Resonancia magnética y espectroscopía pulmonar hiperpolarizada de 129xe en ratones ventilados mecánicamente

Resumen

La resonancia magnética de xenón hiperpolarizado puede cuantificar la microestructura pulmonar regional (dimensiones del espacio aéreo) y la fisiología (ventilación e intercambio de gases) en la investigación traslacional y la atención clínica. Aunque es un desafío, puede proporcionar información pulmonar comparable en estudios preclínicos. Este protocolo describe la infraestructura y los procedimientos necesarios para realizar una resonancia magnética pulmonar de xenón de rutina en ratones.

Resumen

El xenón-129 (¹²⁹Xe) hiperpolarizado (HP) es un agente de contraste de imágenes por resonancia magnética (IRM) inhalado con propiedades espectrales y físicas únicas que se pueden explotar para cuantificar la fisiología pulmonar, incluida la ventilación, la difusión restringida (tamaño del espacio aéreo alveolar) y el intercambio de gases. En los seres humanos, se ha utilizado para evaluar la gravedad y la progresión de la enfermedad en una variedad de trastornos pulmonares y está aprobado para uso clínico en los Estados Unidos y el Reino Unido. Más allá de sus aplicaciones clínicas, la capacidad de la resonancia magnética ¹²⁹Xe para evaluar de forma no invasiva la fisiopatología pulmonar y proporcionar información resuelta espacialmente es valiosa para la investigación preclínica. Entre los modelos animales, los ratones son los más utilizados debido a la accesibilidad de los modelos de enfermedades modificadas genéticamente. En este caso, la resonancia magnética ^{con 129}Xe es prometedora como una técnica mínimamente invasiva, sin radiación y sensible para monitorizar longitudinalmente la progresión de la enfermedad pulmonar y la respuesta al tratamiento (por ejemplo, en el descubrimiento de fármacos). Esta técnica puede extenderse a aplicaciones preclínicas mediante la incorporación de un aparato de respiración libre activado por resonancia magnética o un ventilador mecánico para administrar gas. Aquí, describimos los pasos y proporcionamos listas de verificación para garantizar una recopilación y un análisis de datos sólidos, incluida la creación de un maniquí de gas xenón polarizado térmicamente para el control de calidad, la optimización de la polarización, el manejo de animales (sedación, intubación, ventilación y cuidado de ratones) y los protocolos para la ventilación, la difusión restringida y los datos de intercambio de gases. Si bien la resonancia magnética preclínica ^{de 129}Xe se puede aplicar en varios modelos animales (por ejemplo, ratas, cerdos, ovejas), este protocolo se centra en ratones debido a los desafíos que plantea su pequeña anatomía, que se equilibran con su asequibilidad y la disponibilidad de muchos modelos de enfermedades.

Introducción

Si bien los trastornos pulmonares siguen siendo las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial¹, en la última década se han producido mejoras drásticas en los resultados de los pacientes. Estas mejoras se deben en parte a dos factores. En primer lugar, los ensayos clínicos de fase III ahora priorizan los cambios en la función pulmonar como criterios de valoración en lugar de la mortalidad, lo que acelera los ensayos de fármacos 2,3,4,5. En segundo lugar, los avances en modelos animales mejorados han proporcionado información sobre los mecanismos de la enfermedad y han ayudado al desarrollo de terapias ^6,7. Los modelos de ratón suelen ser los preferidos para la investigación traslacional porque ofrecen paralelismos fisiológicos con los humanos, asequibilidad y rápido desarrollo de enfermedades. La ingeniería genética ha ampliado la gama y la calidad de los modelos disponibles, con el International Mouse Strain Resource que ahora cuenta con más de 32.000 cepas de ratones⁸, en comparación con solo 4.218 cepas de ratas (Rat Genome Database⁹). Estos modelos han abierto nuevas vías para investigar los impulsores mecanicistas y las respuestas terapéuticas para una serie de enfermedades pulmonares, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)¹⁰, la fibrosis quística (FQ)¹¹, la fibrosis pulmonar^12,13, la hipertensión^{pulmonar14,15} y el asma¹⁶.

Desafortunadamente, la investigación pulmonar con ratones está limitada por las técnicas disponibles para cuantificar la carga de la enfermedad. Los estudios a menudo se basan en procedimientos terminales que 1) proporcionan información de todo el pulmón (ensayos bioquímicos) o información localizada (histología) y 2) exigen diseños transversales y tamaños de muestra grandes. Por lo tanto, no captan ni espacial ni temporalmente la dinámica de la enfermedad. Por el contrario, las imágenes tridimensionales no invasivas pueden evaluar la estructura, los procesos moleculares y la función de los pulmones a lo largo del tiempo.

La estructura pulmonar (p. ej., anomalías de las vías respiratorias y fibrosis intersticial) se puede visualizar con una resonancia magnética de tiempo de eco ultracorto (UTE) y una tomografía microcomputarizada (μCT) de alta resolución. La información funcional y mecanicista (por ejemplo, ventilación, perfusión, metabolismo tumoral y procesos inflamatorios) se puede obtener con agentes de contraste exógenos (por ejemplo, TC mejorada con xenón y UTE mejorada con oxígeno) y abordajes de medicina nuclear ionizante (es decir, tomografía por emisión de positrones [PET] y tomografía computarizada por emisión de fotón único [SPECT]). Sin embargo, las imágenes funcionales son un desafío debido al modesto contraste a ruido (particularmente para UTE mejorado con oxígeno a las altas intensidades de campo magnético utilizadas para la resonancia magnética preclínica, donde T₁ se alarga) disponible sin emplear modalidades ionizantes con niveles de radiación más altos de lo normal. Si bien las imágenes con estas modalidades son bien toleradas en modelos animales que utilizan dosis convencionales, la radiación acumulada puede confundir los resultados en estudios sobre inmunología, inflamación y cáncer de pulmón¹⁷. Sin embargo, las imágenes de resonancia magnética (RM) de xenón-129 (¹²⁹Xe) hiperpolarizadas (HP) proporcionan información estructural y funcional mínimamente invasiva, no irradiante y altamente sensible. Si bien esta técnica se ha empleado en la investigación preclínica para caracterizar afecciones como el enfisema^18,19, la fibrosis²⁰, el cáncer de pulmón²¹, la EPOC²² y la lesión pulmonar inducida por radiación²³ en puntos de tiempo únicos o múltiples, sigue estando infrautilizada en el entorno preclínico.

Para permitir la resonancia magnética preclínica de ^{rutina con 129}Xe, se requieren varios requisitos previos, incluido el apoyo regulatorio institucional, un dispositivo de hiperpolarización, una bobina de radiofrecuencia (RF) sintonizada con ¹²⁹Xe y un escáner con capacidad multinuclear. Aunque las aplicaciones avanzadas 24,25,26,27,28,29,30,31,32,33 requieren una programación de pulsos específica del proveedor que está fuera del alcance de este protocolo, las aplicaciones básicas se pueden lograr con modificaciones de software modestas. Por lo tanto, nos enfocamos en el control de calidad, el manejo de magnetización, la recopilación de datos y los procedimientos de manejo de animales, incluida la ventilación mecánica, que son exclusivos de la resonancia magnética preclínica ^{de 129}Xe (Figura 1).

Hasta la fecha, las imágenes ^{de 129}Xe para animales pequeños han empleado tres enfoques de administración de gas seguros para resonancia magnética, cada uno con ventajas y desventajas: respiración libre, accionamiento por pistón y caída de presión. La respiración libre permite la inhalación espontánea sin riesgo de lesiones por intubación o traqueostomía, pero consume significativamente más gas HP y puede introducir artefactos de movimiento^34,35. Los dispositivos comerciales accionados por pistón se autocalibran y son fáciles de usar nada más sacarlos de la caja, pero pueden ser prohibitivamente^caros. El enfoque basado en la caída de presión utilizado aquí está bien descrito en la literatura, modular, personalizable y ejecutado por código abierto 37,38,39,40. Además, es rentable, por lo general por un total de menos de $ 10k y unas pocas semanas de tiempo de construcción dedicado. El ventilador con caída de presión suministra ¹²⁹Xe desde una bolsa de dosis dentro de un recipiente presurizado mientras monitorea la presión de las vías respiratorias de un ratón intubado.

