos operativos complejos y costes elevados, lo que dificulta su amplia aplicabilidad y practicidad en el análisis de muestras de alto rendimiento. Con el avance continuo de la ciencia y la tecnología, ha surgido una variedad de métodos nuevos, eficientes y precisos. La aplicación de estas nuevas tecnologías permite cuantificar el nivel de 8-oxo-dG con mayor precisión y proporciona herramientas más potentes para un estudio en profundidad de la asociación entre el estrés oxidativo y la enfermedad. Por ejemplo, los investigadores han aplicado la tecnología de nanoporos para detectar y secuenciar cuantitativamente el ADN¹³, identificar los tipos de daño del ADN utilizando una estrategia de secuenciación de código con un solo clic¹⁴, desarrollar métodos de secuenciación de alto rendimiento y crear biosensores basados en 8-oxoG mediante la integración de biotina-estreptavidina con ELISA¹⁵. Entre ellas, ELISA, con sus reconocidas ventajas en términos de especificidad, cribado de alto rendimiento y coste, es una de las soluciones ideales para la detección de 8-oxo-dG. Por lo tanto, es crucial desarrollar un método de alto rendimiento, altamente sensible, conveniente y rápido para detectar 8-oxo-dG.

La técnica de ensayo inmunoenzimático (ELISA), desarrollada en 1971¹⁶, ha avanzado rápidamente en los últimos 50 años y se ha convertido en uno de los métodos de detección más utilizados en los campos de la biología y la medicina 17,18,19. La tecnología ELISA exhibe una alta sensibilidad y especificidad, posee un tiempo de reacción corto y es fácil de usar, lo que la convierte en una opción ampliamente reconocida para pruebas de muestras a gran escala y análisis de alto rendimiento²⁰. Como resultado, ELISA ha sido ampliamente utilizado para el análisis cuantitativo o semicuantitativo de compuestos, proteínas, anticuerpos o moléculas dentro de las células 21,22,23. Por ejemplo, se ha utilizado en la detección de biomarcadores asociados a diversas enfermedades, residuos de fármacos y biomoléculas²⁴. Los ELISA se pueden clasificar en cuatro tipos principales basados en el diseño experimental y los principios²⁵. Estos métodos incluyen ELISA directo, ELISA indirecto, ELISA sándwich y ELISA competitivo^26,27. Entre estos, se eligió para el estudio en este trabajo el ELISA sándwich, que utiliza dos anticuerpos específicos, uno para capturar la molécula objetivo y otro para la detección. El principio experimental del ELISA sándwich es el siguiente: en primer lugar, se inmoviliza un anticuerpo específico en los pocillos de una microplaca para capturar el analito de interés. Una vez añadido el patrón o la muestra, el analito diana se une al anticuerpo inmovilizado. Posteriormente, se añade un anticuerpo marcado que reconoce un epítopo diferente en el antígeno, formando una estructura de sándwich. Tras la eliminación de los anticuerpos no unidos, se añade un sustrato. Bajo la acción catalítica del anticuerpo secundario, se produce una reacción de color y la intensidad del color se correlaciona positivamente con la concentración del analito objetivo en la muestra. Finalmente, se midió la densidad óptica (DO) para determinar la concentración de la muestra. El ELISA sándwich tiene las ventajas de una mayor sensibilidad y especificidad para las muestras objetivo, lo que lo hace adecuado para detectar bajas concentraciones de analitos objetivo y muestras complejas²⁸. Además, los resultados obtenidos pueden ser cuantificados para su posterior análisis. Estos factores hacen que el ELISA sándwich sea un método de detección comúnmente utilizado tanto en la investigación científica como en los laboratorios clínicos²⁹.

