Recientemente identificamos el endurecimiento capilar de la retina como un nuevo paradigma para la disfunción retiniana asociada con la diabetes. Este protocolo detalla los pasos para el aislamiento de los capilares de la retina del ratón y la matriz subendotelial de los cultivos endoteliales de la retina, seguido de una descripción de la técnica de medición de la rigidez mediante microscopía de fuerza atómica.
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Artículo de método
Aislamiento de capilares retinianos y matriz subendotelial de ratón para la medición de la rigidez mediante microscopía de fuerza atómica
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Resumen
Resumen
La degeneración capilar de la retina es un sello clínico de las primeras etapas de la retinopatía diabética (RD). Nuestros estudios recientes han revelado que el endurecimiento capilar de la retina inducido por la diabetes desempeña un papel causal crucial y previamente no reconocido en la degeneración de los capilares de la retina mediada por la inflamación. El aumento de la rigidez capilar de la retina es el resultado de la sobreexpresión de la lisil oxidasa, una enzima que se entrecruza y endurece la matriz subendotelial. Dado que se espera que el abordaje de la RD en una etapa temprana prevenga o ralentice la progresión de la RD y la pérdida de visión asociada, la matriz subendotelial y la rigidez capilar representan objetivos terapéuticos relevantes y novedosos para el tratamiento temprano de la RD. Además, la medición directa de la rigidez capilar de la retina puede servir como un paso crucial de validación preclínica para el desarrollo de nuevas técnicas de imagen para la evaluación no invasiva de la rigidez capilar de la retina en sujetos animales y humanos. Con este punto de vista en mente, aquí proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento y la medición de la rigidez de los capilares de la retina y la matriz subendotelial de ratón utilizando microscopía de fuerza atómica.
Introducción
Los capilares de la retina son esenciales para mantener la homeostasis de la retina y la función visual. De hecho, su degeneración en la diabetes temprana está fuertemente implicada en el desarrollo de complicaciones amenazantes para la visión de la retinopatía diabética (RD), una afección microvascular que afecta a casi el 40% de todos los individuoscon diabetes. La inflamación vascular contribuye significativamente a la degeneración capilar de la retina en la RD. Estudios anteriores han demostrado un papel importante de las señales moleculares y bioquímicas aberrantes en la inflamación vascular de la retina inducida por la diabetes 2,3. Sin embargo, trabajos recientes han introducido un nuevo paradigma para la patogénesis de la RD que identifica el endurecimiento capilar de la retina como un determinante crucial aún no reconocido de la inflamación y degeneración vascular de la retina 4,5,6.
Específicamente, el aumento de la rigidez capilar de la retina inducido por la diabetes es causado por la regulación positiva de la enzima reticulante de colágeno lisil oxidasa (LOX) en las células endoteliales de la retina (EC), lo que endurece la matriz subendotelial (membrana basal)4,5,6. El endurecimiento de la matriz, a su vez, endurece las CE retinianas suprayacentes (debido a la reciprocidad mecánica), lo que conduce al aumento general de la rigidez capilar de la retina4. De manera crucial, este endurecimiento capilar de la retina inducido por la diabetes por sí solo puede promover la activación de la EC en la retina y la muerte de la EC mediada por la inflamación. Esta regulación mecánica de los defectos de la CE en la retina puede atribuirse a la alteración de la mecanotransducción endotelial, el proceso por el cual las señales mecánicas se convierten en señales bioquímicas para producir una respuesta biológica 7,8,9. Es importante destacar que las señales mecánicas alteradas de la CE y la estructura de la matriz subendotelial también se han implicado en la degeneración vascular coroidea asociada con la degeneración macular asociada a la edad temprana (DMAE)10,11,12, lo que atestigua las implicaciones más amplias de la mecanobiología vascular en las enfermedades degenerativas de la retina.
En particular, el endurecimiento capilar de la retina se produce al principio de la diabetes, que coincide con el inicio de la inflamación de la retina. Por lo tanto, el aumento de la rigidez capilar de la retina puede servir como diana terapéutica y como marcador de diagnóstico precoz de la RD. Para ello, es importante obtener mediciones fiables y directas de la rigidez de los capilares de la retina y de la matriz subendotelial. Esto se puede lograr mediante el uso de un microscopio de fuerza atómica (AFM), que ofrece una técnica única, sensible, precisa y confiable para medir directamente la rigidez de las células, la matriz extracelular y los tejidos13. Un AFM aplica una fuerza de indentación diminuta (a nivel de nanoNewton) sobre la muestra cuya rigidez determina el grado en que se dobla el voladizo del AFM con indentación: cuanto más rígida es la muestra, más se dobla el voladizo y viceversa. Hemos utilizado ampliamente la AFM para medir la rigidez de células endoteliales cultivadas, matrices subendoteliales y capilares retinianos aislados de ratón 4,5,6,11,12. Estas mediciones de la rigidez de AFM han ayudado a identificar la mecanobiología endotelial como un determinante clave de la patogénesis de la RD y la DMAE. Para ayudar a ampliar el alcance de la mecanobiología en la investigación de la visión, aquí proporcionamos una guía paso a paso sobre el uso de AFM para mediciones de rigidez de capilares retinianos aislados de ratón y matriz subendotelial.
