Artículo de método

Hellgrammite como biomonitor no convencional para la evaluación de aguas superficiales y salud ambiental

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DOI:

10.3791/66911

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26 de julio de 2024

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1Posgrado en Hidrociencias, Colegio de Postgraduados, 2Instituto Politécnico Nacional, Laboratorio de Evaluación de la Salud de los Ecosistemas Acuáticos, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, 3Instituto Politécnico Nacional, Coordinación Politécnica para la Sustentabilidad

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el uso de biomarcadores para la detección temprana de impactos deletéreos en los ecosistemas acuáticos. Los biomarcadores están estrechamente relacionados con los rasgos centinela y sus cambios ayudan a detectar daños en alerta temprana.

Resumen

Las larvas de moscas dobson del género Corydalus, comúnmente conocidas como Hellgrammites, se caracterizan por su notable tamaño, su amplia gama de presencia y su prolongado período de inmadurez, que puede durar hasta un año. Se sabe claramente que los Hellgrammites exhiben sensibilidad a la contaminación y a los impactos en la estructura del hábitat. Dadas estas características únicas, el uso de larvas de Corydalus texanus es muy adecuado como agentes de biomonitoreo confiables para evaluar la integridad ecológica de los ecosistemas acuáticos. Este protocolo tiene como objetivo proporcionar las herramientas necesarias para la evaluación de C. texanus y demostrar su eficacia a través de un estudio de caso. Los resultados de la investigación tienen implicaciones prácticas, indicando que las larvas de C. texanus exhiben respuestas de alerta temprana a la contaminación minera, bioacumulando altas cantidades de metales pesados como Zn, Fe y Al. La presencia o ausencia de poblaciones de C. texanus puede servir como un indicador útil para identificar posibles problemas relacionados con la salud del ecosistema. El enfoque no convencional ha mostrado alertas tempranas de contaminación en los sitios impactados por la minería, lo que destaca la necesidad de tomar medidas oportunas para proteger el medio ambiente. Dadas sus características únicas, se recomienda encarecidamente el uso de larvas de C. texanus como un bioindicador no convencional confiable.

Introducción

Las Hellgramites son larvas de insectos del orden Megaloptera (Latreille, 1802), llamadas moscas dobson o moscas de los peces en su etapa adulta. Una diversidad baja pero generalizada caracteriza a este grupo de larvas de insectos depredadores superiores de los ecosistemas acuáticos1. Las especies de Hellgramite se encuentran en regiones biogeográficas bien definidas; Por lo tanto, es relativamente fácil identificar especies sin un alto conocimiento taxonómico. En particular, las larvas de Corydalidae poseen las especies más prominentes del orden Megaloptera (20-90 mm de longitud corporal)2, lo que hace que la gramita infernal sea visible a simple vista.

Los Hellgrammites juegan un papel crucial en los ecosistemas acuáticos como depredadores, con una poderosa presencia debido a los grandes masticadores que denotan su impresionante forma depredadora. Un cuerpo aplanado dorsoventralmente también se une con 7-8 pares de branquias de filamento a lo largo del cuerpo, y una cápsula de la cabeza con seis tallos por lado hace que los hellgrammites sean organismos fascinantes para entomólogos y aficionados3. Los adultos de Corydalidae sorprenden y crean una imagen de impresión a las personas debido a su tamaño prominente; sin embargo, son completamente inofensivos. Cabe destacar que las hellgrammitas tienen la capacidad de persistir en ambientes acuáticos en su etapa larvaria durante un tiempo significativo.

Las características fenotípicas de los hellgrammitas permiten una oportunidad particular para resaltar su papel en los ecosistemas acuáticos; Sin embargo, su potencial indicador es la característica más buscada por los ecólogos acuáticos. Se destaca el vasto conocimiento de su potencial bioindicador en los ecosistemas acuáticos debido a que su ocurrencia se relaciona con las buenas condiciones de salud en sus hábitats debido a su intolerancia a la contaminación orgánica en las aguas superficiales 4,5,6,7,8.

La mayoría de los Corydalidae megalopterans viven en aguas corrientes de alta velocidad como arroyos y sustratos predominados por guijarros y guijarros, pero los hellgrammites también ocurren en arroyos de baja pendiente con enganches y sustratos de arena, así como en hábitats lénticos como lagos 3,9,10. Su amplia gama de presencia refleja los rasgos críticos de un depredador superior y su capacidad para colonizar varios hábitats objetivo por sus estrategias efectivas de historia de vida11. Los hellgramitas vincularon sus rasgos con la dinámica de los ecosistemas acuáticos; así, estrategias como la adaptación a la respiración aérea por parte de los espiráculos (además de sus penachos ventrales de branquias traqueales) son propias de las estrategias de Corydalidae10.