Este estudio tuvo como objetivo detectar cuantitativamente 8-oxo-dG en células MCF-7 para determinar el grado de daño oxidativo del ADN en las células. Este estudio consta de dos partes principales: la construcción de un modelo de daño oxidativo del ADN de la célula MCF-7 y la detección de 8-oxo-dG mediante ELISA. En primer lugar, las células MCF-7 se cultivaron in vitro y se trataron con diferentes concentraciones de_H2O2 durante diferentes duraciones. La viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo CCK-8 para determinar la concentración inhibitoria semimáxima (IC₅₀) de_H2O2 en células MCF-7. Sobre la base de los valores de IC₅₀, se eligieron un tiempo de tratamiento de H₂O₂ y una concentración de inducción adecuados. Para extraer muestras de células MCF-7 dañadas por oxidación, se obtuvieron muestras celulares y sobrenadantes y se añadieron a pocillos ligados a enzimas previamente recubiertos con anticuerpos 8-oxo-dG. El 8-oxo-dG presente en la muestra se unirá a los anticuerpos unidos al portador en fase sólida. A continuación, se añadieron anticuerpos 8-oxo-dG marcados con peroxidasa de rábano picante. La mezcla de reacción se incubó a una temperatura constante para asegurar la unión completa de la muestra y el anticuerpo. La enzima no unida se eliminó mediante lavado y luego se agregó el sustrato colorimétrico, que produjo un color azul. Bajo la acción del ácido, la solución se volvió amarilla. Finalmente, el valor de OD de las muestras de los pocillos de reacción se midió a 450 nm, y la concentración de 8-oxo-dG en la muestra fue proporcional al valor de OD. Al generar una curva estándar, se puede calcular la concentración de 8-oxo-dG en la muestra.

