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Extracción mejorada de ADN de bajo peso molecular de aguas residuales para una evaluación integral de la resistencia a los antimicrobianos

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DOI:

10.3791/66899

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19 de julio de 2024

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1Ashoka University

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos una técnica simple para evaluar la resistencia a los antimicrobianos (RAM) ambiental mediante el aumento de la proporción de ADN extracelular de bajo peso molecular. El tratamiento previo con PEG al 20%-30% y NaCl 1,2 M permite la detección de genes de AMR tanto genómicos como transferidos horizontalmente. El protocolo se presta a un proceso sin kits con optimización adicional.

Resumen

Se reconoce que la vigilancia ambiental es una herramienta importante para evaluar la salud pública en la era posterior a la pandemia. El agua, en particular las aguas residuales, se ha convertido en la fuente de elección para muestrear las cargas de patógenos en el medio ambiente. Las aguas residuales de los desagües abiertos y las plantas de tratamiento de aguas comunitarias son un reservorio de patógenos y genes de resistencia a los antimicrobianos (RAM), y con frecuencia entran en contacto con los seres humanos. Si bien existen muchos métodos para rastrear la resistencia a los antimicrobianos en el agua, aislar ADN de buena calidad a altos rendimientos de muestras heterogéneas sigue siendo un desafío. Para compensar, los volúmenes de muestra a menudo deben ser altos, lo que crea restricciones prácticas. Además, el ADN ambiental se fragmenta con frecuencia, y las fuentes de AMR (plásmidos, fagos, ADN lineal) consisten en ADN de bajo peso molecular. Sin embargo, pocos procesos de extracción se han centrado en métodos para la extracción de alto rendimiento de ADN lineal y de bajo peso molecular. Aquí, se presenta un método simple para la extracción lineal de ADN de alto rendimiento a partir de pequeños volúmenes de aguas residuales utilizando las propiedades de precipitación del polietilenglicol (PEG). Este estudio aboga por el aumento de los rendimientos generales de ADN de las muestras de agua recogidas para los análisis metagenómicos mediante el enriquecimiento de la proporción de ADN lineal. Además, la mejora del ADN de bajo peso molecular supera el problema actual de la falta de muestreo de la resistencia a los antimicrobianos ambientales debido a un enfoque en el ADN intracelular y de alto peso molecular. Se espera que este método sea particularmente útil cuando existe ADN extracelular pero en bajas concentraciones, como en el caso de los efluentes de las plantas de tratamiento. También debería mejorar el muestreo ambiental de fragmentos de genes de resistencia a los antimicrobianos que se propagan a través de la transferencia horizontal de genes.

Introducción

El SARS-CoV-2 y sus secuelas subrayaron la importancia de la vigilancia ambiental en el seguimiento y la predicción de brotes de enfermedades infecciosas 1,2. Si bien las pandemias virales son evidentes, el aumento de la resistencia a los antimicrobianos (RAM) a menudo se describe como una pandemia insidiosa y que constituye un importante problema de salud pública en todo el mundo 3,4. En consecuencia, existe una necesidad urgente de estrategias coordinadas para comprender la evolución y la propagación de la resistencia a los antimicrobianos. Las masas de agua, así como las aguas residuales, pueden servir como reservorios tanto para los patógenos como para la resistencia a los antimicrobianos 5,6,7,8. Las fuentes de agua compartidas son, por lo tanto, una potente fuente de transmisión de enfermedades entre los seres humanos, especialmente en los países de ingresos bajos y medianos (PIMB), donde la falta de higiene y la superpoblación van de la mano 9,10,11. El análisis de las fuentes de agua se ha empleado durante mucho tiempo para evaluar la salud de la comunidad 12,13,14. Recientemente, las aguas residuales de las plantas de tratamiento de aguas residuales urbanas demostraron ser un buen indicador de avance de los casos de COVID en la clínica 1,2,15,16,17,18.

En comparación con el seguimiento de enfermedades específicas, la detección y el seguimiento de la resistencia a los antimicrobianos en el medio ambiente plantean un problema más complejo. El gran número de antibióticos en uso, los diversos genes de resistencia, las diferentes presiones de selección local y la transferencia horizontal de genes entre bacterias dificultan la evaluación de la verdadera carga de RAM y, una vez evaluada, su correlación con las observaciones clínicas 19,20,21,22. Como resultado, mientras que la vigilancia concertada de la RAM clínica está siendo llevada a cabo por varias organizaciones en todo el mundo 3,23,24, la vigilancia ambiental de la RAM aún está en pañales, revisada en 19,25,26.