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Protocolo
Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión y fueron aprobados por los Comités Institucionales de Uso de Animales y Cuidado (IACUC; número de protocolo ARC-2020-030) de la Universidad de California, Los Ángeles (número de garantía de bienestar animal de la institución OLAW A3196-01). El siguiente protocolo se ha realizado utilizando capilares retinianos aislados de ratones machos C57BL/6J adultos (20 semanas de edad) con un peso de ~25 g (ratones diabéticos) y ~32 g (ratones no diabéticos; Laboratorio Jackson).
1. Aislamiento de capilares retinianos de ratón para la medición de la rigidez de AFM (Días 1-4)
NOTA: Este protocolo, reportado en un estudio reciente4, detalla la enucleación y la fijación leve del ojo del ratón, el aislamiento de la retina y la digestión de la tripsina, y el posterior montaje de la vasculatura de la retina resultante en portaobjetos de microscopía para la medición de la rigidez de la AFM.
- Enucleación y fijación leve (Día 1)
- Después de sacrificar al ratón con exposición al dióxido de carbono seguida de dislocación cervical, inserte micropinzas detrás del globo ocular, sujete la unión muscular y saque con cuidado el ojo sin apretar demasiado las micropinzas, lo que podría cortar el nervio óptico.
- Colocar el ojo enucleado en formol al 5% (v/v) en PBS durante 24 h a 4 °C para una fijación suave.
NOTA: Sobre la base de la experiencia4, los ojos no fijos o más levemente fijos producen capilares frágiles que se fragmentan durante la preparación de la muestra de AFM y la medición de la rigidez.
- Aislamiento de la retina (Día 2)
- Coloque el ojo fijo en un pedazo de papel encerado bajo un microscopio de disección. A continuación, con micropinzas, sujete los restos del músculo y el nervio óptico unidos a la parte exterior del ojo posterior y oriente el ojo de modo que la córnea mire hacia un lado (Figura 1).
- Con ayuda de una cuchilla quirúrgica, haga una incisión de 1-2 mm por detrás y paralela al limbo (unión córnea-esclerótica). A continuación, mientras mantiene el ojo en su lugar con las micropinzas, aplique una fuerza hacia abajo con la cuchilla y continúe presionando hasta que el segmento anterior del ojo esté totalmente separado del extremo posterior (Figura 1). Deseche el segmento anterior y el cristalino. No corte de un lado a otro, ya que eso puede causar daño en la retina.
- Transfiera el segmento posterior (esclerótica, coroides y retina) a una placa de 6 cm llena de PBS (pH 7,4).
- Con una microespátula y sujetando suavemente el nervio óptico con micropinzas, saque la retina. Almacene la retina en un tubo de microcentrífuga de 2 mL que contenga PBS a 4 °C hasta el aislamiento capilar.
- Enjuagues retinianos
- Para enjuagar una retina, llene seis pocillos de una placa de 12 pocillos con 1 mL de H2O (ddH2O) destilado doble. A continuación, con una pipeta Pasteur invertida, transfiera la retina del tubo de microcentrífuga de 2 ml al primer pocillo.
- Enjuague la retina del agitador orbital a 120 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT).
- Con una pipeta P1000, pipetee cuidadosamente el agua hacia arriba y hacia abajo adyacente a la retina, soplando agua en la retina para causar una agitación suave.
- Con la pipeta de vidrio invertido, transfiera la retina al segundo pocillo y repita los pasos 1.3.2 y 1.3.3 4 veces, con cada enjuague realizado en un pocillo nuevo (que contiene ddH2O).
- Finalmente, transfiera la retina al sexto pocillo y enjuáguela durante la noche (O/N) a RT en el agitador orbital ajustado a 100 RPM para facilitar la separación de la neuroglía retiniana de los vasos sanguíneos durante la digestión con tripsina.
- Digestión retiniana de tripsina (Día 3)
- Prepare una solución de tripsina al 10% (p/v) disolviendo el polvo de tripsina 1:250 en tampón Tris (pH 8; 0,1 M). Mezcle suavemente invirtiendo el tubo cónico varias veces para minimizar la formación de burbujas, lo que dificulta la confirmación de la solubilidad de la tripsina.
- Equilibrar la solución de tripsina al 10% en un baño de agua a 37 °C durante 10-15 min. Una vez que el polvo de tripsina se haya disuelto por completo, filtre la solución con un filtro de jeringa de 0,2 μm.