Figura 1: Descripción general del protocolo para recolectar imágenes de resonancia magnética (MRI) de xenon-129 (¹²⁹Xe) de rutina en ratones. (A) Pasos para la configuración inicial. (Nota: la programación del escáner es única para cada proveedor y no se describe en este protocolo). (B) Pasos para recopilar datos diarios de aseguramiento de la calidad (QA) y de los animales. (C) Pasos para la conclusión exitosa del experimento y el análisis de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aquí, recopilamos y analizamos las tres clases comunes de datos de resonancia magnética de ¹²⁹Xe: ventilación, imágenes ponderadas por difusión (tamaño del espacio aéreo alveolar) e intercambio de gases. Las imágenes de ventilación muestran la distribución del gas ¹²⁹Xe inhalado. Las regiones de los pulmones con flujo de aire reducido aparecen oscuras en las imágenes de gas HP, y la patología se cuantifica por el volumen de ventilación defectuosa. En humanos, el porcentaje de defectos ventilatorios (VDP) ha mostrado una fuerte repetibilidad^41,42 y una alta sensibilidad a la obstrucción pulmonar en enfermedades como la EPOC 43,44,45 y el asma ^46,47.

La difusión restringida de los ^{átomos de 129}Xe en el espacio aéreo se puede medir a través del coeficiente de difusión aparente (ADC) y sirve como sustituto del tamaño del espacio aéreo. El ADC se calcula adquiriendo una imagen de referencia (b₀) sin ponderación de difusión y una o más imágenes adquiridas en presencia de ponderación de difusión inducida por gradiente bipolar (b_N). Un ADC elevado refleja un aumento en el tamaño del espacio aéreo debido al envejecimiento o a la remodelación enfisematosa^18,48. Además, el uso de múltiples imágenes de valor b (≥4) permite calcular información morfométrica más detallada (por ejemplo, la intersección lineal media)^49,50.

El intercambio de gases se puede caracterizar debido a 1) la solubilidad de ¹²⁹Xe en el tejido de la membrana capilar, el plasma y los glóbulos rojos y 2) el cambio químico de >200 ppm en el campo de ¹²⁹Xe cuando se disuelve en estos compartimentos. Tanto los datos espectroscópicos como los de imagen proporcionan información sobre las enfermedades cardiopulmonares (p. ej., hipertensión pulmonar e insuficiencia cardíaca izquierda 51,52,53). Mientras que muchas especies (humanos, caninos y ratas) muestran picos espectrales únicos que se originan en cada compartimento, los ratones carecen de una señal única de glóbulos rojos debido a las diferencias en las interacciones del sitio de unión de la hemoglobina y el xenón. En cambio, todos los componentes disueltos se combinan en una sola señal en los ratones⁵⁴. Sin embargo, es posible observar una resonancia distintiva de los glóbulos rojos en ratones transgénicos que expresan hemoglobina humana, como los utilizados en modelos de enfermedad de células falciformes⁵⁴. En general, la espectroscopia y las imágenes de ¹²⁹Xe disuelto proporcionan información única sobre la fisiopatología cardiopulmonar en ratones^55,56.

Antes de intentar este protocolo, es necesario comprender la información general sobre el escáner de resonancia magnética, la ventilación mecánica y las técnicas de manejo de ratones necesarias para los estudios con animales. Antes de iniciar estudios con animales, todos los procedimientos deben ser aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) ^local57. Debido a que el momento magnético total disponible en el pulmón del ratón es intrínsecamente bajo (es decir, volumen corriente ~ 250 μL), el tamaño del vóxel debe ser 1000 veces más pequeño que en los humanos para lograr una resolución anatómicamente equivalente. La frecuencia respiratoria murina también es extremadamente rápida (>100 respiraciones/minuto). Como tal, los procedimientos de retención de la respiración única que se utilizan normalmente para las imágenes humanas no son factibles. En cambio, solo se pueden aplicar unas pocas excitaciones de RF dentro de cada respiración, por lo que se deben codificar ^{imágenes de 129}Xe durante decenas o cientos de respiraciones. Es posible que se requiera programación de pulsos para permitir la activación externa de las adquisiciones y para reproducir correctamente los cortes, las codificaciones de fase y/o las imágenes ponderadas en difusión, al tiempo que se equilibra la relación señal-ruido (SNR), la resolución y la duración del escaneo. Aquí, el ventilador emite un pulso de lógica de transistor-transistor (TTL) una vez por respiración para desencadenar la adquisición de datos (Figura 2).

Figura 2: Ventilación mecánica representativa y temporización de adquisición de datos. (A) La ventilación controlada por el usuario puede desencadenar la adquisición de datos al final de la inspiración, durante la retención de la respiración o al final de la espiración. (B) Para esta secuencia de ventilación radial 3D, el usuario define el número total de proyecciones adquiridas y el número de proyecciones por respiración. (C) En el caso de una imagen ponderada en difusión 2D con selección de segmentos, el usuario define el orden de los sectores, las imágenes de valor b y las codificaciones de fase. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para permitir una ventilación confiable y la administración de ¹²⁹Xe, se requieren procedimientos sólidos de sedación e intubación. Para cada estudio, se deben considerar los efectos posteriores de cada anestésico, incluidos los cambios en la ventilación por minuto, la frecuencia cardíaca (FC) y la presión arterial 58,59,60,61,62,63,64,65,66. Si bien se han utilizado una variedad de sedantes para la resonancia magnética preclínica con gases HP, empleamos una mezcla de ketamina, xilacina y acepromazina, debido a su disponibilidad, rentabilidad, confiabilidad y duración^67,68. Una vez sedados, los animales deben ser intubados para una ventilación mecánica efectiva. La intubación de ratones es difícil debido al pequeño tamaño de su anatomía, por lo que es importante entrenarse a fondo en esta técnica. Animamos a los investigadores a revisar los protocolos de vídeo publicados^69,70. Debido a que la mayoría de las cánulas de intubación comerciales contienen acero inoxidable, introducimos una técnica para fabricar cánulas en forma de cuña sin metal (es decir, compatibles con MRI y gas HP) que se pueden personalizar para que coincidan con el diámetro de las vías respiratorias para crear un sello hermético con la pared traqueal del ratón.

Debido a que se recopilan ¹²⁹imágenes Xe durante muchas respiraciones, la configuración del ventilador es fundamental. Las estrategias de ventilación protectora deben ser cuidadosamente consideradas para prevenir la lesión pulmonar 71,72,73,74. En particular, el uso de bajo volumen corriente (TV), presión positiva moderada al final de la espiración (PEEP) y maniobras de reclutamiento alveolar (RM) reducen el riesgo de lesión pulmonar inducida por ventilador en pacientes humanos y modelos animales 75,76,77,78,79,80,81. En este caso, recomendamos una técnica sencilla que es compatible con la ventilación mecánica con caída de presión ¹²⁹Xe que es protectora y proporciona suficiente SNR de imagen ¹²⁹Xe. En concreto, aplicamos la PEEP añadiendo una válvula comercial de PEEP a la línea de exhalación del ventilador. Para realizar RM, la línea de exhalación debe estar cerrada de modo que el animal reciba múltiples inhalaciones sin exhalar hasta que se haya alcanzado una presión y duración objetivo.

A lo largo de todo el estudio, proporcionamos configuraciones generales de ventilación, pero se recomienda revisar la literatura para abordar los objetivos específicos del estudio^82,83. Además de controlar la presión inspiratoria máxima durante la ventilación mecánica, es importante controlar la temperatura del animal, lo que se puede hacer utilizando métodos estándar de control de la temperatura en ratones. Si bien no es necesario para la obtención de imágenes, el monitoreo de la frecuencia cardíaca a través de un electrocardiograma (ECG) puede ser ventajoso; El ECG puede indicar si un animal se está despertando de la sedación, con una sobredosis o angustiado, lo que permite que el investigador intervenga.

El protocolo que describimos está diseñado para recopilar datos de ventilación radial 3D ¹²⁹Xe⁶¹, datos ponderados en difusión GRE^{2D 76} y datos de intercambio de gases de espectroscopia dinámica de adquisición de pulsos. Este protocolo tiene como objetivo cerrar la brecha entre la investigación preclínica en modelos de animales pequeños y el potencial de la resonancia magnética con ¹²⁹Xe para avanzar en nuestra comprensión de los trastornos pulmonares.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) del Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati.