En los últimos años, se han descrito diferentes métodos para el seguimiento de la RAM ambiental 5,27, revisados en28,29. El punto de partida de la mayoría de ellos es la extracción de ADN de buena calidad a partir de muestras ambientales heterogéneas, lo que en sí mismo es un desafío. Además, el ADN ambiental suele estar fragmentado debido a la exposición a entornos hostiles. El ADN extracelular fragmentado ha sido reconocido durante mucho tiempo como un importante reservorio de genes de AMR (revisado en 30,31,32), con el potencial adicional de entrar y salir de las bacterias a través de la transferencia horizontal de genes. Por lo tanto, es importante que cualquier protocolo que tenga como objetivo medir la carga de RAM en el medio ambiente muestree ADN lineal y de bajo peso molecular lo mejor posible. Sorprendentemente, ha habido poco enfoque en el desarrollo de métodos específicos para la extracción de alto rendimiento de ADN lineal y de bajo peso molecular: este trabajo se centra en abordar la brecha.

Un método común y sencillo para precipitar el ADN es combinar polietilenglicol (PEG) y sales como el cloruro de sodio (NaCl)33. El PEG es un agente de aglomeración macromolecular utilizado para lograr la precipitación específica del tamaño de los fragmentos de ADN34,35. Cuanto menor sea la concentración de PEG, mayor será el peso molecular del ADN que se puede precipitar de manera eficiente. Muchos estudios han utilizado PEG durante la extracción ambiental de ADN y ARN 1,2 (resumidos en la Tabla 1 17,33,36,37,38,39) ya sea en el paso final 33,36,37 o para concentrar grandes muestras de agua para la extracción de partículas virales como con el SARS-CoV-2 15,40. En el trabajo actual, se encuentra que las concentraciones de PEG utilizadas previamente para las extracciones de ADN ambiental (determinadas en gran medida por protocolos de vigilancia viral) no capturan ADN lineal de bajo peso molecular. Por lo tanto, pierden la oportunidad de muestrear fragmentos cortos de ADN y no son adecuados para evaluar con precisión el contenido de RAM. Este estudio ha explotado las propiedades del polietilenglicol y el cloruro de sodio para precipitar eficazmente fragmentos de ADN lineal de bajo peso molecular con un alto rendimiento que puede, en el futuro, conducir a un método de extracción de ADN rentable. Este método se puede utilizar para enriquecer la proporción de ADN fragmentado y de bajo peso molecular de muestras naturales complejas, capturando así una imagen más precisa de la resistencia a los antimicrobianos ambientales. Con un poco más de refinamiento, la técnica se presta a una aplicación fácil y de bajo costo por parte de las corporaciones municipales locales y otros organismos gubernamentales para su uso como herramienta de vigilancia con una capacitación técnica mínima.

Protocolo

1. Toma de muestras de aguas residuales

  1. Sumerja un vaso de polipropileno de 500 mL en el desagüe abierto o en el depósito de la planta de tratamiento de aguas residuales (STP) y recoja ~ 300 mL de muestra de aguas residuales.
  2. Transfiera ~ 250 mL de la muestra a una botella de polipropileno esterilizada en autoclave de 250 mL.
  3. Enrosca la tapa de la botella y séllala con una película de plástico. Mantenga el frasco en posición vertical dentro de una bolsa cerrada.
  4. Transporte la muestra en posición vertical en un recipiente cerrado a temperatura ambiente.
  5. Inactivar con calor la muestra a 70 °C en un horno de aire caliente durante 4 h antes de procesarla para la extracción de ADN.