- En una placa de 12 pocillos, agregue 2 mL/pocillo/retina de la solución filtrada de tripsina al 10%. Agregue un poco de solución de tripsina adicional en el pocillo vecino (para equilibrar las paredes de la pipeta de vidrio para los pasos posteriores).
- Agregue 3 mL de ddH2O en tres pocillos de una placa de 6 pocillos (dedique estos tres pocillos para una retina).
- En un tubo cónico de 15 ml, inserte una punta P200 antes de agregar 4 ml de la solución de tripsina filtrada al 10%. Transfiera este tubo cónico al baño a 37 °C para permitir que la punta se empape en tripsina durante 2-3 minutos, ya que eso ayuda a evitar que la retina se pegue a las paredes de la punta en los últimos pasos.
- Después del enjuague O/N de la retina (a partir del paso 1.3.5), utilice una pipeta P1000 para pipetear cuidadosamente el agua hacia arriba y hacia abajo adyacente a la retina, chorreando agua sobre la retina para provocar una agitación suave.
- Con una pipeta de vidrio invertido, transfiera la retina enjuagada al pocillo que contiene tripsina de la placa de 12 pocillos (del paso 1.4.3). Asegúrese de que la retina se transfiera con una cantidad mínima de ddH2O residual para no diluir significativamente la solución de tripsina. Incubar durante 3 h a 37 °C.
- Centrando la punta P200 empapada en tripsina (del paso 1.4.5) en el área del nervio óptico, pipetear suavemente toda la red vascular hacia arriba y hacia abajo para disociar el tejido no vascular14.
- Utilizando una pipeta de vidrio invertido previamente enjuagada con tripsina (pipeteando tripsina hacia arriba y hacia abajo 5 veces), transfiera la vasculatura de la retina al primer pocillo que contieneddH2O de la placa de 6 pocillos (del paso 1.4.4).
- Gire la placa y pipetee la vasculatura hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de vidrio enjuagada con tripsina invertida para eliminar cualquier tejido no vascular residual.
- Con la pipeta de vidrio, transfiera la vasculatura de la retina al segundo pocillo que contiene ddH2O de la placa de 6 pocillos y guárdela a 4 °C hasta que se monte en el portaobjetos para la medición de la rigidez del AFM.
NOTA: La vasculatura retiniana hidratada (en PBS) permanece estructuralmente intacta a 4 °C durante un máximo de 2 semanas. Sin embargo, las mediciones rutinarias de rigidez deben realizarse a partir de capilares recién aislados.
- Montaje de la vasculatura de la retina para la medición de la rigidez de la AFM (día 4)
- Con una pipeta de vidrio enjuagada con tripsina invertida, transfiera la vasculatura de la retina al tercer pocillo que contiene ddH2O de la placa de 6 pocillos para eliminar cualquier solución de tripsina residual.
- Limpie a fondo (con ddH2O y un pañuelo de limpieza) un portaobjetos de microscopía de superficie cargado que se utilizará para montar la red vascular para la medición de la rigidez de la MFA.
NOTA: La superficie cargada del portaobjetos proporciona una fuerte unión para la red vascular durante la medición de la MFA. - Etiquete el portaobjetos y dibuje una región circular de 4-5 cm alrededor del centro con un bolígrafo hidrofóbico para evitar derrames de agua durante los pasos posteriores.
- Con una pipeta de vidrio enjuagada con tripsina invertida, transfiera cuidadosamente la vasculatura de la retina al centro de la región marcada.
- Con una pipeta P200, elimine con cuidado la mayor cantidad posible de agua de un borde sin aspirar accidentalmente la vasculatura hacia la punta.
- Coloque el portaobjetos en una cabina de bioseguridad (campana BSL-2) cerca de la parte delantera (malla filtrada) y deje que el agua residual se evapore.
- Una vez que la vasculatura esté casi seca, bajo un microscopio de contraste de fase (aumento de 4x), rehidrate cuidadosamente la vasculatura añadiendo lentamente ddH2O con una pipeta P200 en un lado de la región marcada. La adición de ddH2O directamente sobre la vasculatura hace que se desprenda.
- Tome imágenes de contraste de fase de la vasculatura rehidratada con aumentos de 4x y 20x para asegurarse de que tenga una buena integridad estructural y esté correctamente extendida (no doblada sobre sí misma) y unida al portaobjetos de vidrio, que son criterios esenciales para la medición confiable de la rigidez de AFM.
2. Obtención de matriz subendotelial a partir de cultivos de células endoteliales microvasculares (REC) de retina (Días 1-17)
NOTA: Este protocolo, adaptado de Beacham et al.15 y reportado en estudios recientes 4,5,6, describe el cultivo de REC en cubreobjetos de vidrio modificados, seguido de descelularización para obtener una matriz subendotelial para la posterior medición de la rigidez de la AFM.
