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Elucidando #946;-1,3-glucanasa y peroxidasa, propiedades fisicoquímicas del mecanismo de defensa de la pared celular del trigo contra la infestación por Diuraphis noxia

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DOI:

10.3791/66903

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26 de julio de 2024

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1Carbohydrates and Enzymology Laboratory (CHEM-LAB), Department of Plant Sciences, University of the Free State, 2Faculty of Natural and Agricultural Sciences, Department of Plant Science, Botany, Plant Biochemistry and Physiology, University of the Free State, 3Agricultural Research Council - Small Grain Institute

En este artículo

Resumen

El presente protocolo describe los procedimientos utilizados para estudiar y caracterizar las enzimas relacionadas con la pared celular, principalmente la β-1,3-glucanasa y la peroxidasa, en plantas de trigo. Sus niveles de actividad aumentan durante la interacción trigo-RWA y están involucrados en la respuesta de defensa de la planta a través del refuerzo de la pared celular, lo que disuade la alimentación de pulgones.

Resumen

Las plantas de trigo infestadas por pulgones rusos del trigo (RWA) inducen una cascada de respuestas de defensa, incluidas las respuestas de hipersensibilidad (HR) y la inducción de proteínas relacionadas con la patogénesis (PR), como la β-1,3-glucanasa y la peroxidasa (POD). Este estudio tiene como objetivo caracterizar las propiedades fisicoquímicas de la POD y la β-1,3-glucanasa asociadas a la pared celular y determinar su sinergia en la modificación de la pared celular durante la interacción RWASA2-trigo. Los cultivares Tugela susceptible, Tugela-Dn1 moderadamente resistente y Tugela-Dn5 resistente se pregerminaron y plantaron en condiciones de invernadero, se fertilizaron 14 días después de la siembra y se regaron cada 3 días. Las plantas se infestaron con 20 individuos partenogenéticos del mismo clon RWASA2 en la etapa de 3 hojas, y las hojas se cosecharon de 1 a 14 días después de la infestación. El fluido de lavado intercelular (IWF) se extrajo mediante filtración al vacío y se almacenó a -20 °C. Los residuos de las hojas se trituraron hasta convertirlos en polvo y se utilizaron para los componentes de la pared celular. La actividad y caracterización de POD se determinó utilizando sustrato de guayacol 5 mM yH2O2, monitoreando el cambio en la absorbancia a 470 nm. La actividad de la β-1,3-glucanasa, el pH y las condiciones óptimas de temperatura se demostraron midiendo los azúcares reductores totales en el hidrolizado con reactivo DNS utilizando sustratos de β-1,3-glucano y β-1,3-1,4-glucano, midiendo la absorbancia a 540 nm y utilizando la curva estándar de glucosa. El pH óptimo se determinó entre pH 4 a 9, la temperatura óptima entre 25 y 50 °C y la estabilidad térmica entre 30 °C y 70 °C. La especificidad del sustrato de β-1,3-glucanasa se determinó a 25 °C y 40 °C utilizando sustratos de curdlan y cebada β-1,3-1,4-glucano. Además, se determinó el modo de acción de la β-1,3-glucanasa utilizando laminaribiosa a laminaripentaosa. Los patrones de productos de hidrólisis de oligosacáridos se analizaron cualitativamente con cromatografía en capa fina (TLC) y cuantitativamente con HPLC. El método presentado en este estudio demuestra un enfoque robusto para infestar trigo con RWA, extrayendo peroxidasa y β-1,3-glucanasa de la región de la pared celular y su caracterización bioquímica integral.

Introducción

Los pulgones rusos del trigo (APR) infestan el trigo y la cebada, causando una pérdida significativa de rendimiento o una reducción de la calidad del grano. El trigo responde a la infestación induciendo varias respuestas de defensa, incluyendo el aumento de los niveles de actividad de la β-1,3-glucanasa y la peroxidasa en los cultivares resistentes, mientras que los cultivares susceptibles reducen la actividad de estas enzimas en el período de infestación temprano 1,2,3,4. Las funciones clave de la β-1,3-glucanasa y la POD en la planta de trigo incluyeron la regulación de la acumulación de calosa en el cultivar resistente y el enfriamiento de las especies reactivas de oxígeno (ROS) en la pared celular y las regiones apoplásticas durante la infestación por RWA 1,3,5,6,7. Mafa et al.6 demostraron que había una fuerte correlación entre el aumento de la actividad de POD y el aumento del contenido de lignina en el cultivar de trigo resistente tras las infestaciones de RWASA2. Además, el aumento del contenido de lignina indicó que la pared celular del cultivar de trigo resistente infestado se reforzó, lo que llevó a una reducción de la alimentación con RWA.

La mayoría de los grupos de investigación extrajeron y estudiaron la β-1,3-glucanasa apoplástica y la POD durante la interacción trigo/cebada-RWA; además, la mayoría de estos estudios afirmaron que estas enzimas influyen en la pared celular de la planta de trigo infestada con RWA sin medir la presencia de la enzima en la región de la pared celular. Solo unos pocos estudios han utilizado técnicas microscópicas para demostrar que los niveles de actividad de la β-1,3-glucanasa estaban relacionados con la regulación de la calosa 7,8,9 o han extraído los principales componentes de la pared celular para demostrar la correlación entre las actividades de POD y la modificación de la pared celular en los resistentes 6,10. La falta de sondeo de la asociación de la β-1,3-glucanasa y la POD con la pared celular indica la necesidad de desarrollar métodos que permitan a los investigadores medir directamente las enzimas unidas a la pared celular.

El método actual propone que es necesario eliminar el líquido apoplástico del tejido de la hoja antes de extraer las enzimas unidas a la pared celular. El procedimiento de extracción del líquido apoplástico debe realizarse dos veces del tejido de la hoja, que se utiliza para extraer las enzimas unidas a la pared celular. Este proceso reduce la contaminación y la confusión de las enzimas apoplásticas con las que se encuentran en las regiones de la pared celular. Por lo tanto, en este estudio, extrajimos POD unidos a la pared celular, β-1,3-glucanasa y β-glucanasa específicos de MLG y realizamos su caracterización bioquímica.