Protocolo

1. Construcción de un modelo dedaño oxidativo del ADN inducido por_H2O2en células MCF-7

1. Recuperación de células MCF-7
   1. Transfiera rápidamente el tubo criogénico de cultivo celular, que contiene 3,5 x 10⁶ células MCF-7 y se almacena en un refrigerador a -80 °C, a una caja de espuma que contiene nitrógeno líquido. Recupere el tubo con pinzas y colóquelo en un baño de agua a temperatura constante a 37 °C durante aproximadamente 1 minuto para descongelar las células conservadas.
      NOTA: Durante el proceso de descongelación en un baño de agua, agite las células de forma intermitente para asegurar un calentamiento uniforme del criovial.
   2. Coloque el criovial en una centrífuga y centrifuga a temperatura ambiente a 150 x g durante 5 min.
   3. Utilice una pipeta para desechar el sobrenadante del tubo de almacenamiento criogénico y añada 1 ml de medio de cultivo completo. Mezclar bien y transferir a una placa de cultivo de 10 mm, complementar 7 mL adicionales de medio de cultivo completo.
   4. Agite la placa de cultivo en un patrón entrecruzado para asegurar una mezcla uniforme, y el cultivo en una incubadora de CO₂ a 37 °C con 5% de CO₂.
      NOTA: El medio de cultivo completo consiste en un medio de cultivo DMEM suplementado con un 10% de suero fetal bovino, un 1% de penicilina y estreptomicina.
2. Evaluación de la viabilidad celular
   1. Seleccione células MCF-7 en la fase de crecimiento logarítmico con buen estado celular para el experimento. Durante la fase de crecimiento logarítmico, las células suelen exhibir un ciclo de división más corto y una alta frecuencia de división celular.
      1. Observe la morfología y la tasa de crecimiento de las células MCF utilizando un microscopio electrónico. Cuando las células presentan una morfología monocapa uniforme y densamente empaquetada, y la proliferación celular es evidente, se puede determinar que las células se encuentran esencialmente en la fase de crecimiento logarítmico.
   2. Lavado de células: Utilice una pipeta para retirar el medio de cultivo de la placa de cultivo, añada 1 ml de tampón PBS para lavar las células y, a continuación, deseche el PBS.
   3. Desprendimiento de células: Agregue 1 ml de tripsina para lavar las células, espere aproximadamente 1 minuto para que la tripsina separe completamente las células de la placa de cultivo. Golpee suavemente el plato de cultivo; Observación del movimiento celular
      en hojas indica un desprendimiento completo de la célula.
   4. Terminación del desprendimiento de células y recuento de células: Agregue 8 ml de medio de cultivo completo para terminar el desprendimiento, pipetee suavemente las células y determine la concentración de suspensión celular utilizando un dispositivo de recuento de células.
      NOTA: Asegúrese de que la suspensión celular sea homogénea antes de contar pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
   5. Siembra celular: Ajuste la suspensión celular diluida para lograr una densidad celular de 5.000 células por 100 μL. Inocular la suspensión celular en 21 pocillos de una placa de 96 pocillos con una pistola de pipetas, dispensando 100 μL en cada pocillo. Añada 100 μL de tampón PBS a los pocillos circundantes de los pocillos sembrados para evitar la evaporación excesiva del medio de cultivo.
   6. Preparación del medio que contiene_H2O2: Elija 9 pocillos en la placa de cultivo celular de 12 pocillos y asigne etiquetas en función del gradiente de las concentraciones de_H2O2 (0, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5, 2,0 mM). Agregue 720 μL de medio completo a los pocillos etiquetados como 2.0 mM y 1.5 mM y agregue 360 μL de medio completo a los pocillos restantes.
      1. Con una pipeta, dispense 1,63 μL y 1,22 μL de reactivo H₂O₂ al 3% en los pocillos etiquetados como 2,0 mM y 1,5 mM, respectivamente. Mezcle bien la solución. Con una pipeta, transfiera 360 μL de 2,0 mM H₂O₂ al pocillo 1,0 mM etiquetado y mezcle; luego, transfiera 360 μL de 1,0 mM H₂O₂ a los 0,5 mM bien marcados y mezcle; y finalmente transferir 360 μL de 0,5 mM H₂O₂ al pozo marcado 0,25 mM. Pipetear 360 μL de 1,5 mM H₂O₂ en el pocillo marcado 0,75 mM para diluir y lograr la concentración deseada. (Figura 1).
         NOTA: Asegúrese de que la solución madre H₂O₂ de la pipeta se transfiera completamente a los pocillos para evitar cualquier solución residual. Asegúrese de mezclar bien las soluciones antes de proceder a la dilución.
   7. Incubación: Después de aproximadamente 24 h de siembra de células, use una pipeta para eliminar el medio de cultivo de la placa de 96 pocillos una vez que las células se hayan adherido a las superficies. Según el gradiente de concentración, agregue el medio que contiene H₂O₂ respectivo a cada pocillo. Regrese la placa a la incubadora durante 12 h.
   8. Adición del reactivo CCK-8: Después del período de tratamiento designado de 12 horas, use una pipeta para eliminar el medio de cultivo de la placa de 96 pocillos, agregue 100 μL de medio de cultivo completo y 10 μL de reactivo CCK-8 a cada pocillo, e incluya tres pocillos de control en blanco. Incubar la placa a 37 °C durante 2 h.
      NOTA: Durante el proceso de adición de muestras, evite la formación de burbujas para evitar cualquier interferencia con la lectura del valor OD.
   9. Medición de la absorbancia: Extraiga la placa de 96 pocillos de la incubadora, mida la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm con un lector de microplacas y registre los resultados.
   10. De acuerdo con la fórmula de cálculo IC₅₀ ,
       tasa de inhibición (%) = (DE del grupo experimental de fármacos-DE promedio del orificio de control de medicamentos)/ (DE promedio del orificio de control celular-DE promedio del orificio de control de medicamentos) x 100%
       Calcule los resultados como porcentaje de absorbancia en cultivos de control.
   11. Importe los datos experimentales procesados a un software de análisis estadístico, seleccione el tipo de análisis Regresión no lineal, construya el modelo logístico de cuatro parámetros y proceda a hacer clic en el botón Ajustar curva para el ajuste de la curva. Después del proceso de ajuste, el software calculará automáticamente el valor IC₅₀ .
3. Experimento de oxidación celular MCF-7 inducida por_H2O2
   1. Recuperar células MCF-7 en la fase de crecimiento logarítmico con buen estado celular para la experimentación.
   2. Lavar, realizar el desmontaje de células, finalizar el desmontaje y contar las células (consulte el paso 1.2 para conocer los métodos específicos).
   3. Siembra de células: Ajustar la densidad de la suspensión celular a 1 x 10⁶ celdas por plato, con 4 mL de la suspensión por plato de 6 cm de diámetro.
   4. Etiquete dos tubos de microcentrífuga de 5 mL como 0,25 mM y 0,75 mM 3% H₂O₂. Agregue 4 mL de medio completo a cada tubo, luego agregue 1.13 μL y 3.40 μL de 3% H₂O₂, respectivamente. Agite suavemente los tubos para asegurar una mezcla completa. Reemplace el medio de cultivo en las tres placas con un medio completo que contenga concentraciones de H,₂O_{, 2} y 0,75 mM.
   5. Incubar los cultivos: Devolver los platos a la incubadora durante 12 h.

