En este artículo se describe la identificación de células piroptóticas mediante citometría de flujo tras tinción dual con anticuerpos contra el fragmento N-terminal de GSDME de pollo (chGSDME-NT) y yoduro de propidio (PI).
Artículo de método
Examen de la piroptosis por citometría de flujo
En este artículo
Resumen
Resumen
La piroptosis es un tipo inflamatorio de muerte celular programada impulsada predominantemente por la formación de poros de la membrana plasmática por el N-terminal generado a partir de las proteínas de la familia Gasdermin escindida (GSDM). El examen de GSDM-NT unido a la membrana mediante Western Blot es el método más utilizado para evaluar la piroptosis. Sin embargo, es difícil diferenciar las células con piroptosis de otras formas de muerte celular utilizando este método. En este estudio, se emplearon células DF-1 infectadas por el virus de la bursitis infecciosa (IBDV) como modelo para cuantificar la proporción de células sometidas a piroptosis por citometría de flujo, utilizando anticuerpos específicos contra el fragmento N-terminal de GSDME de pollo (chGSDME-NT) y la tinción de yoduro de propidio (PI). Las células chGSDME-NT positivas fueron fácilmente detectables por citometría de flujo utilizando anticuerpos anti-chGSDME-NT marcados con Alexa Fluor 647. Además, la proporción de células doble positivas chGSDME-NT/PI en las células infectadas por IBDV (alrededor del 33%) fue significativamente mayor que en los controles infectados simulados (P < 0,001). Estos hallazgos indican que el examen de chGSDME-NT unido a la membrana mediante citometría de flujo es un enfoque eficaz para determinar las células piroptóticas entre las células que experimentan muerte celular.
Introducción
La piroptosis es un tipo inflamatorio de muerte celular programada que depende principalmente de la formación de poros de la membrana plasmática por Gasdermin (GSDM) D en mamíferos 1,2,3. Debido a la deficiencia genética de GSDMD en pollos 4,5, el mecanismo de la piroptosis en pollos sigue siendo difícil de alcanzar. La familia Gasdermin comprende proteínas conservadas, incluyendo GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME y DFNB59 3,6. Los estudios han informado que la GSDME de peces y patos teleósteos es escindida por caspasa-1/3/7 o caspasa-3/7 para inducir la muerte celular piroptótica 7,8. Sin embargo, el papel de la piroptosis mediada por GSDME en la respuesta del huésped a las infecciones patógenas en los pollos aún no se ha dilucidado.
La enfermedad infecciosa de la bolsa (EII) es una enfermedad avícola aguda, altamente contagiosa e inmunosupresora causada por el IBDV9. El IBDV, un virus de ARN bicatenario (ds) bisegmentado sin envoltura, pertenece al género Avibirnavirus de la familia Birnaviridae10. Estudios previos realizados por otros y nuestro laboratorio han demostrado que la infección por IBDV induce la muerte celular en las células huésped a través de diferentes vías 11,12,13,14. Hallazgos previos han demostrado que la infección por IBDV desencadena la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH), un indicador de muerte de células líticas 6,15, lo que sugiere que la infección por IBDV induce la muerte de células líticas en las células huésped. Además, los datos muestran que las células infectadas por IBDV exhiben características morfológicas de muerte celular piroptótica, incluida la hinchazón celular con grandes burbujas que salen de la membrana plasmática y la tinción positiva de yoduro de propidio (PI), lo que sugiere que la infección por IBDV induce piroptosis en las células.