Los Hellgrammitas habitan ecosistemas particulares y muestran respuestas rápidas a las desviaciones de los patrones establecidos, sirviendo así como un sistema de alerta temprana7. Las reacciones de estos organismos de la fauna silvestre pueden emplearse como una herramienta valiosa para evaluar el impacto de la contaminación en los ecosistemas acuáticos, particularmente en el caso de mezclas de contaminantes no objetivo. Se han reconocido algunos efectos nocivos sobre los organismos vivos en los ecosistemas debido a la toxicidad individual de los productos químicos, pero se identificará el efecto de las mezclas de contaminantes. Las respuestas de alerta temprana de los hellgrammites pueden permitir identificar los efectos deletéreos dando una referencia a los impactos de una mezcla de contaminantes o incluso cuando los efectos individuales de los contaminantes reconocen una concentración sin efecto observable (NOEC)12.

Se han utilizado varios organismos modelo para pruebas experimentales agudas y crónicas; sin embargo, se cultivan y mantienen en condiciones controladas13. Las condiciones controladas hacen que no puedan identificar los efectos no deseados de varios contaminantes a los que están expuestos. Además, el NOEC se reconoce con frecuencia debido a la complejidad de la mezcla del contaminante. Por esa razón, en las últimas décadas, se reconocieron especies nativas no modelo con efectos no objetivo para los sistemas de tamizaje, que son esenciales para llevar a cabo investigaciones ecotoxicológicas14. En consecuencia, los hellgrammites parecen capaces de evaluar los efectos nocivos de la contaminación en los ecosistemas acuáticos. Rasgos como su biología, genética y fisiología, entre otros, hacen que los organismos no modelo sean adecuados para la evaluación de impacto en los ecosistemas14.

Este protocolo tiene como objetivo establecer una nueva herramienta de biomonitoreo utilizando un organismo no modelo que pueda detectar señales de alerta temprana en respuesta a mezclas de contaminación no objetivo. Para lograr los mejores resultados, se han considerado de manera integral e integrados en el análisis los rasgos exhibidos por las larvas de la especie modelo, C. texanus 15.

Protocolo

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Figura 1: Guía rápida paso a paso sobre cómo utilizar el biomonitor no convencional Corydalus texanus para su implementación en ecosistemas acuáticos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Trabajo de campo

  1. Identificar los sitios de estudio ubicados aguas arriba y aguas abajo de la fuente de contaminación donde se reconocen impactos presuntos o evidentes (es decir, emisiones puntuales o difusas).
    NOTA: El presente protocolo incluyó 15 sitios de estudio en cuatro ríos principales: 1) Río Extoraz (sitios PB, EZ, RQ, BC); 2) Río Escanela-Jalpan (ES, EN, AH, JL, PI, PA); 3) Río Ayutla (AY); y 4) Río Santa María (SM, AT).
  2. Buscar y ubicar al menos un sitio de referencia (un lugar con impactos menores o ausentes) y definirlo como un sitio de estudio.
    NOTA: Para el presente estudio, se consideraron como sitios de referencia BC, ES, SM, AY y AT.
  3. Reconocer ciertos atributos de los hábitats que aumentan la probabilidad de encontrar individuos de C. texanus. Estos incluyen sustrato de grava, hábitats rocosos con pendientes más pronunciadas, flujos de alta velocidad, aguas bien oxigenadas, alta densidad de dosel y hábitats en tierras altas y bajas.
  4. Cercar una sección de 100 m del arroyo para identificar hábitats apropiados para el monitoreo biológico16.
  5. Entra en el arroyo para recoger muestras.
  6. Muestree al menos seis individuos de C. texanus en hábitats como arroyos, guijarros, aguas cristalinas y escombros utilizando una red de patada con un tamaño de malla de 500 μm.
  7. Retire las rocas en la dirección del flujo de agua y transfiera las larvas a la red.
  8. Manipule la red de patada con las larvas muestreadas y transfiéralas a botellas designadas para alojamiento temporal. Manipule la red con precaución y doble los bordes hacia el interior para evitar cualquier pérdida de larvas.
  9. Mida el ancho de la cabeza de las larvas muestreadas usando un calibrador para identificar los estadios IX a XI (dentro del rango de 6 mm a 10 mm).
  10. Purgue las larvas sumergiéndolas en una botella que contenga agua de arroyo durante 30 minutos.
  11. Coloque las muestras en botellas de plástico con etiquetas claras y luego eutanasiélas sumergiéndolas en nitrógeno líquido (-75 °C) en un tanque criogénico.
  12. Transporte y almacenamiento seguro de las muestras a -45 °C en el ultracongelador del laboratorio.
  13. Con una botella de polietileno, tome una muestra de agua de corriente de 200 mL, agregue 1 mL de ácido nítrico y almacene la muestra a 4 °C para su posterior cuantificación de metales pesados en el laboratorio.