- Preparación de cubreobjetos de vidrio recubiertos de gelatina y recubrimiento celular (Día 1)
NOTA: Realice el recubrimiento de gelatina y los pasos posteriores de enjuague de PBS++ en una campana de cultivo de tejidos antes de pasar a una campana de humo químico para los pasos posteriores de tratamiento con glutaraldehído y etanolamina.- Coloque un cubreobjetos de vidrio circular de 12 mm de diámetro esterilizado en autoclave por pocillo de una placa estéril de 24 pocillos y agregue 500 μL de gelatina estéril precalentada al 0,2% (p/v) (diluida en PBS que contiene calcio y magnesio; PBS++) a cada pocillo que contenga cubreobjetos. Incubar durante 1 h a 37 °C.
- Aspire la solución de gelatina, enjuague los cubreobjetos una vez con PBS++ estéril y reticule la gelatina recubierta agregando 500 μL de glutaraldehído al 1% (v/v) durante 30 min a RT.
- Recoja y deseche adecuadamente (según las pautas institucionales) la solución de glutaraldehído antes de enjuagar los cubreobjetos con PBS++ durante 5 minutos en un agitador orbital a 100 RPM en RT. Repita este paso de enjuague 5 veces. Durante los tres primeros enjuagues, levante los cubreobjetos con una pinza estéril para permitir un enjuague completo del glutaraldehído. Cualquier cantidad residual puede reducir la viabilidad celular.
- Agregue 800 μL de etanolamina 1 M al cubreobjetos reticulado de gelatina durante 30 min a RT para apagar cualquier rastro restante de glutaraldehído en el pocillo.
- Recoja y deseche adecuadamente (según las pautas institucionales) la solución de etanolamina y enjuague los cubreobjetos 5 veces con PBS++ durante 5 minutos en un agitador orbital a 100 rpm en RT. Durante los tres primeros enjuagues, levante los cubreobjetos con una pinza estéril para permitir un enjuague completo de la etanolamina. Cualquier cantidad residual puede reducir la viabilidad celular.
- Los cubreobjetos reticulados ya están listos para el recubrimiento de celdas.
NOTA: A pesar de que rutinariamente colocamos células inmediatamente después de la preparación del cubreobjetos, puede valer la pena comparar la siembra de células en cubreobjetos de gelatina reticulada almacenados en PBS++ a 4 °C durante 1-2 días. - En condiciones estériles en una campana de cultivo de tejidos, placas de células endoteliales microvasculares (REC) de la retina en un medio/pocillo de 500 μL a una densidad que alcanza el 100% de confluencia en 24 h, como lo confirma la microscopía de contraste de fase.
NOTA: Es importante alcanzar la confluencia dentro de las 24 horas, ya que la quietud REC resultante aumentará la capacidad de las células para secretar matriz (consulte el siguiente paso). En nuestra experiencia con RECs humanos, una densidad de recubrimiento de 4 x 104 células/cm2 es suficiente para alcanzar la confluencia en 24 h. Sin embargo, dado que el tamaño del REC varía según la especie (por ejemplo, los REC de ratón son significativamente más pequeños), puede ser necesario optimizar la densidad inicial de siembra.
- Producción de matriz subendotelial por cultivo REC (Día 2-16)
- Después de que las células alcancen la confluencia (~24 h), reemplace el medio de cultivo con medio fresco suplementado con ácido ascórbico filtrado estéril (concentración final de 200 μg/mL).
NOTA: Cualquier tratamiento de REC con factores de riesgo de enfermedad (por ejemplo, glucosa alta, productos finales de glicación avanzada, etc.) o agentes farmacológicos puede comenzar ahora, junto con el tratamiento con ácido ascórbico. - Cambie el medio de cultivo suplementado con ácido ascórbico cada dos días durante 15 días.
NOTA: El ácido ascórbico es inestable en solución. Prepare una solución madre fresca 100X cada dos días para una suplementación media.
- Después de que las células alcancen la confluencia (~24 h), reemplace el medio de cultivo con medio fresco suplementado con ácido ascórbico filtrado estéril (concentración final de 200 μg/mL).
- Descelularización de cultivos REC para la obtención de la matriz subendotelial (Día 16)
- Después de 15 días de tratamiento con ácido ascórbico, retire el medio y enjuague las células con PBS sin calcio/magnesio.
- Descelularice los cultivos REC añadiendo 250 μL/por pocillo de tampón de descelularización caliente (20 mM de hidróxido de amonio y Triton X-100 al 0,5% en PBS) durante ~2-3 min. Confirme la extracción de células bajo un microscopio de contraste de fase (aumento de 10x).
- Retire suavemente el tampón de descelularización sin alterar la matriz subendotelial secretada por REC y añada 0,5 mL de PBS a cada pocillo.