Teniendo en cuenta que la formación de poros de membrana en las células piroptóticas por el fragmento N-terminal de GSDM escindido (GSDM-NT) es un sello distintivo de la piroptosis, teóricamente, las células piroptóticas podrían detectarse por citometría de flujo mediante el examen de GSDM-NT en la membrana celular utilizando anticuerpos específicos. En las células piroptóticas aviares, el fragmento N-terminal de la gasdermina E de pollo (chGSDME-NT) forma poros en la membrana, lo que permite que el yoduro de propidio (PI) pase a través del ADN y se una a él. De este modo, la proporción de células piroptóticas puede detectarse mediante citometría de flujo, distinguiendo así la piroptosis de otras formas de muerte celular, como la apoptosis y la necrosis. Sin embargo, no se ha descrito el método para examinar las células piroptóticas mediante citometría de flujo. En este estudio, las células DF-1 se infectaron con IBDV y se realizó una citometría de flujo para examinar las células piroptóticas utilizando anticuerpos monoclonales (McAb) contra el fragmento chGSDME-NT (unido a la membrana) y la tinción de PI. Sorprendentemente, las células piroptóticas se detectaron eficazmente mediante citometría de flujo. Además, se pudo cuantificar la proporción de células piroptóticas. Estos hallazgos proporcionan un medio poderoso y eficaz para determinar la piroptosis.
En este artículo se describe un método para examinar la piroptosis en células infectadas por IBDV mediante citometría de flujo utilizando tinción anti-chGSDME-NT, McAb y PI. Este método también puede extenderse a otras células infectadas por patógenos y aplicarse para examinar varios tipos de células con piroptosis, distinguiéndolas de otras formas de muerte celular.
Protocolo
Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de las células de muestra
- Cultivo de células DF-1 (fibroblastos de embrión de pollo inmortal) en placas de seis pocillos (5 x 105 células por pocillo) con el Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% en una incubadora de CO2 al 5% a 38 °C.
- Cuando las células alcancen el 80% de confluencia, deseche el medio de cultivo celular que contiene suero, lave las células tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego agregue 2 ml de medio de cultivo celular sin suero a cada pocillo.
- Agregue la solución de virus IBDV (que contiene el MOI calculado) a cada pocillo y configure un control de infección simulado agregando el volumen de DMEM igual al de la solución de virus.
- Después de 1 h de adsorción del virus, desechar el medio de cultivo, lavar las células con PBS tres veces, añadir 2 mL de DMEM suplementado con FBS al 2% a cada pocillo y continuar con los cultivos celulares durante 24 h.
- 24 h después de la infección por IBDV, realizar un tratamiento con tripsina (500 μL por pocillo) durante 1 min y posteriormente neutralizar mediante DMEM suplementado con FBS al 10% (2 mL por pocillo). Posteriormente, las células deben recolectarse para preparar suspensiones unicelulares para la citometría de flujo.
- Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min a 2-8 °C. Deseche el sobrenadante con una pipeta.
- Vuelva a suspender el pellet de celda en PBS y agite suavemente los tubos durante 3 s.
- Centrifugar las células como se describe en el paso 1.6 (400 x g durante 5 min a 2-8 °C).
- Repita el lavado de células como se describe en los pasos 1.7 y 1.8.
- Realice el recuento de células con un hemocitómetro bajo un microscopio. A continuación, vuelva a suspender las células en un volumen adecuado de tampón de tinción por citometría de flujo (de modo que la concentración celular final sea de 1 x 107 células/ml). Vórtice suavemente las suspensiones.
2. Tinción celular para citometría de flujo
- Añada 100 μL de las suspensiones unicelulares del paso 1.10 en tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 mL (12 mm × 75 mm). Prepare células simuladas e infectadas con IBDV para la tinción de anticuerpos anti-chGSDME-NT/CT , y utilice IgG de ratón normal como control de isotipo. Mientras tanto, prepare tubos de control en blanco y de tinción única con células infectadas con IBDV.
- Agregue 1 μg de McAb anti-chGSDME-NT marcado con Alexa Fluor 647, McAb anti-chGSDME-CT o IgG de ratón normal (como control de isotipo) a los tubos infectados por IBDV y de control simulado, respectivamente. Posteriormente, vórtice suavemente los tubos durante 3 s.
- Incubar las células teñidas a 2-8 °C o en hielo durante 30 min en la oscuridad. Tubos de vórtice suave cada 10 min.