2. Disección de las larvas muestreadas y separación de tejidos

  1. Coloque la bandeja de disección de plástico sobre hielo y espere hasta que alcance los 4 °C, utilizando un termómetro para comprobarlo.
  2. Tome muestras del ultracongelador y colóquelas en la bandeja de disección para comenzar a diseccionar.
  3. Seleccione los tejidos objetivo: músculo, ramas, tubo neural y exoesqueleto.
  4. Use un cuchillo de cerámica para quitar la cabeza y separe los tejidos con cuidado. Abre el cuerpo longitudinalmente y retira las branquias de cada lado.
  5. Separe los exoesqueletos con un cuchillo de cerámica más pequeño y limpie el exceso de tejido. Colocar los exoesqueletos en un horno y secarlos a 80 °C durante 48 h.
  6. Después de que pase el tiempo, guarde los exoesqueletos secos para un análisis más detallado.
  7. Siga limpiando los tejidos blandos en condiciones frías para su posterior análisis mediante microensayos.
  8. Use un pequeño cuchillo de cerámica para extraer los tejidos blandos de la grasa. Separe y agrupe cada tejido objetivo de los individuos del mismo punto de muestreo.
  9. Almacene cada tipo de tejido en un microtubo de 2 ml, manteniendo las condiciones de frío durante todo el proceso.
  10. Para preparar cada tejido diana, pese 100 mg de tejido y añada 1 ml de solución de PBS con un pH de 7,4. Utilice un desgarrador de tejido con una sola mano para homogeneizar cada tejido. Por lo general, los tejidos blandos requieren tres ciclos de 10 s cada uno.
  11. Centrifugar la muestra a 1.000 x g durante 5 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un microtubo de 1 mL.
  12. Realizar microensayos de biomarcadores.

3. Cuantificación de metales pesados

  1. Pesar 250 mg de exoesqueletos secos de al menos seis especímenes en la etapa de desarrollo especificada utilizando una balanza analítica.
  2. Muele los exoesqueletos en un mortero de vidrio hasta que se conviertan en polvo fino. Agregue 250 mL de ácido nítrico ultrapuro a los recipientes de reacción del polvo.
  3. Para digerir las muestras, transfiéralas a un microondas de digestión a 180 °C durante 30-45 min.
    NOTA: Utilice el recipiente apto para microondas adecuado para la marca de microondas para calentar las muestras de manera segura y eficaz. El tiempo de digestión de las muestras de tejido varía según la marca del microondas, tardando entre 30 y 45 minutos. Algunas marcas ofrecen métodos estandarizados.
  4. Realice un método de digestión por microondas para muestras de agua siguiendo el método EPA3015A, utilizando 45 mL de la muestra de agua y agregando 5 mL de ácido nítrico.
  5. Mida metales pesados y metaloides en muestras digeridas (agua y tejidos) utilizando espectroscopia de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES), incluidos Hg, Cu, Pb, Zn, Fe, Cr, Cd, Mn, Ba y As.
    NOTA: Utilice argón grado 5 y soluciones estándar de cada metal y metaloide para construir una curva de calibración.