1. Preparación inicial del sitio

1. Cree y pruebe un maniquí de gas ¹²⁹Xe polarizado térmicamente (Figura 3).
   1. Obtenga un recipiente de vidrio de borosilicato (~ 60 mL), una válvula de émbolo con una junta tórica de sellado frontal y un vástago de vidrio de borosilicato molido, todo con una capacidad de hasta 150 psig. Asegúrese de que no haya partes magnéticas. Coloque un accesorio de compresión en el vástago de vidrio. Apriete para producir un sello hermético al gas.
   2. Conecte el recipiente a una bomba de vacío y un depósito de oxígeno de acuerdo con la Figura 3A. Recipiente de vacío a menos de 100 mTorr de presión absoluta.
   3. Llene el recipiente con oxígeno a una presión de 1,5 atm para reducir el ¹²⁹Xe T₁ de > 30 minutos a ~2 s (a una intensidad de campo magnético de 7 T; Para un escáner de 9,4 T, utilice oxígeno de 1,6 atm). Recipiente de sellado.
      NOTA: Para intensidades de campo más altas, se requerirá una presión parcial de oxígeno algo más alta para lograr T₁≤ 2 s⁸⁴.
   4. Llene un depósito impermeable al gas con 400 mL de xenón enriquecido isotópicamente (85% ¹²⁹Xe).
      NOTA: También se puede utilizar xenón de abundancia natural (26% ¹²⁹Xe), pero será necesario aumentar el promedio de la señal para mitigar la reducción de ~ 3 veces en SNR.
   5. Conecte el recipiente al depósito de ¹²⁹Xe. Tubo de vacío a menos de 100 mTorr de presión absoluta.
   6. Llene un líquido de sobremesa de boca abierta N₂ Dewar hasta ~90%. Sumerja el fondo del recipiente (~5 cm) en nitrógeno líquido para condensar el_O2 y crear un vacío (Figura 3B). Mientras está sumergido, abra la válvula para permitir que ¹²⁹Xe del depósito fluyan hacia el recipiente (Figura 3C).
   7. Selle la válvula del émbolo tirando lentamente del vástago hasta que el orificio de entrada en el émbolo pase por la junta tórica. Inmediatamente después de que el orificio haya pasado la junta tórica, apriételo a mano para sellar el recipiente. Retire el recipiente del nitrógeno líquido y deje que se descongele.
      NOTA: Una vez descongelado, el recipiente se presurizará a ~ 4,5 atm (2 atm O₂ + 2,5 atm ¹²⁹Xe).
   8. Proteja la cristalería (p. ej., inserte el recipiente en un recipiente de tubería acolchado de cloruro de polivinilo (PVC), Figura 3D).
      NOTA: Si se le da el mantenimiento adecuado, el maniquí puede mantener la presión durante una década o más.
   9. Mida el T₁ del maniquí (por ejemplo, utilizando una secuencia espectroscópica de recuperación de inversión). Confirme T₁ < 2 s para escáneres de 7 T. Seguimiento de la señal y T₁ a lo largo del tiempo para el aseguramiento de la calidad (QA).

Figura 3: Creación de un maniquí de gas ¹²⁹Xe polarizado térmicamente guiado por el protocolo detallado en el Paso 1.1. Las presiones parciales de O₂ y ¹²⁹Xe se pueden modificar para personalizar el T₁ para producir tiempos apropiados ^{de 129}Xe T₁ y una intensidad de señal a una intensidad de campo dada⁸⁴. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Realice el aseguramiento de la calidad con el fantasma de gas polarizado térmicamente (Tabla 1 y Figura 4).
   1. Coloque la bobina ¹²⁹Xe en el isocentro del imán y centre el maniquí de gas ¹²⁹Xe dentro de la bobina. En una sola secuencia de pulso y adquisición ("pulso único"), ajuste la frecuencia de trabajo para que coincida con la frecuencia de gas aproximada ^{de 129}Xe en el maniquí (~83,07 MHz a 7T).
   2. Centre las frecuencias de adquisición y excitación a la frecuencia ¹²⁹Xe Larmor y utilice esta frecuencia para todos los escaneos de calibración y control de calidad ¹²⁹Xe de Phantom. Consulte la Tabla 1 para conocer los parámetros experimentales de todas las exploraciones de control de calidad. Confirme que el maniquí está centrado con un localizador de fantasmas (Figura 4A).
   3. Realice el experimento de nutación para calibrar el ángulo de volteo: Suponiendo que SNR es suficiente, use pulsos de RF individuales con un espaciado de tiempo de repetición (TR) > 5 x T₁. Para cada adquisición, aumente gradualmente la potencia de RF hasta que la señal se anule y comience a invertirse. El estándar utilizado aquí es: número de pulsos = 65; TR = 10 s; duración del pulso = 125 μs; Potencia de RF = 1-13,8 W, incrementada en 0,2 W
   4. Transformada de Fourier y fase del primer espectro (es decir, el espectro adquirido con la potencia de RF más baja). Aplique la misma fase para todos los espectros. Trace los espectros reales en función de la potencia del pulso de RF (Figura 4B).
   5. La potencia que produce un pico nulo (es decir, la altura mínima del pico) corresponde al ángulo de giro de 180°. Logre un ángulo de giro de 90° utilizando la misma potencia a la mitad de la longitud de pulso necesaria para producir el ángulo de giro de 180°. Suponiendo que el software del escáner lo permita, configure esta potencia de referencia de 90° y la longitud del pulso para el escalado posterior del ángulo de volteo.
   6. Utilice un solo pulso para calzar minimizando el ancho total a la mitad del máximo del espectro de ¹²⁹Xe (TR ~ 1 s). Si es necesario, vuelva a centrar la frecuencia después de calzar. Grabe el ancho completo medio máx.
   7. Ejecute el escaneo de control de calidad ¹²⁹Xe (Tabla 1 y Figura 4C). Registre los datos de control de calidad: SNR, señal fantasma media y desviación estándar del ruido.

Figura 4: Aseguramiento de la calidad previo al escaneo. (A) Un localizador de maniquí coronal GRE 2D de baja resolución garantiza que el maniquí esté centrado en el imán. (B) Un experimento de nutación para establecer un pulso de 90° muestra un pico nulo en el pulso de 180°. (C) Después de localizar y calibrar el ángulo de volteo, adquiera una imagen de control de calidad GRE 2D de mayor resolución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre abreviado del protocolo	Descripción de la secuencia	TR (ms)	TE (ms)	Promedios / Repeticiones	Ángulo de giro (°)	Tamaño de la matriz o Npts	Campo de visión (mm2)	Ancho de banda de RF (kHz)	Espesor de la rebanada / losa (mm)	Duración del escaneo
Pulso único	Adquisición de pulso	1000		1 / 1	60	2048		10		1 s
Localizador fantasma	GRE 2D	200	3.7	20 / 1	48	60 × 32	120 × 48	3	60	2 minutos
Calibración del ángulo de volteo	Adquisición de pulso	7000		1 / 65	20	2048		5.12		7.5 minutos
Artículo 129Xe QA	GRE 2D	5000	3.3	8 / 1	90	322	322	3	40	21 minutos

Tabla 1: Parámetros de la secuencia de aseguramiento de la calidad de la calibración fantasma. TR = tiempo de repetición, TE = tiempo de eco, N_pts = número de puntos, FOV = campo de visión, BW = ancho de banda. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

3. Polarización plana (Figura 5A, B).
   1. Seleccione el volumen polarizado ¹²⁹Xe y el tiempo de acumulación: 400 mL en 15 min es óptimo para este protocolo (Figura 5), pero se puede ajustar fácilmente para otras aplicaciones y equipos.
   2. Suponiendo un volumen muerto conocido dentro del hiperpolarizador (por ejemplo, V_{vol muerto} = 80 mL), calcule el caudal (F_Xe en SLM) para un volumen dispensado V_deseado, ¹²⁹Xe fracción de gas f, y el tiempo de acumulación t_acc:
      (1)
      NOTA: Si bien los tiempos de producción más largos generalmente producirán una polarización más alta, es posible que no sean prácticos para la obtención de imágenes in vivo. Utilice un modelo apropiado para el hiperpolarizador 85,86,87,88 para determinar un caudal que equilibre el tiempo de producción y la polarización. En este caso, se utilizó el modelo de J. W. Plummer et ^al.89 (Figura 5A). Esto se aplica a los polarizadores de flujo continuo y no es aplicable a los hiperpolarizadores de flujo detenido⁹⁰.
   3. Polarizar el gas de acuerdo con estos parámetros, medir la polarización con un dispositivo comercial o casero y compararla con la polarización predicha para el control de calidad.
   4. Mida la pérdida de polarización durante el transporte. Si la polarización disminuye en una cantidad suficientemente grande (por ejemplo, >10%), construya un estuche de transporte magnético para proteger la polarización durante el transporte. Ver Archivo Suplementario 1: Gestión de la polarización durante el transporte y Figura Suplementaria 1.