Protocolo

El estudio se realizó con la aprobación y permiso del Comité de Ética en Investigación en Medio Ambiente y Bioseguridad de la Universidad del Estado Libre (UFS-ESD2022/0131/22). Los detalles de los reactivos y el equipo aquí se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Condiciones de crecimiento de las plantas

  1. Germinar 250 semillas de cada cultivar de trigo, es decir, Tugela susceptible, Tugela-Dn1 moderadamente resistente y Tugela-Dn5 resistente, en placas de Petri separadas.
  2. Añadir 5 mL de agua destilada en cada placa de Petri, sellar con una película de parafina e incubar en la cámara de germinación a 25 °C durante 2 días.
  3. Trasplante las semillas germinadas de cada cultivar en macetas de 15 cm que contengan tierra 1:1 y turba (15 plantas por maceta) en condiciones controladas de invernadero.
  4. Ajuste los regímenes de temperatura a 18 °C y 24 °C durante la noche y el día, respectivamente.
  5. Riegue las plantas cada 3 días con agua del grifo y proporciónelas con 2 g / L de fertilizante 14 días después de la germinación.
  6. Coloque las plantas en jaulas encerradas en redes y déjelas crecer hasta la etapa de la tercera hoja 2,6 (con cuatro réplicas biológicas de cada cultivar).

2. Infestación de cultivares de trigo con RWASA2

  1. Infestar los cultivares de trigo Tugela, Tugela-Dn1 y Tugela-Dn5 con RWASA2 según Jimoh et al.11 y Mohase y Taiwe12.
  2. Mantenga las plantas en dos conjuntos separados en jaulas; infestar un conjunto con 20 individuos partenogenéticos del mismo clon RWASA2 por planta en cada maceta en las cámaras de crecimiento cubiertas con redes. Mantenga otro conjunto de plantas de trigo en una habitación separada debajo de la cámara de crecimiento con redes limpias y trátelas como controles.
    NOTA: Mantenga los dos tratamientos en habitaciones separadas y cubra las plantas en jaulas encerradas en redes. Además, en el caso de que se utilicen dos biotipos diferentes de RWA en un estudio, mantenga las plantas infestadas con un biotipo de RWA de las infestadas con el segundo biotipo en la medida de lo posible o en salas separadas bajo cámaras de crecimiento cubiertas con redes para evitar cualquier posible contaminación cruzada de RWASA2.
  3. Para la cosecha, seleccione la segunda y tercera hoja en dos regímenes de tiempo diferentes, período de alimentación a corto plazo (1, 2 y 3 días) y período de alimentación a largo plazo (7 y 14 días), y envuélvalas en toallas de papel húmedas.
  4. Transfiera inmediatamente las hojas cosechadas a una caja que contenga hielo para reducir el metabolismo de las hojas antes de la extracción con líquido de lavado intercelular (IWF).

3. Extracción del líquido de lavado intercelular (IWF) del apoplasto

  1. Corta las hojas cosechadas de unos tres cultivares de trigo en trozos de 7 cm.
  2. Enjuague los trozos de hoja dos veces en agua destilada para eliminar cualquier contaminación citosólica de los extremos cortados 6,13.
  3. Inserte los trozos de hoja en un tubo de vidrio de paredes gruesas y sumerja las muestras en un tampón de extracción (50 mM de Tris-HCl, pH 7,8).
  4. Aplique la infiltración al vacío durante 5 min con una bomba de chorro de agua para impregnar las hojas con el tampón de extracción.
  5. A continuación, retire los trozos de hoja del tubo de vidrio y séquelos con una toalla de papel.
  6. Inserte los trozos de hoja seca verticalmente en tubos de centrífuga preenfriados provistos de discos perforados y centrifugar a 500 x g durante 10 min a 4 °C.
  7. Utilice una pipeta de 100 μL para recoger el sobrenadante en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL preenfriados.
  8. Repita todo el procedimiento de extracción con el mismo material de hoja.
  9. Combine el sobrenadante recolectado y guárdelo a -20° C.
    NOTA: Las alícuotas sobrenadantes se tratan como la fuente del contenido de apoplasto o IWF. La IWF no se utilizó en el estudio actual, pero era importante eliminarla de los tejidos de las hojas antes de extraer la β-1,3-glucanasa y la peroxidasa (POD) unidas a la pared celular.

4. Extracción de la β-1,3-glucanasa y POD asociadas a la pared celular

NOTA: Los residuos de hojas que quedaron después de la extracción de IWF se utilizaron para extraer la proteína total de la pared celular.

  1. Triture los residuos de las hojas hasta convertirlos en un polvo fino con nitrógeno líquido utilizando un mortero.
  2. Transfiera aproximadamente 200 mg del tejido foliar en polvo a un mortero que contenga 4 mL de tampón de extracción (50 mM de fosfato de sodio con 1% (p/v) de polivinilpolipirrolidona (PVPP); pH 5.0) seguido de molienda con un mortero hasta obtener una pasta suave, que luego se transfiere a tubos de microcentrífuga.
  3. Incubar la mezcla en los tubos de la microcentrífuga durante 3 min sobre hielo y luego centrifugar a 10.000 x g durante 15 min a 4 °C.
  4. Recoger el sobrenadante (extractos de proteínas totales) en tubos de microcentrífuga (alícuotas de 2 mL) y utilizarlo como fuente de β-1,3-glucanasa y POD durante todo el estudio.

5. Determinación del patrón proteico

  1. Determinar la concentración total de proteínas de los extractos siguiendo el método de Bradford14.
  2. Prepare las soluciones de albúmina sérica bovina (BSA) en las concentraciones de 0,0 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL y 1,0 mg/mL disueltas en tampón de fosfato de sodio de 50 mM para generar el patrón de proteína.
  3. Prepare el estándar añadiendo 10 μL de cada solución de BSA en la microplaca de 96 pocillos con 190 μL (0,25% v/v) de reactivo Bradford (consulte la Tabla de materiales).
  4. Incubar a 25 °C durante 20 min y medir la absorbancia a 595 nm utilizando el lector de microplacas y utilizar los valores de absorbancia para preparar la curva estándar para cuantificar la concentración de proteínas.
  5. Cuantificar la concentración de proteínas
    1. Añada 10 μL de la enzima extraída (paso 4) en una microplaca de 96 pocillos con 190 μL (0,25% v/v) de reactivo Bradford por triplicado.
    2. Incubar a temperatura ambiente (25 °C) durante 20 min.
    3. Mida la absorbancia a 595 nm utilizando el espectrofotómetro con un lector de microplacas y utilice los valores de absorbancia para determinar la concentración de proteínas utilizando BSA como patrón de proteínas (preparado en el paso 5.4).