NOTA: Para asegurarse de que la matriz subendotelial no se desprenda durante este y los siguientes pasos de enjuague, realice un enjuague suave solo con una pipeta P1000. No realice aspiración endouterina. - Almacene las placas a 4 °C durante la noche para estabilizar la matriz secretada por REC.
- Tratamiento con DNasa de la matriz subendotelial para eliminar los restos celulares (Día 17)
- Enjuague la matriz subendotelial del paso 2.3.4 con 800 μL de PBS/pocillo.
- Retire suavemente el PBS e incube la matriz con 200 μL de DNasa I libre de RNasa (unidades de 30 K) a 37 °C durante 30 minutos para eliminar todos los rastros de restos celulares. Compruebe la eficacia del tratamiento con DNasa buscando cuidadosamente restos celulares bajo un microscopio de contraste de fase.
- Retire suavemente la solución de DNasa I y enjuague la matriz subendotelial dos veces con 800 μL de PBS/pocillo.
- Compruebe que la matriz subendotelial fibrosa a macroescala es visible bajo un microscopio de contraste de fase (aumento de 10x). La visualización de las fibras más finas de la matriz a nanoescala requiere un escaneo topográfico AFM o imágenes confocales de alta resolución de proteínas de la matriz inmunomarcadas con un aumento de 100x.
- Utilice inmediatamente la matriz subendotelial nueva (no fijada) para la medición de la rigidez de AFM.
- Después de la medición de AFM, fije las muestras de la matriz con paraformaldehído al 1% (v/v) (15 min a temperatura ambiente) y almacene a 4 °C para el inmunomarcaje con anticuerpos contra proteínas de la matriz subendotelial y/o enzimas de reticulación.
3. Medición de la rigidez AFM
NOTA: Este protocolo, adaptado de un manual de usuario estándar de AFM y reportado en estudios recientes 4,5, detalla la adquisición y el análisis de datos de rigidez de los capilares de la retina y la matriz subendotelial utilizando un AFM y un software de análisis de datos. Aunque los pasos que se describen a continuación se basan en un modelo específico de AFM (consulte la Tabla de materiales), los principios subyacentes son generalmente aplicables a todos los modelos de AFM.
- Selección de sonda en voladizo
NOTA: Las muestras biológicas blandas requieren voladizos blandos que puedan doblarse al indentarse la muestra mientras se seleccionan las dimensiones de la sonda para que coincidan con las dimensiones de la muestra.- Para la medición de la rigidez de vasos retinianos de ratón de 5-8 μm de diámetro, utilice una sonda en voladizo de 1 μm de radio con una constante de resorte (k) de 0,2-0,3 N/m. Para la medición de la rigidez de una matriz subendotelial compuesta por fibras a nanoescala, utilice una sonda en voladizo de 70 nm de radio con una constante de resorte (k) de 0,06-0,1 N/m.
- Montaje en voladizo
- En el equipo AFM, abra el software que controla la unidad AFM y la cámara conectada a un microscopio de contraste de fase que se utiliza para visualizar el voladizo y la muestra.
- Fije el soporte en voladizo en el soporte de cambio de voladizo y monte el voladizo seleccionado en el soporte con pinzas de relojero debajo de un estereoscopio sin dañar físicamente el voladizo. Apriete el tornillo del soporte para asegurar el voladizo.
- Coloque y bloquee el soporte en voladizo en el cabezal AFM que descansa sobre el soporte.
- Usando la función de motor paso a paso en el software AFM, retire el cabezal AFM al punto más alto y establezca esa posición como punto cero en el software. Este paso evita que el voladizo AFM golpee accidentalmente la etapa de muestra mientras se monta el cabezal AFM (siguiente paso).
- Levante con cuidado el cabezal AFM de su soporte y móntelo en la platina de muestra AFM colocando las patas en sus respectivas ranuras.
- Alineación láser
NOTA: La alineación láser inicial se realiza sin ninguna muestra (es decir, en modo Aire), ya que garantiza una alineación más precisa del rayo láser en la punta del voladizo (al evitar la refracción del láser en el líquido). Sin embargo, como las muestras biológicas se sumergen en un medio que tiene un índice de refracción diferente al del aire, es importante realinear el láser en el medio antes de la medición de la rigidez.- Para la alineación láser en el aire, coloque el cabezal AFM en la platina de muestra y utilice el objetivo 10x y la cámara adjunta para visualizar el voladizo en el monitor en modo en vivo. El láser infrarrojo está oculto a la vista del usuario, pero es visible con una cámara CCD.
- Seleccione la función Espectroscopía de fuerza en modo de contacto en el software y abra la ventana titulada Alineación láser.
- Usando los dos tornillos marcados como laterales láser en la cabeza del AFM, enfoque el rayo láser en el voladizo de modo que el valor SUM en la ventana de alineación láser sea el más alto. Para lograr esto, enfoque el láser en o alrededor del centro del voladizo.
