En este artículo se describe la identificación de células piroptóticas mediante citometría de flujo tras tinción dual con anticuerpos contra el fragmento N-terminal de GSDME de pollo (chGSDME-NT) y yoduro de propidio (PI).
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Examen de la piroptosis por citometría de flujo
En este artículo
Resumen
Resumen
La piroptosis es un tipo inflamatorio de muerte celular programada impulsada predominantemente por la formación de poros de la membrana plasmática por el N-terminal generado a partir de las proteínas de la familia Gasdermin escindida (GSDM). El examen de GSDM-NT unido a la membrana mediante Western Blot es el método más utilizado para evaluar la piroptosis. Sin embargo, es difícil diferenciar las células con piroptosis de otras formas de muerte celular utilizando este método. En este estudio, se emplearon células DF-1 infectadas por el virus de la bursitis infecciosa (IBDV) como modelo para cuantificar la proporción de células sometidas a piroptosis por citometría de flujo, utilizando anticuerpos específicos contra el fragmento N-terminal de GSDME de pollo (chGSDME-NT) y la tinción de yoduro de propidio (PI). Las células chGSDME-NT positivas fueron fácilmente detectables por citometría de flujo utilizando anticuerpos anti-chGSDME-NT marcados con Alexa Fluor 647. Además, la proporción de células doble positivas chGSDME-NT/PI en las células infectadas por IBDV (alrededor del 33%) fue significativamente mayor que en los controles infectados simulados (P < 0,001). Estos hallazgos indican que el examen de chGSDME-NT unido a la membrana mediante citometría de flujo es un enfoque eficaz para determinar las células piroptóticas entre las células que experimentan muerte celular.
Introducción
La piroptosis es un tipo inflamatorio de muerte celular programada que depende principalmente de la formación de poros de la membrana plasmática por Gasdermin (GSDM) D en mamíferos 1,2,3. Debido a la deficiencia genética de GSDMD en pollos 4,5, el mecanismo de la piroptosis en pollos sigue siendo difícil de alcanzar. La familia Gasdermin comprende proteínas conservadas, incluyendo GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME y DFNB59 3,6. Los estudios han informado que la GSDME de peces y patos teleósteos es escindida por caspasa-1/3/7 o caspasa-3/7 para inducir la muerte celular piroptótica 7,8. Sin embargo, el papel de la piroptosis mediada por GSDME en la respuesta del huésped a las infecciones patógenas en los pollos aún no se ha dilucidado.
La enfermedad infecciosa de la bolsa (EII) es una enfermedad avícola aguda, altamente contagiosa e inmunosupresora causada por el IBDV9. El IBDV, un virus de ARN bicatenario (ds) bisegmentado sin envoltura, pertenece al género Avibirnavirus de la familia Birnaviridae10. Estudios previos realizados por otros y nuestro laboratorio han demostrado que la infección por IBDV induce la muerte celular en las células huésped a través de diferentes vías 11,12,13,14. Hallazgos previos han demostrado que la infección por IBDV desencadena la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH), un indicador de muerte de células líticas 6,15, lo que sugiere que la infección por IBDV induce la muerte de células líticas en las células huésped. Además, los datos muestran que las células infectadas por IBDV exhiben características morfológicas de muerte celular piroptótica, incluida la hinchazón celular con grandes burbujas que salen de la membrana plasmática y la tinción positiva de yoduro de propidio (PI), lo que sugiere que la infección por IBDV induce piroptosis en las células.