6. Preparar el estándar de glucosa para la actividad de la β-1,3-glucanasa

  1. Prepare las soluciones patrón con concentraciones entre 0,00 mg/mL y 1,0 mg/mL (0,0 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL, 1,0 mg/mL) con glucosa disuelta en agua destilada.
  2. Añadir 300 μL de cada solución de glucosa y 600 μL de reactivo de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) en una proporción de 1:2 en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e incubar las reacciones a 100 °C durante 5 min (ver Tabla de materiales para reactivos DNS) (Miller et al.15).
  3. Deje que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente antes de medir la absorbancia a 540 nm con el espectrofotómetro.
  4. Utilice los valores medios de absorbancia para desarrollar la curva estándar para determinar la actividad de la enzima β-1,3-glucanasa.

7. Determinación de la actividad de la β-1,3-glucanasa

NOTA: La actividad enzimática de la β-1,3-glucanasa unida a la pared celular extraída de Tugela, Tugela-Dn1 y Tugela-Dn5 se determinó por la cantidad de azúcares reductores totales liberados de la hidrólisis de sustratos de β-1,3-4-glucano (MLG) y β-1,3-glucano (MLG) mixtos al 0,5% (p/v) utilizando un método modificado según lo descrito por Miller et al.15. Mantenga siempre los tubos con alícuotas de proteínas en el hielo. Si las muestras estaban congeladas, descongélelas en hielo y proceda inmediatamente después de descongelarlas.

  1. Añadir 200 μL del extracto enzimático (mantener la concentración de proteína entre 20 μg/mL y 90 μg/mL en todas las reacciones, a menos que se indique lo contrario) y 300 μL del sustrato disuelto en 50 mM de tampón de citrato de sodio (pH 5,0) en los tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
    NOTA: Ejecute una reacción paralela en blanco sin el extracto enzimático para todos los sustratos (primer blanco), y el blanco enzimático consiste en extracto enzimático sin sustrato (segundo blanco). Tanto el sustrato como el extracto enzimático se reemplazaron con el tampón en el primer y segundo negro, respectivamente.
  2. Incubar las reacciones a 37 °C durante 24 h y finalizar la reacción calentándola a 100 °C durante 5 min, luego centrifugar a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C.
  3. Mezclar 300 μL del sobrenadante con 600 μL de reactivo DNS (proporción 1:2) en nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y hervir a 100 °C durante 5 min.
  4. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente y mida la absorbancia a 540 nm con el espectrofotómetro.
    NOTA: Si la concentración de azúcares reductores totales es alta en la mezcla, dará como resultado una solución de color marrón oscuro, que es difícil de leer con el espectrofotómetro. Por lo tanto, es necesaria una mayor dilución de las muestras antes de leer la absorbancia.
  5. Utilice la curva estándar de glucosa desarrollada en el paso 6.4 anterior para determinar la actividad enzimática en las unidades SI de la curva estándar.
  6. Para convertir la actividad en una actividad específica que se expresa en μmol de glucosa/h/mg de proteína, utilice la siguiente ecuación:
    Actividad específica = [(actividad enzimática/180.16)*1000]/tiempo/concentración de proteína
    NOTA: Convierta la actividad enzimática en mg/mL a g/mL; 180,16 g/mol es el peso molecular de la glucosa, 1000 es un factor que convierte M en micromoles, el tiempo es el período de reacción y la concentración de extracto de proteínas se representa en mg/mL. Una unidad de actividad de β-1,3-glucanasa se define como 1 μmol de glucosa liberada del sustrato en un período de reacción de 1 h.

8. Determinación de la actividad de la peroxidasa (POD)

NOTA: La actividad de la peroxidasa unida a la pared celular de los cultivares de trigo Tugela, Tugela-Dn1 y Tugela-Dn5 se determinó cuantificando la formación del tetra-guayacol producido por unidad de tiempo a partir de guaiacol16.

  1. Añadir 30 μL del extracto enzimático, 30 μL 1% (v/v) H2O2 y 970 μL de 5 mM de guayacol en las cubetas a 25 °C.
    NOTA: Realice la reacción en blanco sin el extracto enzimático (primer blanco), y otro blanco para muestras de enzimas sin sustrato (segundo blanco). Las muestras de enzima o sustrato se reemplazaron por 50 mM de tampón de fosfato de sodio en el primer y segundo blanco, respectivamente.
  2. Utilice el modo cinético del espectrofotómetro para controlar el cambio en la absorbancia a 470 nm.
  3. Determine la pendiente en la que el gráfico era lineal y utilícela como valor de absorbancia.
  4. Calcule la absorbancia media y utilícela para calcular la actividad del POD.
  5. Calcular la actividad de la peroxidasa utilizando el coeficiente de extinción molar del guayacol (26,6 mM-1 cm-1) y expresar la actividad en μmol de tetra-guayacol/min/mg de proteína.
  6. Calcule la actividad de POD utilizando la ecuación utilizada por Mafa et al.6:
    ACTIVIDAD DEL POD = [(ΔABS × DF) ÷ concentración de proteína] × 26,6 mM-1 cm-1 × 1 cm
    NOTA: Donde ΔABS = absorbancia media; DF = Factor de dilución; 26.6 mM-1 cm-1 = Coeficiente de extinción de Guaiacol.

9. Caracterización de POD

NOTA: Los ensayos de caracterización de POD se llevaron a cabo utilizando extractos enzimáticos de Tugela, Tugela-Dn1 y Tugela-Dn5 después de 3 días después de la infestación siguiendo métodos similares a los descritos en el paso 8, con cambios menores en los tampones de reacción y las temperaturas. Las muestras de enzimas siempre se mantuvieron en hielo mientras se realizaban los experimentos. Ejecute las reacciones en cuadruplicados con una reacción en blanco paralela.