Figura 5: Gestión de la polarización. (A) La polarización y el volumen producido son una función del tiempo de acumulación y el caudal. Una bolsa de gas de 400 mL proporciona una alta polarización inicial (~35%) durante 20 min. Si bien el uso de 1 L de gas puede parecer atractivo, tendrá una polarización inicial más baja (~ 20%). (B) Después de ~ 15 minutos de ventilación, un lote de 1 litro de HP ¹²⁹Xe se agotaría a una polarización del <10%, mientras que 600 mL de gas permanecerían^{en 116}. Por lo tanto, el uso de múltiples bolsas de 400 mL de ¹²⁹Xe mantiene una polarización promedio entregada más alta. C) Las ubicaciones donde el campo primario y el campo de blindaje activo se cruzan (cuadro rojo en la posición (N,N,N)) pueden causar una relajación rápida del HP ¹²⁹Xe. La caracterización del campo de franjas del imán ayuda a identificar las zonas seguras en las que se pueden colocar los depósitos de HP ¹²⁹Xe sin una relajación rápida (cuadro verde en la posición (0,0,n)). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Gestión de la polarización durante el transporte. Haga clic aquí para descargar este archivo.

4. Mida el T₁ dependiente de la posición de HP ¹²⁹Xe dentro del campo de franjas (Figura 5C).
   1. Cree puntos de referencia con distancias y posiciones conocidas en relación con el isocentro del imán a lo largo de las dimensiones X, Y y Z. Etiquete el isocentro y etiquete las otras posiciones de n a N. El número de puestos a investigar dependerá del espacio disponible.
   2. Hiperpolarizar un pequeño volumen de ¹²⁹Xe (~250 mL) y transportarlo a la sala de control de resonancia magnética. Llene una jeringa grande (50-100 mL) con ¹²⁹Xe y colóquela en el isocentro dentro del imán (Posición 1 en la Figura 5C). Reproduzca un pulso de ángulo de giro de ~1° para medir la señal.
   3. Deje la jeringa en posición durante ~ 10 minutos, luego adquiera otro espectro. Vuelva a medir la señal cada 10 minutos hasta que la señal haya decaído al menos 1 T₁ (es decir, la señal haya decaído a ~1/3 de su valor inicial).
   4. Inicie un nuevo experimento T₁ con una nueva jeringa de ¹²⁹Xe repitiendo el paso 1.4.2.
   5. Mueva la jeringa a una nueva posición (por ejemplo, la posición n en la figura 5C) y déjela allí durante 10 minutos. Regrese la jeringa al isocentro para adquirir un espectro de ángulo de giro adicional de ~1°.
   6. Repita este proceso: mueva la jeringa a la posición n, espere 10 minutos, vuelva a colocarla en el isocentro y vuelva a medir la señal hasta que haya decaído al menos 1 T₁.
   7. Repita los pasos 1.4.4 - 1.4.6 para las posiciones de referencia restantes que cubren las direcciones X, Y y Z.
   8. La señal inicial (S₀) decaerá monoexponencialmente sobre n pulsos de RF con un ángulo de inversión θ . Ajuste la señal (S) en función del tiempo (t) en el campo marginal para calcular el T₁ en cada posición:
      (2)
   9. Identifique una posición con suficiente T₁ (>20 min) para la colocación del depósito de ¹²⁹Xe.
5. Cree cánulas de intubación sin metal (Figura 6).
   1. Obtenga dos catéteres de politetrafluoroetileno (PTFE) permanentes venosos con conectores Luer. Deseche las agujas en un recipiente para desechar objetos punzocortantes.
      NOTA: Para ratones >25 g, use catéteres de 18 G y 20 G. Para animales más pequeños, use catéteres de 20 G y 22 G.
   2. Corte el conector Luer de los catéteres. Introduzca el catéter más pequeño en el extremo superior del catéter más grande para crear una cánula más larga y más afilada. Corte la cánula compuesta a ~4,6 cm con un extremo biselado, sin incluir la base Luer (Figura 6A, B).
   3. Corte el extremo más ancho de la punta de una pipeta de 200 μL hasta una longitud de ~2,6 cm (Figura 6C).
   4. Cubra el interior de la punta de la pipeta con lubricante desmoldante general. Utilice otra punta de pipeta insertada en el interior para distribuir finamente el lubricante. Llene la punta de la pipeta con epoxi de pasta vulcanizante de silicona acetoxy (Figura 6D, E).
   5. Enchufe la cánula con un cable de 22 G que se extienda por ambos extremos. Alimente el tubo de la cánula a través de silicona en la punta de la pipeta. Extienda el tubo ~7 mm más allá del extremo de la punta de la pipeta (Figura 6F, G).
   6. Deslice el tubo de la cánula en el lado más ancho de la punta de la pipeta a través de un conector Luer deslizante macho de plástico, pegando las piezas con el epoxi. Ajuste el tubo que se extiende más allá del conector Luer (Figura 6H).
   7. Espere a que el epoxi se seque (>24 h) y, a continuación, retire con cuidado la cánula de intubación de silicona del molde de la punta de la pipeta. Retire el alambre de la cánula, asegurándose de que el tubo no se haya ocluido (Figura 6I).
   8. Para hacer un mango que facilite la intubación, conecte el tubo (1/16" o 1/8") a un conector Luer hembra. Cuando esté listo para la intubación, conecte este conector Luer hembra a la cánula de intubación Luer macho. Esta pieza se puede desmontar fácilmente después de la intubación (Figura 6J).
   9. Desinfectar antes de cada uso en animales: limpie el exterior de la cánula con alcohol al 70%. Limpie el alambre de 20 g con desinfectante y luego pase el alambre a través de la cánula para desinfectar el interior y asegurarse de que no haya obstrucciones.

Figura 6: Creación de cánulas de intubación de ratón compatibles con resonancia magnética y HP ¹²⁹Xe. Estas cánulas están construidas con catéteres venosos, puntas de pipeta y sellador de silicona, como se describe en el paso 1.5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Recopilación diaria de datos

NOTA: Consulte el Archivo complementario 2: Lista de verificación de control de calidad de exploración preclínica.

Archivo complementario 2: Lista de verificación de control de calidad de la exploración preclínica. Haga clic aquí para descargar este archivo.

1. Control de calidad diario completo del escáner y configuración del ventilador (Figura 4).
   1. Con maniquíes, ejecute protocolos de control de calidad en el escáner (consulte la Tabla 1 para conocer los parámetros de análisis de control de calidad y el Paso 1.2 para conocer los pasos diarios de control de calidad).
   2. Calibrar el ventilador según el método de J. Nouls et ^al.38. Ver Archivo Suplementario 3: Calibración del Ventilador, Figura Suplementaria 2 y Figura Suplementaria 3.
   3. Ajuste la configuración del ventilador para la obtención de imágenes al final de la inspiración (Tabla 2). Coloque la cama del animal en el estante del escáner y el módulo de soporte vital (es decir, las piezas del ventilador mecánico) en la mesa junto al escáner.
   4. Active el sistema de calefacción de animales específico del sitio. Ajuste un calentador a 35.5 - 40 °C, encienda el aire circulante y coloque la manguera de aire a menos de ~ 5 "de donde descansará la cabeza del animal para precalentar el orificio del escáner.

Ajuste de ventilación	Recomendación para la resonancia magnética HP 129Xe	Notas
Volumen corriente (TV)	8–10 mL/kg de peso corporal ideal	Televisión moderada; un televisor bajo requiere un BR más alto, lo que puede causar artefactos de movimiento en las imágenes
Presión positiva al final de la espiración (PEEP)	2–6 cmH2O
Frecuencia respiratoria (BR)	80–120 br/min
Maniobras de reclutamiento (RMs)	~35 cmH2O durante 6 s cada 5 min
Duración de la ventilación; Posición	< 6 h; supino	Decúbito supino para ver mejor el movimiento del pecho
Fracción de oxígeno inspirado (FIO2)	0.3–0.5	Prevenir la hipoxia en ratones anestesiados
Relación inspiratoria/espiratoria (I:E)	1:2–1:4
Inspiratorio a la duración total del ciclo	0.2–0.4
Ventilación por minuto	≥0.57 mL·g-1·min-1
Nuestros estándares:
BR = 80 br/min, duración de la inspiración = 200 ms, FIO2 = 0,3
Imágenes al final de la inspiración: apnea = 200 ms, retardo de disparo = 200 ms después del inicio de la inspiración
Imágenes durante la apnea: apnea = 250 ms, retardo de disparo = 250 ms después del inicio de la inspiración
Imágenes al final de la espiración: apnea = 200 ms, retardo de disparo = 650 ms después del inicio de la inspiración

Tabla 2: Ajustes recomendados del ventilador para la obtención de imágenes de ¹²⁹Xe. Los parámetros se pueden ajustar para objetivos de estudio específicos y condiciones experimentales 117,118,119,120,121,122,123,124. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo complementario 3: Calibración del ventilador. Haga clic aquí para descargar este archivo.