4. Microensayos para la evaluación del estrés oxidativo y biomarcadores

  1. Preparación de reactivos
    1. Mezcle 6 g de NaH2PO4 con 1000 mL de agua ultrapura para hacer un tampón de fosfato monobásico de 50 mM. Almacenar en un matraz a 2-8 °C indefinidamente.
    2. Para obtener una SDS al 8,1%, disuelva 450 mg de dodecil sulfato de sodio (SDS) en 5 ml de agua ultrapura. Prepare justo antes de usar.
    3. Diluir 2 mL de ácido tricloroetanoico (TCA) en 8 mL de agua ultrapura (prepare reactivo fresco cuando sea necesario).
    4. Disolver 100 mg de tetrabutilamonio (TBA) en 10 mL de agua ultrapura (preparar el reactivo fresco cuando sea necesario).
    5. Para hacer 50 mM de PBS pH 7.8, disuelva 97 mg de Na2HPO4 y 59 mg de NaH2PO4 en 10 mL de agua ultrapura. Luego, ajuste el pH a 7.8 usando NaOH para aumentar o HCl para disminuir.
    6. Preparar una solución de 200 μg/mL de catalasa bovina disolviendo 8 mg de la misma en 40 μL de agua ultrapura (preparar reactivo fresco cuando sea necesario).
    7. Para hacer una solución de 50 mM de TRIS/5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), agregue 6,05 g de tris (hidroximetil)aminometano (TRIS) y 0,073 g de EDTA a 45 mL de agua ultrapura. Ajuste el pH a 7,6 con HCl y almacene a 4 °C hasta su uso.
    8. Para glutatión reducido (GSH) 0,1 M (para 45 muestras duplicadas), pesar 0,0184 g de GSH y disolverlo en 600 μL de HCl 10 mM.
    9. Para preparar 10 mM de HCl, agregue 0,5 μL de HCl concentrado a 599,5 μL de agua ultrapura.
    10. Añadir 28,5 μL de glutatión reductasa a 1,4 mL de 0,1 M TRIS/HCl 0,5 mM EDTA pH 8,0.
    11. Mezclar 1,211 g de TRIS y 0,0146 g de EDTA con 90 mL de agua ultrapura para preparar una solución de 0,1 M de TRIS/HCl y 0,5 mM de EDTA a pH 8,0. Agregue HCl para ajustar el pH si es necesario. La solución puede almacenarse indefinidamente a 2-8 °C.
    12. Peso 0,075 g de NADPH y añádelo a 2,25 mL de NaHCO3 1% 1 mM EDTA.
    13. Mezcle 1 g de NaHCO3 y 0,0282 g de EDTA en 100 ml de agua ultrapura para preparar una solución de NaHCO3 al 1% y 1 mM de EDTA. Almacene la solución a 4-8 °C durante un tiempo indeterminado.
    14. Mezcle 2 μL de hidroperóxido de t-butilo con 2 mL de agua ultrapura para hacer una solución de 7 mM. Mezclar inmediatamente antes de usar.
    15. Mezclar 1 g de albúmina sérica bovina (BSA) con 1 mL de agua ultrapura para crear una solución madre de 1 μg/μL.
  2. Sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) (peroxidación lipídica, LPO)17
    1. Añadir 5 μL de sobrenadante tisular a un microtubo de 1 mL. Añadir 45 μL de 50 mM de PBS (solución fresca y madre).
    2. Añadir 12,5 μL de SDS al 8,1% (recién preparado). Añadir 93,5 μL de TCA al 20% pH 3,5 (recién preparado).
    3. Añadir 93,5 μL de 1% TBA (recién preparado). Completa el volumen añadiendo 50,5 μL de agua ultrapura. Cierre la tapa del tubo y vértice durante 30 s.
    4. Perforar la tapa del microtubo con una aguja e incubar en agua hirviendo durante 10 min.
    5. Enfríe el tubo a temperatura ambiente (RT) y luego centrifuérrelo a 1000 x g durante 10 min.
    6. Agregue 150 μL de sobrenadante a un pocillo en una microplaca de 96 pocillos y mida la absorbancia a 530 nm usando un espectrofotómetro de microplacas.
    7. Para cuantificar los peróxidos lipídicos, cree una curva de calibración TBARS de 8 puntos (0-160 μM) utilizando malondialdehído bis (dimetilacetal) como se describe en la Tabla 1. Ajuste la curva de malondialdehído (MDA) de acuerdo con el tipo de tejido o el nivel de daño sospechado.
    8. Exprese los resultados como proteína nmol MDA eq·mg-1 .
  3. Microensayo de enzima antioxidante superóxido dismutasa (SOD)18
    1. Use una placa de 96 pocillos. Agregue 147 μL de 1 M TRIS/5 mM HCl EDTA pH 8 en dos pocillos como blancos. Agregue 144 μL de 1 M TRIS/5 mM HCl EDTA pH 8 a otros pocillos por duplicado.
    2. Tome 3 μL del sobrenadante y añádalo a los pocillos de muestra. Mezcle suavemente el contenido en el plato varias veces.