  1. Para obtener ensayos de pH óptimo, realice los siguientes pasos.
    1. Disuelva el sustrato de guayacol en tampones de 50 mM (citrato de sodio, pH 4 y 5), fosfato de sodio (pH 6 y 7) y Tris-HCl (pH 8 y 9) (ver Tabla de Materiales).
    2. Ejecute las reacciones a 25 °C como se describe en el paso 8.
  2. Para realizar ensayos de temperatura óptima, realice los siguientes pasos.
    1. Ejecute las reacciones a 25 °C, 30 °C, 40 °C y 50 °C, respectivamente.
    2. Utilice el sustrato de guaiacol disuelto en el tampón pH 5 (pH óptimo) y ejecute las reacciones como se describe en el paso 8.
  3. Para los ensayos de termoestabilidad, realice los siguientes pasos.
    1. Antes de iniciar las reacciones, incubar la enzima a 37 °C, 50 °C y 70 °C durante 30 min.
    2. Ejecute las reacciones de acuerdo con los métodos descritos en el paso 8 utilizando 50 mM de tampón de citrato de sodio (pH 5) y a 40 °C (temperatura óptima).

10. Caracterización de la β-1,3-glucanasa

NOTA: Realice los ensayos de caracterización siguiendo el método descrito en el paso 7 utilizando extractos enzimáticos de 3 dpi, con algunas modificaciones en los tampones de reacción y las temperaturas. Ejecute las reacciones en cuadruplicados, con una reacción en blanco paralela para cada sustrato.

  1. Para obtener ensayos de pH óptimo, proceda de la siguiente manera:
    1. Disuelva los sustratos de MLG y β-1,3-glucano en tampones de 50 mM (citrato de sodio, pH 4 y 5), fosfato de sodio (pH 6 y 7) y Tris-HCl (pH 8 y 9).
    2. Ejecute la reacción como se describe en el paso 7.
  2. Para los ensayos de temperatura óptima, proceda de la siguiente manera:
    1. Ejecute las reacciones a 25 °C, 30 °C, 40 °C y 50 °C, respectivamente.
    2. Utilice sustratos de MLG y β-1,3-glucano disueltos en el tampón de citrato de sodio de 50 mM (pH 5) con un pH óptimo (obtenido en el paso 10.1) y ejecute las reacciones como se describe en el paso 7.
  3. Para los ensayos de termoestabilidad, proceda de la siguiente manera:
    1. Antes de iniciar las reacciones, incubar la enzima a 37 °C, 50 °C y 70 °C durante 30 min.
    2. Ejecutar las reacciones utilizando sustratos disueltos en 50 mM de tampón de citrato sódico (pH 5) e incubar a 25 °C y 40 °C durante 24 h.

11. Evaluación del mecanismo de acción de la β-1,3-glucanasa en diferentes sustratos de glucano

NOTA: Los sustratos de glucano contienen el mismo residuo de glucosa en su columna vertebral, pero los enlaces glucosídicos entre las unidades de glucopiranosa son diversos y pueden tomar la orientación α o β17. Los enlaces glucosídicos pueden formarse entre varios átomos de carbono de moléculas de glucosa, definiendo su estructura química, por ejemplo, β-1,3-glucano, β-1,4-glucano y β-1,3-1,4-glucano (MLG)18,19,20. El mecanismo de acción de la β-1,3-glucanasa se determinó utilizando muestras de Tugela, Tugela-Dn1 y Tugela-Dn 5 infestados por RWASA2 (fuentes enzimáticas) y los siguientes sustratos: β-1,3-glucano (CM-curdlan), MLG (de cebada) y β-1,4-glucano (AZO-CM-celulosa). El mecanismo de acción se determina en condiciones óptimas de ensayo (25 °C y 40 °C, pH 5,0), utilizando sustratos de β-1,4-glucano al 0,1% (p/v), β-1,3-glucano al 0,4% (p/v) o MLG al 0,5% (p/v).

  1. Disolver los sustratos en 50 mM de tampón de citrato de sodio (pH 5).
  2. Añada 200 μL del extracto enzimático y 300 μL del sustrato en los tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
  3. Incubar las reacciones a dos temperaturas distintas, 25 °C y 40 °C durante 8 h.
  4. Terminación de las reacciones por calentamiento a 100 °C.
  5. Centrifugar la mezcla de reacción de β-1,3-glucano y MLG a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C y proceder como se describe en el paso 7.3.
  6. Para β-1,4-glucano, después de terminar la reacción a 100 °C, diluir la mezcla con 800 μL de etanol absoluto y centrifugar a 4 °C durante 10 min a 10.000 x g.
  7. Transfiera el sobrenadante a las curvas, mida la absorbancia a 590 nm con el espectrofotómetro y calcule la actividad de la β-1,3-glucanasa en el β-1,4-glucano utilizando el procedimiento del fabricante (consulte la tabla de materiales) y exprese la actividad en unidades/mg de proteína.

12. Determinación del modo de acción de la β-1,3-glucanasa

NOTA: El modo de acción de la β-1,3-glucanasa inducido por Tugela, Tugela-Dn1 y Tugela-Dn5 infestado por RWASA2 con laminarina-oligosacáridos (LAM) con un grado de polimerización (DP) entre 5 y 2. Utilice el kit de cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) y peroxidasa de glucosa oxidasa (GOPOD) para determinar la DP necesaria para que la β-1,3-glucanasa hidrolice el sustrato. Para el análisis cualitativo se utilizó el TLC y para el análisis cuantitativo se utilizó el LC-MS, que determinó la concentración de los oligosacáridos en el hidrolizado después de la reacción21.