2. Animal sedado e intubado.
   1. Encienda la incubadora a 27,7 °C y/o la almohadilla térmica eléctrica a 37,7 °C. Mida y registre la masa corporal del animal. Calcule la dosis de sedante en función de la masa. Consulte la Tabla 3 para ver un régimen de dosificación típico.
   2. Inyectar el sedante por vía intraperitoneal. Anote la hora de la inyección y programe el temporizador para la siguiente dosis de sedante.
      NOTA: Complete los pasos restantes de la Sección 2 (Recopilación diaria de datos) lo más rápido posible para minimizar el tiempo bajo sedación y el riesgo de sobredosis.
   3. Aplique lubricante ocular en los ojos del animal y colóquelo en una jaula sobre la almohadilla térmica o dentro de una incubadora para prevenir la hipotermia.
   4. Confirme que el animal está completamente sedado realizando una prueba de pellizco de los dedos del pie 10-15 minutos después de la inyección de sedante⁶⁸. Intubar siguiendo los procedimientos descritos en Das et ^al.69.
      NOTA: El artículo de Das et ^al.69 va acompañado de una completa demostración en vídeo de la técnica. Los pasos son los siguientes:
   5. Cuelga al animal en decúbito supino por los dientes sobre una tabla inclinada. Use un depresor de lengua para roedores para sacar la lengua.
   6. Para asegurarse de que las cuerdas vocales sean visibles, suministre luz blanca a través de un cable de fibra óptica dentro de la cánula de intubación o una luz brillante colocada en el exterior de la garganta. Inserte la cánula a menos de 5 mm de las cuerdas vocales.
   7. Asegúrese de que la cánula esté en la tráquea, no en el esófago, conectándola a un trozo de tubo con una pequeña gota de agua en su interior. Si la gota de agua se mueve al ritmo de la respiración del animal, es probable que la posición sea correcta.

Agente	Dosis	Ruta	Duración	Comentarios
Agentes inhalados
Isoflurano	Inducción: 4%–5% Mantenimiento: 1%– 3% o al efecto	Inhalado	Durante el flujo continuo	• Requiere el uso de un vaporizador calibrado
Agentes inyectables
Recomendado: Ketamina + xilacina + acepromazina	90 + 9 + 3 mg/kg	Intraperitoneal	De 20 a 60 minutos	• Crea susceptibilidad a la hipotermia
				• Para dosis repetidas, se recomienda cambiar a una mezcla de ketamina + xilacina para prevenir una sobredosis
				• Provoca temblores a medida que pasa el efecto. Para la obtención de imágenes, cumpla estrictamente con el programa de dosificación
				• Puede causar bradicardia
Ketamina + xilacina	90 + 9 mg/kg	Intraperitoneal	De 20 a 40 minutos	• Ver arriba (Ketamina + xilacina + acepromazina)
Pentobarbital	50 - 70 mg/kg	Intraperitoneal	De 20 a 60 minutos	• Deprime la frecuencia respiratoria y el movimiento
				• El costo puede ser prohibitivo
				• Es posible que el grado farmacéutico no esté disponible
Descargo de responsabilidad: Estas son pautas generales. Consulte a un veterinario para obtener más información antes de la implementación.

Tabla 3: Formulario anestésico común para ratones. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

3. Ventilar al animal (Tabla 2).
   1. Conecte el animal al ventilador a través del conector Luer en la cánula de intubación. Monitorizar el movimiento diafragmático y la presión inspiratoria máxima (~10-12 cm H₂O para un volumen corriente de 10 mL/kg de peso corporal). Si la presión o el movimiento respiratorio son anormales, ajuste cuidadosamente el ángulo del cuello y la profundidad de la cánula según sea necesario.
   2. Asegúrese de que la cánula de intubación sea hermética realizando una maniobra de reclutamiento: evite la exhalación (por ejemplo, con un dedo, bloquee el puerto de exhalación) de modo que el animal inhale varias veces sin exhalar.
      NOTA: Si la presión de la vía aérea alcanza la presión inspiratoria máxima de 35 cmH₂O durante ~6 s, el sello de la vía aérea está suficientemente apretado. Si no es así, consulte la explicación para solucionar problemas.
   3. Permita que se reanude la exhalación normal. Realice maniobras de reclutamiento entre exploraciones y cada ~ 5 minutos cuando no esté explorando para mantener la distensibilidad pulmonar y prevenir la atelectasia. Conecte la válvula PEEP a la línea de exhalación. Ajuste PEEP a 4 cmH₂O. Observe cómo la presión inspiratoria máxima aumenta en esa cantidad.
   4. Después de una intubación exitosa, planifique e inicialice la producción de HP ¹²⁹Xe en torno al programa de redosis de sedantes para evitar que el animal se despierte durante una exploración. Controla la temperatura corporal durante todo el experimento.
4. Adquisición de datos: Recogida de imágenes de ventilación.
   NOTA: Los pasos de adquisición de datos 2.4, 2.5 y 2.6 se pueden realizar en cualquier orden
   1. Ajuste el ventilador de acuerdo con la Tabla 2 para obtener imágenes al final de la inspiración.
   2. Cargue los siguientes protocolos de configuración: localizador de animales de protones, pulso único para centrarse en la frecuencia del gas en los pulmones del ratón y localizador de animales ¹²⁹Xe. Consulte la Tabla 4 para conocer los parámetros de exploración.
   3. Coloque al animal en el isocentro y confirme que la cavidad torácica está en el centro del campo de visión con localización de protones. Si utiliza bobinas de frecuencia única, reemplace la bobina de protones con una bobina de RF sintonizada con ¹²⁹Xe.
   4. Registre la polarización de ¹²⁹Xe y transpórtela al escáner de resonancia magnética. Ver Archivo Complementario 4: Lista de verificación de control de calidad de polarización de xenón.
   5. Coloque una bolsa de ¹²⁹Xe dentro del recipiente del ventilador y séllelo. Conecte el recipiente en línea con el ventilador y permita que el recipiente se presurice (3 - 6 psig).
   6. Iniciar la ventilación mecánica ¹²⁹Xe. Cada vez que se activa la ventilación ¹²⁹Xe, permita que el animal complete ~ 5 respiraciones antes de comenzar una exploración para cambiar la capacidad residual funcional de los pulmones.
      NOTA: Cambie a la mezcla N₂/O₂ entre ¹²⁹exploraciones Xe para conservar el gas hiperpolarizado.
   7. Con un solo pulso, ajuste la frecuencia de trabajo para que coincida con la frecuencia de resonancia in vivo de ¹²⁹Xe gaseoso (~83,07 MHz a 7 T). Copie la frecuencia en todos los escaneos posteriores de la fase ^{gaseosa 129}Xe. Realice la localización de ¹²⁹Xe para confirmar que los pulmones están en el isocentro.
   8. Cargue y ejecute la secuencia de ventilación radial ¹²⁹Xe. Controle la presión inspiratoria máxima.
      NOTA: Si el gas ¹²⁹Xe se agota antes de que finalice el protocolo, la presión inspiratoria máxima disminuirá rápidamente. Una bolsa de 400 mL de ¹²⁹Xe puede ventilar un ratón de 30 g durante ~24 minutos cuando se ventila con un 70% de ¹²⁹Xe a 80 respiraciones por minuto con un volumen corriente de 10 mL/kg de peso corporal ideal.
   9. Una vez finalizada la exploración, cambie a la ventilación con la mezcla N₂/O₂ y retire la bolsa vacía de ¹²⁹Xe.
   10. Para obtener imágenes al final de la espiración, cambie la duración de la apnea y el retardo del disparo de acuerdo con la Tabla 2 y repita los pasos 2.4.2 a 2.4.9.
   11. Exporte los datos sin procesar del escáner.