2. Extracción de ADN de muestras de aguas residuales

  1. Una vez que la muestra de aguas residuales se enfríe, agite las muestras a máxima velocidad y deje que los desechos/lodos se asienten.
  2. Decantar 27,5 mL de las aguas residuales en tubos de centrífuga de 50 mL y añadir 13,5 g de PEG-8000 (concentración final 30%) y 3 g de NaCl (concentración final 1,2 M) y mezclar bien hasta que se disuelva por completo.
  3. Incubar la muestra durante la noche (~16-18 h) a 4 °C.
  4. Centrifugar la muestra a 15.500 x g a 4 °C durante 30 min.
  5. Deseche el sobrenadante.
    NOTA: PEG-8000 al 30% es altamente viscoso y el pellet puede desprenderse mientras se desecha el sobrenadante. El sobrenadante debe decantarse lenta y cuidadosamente para asegurarse de que el pellet no se pierda. Los pasos 2.6 a 2.23 se realizan utilizando el kit de extracción de ADN del suelo de acuerdo con las instrucciones del kit con algunas modificaciones.
  6. Disuelva el pellet en 800 μL de la solución de lisis del kit y agregue la solución al tubo de perlas de circonio mezclado.
    NOTA: Si procesa volúmenes más grandes, agrupe los gránulos del número deseado de tubos. Por ejemplo, si se procesan 160 mL de muestra; habrá cuatro tubos de 50 mL que contendrán aguas residuales con PEG y NaCl. Después de centrifugar los cuatro tubos a 15.500 x g a 4 °C durante 30 min, deseche el sobrenadante de los cuatro tubos. Agregue 200 μL de solución CD1 a cada uno, vuelva a suspender los gránulos y acompáñelos en un tubo de perlas.
  7. Asegure el tubo de cuentas horizontalmente en un vórtice. Agite el tubo a máxima velocidad durante 20-30 min.
    NOTA: El vórtice prolongado garantiza la lisis y homogeneización completas de las muestras, lo que mejora el rendimiento del ADN.
  8. Gire los tubos a 8.000 x g durante 15 s para asentar las perlas en la parte inferior, eliminar la espuma y transferir el sobrenadante completamente del tubo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Algunas cuentas también pueden transferirse durante este paso.
  9. Centrifugar el sobrenadante a 15.000 x g durante 1 min.
  10. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio de 2 mL. El sobrenadante puede contener todavía algunas partículas en suspensión.
  11. Añadir 200 μL de solución precipitante y vórtice a velocidad máxima durante 5 s. Incubar a 4 °C durante 5 min.
    NOTA: La incubación a 4 °C aumenta la eficiencia de la precipitación de proteínas y desechos celulares mientras el ADN permanece en solución. Es posible pausar el protocolo en este paso hasta 2 h sin una disminución significativa en el rendimiento y la calidad del ADN extraído.
  12. Centrifugar a 15.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente (RT). Evite el gránulo y transfiera el sobrenadante transparente a un tubo de microcentrífuga limpio de 2 mL.
  13. Añadir 600 μL de tampón de unión por cada 700 μL de sobrenadante y vórtice a velocidad máxima durante 5 s.
  14. Cargue 700 μL del lisado en una columna de centrifugación de sílice, incube durante 2 minutos y centrifugue a 15.000 x g durante 1 minuto.
    NOTA: La incubación de lisado en la columna de sílice mejora la unión del ADN a la columna, lo que resulta en un mejor rendimiento de ADN.
  15. Deseche el flujo y repita el paso 2.14 hasta que todo el lisado haya pasado a través de la columna de centrifugado.
  16. Coloque con cuidado la columna de centrifugado en un tubo de recolección limpio de 2 ml. Asegúrese de que no se salpique ningún flujo sobre la columna de centrifugado.
  17. Añada 500 μL de tampón de lavado a la columna de centrifugado y centrifuga la columna de centrifugado a 15.000 x g durante 1 min.
  18. Deseche el flujo y devuelva la columna de centrifugado al mismo tubo de recolección de 2 mL.
  19. Añada 500 μL de tampón de lavado de etanol a la columna de centrifugado. Centrifugar a 15.000 x g durante 1 min.
  20. Deseche el flujo y coloque la columna de centrifugado en un nuevo tubo de recolección de 2 ml.
  21. Centrifugar a 16.000 x g durante 2 min para eliminar el etanol residual. Coloque la columna de centrifugado en un nuevo tubo de 1,5 ml.
  22. Añadir 100 μL de tampón de elución (precalentado a 55 °C) en el centro de la membrana del filtro blanco e incubar durante 5 min.
    NOTA: El tampón de elución calentado, junto con la incubación en la membrana, aumenta la eficiencia de la elución del ADN, especialmente el ADN de alto peso molecular.
  23. Centrifugar a 15.000 x g durante 1 min. Deseche la columna de giro.
  24. Al ADN eluido, añadir 10 μL de NaCl 3 M (1/10 de volumen de ADN eluido) y 250 μL de etanol absoluto refrigerado (2,5 volumen de ADN eluido). Invertir para mezclar bien y girar el contenido a 8.000 x g durante 15 s.
  25. Incubar la mezcla de ADN y etanol a -20 °C durante al menos 1 h.
    NOTA: La incubación de la mezcla de ADN-etanol puede aumentarse a 16 h sin que disminuya significativamente el rendimiento o la calidad del ADN extraído.
  26. Centrifugar a 19.000 x g a 4 °C durante 30 min. Desechar el sobrenadante por decantación.
  27. Agregue 500 μL de etanol refrigerado al 70% al pellet.
  28. Centrifugar a 19.000 x g a 4 °C durante 15 min. Desechar el sobrenadante por decantación.
  29. Invierta y golpee suavemente el tubo sobre papel de seda para eliminar el etanol residual por capilaridad.
  30. Seque completamente el pellet de ADN manteniendo los tubos abiertos en un bloque calefactor durante 5-10 minutos a 37 °C hasta que todo el etanol se haya evaporado.
  31. Vuelva a suspender el pellet de ADN en 30-50 μL de agua bidestilada esterilizada en autoclave (ddH2O). Incubar a 37 °C durante 5-10 min.
  32. Centrifugar el ADN a 8.000 x g durante 15 s.
  33. Seleccione la aplicación dsDNA en la configuración de ácidos nucleicos en un espectrofotómetro Nanodrop.
    1. Limpie el pedestal con papel de seda sin pelusa y agua. Utilice ddH2O para blanquear el instrumento y, a continuación, cargue 2 μL de la muestra de ADN en el pedestal.
    2. Mida las relaciones de concentración y absorbancia (A260/280 y A260/230) para determinar la pureza.
  34. Almacene la muestra de ADN a -20 °C.