  1. Preparar las reacciones del modo de acción de la β-1,3-glucanasa
    NOTA: Prepare el extracto de proteína concentrada con un filtro de membrana concentradora centrífuga de 10 kDa y, por lo tanto, tenga extractos de proteína infestados de RWASA2 concentrados y no concentrados para el experimento.
    1. Para concentrar las enzimas extraídas de cada cultivar, transfiera 5 mL de los extractos a los filtros de membrana concentradores centrífugos de 10 kDa.
    2. Centrifugar los tubos del filtro de membrana que contienen el extracto a 15.000 x g durante 30 min a 4 °C.
    3. Disuelva la laminaripentaosa (LAM5), la laminaritetraosa (LAM4), la laminaritriosa (LAM3) y la laminaribiosa (LAM2) (consulte la tabla de materiales) en 50 mM de citrato de sodio (pH 5) para obtener 10 mg/mL.
    4. Para iniciar la reacción, agregue 20 μL del extracto de proteína y 40 μL de Laminaripentaosa (LAM5), Laminaritetraosa (LAM4), Laminaritriosa (LAM3) y Laminaribiosa (LAM2).
    5. Incubar la reacción a 40 °C durante 16 h y terminar hirviendo a 100 °C durante 5 min.
  2. Realizar cromatografía en capa fina (TLC)
    1. Corta 4 placas de sílice entrozos de 10 cm y 2 y dibuja una línea a través de la superficie de la placa, dejando un espacio de 1 cm desde la parte inferior de un borde.
    2. Marque los puntos sobre la línea y márquelos de acuerdo con los diferentes cultivares y DP de los Oligosacáridos de laminarina, a 1 cm de distancia y. Tome 2 placas de sílice para el extracto de proteína concentrada y las otras 2 para extractos no concentrados.
    3. Agregue 3 μL de las mezclas de reacción de 3 a 5 veces sobre los puntos marcados correspondientes en la placa de sílice y deje que los puntos de la placa se sequen completamente antes de repetir el proceso.
    4. Coloque suavemente las placas de sílice en el tanque TLC que contiene la fase móvil de n-butanol: ácido acético: agua (2:1:1 v/v/v) con el lado que contiene las manchas de las muestras en el fondo.
    5. Permita que la fase móvil se mueva de la parte inferior a la parte superior de la placa.
      NOTA: Este paso puede tardar aproximadamente 2 h. No mueva ni moleste el tanque mientras las muestras se están separando.
    6. Retire las placas de la fase móvil y déjelas secar a temperatura ambiente.
    7. Agregue la solución de tinción en el recipiente pequeño, sumerja suavemente la placa de sílice en la solución de tinción de naftol al 0,3% (p/v) en etanol al 95% (v/v) usando ácido sulfúrico al 5% (v/v) durante 5 s, retírela y luego déjela secar a temperatura ambiente.
      NOTA: En este paso, encienda el bloque calefactor/horno y ajuste la temperatura a 100 °C.
    8. Coloque las placas de sílice seca en el bloque calefactor y caliente a 100 °C durante 7-10 minutos o hasta que aparezcan las manchas azul-violetas. Tome fotos de las placas de sílice que muestran las manchas azul-violetas y documéntelas.
  3. Cuantificar la concentración de hidrolizados de laminarina-oligosacáridos
    NOTA: La concentración de los hidrolizados de LAM se cuantificará tanto para los extractos de proteínas concentrados como para los no concentrados21.
    1. Añada 20 μL de cada muestra en una columna C18 (Hidratos de carbono 4,6 × 250 mm) y deje separar a un caudal de 500 μL/min utilizando un gradiente de agua (disolvente A) y acetonitrilo (Disolvente B) de 100% B a 60% B durante 10 minutos, seguido de pasos de reequilibrio de la columna con un tiempo total de ejecución de 20 min para permitir el reequilibrio de la columna.
    2. Ionizar los analitos eluyentes en modo de electrospray negativo en la fuente de iones de espectrometría de masas con una temperatura de calentamiento de 400 °C para evaporar el exceso de solvente, gas de nebulizador de 30 psi, gas de calentador de 30 psi y gas de cortina de 20 psi.
    3. Ajuste el potencial de desagrupación a 350 V.
    4. Analice los analitos eluyentes en el espectrómetro de masas en un modo de escaneo Q1 que oscila entre 150 Da y 1000 Da con un tiempo de permanencia de 3 s.
    5. Registre las concentraciones de los analitos en la hoja de cálculo.
  4. Cuantificar la concentración de glucosa
    1. Analice la concentración de glucosa producida por hidrólisis de laminarina utilizando el reactivo GOPOD siguiendo las instrucciones del fabricante22,23.
    2. Mida la absorbancia a 510 nm en un modo fijo del espectrofotómetro.

13. Recopilación y análisis de datos

  1. Aleatorice todos los experimentos para evitar sesgos durante la infestación o la recolección de muestras y realice el análisis por cuadruplicados.
  2. A menos que se indique lo contrario, utilice la media ± la desviación estándar para representar los valores en los gráficos y tablas generados a partir de los datos experimentales recopilados.
  3. Utilice Microsoft Excel para analizar todos los datos y generar gráficos.
  4. Realizar análisis estadísticos con software compatible.
    NOTA: Realice un análisis multifactorial de la varianza (ANOVA) para probar la significación entre los tratamientos y el LSD de Fisher para probar grupos homogéneos con un valor alfa de 0,05.

Resultados

Cuatro réplicas biológicas de cultivares de trigo (Tugela, Tugela-Dn1 y Tugela-Dn5) fueron infestadas con RWASA2 en la etapa de crecimiento de 3 hojas. Después de la infestación, las hojas se cosecharon a 1, 2, 3, 7 y 14 ppp. Los tratamientos de control no estaban infestados con RWASA2 para que los resultados del experimento fueran comparables a los de las plantas de trigo no expuestas al estrés. Los experimentos se realizaron por cuadruplicados y los resultados se presentaron como valores medios.

Las concentraciones de proteínas de los extractos infestados por RWASA2 y de los extractos de control se cuantificaron utilizando BSA como patrón de proteína. Esto fue útil para determinar la actividad enzimática de la β-1,3-glucanasa y la POD y para garantizar que las concentraciones de proteínas utilizadas en cada reacción se conocieran para cada muestra; Las diferencias eran insignificantes. Los datos se pueden presentar en formato gráfico o tabla. El primer formato de gráfico se utilizó para expresar las actividades específicas de la enzima (eje y) trazadas en función de los días posteriores a la infestación (eje x) tanto para la actividad enzimática como para los resultados del ensayo de caracterización. El aumento de la actividad específica de la β-1,3-glucanasa, la β-glucanasa específica de MLG y la POD en muestras resistentes de Tugela-Dn5 infestadas con RWASA2 mostró que las enzimas desempeñaron un papel en la respuesta de defensa (Figura 1 y Figura 2). Además, ambas enzimas perdieron significativamente su actividad con el tiempo en la susceptible Tugela infestada con RWASA2.