    3. Añadir 3 μL de ácido pirogálico 10 mM a cada pocillo en un plazo de 30 s. Mezcle suavemente inmediatamente.
    4. Mida la absorbancia a T0 (tiempo = 0 s) y T10 (tiempo = 10 s), a 420 nm y 25 °C.
    5. Determine la SOD calculando el porcentaje de inhibición de pirogalol en la muestra utilizando la siguiente ecuación:
      figure-protocol-2
      Dónde
      x% = porcentaje de oxidación del pirogalol por SOD en la muestra; Por lo tanto, la oxidación del pirogalol es igual a 100 - x%
      NOTA: Cálculo de la actividad de SOD considerando 1 UI es el volumen que inhibe el 50% de la oxidación del pirogalol como se describe a continuación:
      figure-protocol-3
      Dónde
      y = volumen de la muestra en mililitro (inhibe el 50% del pirogalón)
      50% = porcentaje de inhibición de pirogalol igual a 1U de SOD
      0,003 = volumen en mililitros de la muestra
      100 - x% = inhibición de pirogalol en porcentaje por la muestra
    6. Finalmente, determine la actividad de SOD con la ecuación:
      figure-protocol-4
      SOD = actividad de SOD en unidades internacionales por microgramo de proteína
      Y = volumen de la muestra en el que inhibe el 50% de pirogalol
      100 = factor de conversión de decilitro a mililitro.
      proteína = la concentración de proteína obtenida de la cuantificación de Bradford se expresa en microgramos por mililitro; Es necesario dividir por 10 para convertir a gramos por decilitro
  4. Microensayo de enzima antioxidante catalasa (TAC)19,20
    1. Utilice una microplaca de 96 pocillos. Añadir 20 μL de sobrenadante de muestra en los pocillos (por duplicado).
    2. Agregue 20 μL de catalasa fresca (200 μg/mL) en los pocillos como estándar (por duplicado). Añada 100 μL de 50 mM de PBS pH 7,8 a la muestra y a los pocillos en blanco.
    3. Agregue 100 μL de 90 mM (30%) H2O2 en los pocillos para iniciar la reacción. Después de añadir H2O2, lea la absorbancia cada 15 s durante 2,5 min a 240 nm.
    4. Calcula la actividad usando la ecuación:
      figure-protocol-5
      figure-protocol-6
      figure-protocol-7
      figure-protocol-8
      figure-protocol-9
  5. Microensayo enzimático de glutatión peroxidasa (GPx)21
    1. Utilice una microplaca de 96 pocillos.
    2. Mezclar 240 μL de solución de GSH de 0,1 M, 1 200 μL de solución de GSH-Rd de 10 U/mL y 1 200 μL de 4 mM de NADPH. Mantenga la solución en hielo.
    3. Añadir a los pocillos 100 μL de 50 mM TRIS/HCl 5 mM EDTA pH 7,6. Añadir 1 μL de muestra de sobrenadante por duplicado. Golpee la microplaca y mezcle suavemente.
    4. Añadir 50 μL de la solución de mezcla (paso 4.5.2) y mezclar suavemente.
    5. Agregue 20 μL de la solución de hidroperóxido de t-butilo de 7 mM en los pocillos para iniciar la reacción (se necesitan aproximadamente 15 s para iniciar la reacción en 16 muestras duplicadas). Mezcle rápidamente la microplaca.
    6. Controle la absorbancia en cada intervalo de 1 minuto durante 5 minutos a 25 °C a 340 nm.
    7. Calcula la actividad de GPx con la ecuación:
      figure-protocol-10
      Dónde
      GPx = actividad en milimolares por minuto por microgramo de proteína
      ΔAbs340/min= Absorbancia media en delta
      103 = conversión de molar a milimolar
  6. mg prot = concentración de proteína de la determinación de Bradford expresada en microgramos por microlitro
    1. Cuantificación de proteínas mediante el análisis de Bradford22
    2. Realice una curva estándar a partir de soluciones de albúmina sérica bovina (BSA), establecida a partir de una solución madre de 1 μg/μL como se muestra en la Tabla 2.
    3. Utilice una microplaca de 96 pocillos. Añadir 190 μL de reactivo de Bradford en la muestra y en los pocillos estándar.
    4. Agregue 10 μL de BSA en pocillos estándar por duplicado. Añadir 10 μL de sobrenadante en los pocillos de muestra por duplicado.
    5. Mezclar suavemente con la punta de la pipeta.
    6. Lectura de absorbancia a 595 nm. Cuantificar la concentración de proteína con la curva estándar.