2. Preparación de muestras celulares y preparación de reactivos ELISA

1. Recogida de muestras de extractos celulares
   1. Recolección de muestras: Deseche el sobrenadante de cultivo celular MCF-7, enjuague, realice el desprendimiento de células, finalice el desprendimiento y recoja las células. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 mL.
   2. Centrifugación: Centrífuga a 800 x g durante 5 min para recoger el pellet de la célula. Agregue 200 μL de PBS para resuspender cada muestra celular y alterar las células mediante ciclos repetidos de congelación y descongelación. Centrifugar el lisado celular a 1.500 x g durante 10 min y utilizar una pipeta para recoger el sobrenadante para su análisis.
      NOTA: Cuando la cantidad de celdas sea baja, reduzca el volumen de PBS utilizado para la resuspensión. Las muestras pueden almacenarse a 4 °C durante un máximo de 1 semana si no es posible un análisis inmediato. Para el almacenamiento a largo plazo, alícuota de las muestras en cantidades de un solo uso y almacenarlas a -80 °C para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación.
2. Preparación de reactivos ELISA
   1. Descongelación de reactivos: Permita que los reactivos ELISA, incluidas las películas de sellado, las placas prerrevestidas, los patrones, el diluyente de la muestra, el anticuerpo de detección HRP, el sustrato de cromógeno, la solución de parada, el tampón de lavado concentrado (20x) y las muestras de prueba alcancen la temperatura ambiente (18-25 °C) durante 20 minutos antes de comenzar el ensayo. Abra previamente el lector ELISA 15 minutos antes de usarlo.
   2. Preparación del tampón de lavado: Calcule el volumen requerido de tampón de lavado diluido y luego diluya el tampón de lavado concentrado 20x con agua destilada o desionizada en 1x solución de trabajo. Devuelva el tampón de lavado concentrado no utilizado al frigorífico a 4 °C.
      NOTA: El tampón de lavado debe prepararse fresco antes de usarlo. Si hay cristales en el tampón de lavado concentrado almacenado en el refrigerador, deje que alcance la temperatura ambiente y agítelo suavemente hasta que los cristales se disuelvan por completo antes de utilizarlos.
   3. Elaboración de la norma
      1. Prepare soluciones de trabajo de muestras estándar con concentraciones de 1,25, 2,5, 5, 10, 20 y 40 ng/mL, respectivamente. Para garantizar la precisión de los resultados experimentales, mezcle cuidadosamente las muestras estándar hacia arriba y hacia abajo antes de usarlas para evitar la formación de burbujas durante el proceso de disolución.