3. Precipitación de ADN lineal amplificado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para comprobar la recuperación de ADN en un rango de pesos moleculares

  1. Utilizando ADN genómico de E. coli MG155, amplifique fragmentos de genes mediante PCR para generar un conjunto de fragmentos lineales a partir de los siguientes genes: fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S rRNA, marR (consulte la Tabla 2 para conocer las secuencias de cebadores y las condiciones de PCR).
  2. Purifique los productos de PCR utilizando el kit de purificación de PCR y agrupe los productos de PCR juntos.
  3. Divida los amplicones agrupados en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con volúmenes iguales: etiquete un tubo como 'ADN de entrada'.
  4. Añadir PEG y NaCl según las condiciones deseadas (9%, 20%, 30% PEG-8000; 0,3 M, 1,2 M de NaCl) a cada uno de los tubos, excepto el etiquetado como "ADN de entrada", y completar el volumen final a 1 mL.
  5. Incubar los tubos durante la noche (~16-18 h) a 4 °C.
    NOTA: Para el resto de los pasos hasta la versión 3.16, el 'ADN de entrada' se mantiene sin cambios en la nevera.
  6. Centrifugar los tubos en una microcentrífuga de sobremesa según la velocidad deseada (15.000 x g o 20.000 x g) durante 1 h a 4 °C.
  7. Retire con cuidado 900 μL del sobrenadante del lado opuesto al pellet con una micropipeta.
  8. Primer lavado con etanol: Agregue 900 μL de etanol frío al 70% al pellet y mezcle invirtiendo suavemente los tubos.
  9. Girar los tubos a la misma velocidad que se utilizó en el paso 3.6 (15.000 x g o 20.000 x g) durante 30 min a 4 °C.
  10. Retirar el sobrenadante por decantación.
  11. Segundo lavado con etanol: Agregue 500 μL de etanol refrigerado al 70% al pellet.
  12. Haga girar los tubos a la misma velocidad que se utilizó en el paso 3.6 (15.000 x g o 20.000 x g) durante 30 minutos a 4 °C. Desechar el sobrenadante por decantación.
  13. Invierta y golpee suavemente el tubo sobre papel de seda para eliminar el etanol residual por capilaridad.
  14. Seque completamente el gránulo de ADN manteniendo los tubos abiertos en un bloque calefactor durante 5-10 minutos a 37 °C hasta que se evapore todo el etanol.
  15. Vuelva a suspender el pellet en 20 μL de agua bidestilada esterilizada en autoclave.
  16. Mida la concentración de ADN precipitado por las diferentes condiciones y el 'ADN de entrada' utilizando un espectrofotómetro o fluorómetro Nanodrop.
  17. Cargue el ADN precipitado en un gel de agarosa al 1% para la visualización del ADN.

  

Resultados

Establecimiento de un protocolo para la extracción de ADN de alto rendimiento a partir de muestras de aguas residuales
Se utilizó una versión modificada de los protocolos previamente establecidos para la extracción de ADN y ARN de alta calidad a partir de muestras de agua17. Las muestras se obtuvieron de desagües abiertos, así como de plantas de tratamiento de aguas residuales en la región de Delhi-NCR, en el norte de la India. Después del preprocesamiento con PEG y NaCl (Figura 1), las muestras se procesaron a través de kits para la extracción de ADN del suelo y del agua. En todos los casos, se observó una banda prominente de alto peso molecular probablemente correspondiente al ADN bacteriano intracelular y un frotis de fondo, como es típico de las muestras ambientales37 (Figura 2).

Falta de extracción eficiente de ADN de los efluentes de las plantas de tratamiento de aguas residuales (STP)
Aunque se obtuvo un rendimiento razonable de ADN total de drenajes abiertos e influentes STP (Tabla 3), no se pudo obtener ADN del efluente final tratado; los problemas de bajo rendimiento también se describen en trabajos anteriores41 (Figura 3). El postratamiento, que incluye la cloración de las aguas residuales y, en algunos casos, tanto los tratamientos UV como los de ultrafiltración42, se espera que la carga microbiana sea baja y que cualquier ADN residual (compuesto por ADN extracelular y fragmentado) se diluya. La baja concentración inicial de PEG utilizada en la concentración de la muestra y la precipitación de ácidos nucleicos podría excluir el ADN de bajo peso molecular. En otras palabras, el ADN fragmentado podría perderse en el paso inicial de concentración.