Nombre abreviado del protocolo	Descripción de la secuencia	Detonante	TR (ms)	TE (ms)	Repeticiones	Ángulo de giro (°)	Tamaño de la matriz o Npts	Campo de visión (mm2)	Ancho de banda de RF (kHz)	Espesor de la loncha/losa (mm)	Duración del escaneo
Pulso único	Adquisición de pulsos (fase gaseosa)	Opcional	1000		1	60	2048		10		1 s
Localizador de animales	GRE 2D	Sí	50	1.7	1	60	642	322	3	25	60 s
Ventilación radial	Radial multieco 3D	Sí	20	Ver pie de foto	1	30	613	223	32.05	30	16 minutos
Fase disuelta pulso único	Adquisición de pulsos (fase disuelta)	No	80		1	90	512		10.35		80 ms
Especificaciones dinámicas de fase disuelta.	Adquisición de pulsos (fase disuelta)	No	50		1000	90	512		10.5		50 s
Difusión ponderada	GRE 2D	Sí	12.2	8.1	4	45	642	322	3	1.5	18 minutos

Tabla 4: Parámetros de secuencia in vivo . La secuencia de ventilación radial multieco 3D descrita anteriormente³⁹ adquiere imágenes a 6 veces de eco. Se muestran los resultados de la primera imagen de eco (TE = 1,12 ms, Figura 7). Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo complementario 4: Lista de verificación de control de calidad de polarización de xenón. Haga clic aquí para descargar este archivo.

5. Adquisición de datos: Ejecute espectroscopía dinámica de fase disuelta.
   1. Configure el ventilador de acuerdo con la Tabla 2 para obtener imágenes durante la retención de la respiración. Ajuste el BR a 100 respiraciones/min. Prepárese para una nueva bolsa de ¹²⁹Xe como en los pasos 2.4.2 - 2.4.5.
   2. Iniciar la ventilación mecánica ¹²⁹Xe. Cargue y ejecute un solo pulso para ajustar la frecuencia de trabajo para que coincida con la frecuencia disuelta (~ 83.084 MHz a 7 T). Copie la frecuencia de trabajo en la espectroscopia dinámica de fase disuelta.
      NOTA: Este será un solo pico en ratones con hemoglobina⁵⁴ de tipo salvaje.
   3. Cargue y ejecute la secuencia de espectroscopia dinámica centrada en la frecuencia disuelta en los pulmones de los animales. Una vez finalizada la exploración, cambie a la ventilación con la mezcla N₂/O₂ y retire la bolsa vacía de ¹²⁹Xe. Exporte los datos sin procesar del escáner.
6. Adquisición de datos: Recopile imágenes ponderadas por difusión.
   1. Configure el ventilador de acuerdo con la Tabla 2 para obtener imágenes durante la retención de la respiración. Prepárese para una nueva bolsa de ¹²⁹Xe como en los pasos 2.4.2 - 2.4.7.
   2. Cargue y ejecute la secuencia ponderada de difusión. Una vez finalizada la exploración, cambie a la ventilación con la mezcla N₂/O₂ y retire la bolsa vacía de ¹²⁹Xe. Exporte los datos sin procesar del escáner.

3. Conclusión del experimento

1. Recuperar animal.
   1. Tire de la cánula de intubación directamente fuera de la boca del animal. Si el animal no comienza a respirar espontáneamente de inmediato, administre compresiones torácicas ligeras. Si está disponible, administre un flujo ligero de oxígeno de grado médico cerca de la cara del animal para apoyar la recuperación de la sedación.
   2. Una vez que el animal esté respirando de manera constante por sí solo y si el animal estuvo sedado durante >2 h, administre 0,5 - 1 mL de solución salina normal por vía subcutánea para prevenir la deshidratación.
   3. Regresa al animal a una jaula por sí solo. Coloque la jaula en una incubadora o en una almohadilla térmica.
      NOTA: Los animales sedados son vulnerables al canibalismo y no se pueden colocar en una jaula con compañeros de jaula hasta que estén completamente recuperados (es decir, deambulando de forma independiente). Los animales sedados no pueden regular su temperatura corporal. Use el dorso de la mano para sentir la temperatura del animal cada pocos minutos.
   4. Vigile al animal de cerca hasta que su reflejo de enderezamiento haya regresado (es decir, puede voltearse de forma independiente de una posición supina a una posición prona).
   5. Retire al animal del soporte térmico una vez que pueda deambular de forma independiente. Regrese al animal a una jaula con sus compañeros de jaula.
      NOTA: si el animal no tiene compañeros de jaula, es más susceptible a la hipotermia inducida por la sedación. Proporciónale al animal ropa de cama adicional y, si está disponible, déjalo en una incubadora durante la noche.
   6. Registre el peso del animal una vez por semana durante 2 semanas para controlar su salud.
      NOTA: Si el animal sufrió una lesión en la boca o el esófago a causa de la intubación, puede dejar de comer. Si el animal pierde el >20% de su peso corporal inicial, consulte a un veterinario sobre la eutanasia.
2. Analice las imágenes de ventilación (Figura 7).
   1. Cargue datos sin procesar en una plataforma de programación. Descargue el marco de reconstrucción de código abierto para imágenes no cartesianas⁹¹.
   2. Reconstruya las imágenes de acuerdo con las instrucciones del marco de código abierto. Normalice el primer punto de cada proyección radial³⁹.
   3. Segmente el parénquima pulmonar en las imágenes, incluidos los vóxeles con señal ¹²⁹Xe baja o nula. No incluya las vías respiratorias grandes. Segmente el ruido de fondo en la imagen, excluyendo los pulmones, las vías respiratorias y los artefactos de imagen.
      NOTA: La imagen del localizador de protones puede ayudar a determinar los límites del parénquima.
   4. Calcule la SNR usando la fórmula:
      (3)
   5. Cuantificar la ventilación defectuosa.
      NOTA: Se han propuesto varios métodos para cuantificar el deterioro de la ventilación en modelos de animales pequeños. Los métodos de análisis siguen siendo un área abierta de investigación, pero los enfoques de fácil implementación incluyen: (i) Segmentación manual semicuantitativa⁹², (ii) Enfoque de histograma que utiliza la señal de la tráquea para normalizar la señal parenquimatosa⁴⁷, y (iii) Segmentación del volumen pulmonar total (TLV) y definición de un umbral de señal (por ejemplo, <60% de la media pulmonar total) para dividir los pulmones en volumen defectuoso y volumen pulmonar ventilado (VV). Cuantificar VDP ^93,94 según:
      (4)
3. Analice la espectroscopia dinámica de fase disuelta (Figura 8).
   1. Cargue datos sin procesar en una plataforma de programación. Realice una transformada rápida de Fourier y fone los espectros (la fase manual simultánea de orden cero de los espectros es suficiente para esta aplicación).
   2. Calcule los datos estándar de resonancia magnética nuclear (RMN)^95,96: SNR, ancho completo medio máximo, área integrada, desplazamiento químico y fase de ambos picos.
   3. A partir de los datos de magnitud, divida la amplitud de la señal del espectro disuelto por la del espectro de gases para cada repetición para encontrar la relación entre disueltos y gases a lo largo del tiempo.
4. Analice las imágenes ponderadas por difusión (Figura 9).
   1. Cargue datos sin procesar en una plataforma de programación. Segmente el parénquima pulmonar de la imagen b₀ como en el paso 3.2.3. Calcule la SNR para cada imagen de valor b.
   2. Calcule la relación señal-valor-ruido, SVNR_0, dividiendo la señal en cada vóxel de la imagen b₀ por la desviación estándar del ruido de la imagen. Excluya vóxeles con SVNR₀ < 2,5 veces el ruido de la imagen⁹⁷.
      NOTA: El SVNR₀ es una métrica de vóxel individual, mientras que el SNR parenquimatoso es una métrica de todo el pulmón.
   3. Calcule el ADC ajustando el decaimiento de la señal sobre los valores b (b_i) de acuerdo con la Ecuación 5^98,99:
      (5)