- Con los tornillos de ajuste del detector, ajuste el fotodetector de modo que el punto láser esté en el centro de la ventana de alineación del láser.
- Con el tornillo de ajuste del espejo, ajuste el espejo para asegurarse de que el valor de SUM esté en el valor más alto posible.
NOTA: Un valor SUM alto garantiza una evaluación sensible y precisa de la rigidez de la muestra. Por lo tanto, se deben realizar tanto los pasos de alineación láser como los de ajuste del espejo para obtener el valor SUM más alto. - A continuación, para la alineación láser en líquido, agregue el medio de cultivo deseado en un plato y móntelo firmemente en la plataforma para evitar cualquier vibración o deriva, lo que crea artefactos de medición durante la indentación de la muestra.
- Mientras mira la transmisión de la cámara en vivo enfocada en el voladizo, bájelo en el líquido usando la función de motor paso a paso.
- Repita los pasos 3.3.4 y 3.3.5 para asegurarse de que el valor SUM siga siendo el más alto y que el punto láser esté en el centro de la ventana de alineación láser.
- Calibración de la constante de muelle en voladizo
NOTA: Aunque las sondas en voladizo vienen con una constante de resorte calibrada por el fabricante (k), es una buena práctica verificar de forma independiente su valor (en líquido) antes del inicio de una medición. Utilice una superficie de vidrio limpia que minimice las interacciones entre la sonda en voladizo y la superficie de vidrio.- La fuerza de consigna aplicada por el voladizo establece la deflexión láser máxima del voladizo que se permite para una indentación de fuerza. Ajústelo inicialmente a 1,5 V. Si el voladizo no se aproxima a esta fuerza de punto de ajuste dada, auméntelo gradualmente hasta que indente la muestra y genere una curva de indentación de fuerza.
- La longitud Z significa la distancia máxima a la que se retira el piezoeléctrico z después de que el voladizo ha alcanzado el punto de ajuste durante la indentación de la muestra. La longitud Z debe ser al menos suficiente para garantizar que la sonda en voladizo se separe limpiamente de la muestra. Para la calibración de la constante de resorte en una superficie de vidrio, establezca la longitud Z en 1 μm.
- La velocidad Z se refiere a la velocidad a la que el piezoeléctrico z mueve el voladizo verticalmente hacia la muestra durante la indentación de la fuerza. Debe optimizarse porque una velocidad muy baja capturará principalmente el comportamiento viscoso de la muestra, mientras que una velocidad muy alta capturará principalmente el comportamiento elástico. Se espera que la velocidad óptima capture la verdadera naturaleza viscoelástica de las muestras biológicas. Ajuste la velocidad Z a 2 μm/s para las muestras biológicas viscoelásticas.
- La altura objetivo en el rango Z indica la distancia aproximada de la muestra a la que descansa el piezoeléctrico z después de medir una curva de fuerza y antes de moverse a una ubicación diferente en la muestra. La altura del objetivo del rango Z debe ser mayor que la altura de las entidades de muestra. Establezca la altura objetivo en el rango Z en 7,5 μm.
- Usando la función de motor paso a paso , acerque el voladizo bastante a la superficie de la muestra (a juzgar por el enfoque en la imagen de contraste de fase con un aumento de 10x) antes de seleccionar la función de aproximación en la ventana de espectroscopia de fuerza del modo de contacto para bajar el voladizo en incrementos más pequeños de 15 μm.
- Haga clic en Adquirir para capturar una curva de fuerza.
- Seleccione la curva de fuerza, ábrala en la ventana del administrador de calibración y seleccione Modo basado en contacto en la sección de método.
- Con la función Rango-ajuste de selección , seleccione la curva de retracción en voladizo para un ajuste de curva lineal. A continuación, marque la casilla de verificación Sensibilidad para convertir la unidad de fuerza de V a N.
- Levante el voladizo entre 100 y 200 μm en el líquido y seleccione la función de ruido térmico . De nuevo, utilizando Seleccionar rango de ajuste, ajuste la curva de campana de ruido térmico con una curva de Lorentz. Después del ajuste de la curva, seleccione la casilla Constante de resorte (k). Confirme que la constante de resorte (k) está cerca del valor del fabricante y anótelo para referencia futura. Después de la calibración, la unidad para el punto de ajuste cambiará de mV a nN.
NOTA: El ruido térmico es la frecuencia natural del voladizo a una temperatura determinada. La corrección del ruido térmico es necesaria para una medición precisa de la constante del resorte.
- Adquisición de curvas fuerza-distancia
- Coloque la muestra montada en el portaobjetos (vasos retinianos o matriz subendotelial) en la platina AFM y seleccione Espectroscopia de fuerza en modo de contacto en la sección de experimentos del software.