El aumento de las concentraciones de PEG y NaCl conduce a la precipitación de ADN de menor peso molecular
Para probar si el aumento de la concentración de PEG ayuda a enriquecer el ADN de menor peso molecular, se generó un estándar de laboratorio de fragmentos de PCR de diferentes longitudes, creando una gama de fragmentos de ADN lineales (Figura 4). El estándar se sometió a cuatro condiciones de precipitación diferentes: 9% de PEG-8000 + 0,3 M de NaCl (la combinación original), 9% de PEG-8000 + 1,2 M de NaCl (solo elevando sal), 30% de PEG-8000 + 0,3 M de NaCl (solo aumentando PEG) y 30% de PEG-8000 + 1,2 M de NaCl (aumentando tanto la sal como el PEG). Las condiciones se eligieron en función del protocolo estándar que se utiliza para la vigilancia del SARS-CoV-217 y de las condiciones informadas en un estudio de métodos modulares de extracción de ADN a partir de muestras ambientales33. Se utilizaron dos velocidades de centrifugación diferentes, 15.000 x g y 20.000 x g , en función de los efectos de las velocidades diferenciales en la granulación de ADN43. Al aumentar las concentraciones de PEG y NaCl a 30% y 1,2 M, respectivamente, la recuperación total de ADN aumentó en aproximadamente un 70%, y fragmentos de ADN tan pequeños como 150 pares de bases (pb) se precipitaron efectivamente (Figura 5). La diferencia de velocidad no tuvo mucho efecto en el rendimiento (Figura 6A) y puede deberse al largo tiempo de centrifugación utilizado. Dado que la recuperación total de ADN fue menor en la combinación original de PEG/NaCl, fue posible que las bandas de menor peso molecular, aunque presentes, estuvieran en una concentración por debajo del límite de visualización. Para probar esto, se aumentó la cantidad de ADN de entrada para la precipitación, y se cargó un exceso de ADN correspondiente a cada tratamiento (1,5 mg) en el gel de agarosa para su visualización. Solo el tratamiento con PEG al 30% mostró una buena recuperación del peso molecular más bajo, es decir, la banda de 150 pb (Figura 6B).

La precipitación de ADN circular (ADN genómico bacteriano y plásmido) no sigue la misma tendencia
E. coli Se utilizaron el ADN genómico y el plásmido MG155 (pRSV, ~4 kb) para la precipitación con diferentes concentraciones de PEG y NaCl. A diferencia del ADN lineal, no hubo un impacto significativo en el aumento de los niveles de PEG y NaCl (Figura 7), lo que sugiere que los rendimientos de ADN circular y de alto peso molecular (normalmente ADN intracelular) no se ven afectados por el aumento de PEG. Esto contrasta con observaciones anteriores con precipitación de proteínas44, donde la solubilidad disminuyó abruptamente con la concentración de PEG. Dado que el PEG actúa como un agente de aglomeración, se plantea la hipótesis de que el área de superficie de la macromolécula disponible para la interacción juega un papel importante en su efectividad como agente precipitante. Con el ADN lineal, a medida que aumenta el tamaño, es razonable plantear la hipótesis de que el área disponible para la interacción también aumenta. Con el ADN circular, es posible que las bajas concentraciones de PEG ya sean suficientes para saturar la molécula, y aumentar aún más la concentración puede no aumentar el área de superficie efectiva para la interacción.

Bajo rendimiento de ADN de las aguas residuales cuando se omite la precipitación de preprocesamiento con PEG y NaCl
Para probar si las aguas residuales de preprocesamiento son cruciales para la extracción de ADN, se enriquecieron 20 mL de aguas residuales inactivadas térmicamente (70 °C, 4 h) con 10 mg de patrón lineal previamente preparado y se incubaron durante la noche a 4 °C (a) sin PEG + NaCl, (b) con 9% de PEG + 0,3 M de NaCl (combinación original) y (c) con 20% de PEG + 1,2 M de NaCl (aumento de PEG y sal). A continuación, las muestras se procesaron a través del kit de suelo para la extracción de ADN, tal y como se explica en el protocolo. Se encontró que el rendimiento del ADN extraído aumenta en un 60 % en las muestras de aguas residuales preprocesadas con 9% de PEG + 0,3 M de NaCl en comparación con ninguna etapa de preprocesamiento (Figura 8), lo que indica que la precipitación de PEG y NaCl antes del procesamiento es vital para obtener ADN de alto rendimiento a partir de muestras de aguas residuales. También es digno de mención que, si bien el rendimiento general de ADN, incluido el ADN genómico de alto peso molecular (ADNg), es menor cuando se utilizan altos niveles de PEG y sal para la precipitación, la proporción de ADN de menor peso molecular se enriquece (Figura 8). La disminución en el rendimiento general al aumentar el PEG y la sal se puede atribuir a la naturaleza altamente viscosa del PEG, que puede conducir a la pérdida de gránulos de ADN al eliminar el sobrenadante. Esto refuerza el argumento a favor del método de extracción de ADN escalonado propuesto (Figura 9), en el que el ADN de alto peso molecular puede extraerse primero utilizando una precipitación baja de PEG y NaCl, y el sobrenadante resultante puede someterse a otra ronda de preprocesamiento con un aumento de PEG y NaCl para extraer de manera eficiente el ADN de bajo peso molecular que escapó de la primera ronda de precipitación.