La caracterización bioquímica de la β-1,3-glucanasa y POD asociadas a la pared celular se determinó expresando la actividad en porcentajes de actividad relativa o actividad enzimática específica, los cuales fueron representados por gráficos de líneas y barras, respectivamente (Figura 3). Los resultados mostraron que tanto la β-1,3-glucanasa como la POD tenían condiciones óptimas de pH similar (pH 5) correspondientes a las condiciones ácidas de la pared celular (Figura 3). Es importante señalar que la β-glucanasa específica de MLG también mostró una actividad específica a pH 5. Sin embargo, fue más estable en condiciones básicas que la β-1,3-glucanasa, que perdió hasta un 80% de actividad relativa en la misma condición. Los resultados confirmaron que dos enzimas que catalizaron los sustratos MLG y β-1,3-glucano se extrajeron con éxito de la región de la pared celular en función del pH óptimo. Esta afirmación fue validada por los resultados del ensayo de termoestabilidad (Figura 4), que confirmaron que la β-1,3-glucanasa solo podía tolerar temperaturas de hasta 50 °C y perdía más del 80% de actividad relativa a 70 °C (POD tenía los mismos perfiles). Por el contrario, la enzima β-glucanasa específica de MLG mostró la mayor actividad a 25 °C, seguida de una actividad gradualmente disminuida, pero esta enzima retuvo más del 50% de actividad relativa a 50 °C y 70 °C. Las observaciones confirmaron que la β-glucanasa específica de MLG mostraba propiedades bioquímicas únicas en comparación con la β-1,3-glucanasa y la POD extraídas de Tugela, Tugela-Dn1 y Tugela-Dn5.

El modo de acción de la β-1,3-glucanasa se demostró con laminarina-oligosacáridos con una DP entre 5 y 2 (denominados LAM5 a LAM2). Los resultados de TLC mostraron que Tugela, Tugela-Dn1 y Tugela-Dn5 infestados tenían una enzima β-1,3-glucanasa que hidrolizaba principalmente oligosacáridos más largos (LAM5 y LAM4) en comparación con los más cortos (LAM3). La intensidad de las manchas azul-violetas visualizadas en la placa TLC mostró que LAM5 y LAM4 tuvieron bandas menos intensas, seguidas de LAM3 en los cultivares resistentes y moderadamente resistentes (Figura 5). El cultivar Tugela susceptible mostró que la β-1,3-glucanasa hidrolizó el LAM5 mejor que otros oligosacáridos (LAM4-LAM2), que mostraron bandas de mayor intensidad. El modo de acción también se expresa como las concentraciones de los hidrolizados, presentadas en una tabla con un mapa de calor que muestra la hidrólisis eficiente de los oligosacáridos de Laminarin con mayor DP y moderada actividad durante la hidrólisis de oligosacáridos más cortos (LAM3 y LAM2) (Tabla 1).

figure-results-1
Figura 1: La actividad específica de la peroxidasa extraída de Tugela (A), Tugela-Dn1 (B) y Tugela-Dn5 (C) infestados con RWASA2 14 días después de la infestación. Los experimentos se realizaron por cuadruplicados; los valores y las barras de error representan medias ± SD, respectivamente. U en U/mg de proteína representa μmol tetra-guayacol/min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: La actividad específica de la β-1,3-glucanasa medida en los cultivares Tugela, Tugela-Dn1 y Tugela-Dn5 infestados con RWASA2. La actividad enzimática se llevó a cabo utilizando dos sustratos de glucano químicamente distintos, es decir, β-1,3-1,4-glucano (A-C) y curdlan (D-F) unidos a una mezcla. Los experimentos se realizaron por cuadruplicados; los valores y las barras de error representan medias ± SD, respectivamente. U en U/mg de proteína representa μmol/h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Los ensayos de pH óptimo de la enzima β-1,3-glucanasa extraída de Tugela, Tugela-Dn1 y Tugela-Dn5 infestados con RWASA2 a los 3 días después de la infestación. Los experimentos se llevaron a cabo utilizando sustratos de ligamiento mixto-β-1,3-1,4-glucano (A-C) y curdlan (D-F). Los experimentos se realizaron por cuadruplicados; los valores y las barras de error representan medias ± SD, respectivamente. U en U/mg de proteína representa μmol/h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Ensayo de termoestabilidad. Los ensayos de termoestabilidad de la β-1,3-glucanasa procedente de Tugela, Tugela-Dn1 y Tugela-Dn5 infestados con RWASA2 3 días después de la infestación, investigados sobre β-1,3-1,4-glucano (A-C) y β-1,3-glucano (D-F). Los experimentos se realizaron por cuadruplicados; los valores y las barras de error representan medias ± SD, respectivamente. U en U/mg de proteína representa μmol/h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-5
Figura 5: Análisis del modo de acción de la β-1,3-glucanasa sobre los oligosacáridos laminarinos. Los oligosacáridos de laminarina estuvieron representados por L5, L4, L3 y L2, que fueron equivalentes a Laminaripentaosa (LAM5), Laminaritetraosa (LAM4), Laminaritriosa (LAM3) y Laminaribiosa (LAM2), respectivamente. La flecha roja muestra la glucosa (GLU), y la flecha azul muestra los perfiles de la enzima sin los oligosacáridos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Oligosacáridos laminarinas producidos con β-1,3-glucanasa concentrada extraída de cultivares de trigo infestados con RWASA2 durante 3 días. Las concentraciones de los oligosacáridos en el hidrolizado se determinaron con LC-MS. LAM5, LAM4, LAM3, LAM2 y GLU representan laminaripentaosa, laminaritetraosa, laminaritriosa, laminaribiosa y glucosa, respectivamente. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