3. Experimento ELISA

1. Recubrimiento de placas: Diseñe el número total de pocillos para estándares, muestras y blancos/controles con anticipación y saque las tiras de placa requeridas. Añada 50 μL de solución de trabajo estándar y muestras de detección con diferentes concentraciones a los pocillos de reacción. Realizar patrones por triplicado y abstenerse de agregar muestras a los pocillos en blanco/control²⁵.
   NOTA: Los pasos experimentales del ensayo ELISA se muestran esquemáticamente en la Figura 2. Si la concentración de la muestra excede el rango de detección, la muestra debe diluirse con diluyente de muestra antes de la toma de muestras. Al agregar muestras, agréguelas al fondo del plato, evitando tocar las paredes del pocillo, agite suavemente para mezclar y evite la formación de burbujas. Para garantizar la precisión del experimento, cada adición de muestra debe completarse dentro de los 10 minutos.
2. Incubación: A excepción de los pocillos en blanco, agregue 100 μL de anticuerpo de detección conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) a cada pocillo de reacción, selle los pocillos con un sello de placa e incube a 37 °C durante 60 min en una incubadora de temperatura constante.
3. Lavado: Deseche el líquido, sacuda el líquido en los pocillos de la placa, seque sobre papel absorbente, agregue 350 μL de tampón de lavado a cada pocillo de reacción, déjelo reposar durante 1-2 minutos, luego deseche el tampón de lavado. Repita el proceso de lavado 5 veces.
   NOTA: El lavado a fondo es crucial porque afecta directamente la precisión de los resultados experimentales. Asegúrese de que el tampón de lavado se sacuda completamente después de cada lavado. Limpie cuidadosamente cualquier residuo en la parte inferior de la placa después del lavado para evitar afectar la medición de absorbancia.
4. Reacción de color: Añadir 50 μL de sustrato A y 50 μL de sustrato B a cada pocillo de reacción, sellar la placa e incubar a 37 °C en la oscuridad durante 15 min.
   NOTA: Después de agregar el reactivo de color, observe rápidamente el cambio de color en los pocillos de reacción. Si el color es demasiado oscuro, agregue la solución de parada para terminar la reacción antes.
5. Finalice la reacción y mida la absorbancia: Agregue 50 μL de solución de parada a cada pocillo de reacción y mida inmediatamente el valor de OD a una longitud de onda de 450 nm con un lector ELISA (dentro de los 15 minutos).
6. Análisis de datos: Importe los datos experimentales procesados en el software de análisis estadístico, seleccione el tipo de análisis Regresión lineal. Construya una curva de calibración trazando la concentración de los patrones en el eje X frente a los valores de densidad óptica (OD) en el eje Y. Utilice la curva de calibración establecida para determinar la concentración de 8-oxo-dG presente en las muestras. Construya un modelo matemático logístico y proceda a hacer clic en el botón Ajustar curva para el ajuste de la curva. Después del proceso de ajuste, el software calcula automáticamente la curva estándar y el valor P.
   NOTA: La curva estándar no se puede reutilizar y debe determinarse de nuevo para cada experimento.

Resultados

Como se ilustra en la Figura 3, el eje X denota la concentración de H₂O₂ aplicada a las células MCF-7, mientras que el eje Y indica la viabilidad de la célula. El tratamiento con 0,75 mM durante 12 h redujo la viabilidad de las células MCF-7 al 67%. Concomitantemente con el aumento de la concentración, hubo una disminución significativa en la viabilidad de las células MCF-7, particularmente a una concentración de 1,5 mM, donde la viabilidad disminuyó por debajo del 3% (Tabla 1). Los resultados experimentales sugirieron un IC₅₀ de 0,7655 mM para las células MCF-7.

En esta serie de experimentos, empleamos una técnica ELISA mejorada para la cuantificación de los niveles de 8-oxo-dG. A través del análisis de datos, la ecuación de regresión de la curva estándar es:

Y = 23,66 × X + 0,07038.