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Figura 1: Preprocesamiento de muestras de aguas residuales. Esquema que muestra el flujo de trabajo desde la recolección de muestras hasta la extracción de ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Perfil de gel típico del ADN extraído de muestras de aguas residuales. Un volumen de 50-100 mL (como se indica en la figura) de aguas residuales muestreadas en diferentes sitios fue inactivado térmicamente por incubación a 70 °C durante 4 h. A continuación, se incubó con un 9% de PEG y 0,3 M de NaCl durante la noche a 4 °C y luego se procesó para extraer el ADN utilizando tierra o un kit de agua. Aproximadamente 150 ng del total de ADN extraído se cargaron en un gel de agarosa al 1% junto con una escalera de pares de bases de 1 kilo (kb) como marcador y se sometieron a electroforesis (90 V, 30 min). El ADN se visualizó bajo luz ultravioleta (UV) utilizando el colorante SYBR SAFE. La tabla de la derecha detalla las fuentes de recolección de muestras, el volumen de aguas residuales procesadas y el kit utilizado para la extracción de ADN para cada carril. (STP: Planta de Tratamiento de Aguas Residuales; UVR: Radiación Ultravioleta) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Las muestras de efluentes de STP muestran rendimientos totales de ADN deficientes. Un volumen de 40 mL de aguas residuales muestreadas del afluente y efluente de STP fue inactivado térmicamente por incubación a 70 °C durante 4 h. A continuación, se incubó con un 9% de PEG y 0,3 M de NaCl durante la noche a 4 °C y luego se procesó para extraer el ADN utilizando un kit de tierra o agua o un kit de extracción de ADN genómico bacteriano. Aproximadamente 150 ng del total de ADN extraído se cargaron en un gel de agarosa al 1% junto con una escalera de 1 kb como marcador y se sometieron a electroforesis (90 V, 30 min). El ADN se visualizó bajo luz ultravioleta (UV) utilizando el colorante SYBR SAFE. La concentración de ADN extraído para las muestras de efluentes estaba por debajo de 1 ng/mL de aguas residuales y, por lo tanto, no se pudo visualizar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Generación de un estándar lineal de tamaño de ADN para probar la eficacia de la precipitación de ADN de bajo peso molecular. Se generaron cinco fragmentos de ADN de diferentes tamaños mediante amplificación por PCR utilizando ADN genómico de E. coli (MG1655) como molde y cebadores y condiciones como se describe en la Tabla 2. El ADN purificado (~1 μg) con el kit de purificación por PCR se cargó en un gel de agarosa al 1% junto con una escalera de 1 kb como marcador y se sometió a electroforesis (90 V, 40 min). El ADN se visualizó bajo luz ultravioleta (UV) utilizando el colorante SYBR SAFE. Los carriles están marcados por los nombres de los genes a partir de los cuales se amplificó el fragmento y el tamaño esperado del amplicón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: El ADN de bajo peso molecular se recupera de manera eficiente solo a la concentración más alta (30%) de PEG. El ADN de entrada (3,34 μg) del estándar de tamaño generado anteriormente se trató con diferentes combinaciones de PEG y NaCl como se indica en la figura y se extrajo como se detalla en el protocolo. La velocidad de centrifugación utilizada fue de 15.000 x g. Para la entrada (carril 3) y 1,2 M de NaCl + 30% de PEG (carril 7), se cargaron 0,8 μg de ADN en el gel. Por lo demás, dado que el rendimiento total fue bajo, se cargó la cantidad total de ADN extraído en 16 μL y se cargó una escalera de 1 kb como marcador de tamaño en un gel de agarosa al 1% y se sometió a electroforesis (80 V, 45 min). El ADN se visualizó bajo luz ultravioleta (UV) utilizando el colorante SYBR SAFE. El recuadro blanco resalta la banda más baja de 150 pb. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: La recuperación de ADN de bajo peso molecular está determinada por altas concentraciones de PEG en lugar de altas concentraciones de sal. (A) El ADN de entrada (14 μg) del estándar de tamaño se trató con diferentes combinaciones de PEG y NaCl, como se indica en la figura, y se extrajo utilizando precipitación de etanol como se detalla en el protocolo. La velocidad de centrifugación utilizada fue de 15.000 x g y 20.000 x g, como se indica en la figura. La cantidad total de ADN de entrada y ADN extraído, junto con una escalera de 1 kb, se cargó en un gel de agarosa al 1% y se sometió a electroforesis (90 V, 30 min). El ADN se visualizó bajo luz ultravioleta (UV) utilizando el colorante SYBR SAFE. (B) El ADN de entrada (15,67 μg) del estándar de tamaño generado anteriormente se trató con diferentes combinaciones de PEG y NaCl, como se indica en la figura, y se extrajo según se detalla en el protocolo. La velocidad de centrifugación utilizada fue de 15.000 x g. El ADN extraído (1,5 μg) se cargó en cada carril y se cargó una escalera de 1 kb como marcador de tamaño en un gel de agarosa al 1% y se sometió a electroforesis (80 V, 45 min). El ADN se visualizó bajo luz ultravioleta (UV) utilizando el colorante SYBR SAFE. El recuadro blanco resalta la banda más baja de 150 pb. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: La recuperación de ADN genómico y ADN plasmídico no se ve afectada significativamente por el aumento de la concentración de PEG y NaCl. El ADN de entrada (9 μg; 4,5 μg de plásmido y 4,5 μg de ADN genómico) se trató con diferentes combinaciones de PEG y NaCl como se indica en la figura y se extrajo como se detalla en el protocolo. La velocidad de centrifugación utilizada fue de 15.000 x g. La cantidad total de ADN de entrada y ADN extraído, junto con una escalera de 1 kb, se cargó en un gel de agarosa al 1% y se sometió a electroforesis (90 V, 45 min). El ADN se visualizó bajo luz ultravioleta (UV) utilizando el colorante SYBR SAFE. Los recuadros blancos indican el ADN genómico y el ADN plasmídico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8: La precipitación previa al procesamiento con PEG y NaCl es crucial para la extracción de ADN de alto rendimiento de las aguas residuales. Las aguas residuales inactivadas térmicamente (70 °C, 4 h) (20 mL) se enriquecieron con 10 mg de patrón lineal previamente preparado y se incubaron durante la noche a 4 °C sin PEG y NaCl ni concentraciones variables de PEG y NaCl como se indica en la figura. Luego se procesó para extraer el ADN utilizando un kit de tierra. El ADN de entrada (4 μg) utilizado para el spigking (carril 1), y el ADN extraído (4 μg) con una etapa de preprocesamiento de 9% de PEG + 0,3 M de NaCl (carril 3) se cargaron en un gel de agarosa al 1%. Para el resto de las condiciones, toda la cantidad de ADN extraído se cargó en el gel ya que el rendimiento era bajo. También se cargó una escalera de 1 kb como marcador de tamaño. El gel se sometió a electroforesis (70 V, 2 h). El ADN se visualizó bajo luz ultravioleta (UV) utilizando el colorante SYBR SAFE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-9
Figura 9: Propuesta de método escalonado de extracción de ADN de aguas residuales para enriquecer ADN de alto y bajo peso molecular. Diagrama de flujo que representa un método de extracción de ADN de aguas residuales en dos pasos con un paso inicial de preprocesamiento utilizando una baja concentración de PEG y NaCl. El sobrenadante del primer paso se somete a otra ronda de precipitación de preprocesamiento con aumento de PEG y NaCl para extraer eficazmente el ADN de alto y bajo peso molecular de las aguas residuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Uso previo de PEG y NaCl en estudios para la extracción de ADN a partir de muestras ambientales. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2. Secuencias de cebadores y condiciones de PCR para la generación estándar. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3. Rendimiento y calidad del ADN obtenido de muestras de aguas residuales durante un periodo de dos meses en 2023. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