El trigo y la cebada son cultivos de cereales frecuentemente infestados por especies de pulgones, incluyendo el pulgón ruso del trigo (Diuraphis noxia)7,24. Las plantas de trigo resistentes inducen la regulación positiva de las actividades de POD y β-1,3-glucanasa como respuestas de defensa durante todo el período de infestación para modificar la pared celular mediante la regulación de la acumulación de calosa y lignina 6,25,26,27. Es importante señalar que la mayoría de los estudios extrajeron las enzimas POD y β-1,3-glucanasa del apoplasto 3,12,28, lo que hace que sus funciones de pared celular sean altamente especulativas. El estudio actual desarrolló un método que extrajo la β-1,3-glucanasa unida a la pared celular, la β-glucanasa específica de MLG y POD como parte de la proteína total. Estas enzimas fueron altamente activas en los cultivares de trigo resistentes en comparación con el testigo, mientras que su actividad se retrasó en los cultivares susceptibles. El uso de los controles en los experimentos ayudó a comprender los efectos de la infestación en los niveles de actividad de las enzimas unidas a la pared. El muestreo de los tejidos de la tercera y segunda hoja para muestras infestadas o de control es importante porque aporta consistencia. Además, muestree los infestados y el control con el mismo período porque la POD, la β-1,3-glucanasa y la actividad de la β-glucanasa específica de MLG aumentan el crecimiento de las plántulas de trigo.

El sustrato de curdlan utilizado en este estudio tiene una estructura química similar a la de la callosa, un polímero depositado en la región de la pared celular durante la interacción trigo-RWA 7,24. El sustrato MLG de cebada representa la parte de la pared celular hemicelulosa presente en baja proporción en comparación con el xilano en la mayoría de las monocotiledóneas. Los sustratos se disolvieron en tampón de citrato de sodio pH 5 para imitar la condición ácida de la región29 de la pared celular de la planta. Si la β-1,3-glucanasa y la β-glucanasa específica de MLG se eliminaran con la IWF, la proteína total extraída del tejido foliar restante no tendría actividad en los sustratos de MLG y curdlan. Además, si los extractos de proteínas se obtuvieran de la región citoplasmática, mostrarían actividad en el rango de pH neutro. Curiosamente, ambas enzimas estaban presentes en el extracto de proteína total porque hidrolizaron con éxito los sustratos de MLG y curdlan. La hidrólisis del MLG y del curdlan por las respectivas enzimas produjo los azúcares reductores, los cuales fueron detectados por el reactivo DNS siguiendo un método modificado por Mafa et al.6. Cuando las muestras tienen una mayor concentración total de azúcares reductores, el color del reactivo DNS cambia de amarillo a marrón oscuro o el color cambia de amarillo a marrón claro (se ve naranja oscuro) cuando la concentración de azúcares reductores es baja.

Se utilizó sustrato de guaiacol para medir la actividad de POD. Debido a la alta eficiencia catalítica de POD, medimos su actividad utilizando el modo cinético del espectrofotómetro. El POD se activa por la baja concentración deH2O2 en presencia del sustrato (Guaiacol). La actividad de esta enzima convierte el guayacol en forma de tetra-guayacol, que es un compuesto de color marrón anaranjado. La producción del tetra-guayacol confirma que el POD entrecruza los compuestos fenólicos para producir oligómeros o incorpora compuestos fenólicos en la lignina. POD mostró niveles de actividad más altos en el Tugela-Dn5 resistente infestado con RWASA2, seguido por el Tugela-Dn1 moderadamente resistente en comparación con los controles. Sin embargo, los niveles de actividad de POD se redujeron significativamente con el tiempo en el Tugela susceptible infestado. Los hallazgos de este estudio fueron respaldados por la afirmación de que los cultivares de trigo resistente infestados con RWASA2 utilizan POD para fortalecer su pared celular mediante la reticulación de las conexiones lignina o lignina-hemicelulosa6. POD requería H2O2 para funcionar, lo que indica que redujo la oxidación o blanqueo de los carbohidratos estructurales de la pared celular al regular los niveles de H2O2 en la región de la pared celular.

Se utilizaron diferentes condiciones de pH y temperatura para determinar las condiciones bioquímicas óptimas para estas enzimas unidas a la pared celular. Las condiciones óptimas mostraron que las enzimas tienen actividades óptimas en rangos de pH ácido (pH 5), lo que sugiere que estaban asociadas con la región de la pared celular. La temperatura óptima para la β-1,3-glucanasa se obtuvo a 25 °C y 40 °C al hidrolizar sustratos de β-1,3-1,4-glucano y β-1,3-glucano, respectivamente. Esta observación confirmó que las β-1,3-glucanasas y la β-glucanasa específica de MLG eran dos enzimas diferentes inducidas en la región de la pared celular de cultivares de trigo resistentes durante la infestación de RWASA2. A pesar de que la caracterización bioquímica es un método prometedor para descubrir o identificar diferentes enzimas con sustratos similares, seguimos recomendando el uso de otros métodos laboriosos pero precisos, como el western blot y los ensayos de zimograma. Por último, no pudimos cuantificar el modo de actividad enzimática de la β-glucanasa específica de MLG debido a la falta de oligosacáridos de MLG. Sin embargo, las β-1,3-glucanasas extraídas de Tugela-Dn5 y Tugela-Dn1 infestadas con RWASA2 mostraron una mayor actividad en LAM5, LAM4 y LAM3, mientras que la procedente de Tugela susceptible mostró una mayor actividad en LAM5 y LAM4. Esto confirma que el estudio del modo de actividad enzimática también puede detectar diferencias sutiles entre las β-1,3-glucanasas inducidas en los cultivares resistentes y susceptibles infestados de RWA.

El estudio actual proporciona un procedimiento detallado para extraer las enzimas unidas a la pared celular del tejido de la hoja de trigo. Después de la extracción, identificamos tres enzimas unidas a la pared celular, a saber, β-1,3-glucanasa, β-glucanasa específica de MLG y POD. Los niveles de actividad de estas enzimas fueron significativamente más altos en los cultivares Tugela-Dn1 moderadamente resistente e infestado por RWASA2 y Tugela-Dn5 resistente que en los controles. Estos confirmaron que las enzimas unidas a la pared celular contribuyeron a la respuesta de defensa en los cultivares resistentes. Los resultados de la caracterización dan una idea de que la pared celular POD y la β-1,3-glucanasa funcionan en las mismas condiciones, lo que sugiere que refuerzan sinérgicamente la pared celular durante la interacción trigo-RWASA2.