Como se muestra en la Figura 4A, la curva de calibración demostró una alta linealidad (R² = 0,978), y la Figura 4B muestra que las relaciones entre las concentraciones medidas de 8-oxo-dG en las muestras y sus correspondientes cantidades agregadas estaban fuertemente correlacionadas, lo que indica una buena precisión (el coeficiente de variación fue inferior al 5%). Además, la consistencia de los resultados obtenidos en múltiples réplicas indica la fiabilidad y reproducibilidad del método experimental.

En resumen, los datos experimentales indican que nuestro método ELISA optimizado es capaz de detectar con éxito fluctuaciones en los niveles de 8-oxo-dG en condiciones bien controladas. Esto tiene implicaciones significativas para futuras aplicaciones de esta técnica en una gama más amplia de tipos de muestras para monitorear el daño del ADN causado por el estrés oxidativo. A pesar de ciertas limitaciones, las perspectivas de aplicación del método parecen prometedoras una vez optimizadas las condiciones experimentales.

Figura 1: Preparación de diluciones de H₂O₂ . El diagrama esquemático describe el método para preparar diluciones de peróxido de hidrógeno (H₂O₂), que implica la combinación meticulosa de soluciones y la transferencia precisa de concentraciones variadas de H₂O₂ en tubos etiquetados como 1,0 mM, 0,5 mM y 0,25 mM respectivamente. La concentración objetivo se alcanza transfiriendo 1,5 mM H₂O₂ al tubo designado como 0,75 mM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) para la detección de antígenos. Esta ilustración esquemática representa los pasos secuenciales de un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para la detección de antígenos: adición de muestras y preparación de blancos; Incubación de antígenos marcados con HRP; lavado y preparación de platos; adición de sustrato e incubación; terminación de reacción y medición de densidad óptica (OD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: H₂O₂ inhibió la proliferación de células MCF-7. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo CCK-8 tratado con varias concentraciones de_H2O2 (0, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5 o 2,0 mM) durante 12 h y se calculó IC₅₀ para la condición indicada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis cuantitativo de 8-oxo-dG en células MCF-7 tras el tratamiento con_H2O2. (A) Curva estándar ELISA para 8-oxo-dG. Representa la relación entre las concentraciones conocidas de 8-oxo-dG (1,25, 2,5, 5, 10, 20 y 40 ng/mL) y sus respectivos valores de absorbancia. La ecuación de regresión de la curva estándar es Y = 23,66 × X + 0,07038. (n=3, R²=0,978). (B) Concentración de 8-oxo-dG en células MCF-7 tratadas con_H2O2. El gráfico muestra los niveles de 8-oxo-dG en las células MCF-7 sometidas a diferentes concentraciones de_H2O2(0, 0,25 y 0,75 mM). Cada punto de datos representa la media ± SE (error estándar) de tres experimentos independientes (n = 3), lo que ilustra el impacto del estrés oxidativo en el daño del ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Parámetro
Concentración de H2O2 , mM	0	0.25	0.5	0.75	1	2
Viabilidad de la célula MCF-7, %	100	82.8	81.37	61.07	13.4	2.77

Tabla 1: Viabilidad celular de las células MCF-7 tratadas con_H2O2.

Discusión

El desarrollo de métodos ELISA es de gran importancia tanto para las metodologías de detección de daños en el ADN existentes como para las nuevas. En comparación con las técnicas tradicionales de HPLC y espectrometría de masas, este enfoque no solo es fácil de usar, sino que también exhibe una alta sensibilidad y cumple con las demandas de detección de alto rendimiento³⁰. Esto permite la monitorización de 8-oxo-dG en estudios de cribado de enfermedades a gran escala, lo que facilita una comprensión más profunda de la correlación entre este biomarcador y diversas enfermedades.