La resistencia a los antimicrobianos es una de las 10 principales amenazas para la salud en la actualidad, según la lista de la OMS, y la vigilancia ambiental de la resistencia a los antimicrobianos es reconocida como una herramienta importante en todo el mundo. Como se mencionó en la introducción, un registro completo de la resistencia a los antimicrobianos ambientales incluye ADN de bajo peso molecular, fragmentado y extracelular. El protocolo de preprocesamiento descrito aquí, que utiliza una alta concentración de PEG combinada con sal (30% de PEG y 1,2 M de NaCl), logra este resultado al enriquecer la proporción de ADN de bajo peso molecular sin afectar la extracción de fracciones de mayor peso molecular (principalmente ADN genómico y plasmídico). Esto contrasta con los métodos anteriores de concentración que utilizaban PEG más bajos y protocolos de kit directo (sin preprocesamiento), que son engorrosos debido a la necesidad de procesar grandes volúmenes. El preprocesamiento con concentraciones más bajas de PEG fue ineficiente en la recuperación de ADN de bajo peso molecular ('bajo' se refiere a bandas de ADN por debajo de 600 pb aquí). Cuando no se utiliza PEG durante el preprocesamiento, la extracción de ADN es deficiente, lo que da como resultado que solo se recupere el 10% del ADN de entrada en comparación con el 70% cuando se utilizan PEG y NaCl (Figura 8). Además de la adición de PEG y NaCl, otro paso importante es la eliminación del etanol residual después de la extracción de ADN del kit para obtener ADN puro para el procesamiento posterior. Es importante determinar el volumen inicial de agua necesario para obtener una cantidad total de al menos ~ 300 ng a 5 mg de ADN en un volumen de 30-50 mL después de la elución. En contraste con 1 L o más de agua que normalmente se procesa para la extracción de ADN de las aguas residuales27,41, se encontró que con el paso de preprocesamiento propuesto aquí, solo 27,5-40 mL son suficientes para obtener ADN de alta calidad para el procesamiento posterior. Las aguas residuales también contienen partículas y materia orgánica, que puede contener células bacterianas adsorbidas y ADN extracelular. Por lo tanto, la desorción de células y ADN acompañada de lisis celular es un paso importante para aumentar el rendimiento del ADN. Las altas concentraciones de PEG hacen que la muestra sea viscosa y pueden dificultar los pasos de lisis y desorción para la extracción de ADN, como se mencionó anteriormente. Para evitar esto, se ha propuesto un método escalonado de extracción de ADN, como se describe en el diagrama de flujo (Figura 9). Este método será útil para extraer tanto ADN intracelular de alto peso molecular (Figura 7) como ADN extracelular fragmentado y circular de bajo peso molecular.