Resultados

Los resultados del estudio revelan que los metales pesados, específicamente el Aluminio (Al), el Hierro (Fe) y el Zinc (Zn), tienen un impacto perjudicial en el medio ambiente, como se evidencia en la Figura 2. La detección de altos niveles de metales pesados tanto en muestras de tejido como de agua recogidas en todos los sitios ha llevado a un resultado desfavorable. Se detectaron valores atípicos, con un Factor de Bioacumulación (BAF) de 600, especialmente en áreas intensivas en minería como el río Extoraz (sitios PB, EP, RQ y BC mostrados en la Figura 3). Sorprendentemente, en algunos sitios de estudio donde las concentraciones de zinc en el agua eran anormalmente altas (PB), no fue posible encontrar especímenes de C. texanus. Esto indica que probablemente se haya superado el umbral de bioacumulación.

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Figura 2: Diagrama de caja del factor de bioacumulación (BAF) evaluado en individuos de Corydalus texanus muestreados a lo largo de 15 sitios de estudio. Se calculó el factor de bioacumulación (BAF) para metales Al, Fe y Zn de acuerdo con el análisis de muestras de agua y exoesqueletos de individuos de C. texanus . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Dado que SGBR es un área natural protegida, es esencial garantizar que no ocurran cambios ambientales que puedan afectar al organismo centinela. Sin embargo, se observaron gradientes en las respuestas de los biomarcadores de estrés oxidativo (Figura 3). De acuerdo con la evaluación, los sitios con los niveles más bajos de daño en la membrana celular, como lo demuestran los niveles de LPO, fueron EN, SM y CN. Estos mismos sitios mostraron un bajo nivel de actividad de SOD, que sirve como la enzima principal en la defensa del cuerpo contra el estrés oxidativo. Esto sugiere que el estrés oxidativo es mínimo y, por lo tanto, se podrían considerar intervenciones que no afecten a los organismos centinela. Por el contrario, se observó que la actividad de GPx era significativamente menor en varios sitios, a saber, EP, RQ, BC y ES, donde se registraron altos niveles de LPO. Esta observación sugiere que el organismo está respondiendo a las condiciones estresantes causadas principalmente por la minería. Al evaluar los marcadores de alerta temprana dentro de este organismo en particular, se ha descubierto que ciertos sitios tienen niveles bajos y altos de impacto. Estos hallazgos muestran efectivamente la utilidad de utilizar esta especie como un centinela no convencional.

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Figura 3: Diagrama de caja de las respuestas de biomarcadores evaluadas en especímenes de Corydalus texanus en 15 sitios de muestreo en tres ríos principales que desembocan en una cuenca en México (Reserva de la Biosfera Sierra Gorda) durante las estaciones seca y húmeda. Las respuestas se midieron utilizando tres biomarcadores: (A) nivel de peroxidación lipídica (LPO) que refleja el daño celular temprano, (B) respuesta antioxidante de la superóxido dismutasa (SOD) de defensa celular de primera línea, y (C) respuesta antioxidante de la defensa celular por glutatión peroxidasa (GPx). Las flechas rojas indican la ausencia de individuos biomonitores o un número muy limitado de especímenes, lo que ocurrió solo una vez. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tubo200 μM de MDA bis (μL)Agua ultrapura (μL)Concentración de MDA bis (μM)
1010000
212.5987.52.5
3259755
45095010
510090020
620080040
740060080
8800200160

Tabla 1: Concentración de MDA necesaria para construir la curva de concentración de MDA.

Concentración (μg/μL)Solución madre (μL)Agua ultrapura (μL)
0050
0.1545
0.21040
0.42030
0.84010
1500

Tabla 2: Curva de concentración de BSA para cuantificación de proteínas.