Durante los procedimientos experimentales, varios pasos críticos son esenciales para garantizar la fiabilidad y la reproducibilidad de los resultados. Inicialmente, el experimento evaluó de manera competente la sensibilidad de las células MCF-7 a H₂O₂, con un valor de IC₅₀ de 0,7655 mM a las 12 h, destacando el nivel de tolerancia de las células MCF-7. Este resultado es de gran importancia científica para la comprensión de los mecanismos de defensa antioxidante de las células MCF-7 y su supervivencia bajo estrés oxidativo, al tiempo que proporciona un importante indicador de referencia para el cribado futuro de fármacos antioxidantes o mecanismos de tratamiento relacionados³¹. Además, la selección y el emparejamiento de anticuerpos 8-oxo-dG es vital para la detección de ELISA y afecta directamente a la especificidad y sensibilidad del sistema de detección ELISA. Además, la optimización de la estrategia de amplificación de señales y los pasos de procesamiento de muestras son factores importantes que afectan a la precisión de la detección. Descubrimos que el uso de un sistema de reacción de sustrato estable puede reducir los errores de fondo y aumentar el rango de sensibilidad de detección.

Durante el proceso experimental, pueden producirse problemas técnicos como anticuerpos inestables, fluctuaciones de la señal y reactividad cruzada de los reactivos. Para abordar estos problemas, adoptamos un protocolo experimental más estable, que incluía el uso de disolventes de anticuerpos estables para mejorar la estabilidad de los anticuerpos y la optimización y el ajuste de las condiciones experimentales. Además, para abordar el error causado por las fluctuaciones de la señal, estandarizamos el experimento utilizando muestras estándar de 8-oxo-dG para garantizar la consistencia de los resultados.

En cuanto a las limitaciones del método experimental, aunque ELISA proporciona un enfoque de alto rendimiento, aún puede estar limitado por la cobertura específica de anticuerpos y la inevitable reactividad cruzada del sustrato³². Por lo tanto, es posible que se requieran pasos adicionales de purificación o preprocesamiento de muestras para muestras complejas. Además, la detección de muestras con concentraciones más bajas puede requerir una mayor optimización de la actividad de los anticuerpos para cumplir con los requisitos de la investigación.

En conclusión, el método de detección ELISA para 8-oxo-dG tiene implicaciones importantes para áreas de investigación específicas. Tiene un valor potencial de aplicación en el monitoreo ambiental, la evaluación del riesgo de enfermedades y el diagnóstico temprano, y proporciona un nuevo enfoque de detección para el 8-oxo-dG en la agricultura, la seguridad alimentaria y el cribado de medicamentos³³. Por ejemplo, en el biomonitoreo ambiental, la detección del estrés por daño oxidativo del ADN causado por toxinas ambientales en los organismos puede ayudar a identificar riesgos potenciales de manera oportuna³⁴. En el futuro, con una mayor optimización de la tecnología de detección y su aplicación en múltiples disciplinas, se espera que este método desempeñe un papel más crítico en la investigación en ciencias de la vida.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.25% Trypsin-EDTA(1x)	Gibco	25200-072
Kit de conteo de células-8	Dojindo	CK04
Placa de recuento de células	QiuJing	XB-K-25
CO2 incubadora	Thermo	51032872
DMEM basic(1X)	Gibco	C11995500BT
FBS	PAN	ST30-3302
GraphPad Prisma X9	GraphPad Software		de análisis estadístico
centrífuga de alta velocidad	Thermo	9AQ2861
Kit ELISA 8-oxo-dG humano	Zcibio	ZC-55410
L-1000XLS+ Pipetas	Rainin	17014382
L-20XLS+ Pipetas	Rainin	17014392
tanque de nitrógeno líquido	Mvecryoge	YDS-175-216
MCF-7 CELL	BNCC	BNCC100137
Multiskan FC Fotómetro de microplaca	Thermo	1410101
PBS	Solarbio	P1020
Solución de penicilina-estreptomicina, 100X	Beyotime	C0222
Microscopio trinocular de células vivas	Motic	1.1001E+12
Congelador de ultra baja temperatura	Haire V118574