- Establezca la fuerza de consigna en 0,5 nN y haga clic en Aproximación, que es significativamente mayor que la deflexión térmica de las sondas en voladizo SAA-SPH de 1 μm y PFQNM-LC-A de 70 nm, lo que garantiza un enfoque en voladizo suave hacia la muestra.
- Una vez que el voladizo haya detectado la superficie y haya regresado a su altura objetivo de reposo, ajuste el punto de ajuste a 0,2 nN para la sonda en voladizo SAA-SPH de 1 μm más rígida o a 0,1 nN para la sonda en voladizo PFQNM-LC-A de 70 nm más blanda. Este ajuste del punto de ajuste garantiza que tanto los voladizos rígidos como los blandos se doblen fácilmente durante la indentación de la muestra (consulte la sección 3.1).
- Ajuste la longitud Z a ~2,5 μm para garantizar una separación limpia de la sonda en voladizo de las muestras biológicas durante la retracción (consulte el paso 3.4.2) y la velocidad Z a 2 μm/s (consulte el paso 3.4.3).
- Usando los tornillos de la platina en la platina AFM, coloque con cuidado la sonda en voladizo en la ubicación deseada de la muestra.
NOTA: Dado que los capilares no siempre se extienden planos en el portaobjetos, es seguro retirar el voladizo otros 10-20 μm de su altura objetivo de reposo antes de mover la plataforma. - Haga clic en Aproximación para acercar primero el voladizo a la muestra y, a continuación, haga clic en Adquirir para capturar las curvas de fuerza de las ubicaciones deseadas. Guarde todas las curvas de fuerza para el análisis.
- Análisis de datos
- Abra la curva de fuerza en el software de procesamiento de datos.
- Seleccione la curva de fuerza de retracción para el análisis de datos (similar al paso 3.4.8).
- Usando la función de suavizado de datos, suavize la curva de fuerza con un filtro gaussiano para eliminar el ruido no deseado en los datos adquiridos.
- Con la función de resta de línea base, ajuste el valor de la pendiente y la magnitud de la parte de línea base (sin contacto) de la curva de fuerza a cero.
- Haga clic en la función Punto de contacto para llevar automáticamente el punto de contacto de la curva de fuerza a las coordenadas (0,0) en los ejes X e Y.
- Con la función de posición vertical de la punta , calcule la posición vertical real del voladizo en el eje Y corrigiendo cualquier indentación de la muestra.
- En la curva de fuerza procesada, aplique la función de ajuste de elasticidad seleccionando primero la forma y el radio de la punta (en función de la sonda en voladizo seleccionada), seguido de un ajuste de la curva de fuerza utilizando el modelo de Hertz/Sneddon.
- Si la indentación de la matriz por la sonda de radio de 70 nm supera los 70 nm, que suele ser el caso, seleccione la forma de la punta del paraboloide . Para la medición de la rigidez capilar, la indentación de la muestra por la sonda de radio de 1 μm nunca supera 1 μm, por lo que debe seleccionar la forma de la punta de la esfera . Además, si el punto de contacto de la curva ajustada no coincide con el punto de contacto de la curva de retracción real, seleccione la casilla de verificación Curva de desplazamiento .
- Anote y guarde el valor del módulo de Young (rigidez).
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Resultados
Capilares retinianos de ratón
La medición de la rigidez de la AFM de los capilares retinianos aislados implica pasos de manipulación de muestras que podrían dañar su integridad mecanoestructural. Para evitar esto y, por lo tanto, garantizar la viabilidad, fiabilidad y reproducibilidad de las mediciones de AFM, los ojos enucleados se fijan en formalina al 5% durante la noche a 4 °C antes del aislamiento del vaso. Este protocolo de fijación suave con concentración reducida de formalina, baja temperatura...