Teniendo en cuenta que la formación de poros de membrana en las células piroptóticas por el fragmento N-terminal de GSDM escindido (GSDM-NT) es un sello distintivo de la piroptosis, teóricamente, las células piroptóticas podrían detectarse por citometría de flujo mediante el examen de GSDM-NT en la membrana celular utilizando anticuerpos específicos. En las células piroptóticas aviares, el fragmento N-terminal de la gasdermina E de pollo (chGSDME-NT) forma poros en la membrana, lo que permite que el yoduro de propidio (PI) pase a través del ADN y se una a él. De este modo, la proporción de células piroptóticas puede detectarse mediante citometría de flujo, distinguiendo así la piroptosis de otras formas de muerte celular, como la apoptosis y la necrosis. Sin embargo, no se ha descrito el método para examinar las células piroptóticas mediante citometría de flujo. En este estudio, las células DF-1 se infectaron con IBDV y se realizó una citometría de flujo para examinar las células piroptóticas utilizando anticuerpos monoclonales (McAb) contra el fragmento chGSDME-NT (unido a la membrana) y la tinción de PI. Sorprendentemente, las células piroptóticas se detectaron eficazmente mediante citometría de flujo. Además, se pudo cuantificar la proporción de células piroptóticas. Estos hallazgos proporcionan un medio poderoso y eficaz para determinar la piroptosis.
En este artículo se describe un método para examinar la piroptosis en células infectadas por IBDV mediante citometría de flujo utilizando tinción anti-chGSDME-NT, McAb y PI. Este método también puede extenderse a otras células infectadas por patógenos y aplicarse para examinar varios tipos de células con piroptosis, distinguiéndolas de otras formas de muerte celular.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de las células de muestra
- Cultivo de células DF-1 (fibroblastos de embrión de pollo inmortal) en placas de seis pocillos (5 x 105 células por pocillo) con el Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% en una incubadora de CO2 al 5% a 38 °C.
- Cuando las células alcancen el 80% de confluencia, deseche el medio de cultivo celular que contiene suero, lave las células tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego agregue 2 ml de medio de cultivo celular sin suero a cada pocillo.
- Agregue la solución de virus IBDV (que contiene el MOI calculado) a cada pocillo y configure un control de infección simulado agregando el volumen de DMEM igual al de la solución de virus.
- Después de 1 h de adsorción del virus, desechar el medio de cultivo, lavar las células con PBS tres veces, añadir 2 mL de DMEM suplementado con FBS al 2% a cada pocillo y continuar con los cultivos celulares durante 24 h.
- 24 h después de la infección por IBDV, realizar un tratamiento con tripsina (500 μL por pocillo) durante 1 min y posteriormente neutralizar mediante DMEM suplementado con FBS al 10% (2 mL por pocillo). Posteriormente, las células deben recolectarse para preparar suspensiones unicelulares para la citometría de flujo.
- Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min a 2-8 °C. Deseche el sobrenadante con una pipeta.
- Vuelva a suspender el pellet de celda en PBS y agite suavemente los tubos durante 3 s.
- Centrifugar las células como se describe en el paso 1.6 (400 x g durante 5 min a 2-8 °C).
- Repita el lavado de células como se describe en los pasos 1.7 y 1.8.
- Realice el recuento de células con un hemocitómetro bajo un microscopio. A continuación, vuelva a suspender las células en un volumen adecuado de tampón de tinción por citometría de flujo (de modo que la concentración celular final sea de 1 x 107 células/ml). Vórtice suavemente las suspensiones.
2. Tinción celular para citometría de flujo
- Añada 100 μL de las suspensiones unicelulares del paso 1.10 en tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 mL (12 mm × 75 mm). Prepare células simuladas e infectadas con IBDV para la tinción de anticuerpos anti-chGSDME-NT/CT , y utilice IgG de ratón normal como control de isotipo. Mientras tanto, prepare tubos de control en blanco y de tinción única con células infectadas con IBDV.
- Agregue 1 μg de McAb anti-chGSDME-NT marcado con Alexa Fluor 647, McAb anti-chGSDME-CT o IgG de ratón normal (como control de isotipo) a los tubos infectados por IBDV y de control simulado, respectivamente. Posteriormente, vórtice suavemente los tubos durante 3 s.
- Incubar las células teñidas a 2-8 °C o en hielo durante 30 min en la oscuridad. Tubos de vórtice suave cada 10 min.
- Lavar las células con 1 mL de tampón de tinción por citometría de flujo por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 2-8 °C. Deseche el sobrenadante con una pipeta.
- Repita el lavado de las células como se describe en el paso 2.4.
- Vuelva a suspender el pellet en 100 μL de tampón de tinción por citometría de flujo.