Se han identificado algunas limitaciones que interfieren con los protocolos actuales discutidos. La escasez de plantas de trigo puede limitar el material foliar disponible para extraer las muestras de enzimas. Si la IWF del apoplasto no se extrae con éxito de las muestras de hojas antes de extraer las enzimas de la pared celular, puede conducir a la combinación de enzimas de apoplasto y de la pared celular. La combinación de la IWF y las enzimas de la región de la pared celular dificulta el estudio de las enzimas unidas a la pared celular que se unen a la pared celular. No se identificaron otras limitaciones en el protocolo actual.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses en este trabajo.

Agradecimientos

M. Mafa recibió financiación de la NRF-Thuthuka (Nº de referencia: TTK2204102938). S.N. Zondo recibió la beca de posgrado de la Fundación Nacional de Investigación para su maestría. Los autores agradecen al Instituto del Consejo de Investigación Agrícola - Grano Pequeño (ARC-SG) por proporcionar las semillas utilizadas en este estudio. Todas las opiniones, hallazgos y recomendaciones expresadas en este material pertenecen a los autores y, por lo tanto, los financiadores no aceptan ninguna responsabilidad al respecto.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Centrífuga de 10 kDa Dispositivo de membrana concentradoraSigma-Aldrich R1NB84206Solo para uso en investigación. No debe usarse en procedimientos de diagnóstico. Para la concentración y purificación de soluciones biológicas.
2 g de laminaribiosaMegazyme (Wicklow, Irlanda)O-LAM2Laminaribiosa de alta pureza para su uso en investigación, ensayos enzimáticos bioquímicos y análisis de diagnóstico in vitro.
3 g de laminaritriosaMegazyme (Wicklow, Irlanda)O-LAM3Laminaritriosa de alta pureza para uso en investigación, ensayos enzimáticos bioquímicos y análisis de diagnóstico in vitro.
3,5 Ácido salicílico dinitroSigma-AldrichD0550Utilizado en la determinación colorimétrica de azúcares reductores
4 g Laminaritetraosa Megazyme (Wicklow, Irlanda)O-LAM4Laminaritetraosa de alta pureza para uso en investigación, ensayos enzimáticos bioquímicos y análisis de diagnóstico in vitro.
5 g de laminaripentaosaMegazyme (Wicklow, Irlanda)O-LAM5Laminaripentaosa de alta pureza para uso en investigación, ensayos enzimáticos bioquímicos y análisis de diagnóstico in vitro.
Etanol absoluto al 95%Sigma-Aldrich107017Etanol absoluto para análisis
acéticoSigma-AldrichB00063Acetc ácido glacial 100% para análisis (contiene ácido acético)
Azo-CM-CelulosaMegazyme (Wicklow, Irlanda)S-ACMCEl polisacárido se tiñe con Remazolbrilliant Blue R en una proporción de aproximadamente una molécula de colorante por cada 20 residuos de azúcar.
Beta glucano (cebada) Megazyme (Wicklow, Irlanda)G6513Un sustrato en polvo, menos soluble en agua. Se utiliza para determinar la actividad de la β-1,3-glucanasa.
Colorante de ensayo de proteínas Bio-Rad Bio-RadLaboratories, Sudáfrica500-0006Colorante de ensayo colorimétrico, concentrado, para usar con los kits de ensayo de proteínas Bio-Rad I y II 
Albúmina sérica bovina (BSA)Gibco Europe810-1018Solo para uso en laboratorio
Ácido citratoSigma-AldrichC0759Solo para investigación en ciencias de la vida. No debe usarse en procedimientos de diagnóstico.
CM-curdlan Megazyme (Wicklow, Irlanda)P-CMCURSustrato en polvo para determinar la actividad de la β-1,3-glucanasa. Insoluble en agua.
D-GlucosaSigma-AldrichG8270Solo para investigación en ciencias de la vida. No debe usarse en procedimientos de diagnóstico.
GuaiacolSigma-AldrichG5502Indicador de oxidación. Se utiliza para determinar la actividad de la peroxidasa.
Peróxido de hidrógenoBDH Laboratory Supplies, Inglaterra10366Potente agente oxidante.
Mikskaar Professional SubstarteMikskaar (Estonia)NISustrato de plántulas a base de turba.
Abono multialimentación (5.2.4 (43))MultifeedClassicB1908248Abono soluble en agua para plantas jóvenes en desarrollo y plántulas con un alto requerimiento de fósforo (P) para garantizar un desarrollo óptimo de las raíces.
NaftolMerck, AlemaniaN2780Se somete a hidrogenaciones en presencia de un catalizador.
FenolSigma-Aldrich33517Sensible a la luz. Para R& D uso solamente. No para uso de drogas, doméstico u otros. SDS disponible
Tartrato de potasio y sodio tetrahidratado (sal de Rochelle)Sigma-AldrichS2377utilizado en la preparación de la solución de ácido 3,5-dinitrosalicílico utilizada en la determinación del azúcar reductor.
Placa de sílice (TLC Gel de sílice 60 F254)Sigma-Aldrich60778-25EA Matriz degel de sílice, con indicador fluorescente 254 nm
Hidróxido de sodioSigma-AldrichS8045para R& D uso solamente. No para uso de drogas, doméstico u otros.
Metabisulfito de sodioSigma-Aldrich31448Añadido como antioxidante durante la preparación de soluciones de ácido 3,5-dinitrosalicílico.
Fosfato de sodio dibásico heptahidratadoSigma-AldrichS9390Se utiliza como solución tampón en investigación biológica para mantener el pH constante.
Fosfato de sodio monobásico heptahidratadoSigma-Aldrich71500Un compuesto inorgánico, que es soluble en agua. Se utiliza como reactivo en el desarrollo de lechadas a base de silicatos.
Software de análisis estadísticoTIBCO Statisticaversión 13.1
Ácido sulfúricoMerck, Darmstadt, Alemania30743Ácido sulfúrico 95-97% para análisis de Hg, reactivo ACS.
Tris-HClSigma-Aldrich10812846001Agente tampón en mezclas de incubación. También se ha utilizado como componente de lisis y tampón TE (Tris-EDTA). Solo para investigación en ciencias de la vida. No debe usarse en procedimientos de diagnóstico.
UV– espectrofotómetro visibleGENESYS 120 
  NI = no identificado.
ácido

Referencias

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