Discusión

Aunque el uso de C. texanus es óptimo para la evaluación, es necesario considerar varios aspectos de su uso y recolección. Los sitios de estudio elegidos resultan desafiantes, debido a varios factores, como condiciones climáticas desfavorables, inaccesibilidad geográfica, altos niveles de aridez o protocolos de seguridad insuficientes en regiones seleccionadas. Las restricciones y limitaciones establecidas a menudo pueden presentar desafíos al realizar el trabajo de campo. Al evaluar regiones específicas, particularmente aquellas en arroyos tropicales, la obtención de muestras puede ser un desafío. Aunque se siguieron las directrices de Barbour23 para este fin, puede haber obstáculos para adaptar los protocolos en algunos ecosistemas debido a sus características particulares. Como se indicó anteriormente, la recolección de muestras en ambientes lóticos tropicales presenta una variedad de desafíos debido a factores regionales y locales. Estos factores abarcan los altos niveles de heterogeneidad ambiental, sustratos con alta variación, cuenca, ancho, profundidad, flujo, vegetación ribereña y la amplia gama de condiciones físico-químicas24. En consecuencia, la obtención de un tamaño uniforme para los especímenes puede resultar un desafío, ya que están naturalmente influenciados por un rango de factores establecido, particularmente en respuesta a los cambios estacionales. En consecuencia, estandarizar su tamaño puede ser una tarea compleja. Una vez finalizado con éxito el trabajo de campo, se facilitan los procedimientos de laboratorio posteriores, lo que permite un análisis posterior.

La implementación de una evaluación de alerta temprana en C. texanus ha demostrado su viabilidad para reflejar los impactos en el contexto de los ecosistemas acuáticos. En este sentido, la identificación de macroinvertebrados acuáticos como indicadores confiables del impacto humano ha demostrado ser un enfoque práctico25,26. La investigación actual ha demostrado que C. texanuss sirve como un modelo no tradicional altamente efectivo para evaluar rápidamente las condiciones ambientales. En el caso del presente estudio, se demostró que C. texanus mostró variación en las respuestas al enfrentamiento de la contaminación por metales pesados derivada de la minería. Los efectos añadidos de las alteraciones del hábitat permiten reconocer un alto grado de sensibilidad en C. texanus. Si bien había evidencia de actividad minera en el área, los indicadores de contaminación tradicionales, como el índice de diversidad calculado en Rico-Sánchez et al.27, no reconocieron el impacto de la contaminación por metales pesados en las zonas núcleo o sitios de conservación. Sin embargo, se observaron cambios en zonas como BC o SM, que se sitúan en zonas núcleo. Aunque las áreas naturales protegidas son efectivas para la conservación, los hallazgos con respecto a C. texanus indican que las señales de alerta temprana de daños ya están ocurriendo sin que se note. La inclusión de la fauna no convencional e indígena debe ser promovida por los protocolos de investigación y las regulaciones prospectivas dentro de sus respectivas naciones, particularmente en las regiones tropicales donde los ecosistemas fluviales difieren significativamente de los de las zonas templadas28. El uso de un biomonitor no convencional como C. texanus puede ayudar a mejorar la precisión y relevancia de los hallazgos de la investigación y mejorar los esfuerzos de conservación de estas importantes especies y su hábitat.

El uso de Corydalus sp. mostró, asimismo, una alta sensibilidad a diversos impactos de las actividades humanas (i.e., impactos en la agricultura como el cambio de uso de suelo y el uso de agroquímicos), tal como se observó en el río Filobobos (un lugar hacia la cuenca del Golfo de México)7. El estudio en cuestión destaca el papel significativo del calcio en la inducción de estrés en Corydalus sp. debido al aumento intensificado de los niveles de LPO en aguas anormalmente endurecidas en el río Filobobos. Estos hallazgos, junto con el presente, evidenciaron la utilidad del género Corydalus en la evaluación de ecosistemas acuáticos en latitudes intertropicales. Sin embargo, antes de evaluar un ecosistema acuático específico, es necesario tener un conocimiento previo del área de estudio. Al realizar un análisis exhaustivo, se deben determinar las ubicaciones óptimas de investigación para recopilar los datos más extensos y completos.