- Lavar las células con 1 mL de tampón de tinción por citometría de flujo por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 2-8 °C. Deseche el sobrenadante con una pipeta.
- Repita el lavado de las células como se describe en el paso 2.4.
- Vuelva a suspender el pellet en 100 μL de tampón de tinción por citometría de flujo.
- Teñir las células del grupo infectado por IBDV y del grupo infectado simulado, así como los tubos teñidos con PI individual, con 10 μg/ml de PI durante 10 min a temperatura ambiente, seguido de la adición de 400 μl de tampón de tinción por citometría de flujo para el ensayo de citometría de flujo.
3. Realización del ensayo de citometría de flujo
- Encienda el citómetro de flujo para inicializar el instrumento e iniciar el software.
- Comience con el funcionamiento del tubo de control en blanco, seguido de los tubos manchados individuales para ajustar el voltaje y los parámetros de compensación del citómetro de flujo. Utilice los canales de fluorescencia FL3 y FL4, que emiten a 635 nm, para detectar fluoróforos PI y Alexa Fluor 647, respectivamente.
- Después de configurar todos los parámetros, ejecute todos los ejemplos de forma secuencial.
4. Análisis de datos de citometría de flujo
- Analice la tinción de Alexa Fluor 647 de cada muestra en el histograma del canal FL4.
- Para evaluar la proporción de células dobles positivas en cada muestra, utilice el diagrama de puntos de cuatro cuadrantes de FL3/FL4.
- Establecer umbrales positivos basados en muestras de doble tinción de IgG/PI de control de isotipo, asegurando que la proporción de células dobles positivas se mantenga por debajo del 1%. Este enfoque facilita la medición de la proporción de células dobles positivas en todas las muestras.
Resultados
chGSDME-NT en la membrana de las células DF-1 con infección por IBDV pudo detectarse fácilmente mediante citometría de flujo
Una de las características más importantes de las células piroptóticas es la formación de poros de membrana por fragmentos de GSDM-NT generados a partir de la escisión de Gasdermin. Por lo tanto, las células piroptóticas podrían detectarse teóricamente mediante citometría de flujo mediante el examen de GSDM-NT en las membranas celulares utilizando anticuerpos específicos. Por lo tanto, las células DF-1 se infectaron con IBDV y las células piroptóticas se examinaron mediante citometría de flujo utilizando la tinción de McAb y PI anti-chGSDME-NT marcada con Alexa Fluor 647. Se detectó un número considerable de células chGSDME-NT positivas mediante citometría de flujo después de la infección por IBDV (Figura 1). Por el contrario, los controles infectados simulados o las células teñidas con IgG de control de isotipo mostraron un mínimo de células positivas para Alexa Fluor 647. Estos hallazgos demuestran la detección efectiva y específica de chGSDME-NT unido a la membrana mediante citometría de flujo. Cabe destacar que, dado que los fragmentos C-terminales de chGSDME escindido (chGSDME-CT) se retuvieron dentro del citoplasma en lugar de translocarse a la membrana plasmática como chGSDME-NT, los fragmentos de chGSDME-CT apenas fueron detectables por citometría de flujo utilizando tinción de antígeno de superficie de membrana, lo que concuerda con el hecho de que la piroptosis se asoció con fragmentos de chGSDME-NT unidos a la membrana.