Resultados

Imágenes de ventilación

Si los procedimientos de preparación y ventilación de los animales se implementan correctamente, las imágenes radiales en 3D pueden capturar con éxito los patrones de ventilación cuando la adquisición de datos se realiza en la inspiración o en la espiración (Figura 7). Si bien estas imágenes se recopilan a lo largo de muchas respiraciones, el método descrito aquí es similar al método de imágenes de una sola respiración que se usa en los seres humanos. Esto se debe a que todas las líneas del espacio k se recogen en un momento específico durante el ciclo de respiración (por ejemplo, todas al final de la inspiración), creando acumulativamente una imagen representativa de una sola inhalación. En estas imágenes, las vías respiratorias principales (tráquea y bronquios) son claramente visibles, no hay artefactos de imagen obvios y el parénquima pulmonar parece completamente inflado con una SNR alta (~15 o más, dependiendo de la polarización inicial). Aunque contradictoriamente, las imágenes adquiridas en la inspiración (Figura 7A, SNR = 15) muestran una SNR más baja que las adquiridas en la espiración (Figura 7B, SNR = 27). Esto está relacionado con la modesta presión de conducción y el flujo lento utilizado al ventilar este mouse. Para las imágenes de inspiración, el gas HP aún no había llegado completamente al parénquima de los pulmones, lo que hacía que el ¹²⁹Xe (y por lo tanto la señal) se concentrara en las vías respiratorias más grandes. Este efecto se ve exacerbado visualmente por el escalado del espacio k durante la reconstrucción de la imagen, ya que la señal alta de las vías respiratorias domina el rango dinámico de los datos. No obstante, el análisis debe ser sencillo si el parénquima está segmentado de tal manera que se omiten las vías respiratorias grandes.

Figura 7: Imágenes representativas de ventilación radial en 3D en un ratón C57BL/6J adulto adquiridas utilizando métodos publicados anteriormente³⁹. Si bien ambas imágenes tienen una SNR relativamente alta, las imágenes en (A) inspiración tienen una SNR más baja que las imágenes en (B) espiración, en gran parte porque el gas ¹²⁹Xe aún no había tenido tiempo de llegar a los pulmones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Es importante distinguir entre la ventilación obstruida patológicamente y otras causas de SNR baja. En la Figura 7A, no se espera ninguna obstrucción de la ventilación (es decir, un VDP bajo) porque el animal era un ratón sano de tipo salvaje. Si se obstruyera la ventilación, los defectos aparecerían típicamente como regiones con una señal de ¹²⁹Xe baja o nula. Las causas no patológicas de la señal baja suelen incluir:

(i)  Polarización baja de ¹²⁹Xe: Esto causa una SNR baja en el parénquima pulmonar y las vías respiratorias sin artefactos acompañantes. Por lo general, la baja polarización se puede atribuir a un seguimiento incorrecto de los procedimientos de polarización, a la despolarización durante el transporte o a un contenido excesivo de gas_O2 en el tubo de suministro HP ¹²⁹Xe (por ejemplo, de un ventilador calibrado incorrectamente).

(ii) Cánula de intubación insertada demasiado profundamente: Si se inserta demasiado profundamente en la tráquea, la cánula puede desviarse hacia el bronquio izquierdo o derecho. Si se aloja lo suficientemente apretado, el volumen corriente de todo el pulmón puede limitarse a solo unos pocos lóbulos y vías respiratorias, mientras que el resto del pulmón no recibe ninguno. Si esto ocurriera, los lóbulos hiperinflados podrían lesionarse y podría ser necesario sacrificar al animal. Alternativamente, la punta de la cánula puede entrar en contacto directo con el tejido. En este caso, ¹²⁹Xe se limitará principalmente al interior de la cánula, lo que dará como resultado una señal brillante de un tubo visiblemente recto y una señal mínima dentro del parénquima. En este caso, la posición de la cánula debe corregirse de inmediato y el animal debe ser monitoreado para detectar signos de angustia (p. ej., movimiento torácico anormal, ausente o asincrónico en comparación con el ventilador).

(iii) Cánula de intubación colocada a una profundidad demasiado baja: Cuando un bolo de gas se administra a una profundidad demasiado superficial en la orofaringe, la resistencia a que ese bolo fluya hacia los pulmones puede ser más fuerte que la resistencia a ese bolo que fluye alrededor del exterior de la cánula y sale por la boca. Esto puede resultar en una mala insuflación pulmonar. La SNR traqueal puede ser alta, mientras que la SNR parenquimatosa será baja. Los artefactos de movimiento pueden estar presentes debido al gas que fluye por la tráquea durante la adquisición de datos. El carácter del artefacto variará según el tipo de secuencia (GRE, radial, etc.).

(iv) Tiempo de adquisición incorrecto: Si el pulso de RF y la adquisición de datos ocurrieron durante períodos de flujo de gas inspiratorio o espiratorio, generalmente habrá artefactos de movimiento severos, particularmente cuando se usan secuencias cartesianas, y la SNR parenquimatosa será baja.

(v) Respiración espontánea: Si el animal no está suficientemente sedado durante la adquisición de datos, el movimiento respiratorio espontáneo se superpondrá de forma asincrónica sobre el patrón de ventilación mecánica. Esto dará como resultado una entrega variable de ¹²⁹Xe de respiración a respiración, artefactos de movimiento de moderados a severos y una SNR parenquimatosa deficiente. Es fundamental realizar un seguimiento cuidadoso de la dosis y el momento del sedante.

(vi) Muerte animal: En casos raros, los ratones pueden morir (por ejemplo, debido a una posición incorrecta de la cánula, una administración insuficiente de_O2 , una sobredosis de sedantes o una patología experimental grave). Si esto ocurre, el tejido pulmonar se endurece rápidamente y el parénquima pulmonar se inflará mal. La tráquea superior puede permanecer brillante, pero el parénquima pulmonar tendrá una señal muy baja.

Espectroscopía de intercambio de gases

En sujetos humanos, los parámetros derivados de la espectroscopia (por ejemplo, intensidad de la señal, ancho espectral, desplazamiento químico y fase) ofrecen información sobre la dinámica cardiopulmonar y el estado de la enfermedad^52,53. A diferencia de los humanos⁸⁶, los perros¹⁰⁰ y las ratas^20,101, los espectros de pulmón completo de los ratones obtenidos cuando la magnetización de ¹²⁹Xe se limita al parénquima pulmonar muestran una resonancia de fase única, amplia y disuelta correspondiente a ¹²⁹Xe disuelto en el tejido de la membrana capilar, el plasma sanguíneo y los glóbulos rojos⁵⁴ (Figura 8A, 197 ppm). Cuando se transporta por el flujo sanguíneo a los tejidos más distales, ¹²⁹Xe produce distintas frecuencias de resonancia de varios tejidos, incluido el tejido adiposo⁵⁴, el músculo, la materia gris y la materia blanca^102,103. Sin embargo, debido a los tiempos de tránsito relativamente largos (varios segundos) y a la modesta solubilidad¹⁰⁴ (solubilidad de Ostwald = 0,1 - 0,3), estas señales suelen ser débiles y sólo se observan durante experimentos dedicados y cuidadosos. La excepción es ^{el 129}Xe disuelto en los tejidos grasos (Figura 8A, 189 ppm). A partir de estos tejidos, puede aparecer una señal de ¹²⁹Xe en unos pocos segundos (por ejemplo, durante las primeras respiraciones durante la configuración del animal). Además, la intensidad de la señal puede ser alta, porque la solubilidad de Ostwald de ¹²⁹Xe es casi 20 veces mayor en los tejidos adiposos que en el plasma sanguíneo (es decir, 1,7 frente a 0,094, respectivamente, a 37 °C¹⁰⁴). También se espera que los tiempos de relajación longitudinal sean relativamente largos (in vivo T₁ es de ~20 s en lípidos¹⁰⁵ frente a 3-8 s en sangre¹⁰⁶). Como resultado, la señal ¹²⁹Xe del tejido adiposo puede ser relativamente alta en comparación con otros tejidos.

Debido a la diferente dinámica de la señal, los experimentos de espectroscopia ¹²⁹Xe se pueden adaptar para interrogar el tejido adiposo (por ejemplo, para dirigirse a la termometría de tejido adiposo marrón¹⁰⁷) o la absorción de gas en los pulmones seleccionando los parámetros de adquisición correctos. Cuando se adquieren ^{espectros de 129}Xe de los pulmones con los ajustes descritos en la Tabla 4 (es decir, TR = 50 ms y un ángulo de giro de 90° centrado en el pico de la fase disuelta), se observan tanto los picos de la fase gaseosa como los de la fase disuelta (Figura 8A, B). En particular, el volumen de gas en el pulmón del ratón es 2-3 veces mayor que el volumen del tejido, y la solubilidad de ¹²⁹Xe en este tejido es solo ~ 104,108,109,110,111^. A pesar de esto, la amplitud de la señal disuelta excede a la de la fase gaseosa en aproximadamente 2 veces porque la excitación de la fase gaseosa está muy lejos de la resonancia (~15 kHz a 7 T; Figura 8B, SNR = 102 vs. 43, respectivamente). Por lo tanto, el grupo de magnetización de 20 a 30 veces mayor en la fase gaseosa se puede aproximar como un depósito estable (es decir, no agotado) para la señal de la fase de disolución durante las partes estáticas del ciclo de respiración.