Una limitación actual de este protocolo en términos de gastos es el procesamiento continuo de ADN enriquecido de bajo peso molecular a través de un kit para mejorar la calidad. Esta limitación puede eludirse utilizando otros métodos de limpieza del ADN, como la extracción de fenol-cloroformo. Otra limitación práctica es el manejo de altas concentraciones de PEG, ya que el pellet puede perderse debido a la alta viscosidad de la solución. En la actualidad, se lleva a cabo un preprocesamiento con PEG y NaCl, seguido de una versión modificada de un protocolo de kit existente, es decir, el kit se sigue utilizando para la purificación final del ADN. Se está optimizando una purificación de ADN sin kit, que proporciona un alto rendimiento de ADN pero de baja pureza (no se informa aquí), para mejorar la calidad del ADN extraído. Debido a la naturaleza viscosa de las soluciones de PEG, se debe aspirar a una concentración óptima de PEG que pueda producir una gama completa de tamaños de ADN y, sin embargo, se maneje cómodamente. Al reducir la concentración a 20% (Figura 6B) se logró un resultado intermedio a las eficiencias de extracción de PEG bajo (9%) y alto (30%); Tal vez valga la pena darle seguimiento a esto en trabajos futuros.

El PEG se utiliza de forma rutinaria durante los diferentes pasos de la extracción de ADN de muestras ambientales. Sin embargo, el uso de PEG no se ha estandarizado para la extracción de ADN en el contexto de la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos. La vigilancia de las aguas residuales implica la detección de resistencia a los antimicrobianos en diversos nichos, incluyendo los STP (afluentes y efluentes) y los desagües abiertos y cerrados 8,27. Si bien la información sobre la resistencia a los antimicrobianos en el afluente proporciona información crucial sobre la resistencia que circula en la comunidad, la presencia de genes de resistencia a los antimicrobianos en el efluente es igualmente importante para medir y potencialmente predecir la aparición de brotes de resistencia. Las muestras de efluentes suelen tener una carga microbiana baja, ya que la mayoría de las células mueren durante el proceso de tratamiento, lo que da como resultado un rendimiento muy bajo de ADN celular. Sin embargo, los efluentes contienen ADN extracelular que flota libremente y que comprende tanto ADN genómico de alto peso molecular como plásmidos de bajo peso molecular, fagemidos y ADN fragmentado. Los genes de AMR presentes en el ADN de bajo peso molecular (tanto fragmentado como plásmido/fagémido) pueden transferirse a las células vivas restantes en el efluente, lo que lleva a la diseminación de resistencia 30,41,45. Por lo tanto, es importante detectar ADN extracelular de bajo peso molecular en aguas residuales. Otros métodos empleados para la extracción de ADN de las aguas residuales durante la evaluación de la resistencia a los antimicrobianos no suelen garantizar el enriquecimiento inicial del ADN de bajo peso molecular. Este enfoque de extracción de ADN de aguas residuales se puede utilizar para proporcionar información sobre una resistencia integral del medio ambiente.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos el apoyo financiero de la Fundación Rockefeller (Subvención de la Fundación Rockefeller Número 2021 HTH 018) como parte del equipo de APSI India (Alianza para las Innovaciones en Vigilancia de Patógenos https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). También agradecemos la ayuda financiera proporcionada por Axis Bank para apoyar esta investigación y la Escuela de Biociencias Trivedi de la Universidad de Ashoka para equipos y otro tipo de apoyo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microcentrífuga de 24 asientosCentrífuga Eppendorf 5425 REP5406000046
etanol absoluto (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur Etanol absoluto para análisis)Supelco100983-0511
AgarosaInvitrogen16500500
Centrífuga refrigerada de sobremesaEppendorf Centrífuga 5920 REP5948000131
ChemiDoc Sistema de imagenBioRad12003153
DNeasy PowerSoil Pro KitQiagen47014
DNeasy PowerWater Pro KitQiagen14900-100-NF
dNTPs (dNTP Mix 10mM cada uno, 0.2 mL, R0191)Thermo FisherR0191
DreamTaq DNA Polymerase, 5 U/µ L + 10x Tampón DreamTaq*ThermofscientificEP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA LadderInvitrogen10488091
Maxiamp Tubos de PCR 0,2 mLTarsons510051
Agua de grado de biología molecular para PCRHiMediaML065-1.5ML
NanoDrop OneC Microvolumen Espectrofotómetro UV-VisThermo Scientific13400519
ParafilmBemisS37440
PEG-8000SRL54866
QIAquick PCR & Kit de limpieza de gelQiagen28506
Qubit 4 Fluorímetro (con WiFi)ThermofisherQ33238
Tubos de ensayo QubitThermofisherQ32856
Qubitt kit de reactivos para ds DNA, amplio rangoThermo ScientificQ32853 (500 ensayos)
Cloruro de sodioHiMediaTC046M-500G
SYBR Safe DNA Gel StainTermociclador BioRadS33102
T100BioRad1861096
Termociclador (Sistema de PCR ProFlex de 3 x 32 pocillos)Applied Biosystems4484073
Wizard Kit de purificación de ADN genómicoPromegaA1125

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