La eficacia del trabajo de laboratorio depende en gran medida del uso de técnicas de recolección adecuadas. La recolección de especímenes más grandes puede resultar beneficiosa al realizar la disección debido a la mayor cantidad de tejido blando y exoesqueleto disponible para el análisis. Sin embargo, es importante tener en cuenta que las variaciones estacionales pueden afectar la acumulación de tejido graso, lo que dificulta la separación de los tejidos blandos y los exoesqueletos durante los estudios temporales. En tales casos, puede ser aconsejable centrarse en las branquias y los músculos disponibles de cada individuo. Obtener un número significativo de individuos puede representar un desafío crítico. Debido a las variaciones mencionadas anteriormente, obtener suficiente tejido para evaluar el contenido de metales pesados y la respuesta de los biomarcadores podría ser más difícil. El presente estudio mostró un ejemplo de este caso, ya que no fue posible evaluar la catalasa en muestras del SGBR. Antes del presente protocolo, la evaluación de la catalasa demandaba una gran cantidad de tejido; Sin embargo, la propuesta actual para la determinación de catalasa ofrece una cantidad mínima de tejido para su evaluación.

La actual propuesta de protocolo ofrece una oportunidad adecuada para realizar una aproximación factible de la integridad ecológica utilizando hellgrammites comunes en los ecosistemas acuáticos. Proporciona información crucial para identificar la contaminación puntual o los efectos nocivos indirectos de los impactos humanos, lo que permite información oportuna a las partes interesadas, ecologistas y científicos acuáticos. Aunque el costo del protocolo actual se ha reducido significativamente, sigue siendo relativamente caro debido a la necesidad de varios reactivos y al uso de equipos especializados. Además, la necesidad de equipos especializados limita el número de lugares en los que se puede realizar el ensayo completo.

Divulgaciones

Los autores no revelaron conflictos de intereses presentes en su trabajo.

Agradecimientos

Los autores desean expresar su sincero agradecimiento a CONAHCyT por otorgar la beca FONINS P 1931, que facilitó enormemente sus esfuerzos de investigación. También agradecieron a la Secretaría de Investigación y Posgrado del Instituto Politécnico Nacional por el invaluable apoyo brindado a través de la subvención para proyectos SIP (20200577). Además, el primer autor desea agradecer la generosa beca de posgrado otorgada por CONAHCyT, que permitió al equipo realizar viajes de campo y recopilar datos esenciales. Por último, los autores quieren expresar su agradecimiento por la inestimable ayuda de María Teresa García Camacho en el laboratorio, sin la cual este proyecto no hubiera sido posible.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Balanza analítica de 220 gOhausPR224/EEsta balanza es útil para pesar el tejido extraído de las muestras.
Vadeadores de pechoLaCrosse700152MRecomendamos el uso de vadeadores para la recogida de muestras. Alternativamente, también puede usar botas con botas de cadera de goma para tomar muestras.
Tabla de cortarTrueTRUE915121Se recomienda utilizar tablas blancas y de plástico.
PinzasDR Instruments112Se recomienda utilizar unas pinzas de 12 pulg fabricadas en acero inoxidable.
Sistema de espectroscopía de emisión óptica de plasma acoplado inductivamentePerkin Elmer7300 DVUn dispositivo para cuantificar metales pesados mediante espectroscopia.
Red de patadaLaMotte0021-PUn método alternativo para hacer una red de patada consiste en fabricar una manualmente utilizando una malla con un grosor de 500 micrómetros.
Nitrógeno líquido NANA
NA Contenedor criogénico estático de nitrógeno líquido DewarBestEquipDF0504Se recomienda utilizar un tanque de aluminio con botes.
Juego de morteroCole-ParmerEW-63100-54Este es un mortero de porcelana que se utiliza para moler tejidos secos.
Multiwave GO PlusAnton PaarC93IP001EN-EMultiwave es una herramienta útil para digerir múltiples muestras.
Horno para secadoFisher scientific506GUn horno incubador, también conocido como horno de papel tisú seco, es esencial para secar tejidos a temperaturas de al menos 80 °C.
Bisturí de precisiónXcelite de Weller037103-48768Se recomienda utilizar un bisturí fabricado en aluminio.
Homogeneizador de tejidos (desgarrador)KoproK110000Se recomienda utilizar un desgarrador de tejidos con base. Algunas empresas ofrecen desgarradores ultrasónicos, que pueden ser la opción óptima.
Congelador horizontal de temperatura ultrabajaREVCOCA89200-384Muchas empresas ofrecen congeladores, pero se recomienda elegir uno con una temperatura de almacenamiento de al menos -40 ° C.
Botellas de plástico de boca anchaUnited Scientific81900recomienda encarecidamente el uso de botellas de polipropileno con tapas y bocas anchas.
Se

Referencias

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