- Teñir las células del grupo infectado por IBDV y del grupo infectado simulado, así como los tubos teñidos con PI individual, con 10 μg/ml de PI durante 10 min a temperatura ambiente, seguido de la adición de 400 μl de tampón de tinción por citometría de flujo para el ensayo de citometría de flujo.
3. Realización del ensayo de citometría de flujo
- Encienda el citómetro de flujo para inicializar el instrumento e iniciar el software.
- Comience con el funcionamiento del tubo de control en blanco, seguido de los tubos manchados individuales para ajustar el voltaje y los parámetros de compensación del citómetro de flujo. Utilice los canales de fluorescencia FL3 y FL4, que emiten a 635 nm, para detectar fluoróforos PI y Alexa Fluor 647, respectivamente.
- Después de configurar todos los parámetros, ejecute todos los ejemplos de forma secuencial.
4. Análisis de datos de citometría de flujo
- Analice la tinción de Alexa Fluor 647 de cada muestra en el histograma del canal FL4.
- Para evaluar la proporción de células dobles positivas en cada muestra, utilice el diagrama de puntos de cuatro cuadrantes de FL3/FL4.
- Establecer umbrales positivos basados en muestras de doble tinción de IgG/PI de control de isotipo, asegurando que la proporción de células dobles positivas se mantenga por debajo del 1%. Este enfoque facilita la medición de la proporción de células dobles positivas en todas las muestras.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
chGSDME-NT en la membrana de las células DF-1 con infección por IBDV pudo detectarse fácilmente mediante citometría de flujo
Una de las características más importantes de las células piroptóticas es la formación de poros de membrana por fragmentos de GSDM-NT generados a partir de la escisión de Gasdermin. Por lo tanto, las células piroptóticas podrían detectarse teóricamente mediante citometría de flujo mediante el examen de GSDM-NT en las membranas celulares utilizando ...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este artículo describe un método eficaz para examinar la piroptosis mediante citometría de flujo, logrado mediante la tinción dual de células infectadas con McAb y PI anti-chGSDME-NT marcados con Alexa Fluor 647. Este enfoque también se puede aplicar en varios tipos de células para diferenciar la piroptosis de otros tipos de muerte celular, como la apoptosis y la necrosis.
La piroptosis, un tipo inflamatorio de muerte celular programada que depende principalmente de la formación de ...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer al Dr. Jue Liu por su amable asistencia. Este estudio contó con el apoyo de subvenciones del Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (No. 2022YFD1800300), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 32130105) y el Fondo Asignado para el Sistema de Investigación de Tecnología Agroindustrial Moderna (No. CARS-40), China.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 mL (12 y veces; 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
| Placa de cultivo celular de 6 pocillos | Corning | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | Empresa de tecnología biomédica SAE (Zhongshan, China) | EU0227 | |
| Software CellQuest | BD Biosciences | ||
| Incubadora de CO2 | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
| Eppendorf | 5810R | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Citómetro de flujo | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Citometría de flujo Tampón de tinción | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Hemocitómetro | Qiu-jing Reactivo bioquímico & Compañía de instrumentos (Shanghai, China) | YX-JSB52 | |
| Cepa IBDV Lx | La cepa IBDV Lx fue amablemente proporcionada por el Dr. Jue Liu, Academia de Agricultura y Silvicultura de Beijing, Beijing, China | ||
| M& C Tecnología génica | CC017 | ||
| Yoduro de propidio (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Tripsina-EDTA, 0,25% | M& C Gene Technology | CC008 | |
| Oscilador de vórtice | MIULAB | MIX-28+ |
Referencias
- He, W. T., et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion. Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).
- Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Angosto-Bazarra, D., et al. Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality. BMC Biol. 20 (1), 9(2022).
- De Schutter, E., et al. Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins. Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).
- Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
- Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis. J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).
- Li, H., et al. Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis. Front Immunol. 13, 1078526(2022).
- Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future. Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).
- Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA. J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).
- Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha. J Virol. 92 (11), (2018).
- Duan, X., et al. Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication. J Virol. 94 (2), e01724(2020).
- Li, Z., et al. Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5. J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).
- Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).
- Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. Methods for monitoring cancer cell pyroptosis. Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis. Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