La piroptosis en las células DF-1 se puede determinar mediante citometría de flujo utilizando tinción dual de células con McAb y PI anti-chGSDME-NT marcados con fluoresceína
Cuando las células se tiñeron dos veces con McAb y PI anti-chGSDME-NT marcados con Alexa Fluor 647, seguidos de un análisis de citometría de flujo en los canales de fluorescencia FL3 y FL4, las células piroptóticas pudieron determinarse mediante la tinción de chGSDME-NT y PI siendo positivas. Como se muestra en la Figura 2A,B, se detectó un número considerable de células chGSDME-NT positivas con infección por IBDV mediante ensayos de citometría de flujo, y la proporción de células chGSDME-NT/PI doble positivas en las células infectadas por IBDV (alrededor del 33%) fue significativamente mayor que la de los controles infectados simulados (P < 0,001), lo que sugiere que la formación de poros de membrana por el chGSDME-NT fue sincrónica con la ruptura de las membranas celulares, lo que provocó que estas células infectadas por IBDV sufrieran la muerte celular piroptótica. Estos datos muestran claramente que la infección por IBDV induce piroptosis mediada por chGSDME en las células huésped. Mientras que las células PI monopositivas pueden representar otras formas de muerte celular inducida por la infección por IBDV. Por lo tanto, el examen de chGSDME-NT formador de poros mediante citometría de flujo proporciona un método valioso para distinguir las células piroptóticas de las que experimentan otras formas de muerte celular.
Figura 1: Examen de las células unidas a chGSDME-NT mediante citometría de flujo. Las células DF-1 se infectaron simuladamente o se infectaron con IBDV con un MOI de 1. 24 h después de la infección, las células se recolectaron y se tiñeron con Alexa Fluor 647 marcado con anti-chGSDME-NT /anti-chGSDME-CT McAb o IgG de control de isotipo, y se analizaron con citometría de flujo. La tinción positiva de chGSDME-NT en el ensayo de citometría de flujo demostró las células chGSDME-NT unidas a la membrana con piroptosis inducida por IBDV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Examen de piroptosis por citometría de flujo mediante tinción dual con chGSDME-NT y PI. (A) Análisis de diagramas de puntos de células piroptóticas por citometría de flujo. Las células DF-1 se infectaron con IBDV con un MOI de 1. 24 h después de la infección, se recolectaron las células, se tiñeron con Alexa Fluor 647 anti-chGSDME-NT / anti-chGSDME-CT McAb y PI, y se analizaron con citometría de flujo. (B) Se graficó y analizó estadísticamente el porcentaje de células piroptóticas en cada grupo en (A). Se empleó ANOVA de dos vías para analizar la significación estadística. Los datos representaron tres experimentos independientes y se presentaron como medias ± la DE. ***P < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discusión
Este artículo describe un método eficaz para examinar la piroptosis mediante citometría de flujo, logrado mediante la tinción dual de células infectadas con McAb y PI anti-chGSDME-NT marcados con Alexa Fluor 647. Este enfoque también se puede aplicar en varios tipos de células para diferenciar la piroptosis de otros tipos de muerte celular, como la apoptosis y la necrosis.
La piroptosis, un tipo inflamatorio de muerte celular programada que depende principalmente de la formación de poros de la membrana plasmática inducida por Gasdermin (GSDM) D en mamíferos 1,2,3, se ha evaluado tradicionalmente a través de métodos como la liberación de LDH 6,15, las características morfológicas16 y la detección de fragmentos de GSDM-NT / GSDM-CT mediante ensayos de Western Blot o IFA17. Sin embargo, ninguno de estos métodos cuantifica con precisión el porcentaje de células piroptóticas. Este estudio aprovecha los poros característicos de la membrana plasmática en las células piroptóticas formadas por fragmentos de GSDM-NT para desarrollar una estrategia basada en citometría de flujo para su determinación.
Cuando las células se tiñeron dos veces con chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 y PI y posteriormente se analizaron mediante citometría de flujo en los canales de fluorescencia FL3 y FL4, la piroptosis fue discernible a través de dos parámetros simultáneos: la tinción de chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 que indica la formación de poros de la membrana plasmática por el fragmento N-terminal de chGSDME escindido, y la tinción de PI que indica la ruptura de la membrana plasmática. Los datos demuestran que la proporción de células doble positivas chGSDME-NT/PI en las células infectadas por IBDV (aproximadamente el 33%) fue significativamente mayor que en los controles infectados simulados (P < 0,001).