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Discusión
La MFA ha sido ampliamente utilizada para medir los cambios asociados a enfermedades en la rigidez de los vasos más grandes, como la aorta y las arterias16. Estos hallazgos han ayudado a establecer el papel de la mecanobiología endotelial en complicaciones cardiovasculares como la aterosclerosis17. Sobre la base de estos hallazgos, hemos comenzado a investigar el papel previamente no reconocido de la mecanobiología endotelial en el desarrollo de lesiones microvasculares de ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el National Eye Institute/NIH Grant R01EY028242 (a K.G.), el Premio Catalyst de la Investigación para Prevenir la Ceguera/Fundación Internacional de Investigación de la Retina por Enfoques de Investigación Innovadores para la DMAE (a K.G.), la Beca Especial de la Iniciativa Stephen Ryan para la Investigación Macular (RIMR) de la Fundación W.M. Keck (al Instituto Oftalmológico Doheny), y la Beca Ursula Mandel y la Beca de Diversidad del Consejo de Graduados de UCLA (a I.S.T.). Este trabajo también fue apoyado por una subvención sin restricciones de Research to Prevent Blindness, Inc. para el Departamento de Oftalmología de UCLA. El contenido de este artículo es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Aislamiento capilar de la retina | |||
| 0.22 y micro; m Filtro de jeringa PVDF | Merck Millipore | SLGVM33RS | Baja Unión a Proteínas Durapore |
| 10X Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio % magnesio | Corning | 20-031-CV | Concentración final 1X, pH 7.4 |
| Placa de 12 pocillos | Falcon Corning | 353043 | |
| tubo de centrífuga de 15 mL | Corning | 430791 | Libre de Rnasa-Dnasa, No pirogénico |
| 20 mL Jeringa Luer-Lok TIP | BD | 302830 | |
| 5 3/4 pulgadas Vidrio de borosilicato desechable/No estéril pipeta Pasteur | FisherBrand | 13-678-20A | |
| 60x15 mm Placa de cultivo de tejidos | Falcon Corning | 353002 | |
| placa de 6 pocillos | Falcon Corning | 353046 | |
| Aqua-Hold 2 Pap - Pluma de 13 mL | Laboratorio de Dispositivos Científicos | 9804-02 | |
| Portacuchillas | X-ACTO Acero al | ||
| carbono Cuchilla quirúrgica #10 | Bard-Parker | 371110 | |
| Cera dental | Microscopía electrónica Ciencias | 50-949-027 | |
| Microscopio de disección | Am-scope | ||
| Solución de formalina, tamponada neutra, 10% | Millipore Sigma | HT501128-4L Concentración | final 5% (v/v) |
| Kimwipes - toallitas húmedas | Kimtech Science | 34133 | |
| Micro espátula | Fine Science Tools | 10089-11 | |
| Orbital | Shaker Lab Genius | SK-O180 | |
| PELCO Economy #7 Acero inoxidable 115mm Pinza | Ted Pella, Inc. | 5667 | |
| Microscopio de contraste de fase | Nikon TS2 | ||
| Purifier Logic+ Clase II, Tipo A2 Cabina de bioseguridad | Labconco | 302380001 | |
| Tubos de microcentrífuga Safe-Lock 2 mL | Eppendorf | 22363352 | |
| Estereoscopio | AmScope | SM-3 Series Zoom Microscopio estereoscópico trinocular 3.5X-90X | |
| Portaobjetos de microscopía Superfrost Plus - Lengüeta blanca - Prelimpieza - 25x75x1,0 mm | |||
| FisherBrand, solución 0,1M, pH 7,4 - Grado biotecnológico | VWR | E553-500ML | pH 8 para solución de tripsina |
| Tripsina 1:250 polvo Grado de cultivo de tejidos | VWR | VWRV0458-25G | 10 % (p/v) solución de tripsina |
| Agua Grado de Biología Molecular Corning | 46-000-CM | ||
| Matriz subendotelial | |||
| 10X PBS | Corning | 20-031-CV | |
| 1X PBS con calcio y magnesio | Thermo Fisher Scientific | 14040-117 | pH 7.4 |
| Hidróxido de amonio | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| Ácido ascórbico | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Colágeno IV anticuerpo | Novus Biologicals | NBP1-26549 | |
| DNasa I | Qiagen | 79254 | |
| Etanolamina | Sigma-Aldrich | 398136 | |
| Anticuerpo de fibronectina | Sigma-Aldrich | F6140 | |
| Fluoromount | Invitrogen-Thermo Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Gelatina | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Cubreobjetos de vidrio (12 mm) | Fisher | 12-541-000 | |
| Glutaraldehído | Microscopía electrónica Ciencias | 16220 | |
| Células endoteliales de la retina humana (HREC) | Cell Systems Corp | ACBRI 181 | |
| medio MCDB131 | Corning | 15-100-CV | |
| Células endoteliales de la retina de ratón (mREC) | Cell Biologics | C57-6065 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tripsina | Gibco-Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | |
| AFM Medición | |||
| 1 y micro; m Sonda | Bruker | SAA-SPH-1UM | Una sonda hemisférica de 19 micras de altura con radio final de 1 micras, constante de resorte 0,25 N/m |
| 70 nm Sonda LC | Bruker | PFQNM-LC-V2 | Una sonda hemisférica de 19 micras de altura con radio final de 70 nm, Constante de resorte 0.1N/m |
| cámara | XCAM family | Toupcam | 1080P |
| HDMI Desktop para ejecutar la cámara | Asus Asus desktop | Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM | |
| Soporte de plato para cubreobjetos | Cellvis | D29-14-1.5-N | 29mm plato de fondo de vidrio con Micropocillo de 14 mm |
| Nanowizard 4 | Bruker | Nanowizard 4 | Microscopio de fuerza atómica Bioscience montado en un microscopio óptico para la medición sensible de las propiedades mecanoestructurales (rigidez y topografía) de muestras biológicas blandas |
| Microscopio de contraste de fase | Zeiss | Axiovert 200 | Microscopio invertido con objetivo 10X |
Referencias
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