El método experimental requiere varias consideraciones para garantizar la precisión y la fiabilidad. En primer lugar, cada tubo de muestra utilizado para el análisis de flujo debe contener no menos de 1 x 106 celdas para mantener la precisión del análisis de flujo. Teniendo en cuenta los múltiples pasos de lavado del protocolo, es aconsejable aumentar el número inicial de células en cada tubo en el paso 2.1 en consecuencia, por ejemplo, a 2 x 106 células. Es crucial manejar el lavado y la transferencia de células con extrema precaución para evitar interrupciones involuntarias de la integridad de las células. Además, tenga en cuenta que la densidad celular, la concentración de anticuerpos y la duración de la operación pueden influir en la configuración óptima de los parámetros. Por lo tanto, es necesario ajustar los parámetros y la configuración del citómetro de flujo en función de las condiciones experimentales específicas. En este estudio, los parámetros utilizados fueron los siguientes: FSC AmpGain se ajustó a 1,40 y el voltaje SSC se ajustó a 490 V. La puerta en la parcela FSC/SSC se configuró para cubrir todas las poblaciones celulares para el análisis posterior del canal FL3/4. Los voltajes de fluorescencia se ajustaron a 600 V para el canal FL3 (PI) y 600 V para el canal FL4 (Alexa Fluor 647). La compensación se fijó en un 38,0% entre los canales FL4 y FL3. El caudal se estableció en 200 eventos/s, con un umbral de eventos establecido en 10.000.
Con la ayuda de este nuevo enfoque, esta comprensión del papel de la piroptosis mediada por GSDME en la respuesta del huésped a las infecciones patógenas en los pollos y los mecanismos subyacentes ha avanzado significativamente. Mediante el uso de anticuerpos específicos, pudimos examinar chGSDME-NT formador de poros mediante citometría de flujo, distinguiendo las células piroptóticas de otras y facilitando la determinación de la proporción de células sometidas a piroptosis. Como resultado, este método ofrece una clara ventaja sobre los ensayos Western Blot o IFA en la detección de células piroptóticas.
Sin embargo, la limitación de este protocolo radica en el uso del fragmento N-terminal de GSDME de pollo en células infectadas por IBDV como modelo experimental para el estudio de la piroptosis. No obstante, este estudio marca la primera utilización exitosa de la citometría de flujo para determinar la piroptosis.
En resumen, el método de citometría de flujo descrito aquí para examinar la piroptosis tiene un gran potencial para avanzar en nuestra comprensión de los mecanismos detrás de la piroptosis tanto en mamíferos como en aves. Este método se erige como una herramienta eficaz que contribuye a la investigación sobre la muerte celular en las ciencias de la vida.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer al Dr. Jue Liu por su amable asistencia. Este estudio contó con el apoyo de subvenciones del Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (No. 2022YFD1800300), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 32130105) y el Fondo Asignado para el Sistema de Investigación de Tecnología Agroindustrial Moderna (No. CARS-40), China.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 mL (12 y veces; 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
| Placa de cultivo celular de 6 pocillos | Corning | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | Empresa de tecnología biomédica SAE (Zhongshan, China) | EU0227 | |
| Software CellQuest | BD Biosciences | ||
| Incubadora de CO2 | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
| Eppendorf | 5810R | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Citómetro de flujo | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Citometría de flujo Tampón de tinción | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Hemocitómetro | Qiu-jing Reactivo bioquímico & Compañía de instrumentos (Shanghai, China) | YX-JSB52 | |
| Cepa IBDV Lx | La cepa IBDV Lx fue amablemente proporcionada por el Dr. Jue Liu, Academia de Agricultura y Silvicultura de Beijing, Beijing, China | ||
| M& C Tecnología génica | CC017 | ||
| Yoduro de propidio (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Tripsina-EDTA, 0,25% | M& C Gene Technology | CC008 | |
| Oscilador de vórtice | MIULAB | MIX-28+ |
Referencias
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