Con un nuevo aliento de magnetización cada ~600 ms y un TR de 50 ms, la intensidad de la señal tanto de la fase gaseosa como de la fase disuelta ¹²⁹Xe oscila. En el caso de la señal de gas, esto es atribuible al cambio en el volumen total de gas (es decir, alto en la inspiración y bajo en la espiración). La situación es más compleja para la señal disuelta porque la magnetización del gas fuente, T₂*, y el volumen de sangre capilar pueden fluctuar con el estado de inflado. Como resultado, la relación entre la amplitud de la señal disuelta y gaseosa también oscila con respecto al ciclo de respiración (Figura 8C, relación media entre disuelto y gas = 1,9 ± 0,39).

Figura 8: Espectroscopia dinámica representativa en un ratón C57BL/6J adulto. (A) Un solo espectro de pulso muestra la señal que se origina en ¹²⁹Xe en la fase gaseosa, disuelta en el tejido adiposo (189 ppm) y disuelta tanto en la membrana capilar como en los tejidos sanguíneos (197 ppm). (B) Espectroscopia dinámica que muestra la intensidad de la señal variable en el tiempo de ¹²⁹Xe disueltos y gaseosos (tiempo de repetición = 50 ms). Para ayudar a la visualización, solo se muestran cinco espectros. Las líneas diagonales en el eje de tiempo representan saltos de escala. (C) La relación entre la amplitud de la señal disuelta y gaseosa en un intervalo de 2 s (correspondiente a la ruptura de la escala roja en el panel B) muestra una clara variación con el ciclo de respiración (0,6 s por respiración). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La siguiente es una lista de factores que podrían comprometer los resultados de la espectroscopia de intercambio de gases ¹²⁹Xe. En cada caso, el resultado probable es una SNR baja, lo que puede hacer que el ajuste espectral y las métricas resultantes (por ejemplo, la relación entre la amplitud de la señal disuelta y gaseosa, el desplazamiento químico, el ancho espectral y la fase) sean inexactos.

(i) Frecuencia de trabajo incorrecta: Debido al volumen de gas significativamente mayor y la baja solubilidad tisular, los pulsos de RF centrados en la frecuencia de la fase gaseosa no producirán ninguna señal de fase disuelta. Los pulsos de RF deben estar centrados en o cerca de la frecuencia de fase disuelta.

ii) Anchura de banda demasiado amplia: La anchura de banda de excitación debe ser lo suficientemente amplia como para excitar alguna fase gaseosa ¹²⁹Xe a fin de medir la relación entre la amplitud de la señal disuelta y gaseosa. Pero si el ancho de banda es demasiado amplio, el pulso de excitación destruirá la magnetización en la fase gaseosa antes de que se disuelva en el tejido. Esto puede verse como una señal de gas muy alta y una señal de fase disuelta baja o nula, a pesar de que el pulso se centra en la frecuencia de fase disuelta.

(iii) TR no optimizado: Para interrogar la dinámica de la señal sobre una respiración, el teorema de muestreo de Nyquist-Shannon requiere que la señal se muestree a un mínimo del doble de su frecuencia (aquí, se muestrearon 100 respiraciones por minuto cada 50 ms, o ~ 12x por respiración). Dependiendo de las condiciones experimentales, es posible una mayor interrogación de la dinámica de la señal cardiopulmonar a una frecuencia de muestreo más rápida. Los resultados de estos experimentos dependerían de muchos factores, como el ancho de banda de excitación, la frecuencia respiratoria y la frecuencia cardíaca. También se debe considerar el tiempo de intercambio de xenón (es decir, el tiempo que tarda el xenón en disolverse en el tejido; ~56 ms⁵⁴) y el tiempo de tránsito pulmonar (es decir, el tiempo que tarda la sangre en fluir del ventrículo derecho al izquierdo; ~830 ms para una frecuencia cardíaca de ~436 latidos/min¹¹²). El muestreo con demasiada frecuencia resultará en la destrucción temprana de la magnetización y la baja señal, pero también reducirá la influencia del flujo sanguíneo. El muestreo con menos frecuencia permitirá que la magnetización se disuelva más y acumule más señal, pero dependerá más del flujo sanguíneo y se localizará menos en las regiones de intercambio de gases en los alvéolos.

Imágenes ponderadas en difusión

Las imágenes ponderadas por difusión, utilizadas para cuantificar el tamaño del espacio aéreo alveolar, han sido rigurosamente validadas en modelos de animales pequeños mediante métodos tradicionales de histomorfometría 98,113,114. Aquí, restringimos la discusión a imágenes 2D, selectivas en cortes para minimizar el tiempo de escaneo y el uso de gas, al tiempo que coincidimos con los protocolos validados previamente⁹⁸. Un mínimo de 2 imágenes de valor b es suficiente para calcular el ADC, y 4 o más imágenes de valor b son necesarias para cálculos avanzados de morfometría (como la intersección lineal media). La adquisición de múltiples imágenes de valor b ofrece una ventaja significativa al mejorar la precisión de los cálculos. A diferencia de las imágenes humanas durante una sola retención de la respiración, las imágenes preclínicas durante muchas respiraciones proporcionan una señal repuesta continuamente. Debido a esto, es posible adquirir muchas imágenes de valor b de SNR altas, limitadas solo por el volumen de gas HP disponible y la duración de la sedación animal. Aquí, adquirimos 7 imágenes de valor b, cada una con SNR >15, utilizando 400 mL de gas ¹²⁹Xe durante 18 minutos de tiempo de escaneo (Figura 9). La señal en cada imagen decae con el aumento de la intensidad del gradiente de difusión (valor b). Esta disminución de la señal es proporcional al ADC del ¹²⁹Xe dentro del pulmón. Las vías respiratorias grandes se pueden distinguir del tejido acinar comparando las imágenes b₀ y b₆. En las regiones que tienen una probabilidad anatómica de contener vías respiratorias, los píxeles aparecerán muy brillantes en la imagen b₀, pero aparecerán oscuros en la imagen b₆ (flechas rojas, Figura 9). Estos píxeles deben excluirse del análisis del parénquima pulmonar.

Figura 9: Imágenes representativas ponderadas por difusión en un ratón C57BL/6J adulto. Las vías respiratorias grandes (flechas rojas), a través de las cuales ¹²⁹Xe se difunde libremente mientras se diluye con oxígeno, muestran una mayor atenuación de la señal en relación con el parénquima pulmonar. Esto da como resultado vías respiratorias brillantes en la imagen b₀ y vías respiratorias de señal baja en la imagen b₆ . Los ratones y las ratas tienen valores de ADC similares a los humanos en relación con los humanos, pero los valores dependerán de factores biológicos y experimentales como la edad, el volumen corriente, la presión y los parámetros de difusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El ADC de este ratón adulto sano de tipo salvaje sigue el resultado esperado en función de la literatura, su edad, SNR, parámetros de adquisición y más. Los factores que pueden afectar negativamente la precisión y exactitud de los resultados del ADC incluyen:

(i) SNR baja: Es importante destacar que la SNR baja en las imágenes sesga el cálculo del ADC hacia valores más bajos^{de 99,115}. Por esta razón, excluimos los vóxeles con SVNR₀ < 2,5 veces el ruido de la imagen⁹⁷.

(ii) Segmentación inadecuada: Una segmentación deficiente (por ejemplo, el uso de umbrales de señal sin inspección visual para el control de calidad) puede sesgar los resultados. Si las imágenes contienen artefactos (como los causados por el movimiento), es posible que superen el umbral y se clasifiquen incorrectamente como parénquima. Además, es particularmente importante excluir los píxeles cerca de las vías respiratorias grandes, ya que los efectos de volumen parcial pueden sesgar su ADC hacia valores más altos.

(iii) Ventilador mal calibrado: En general, la dilución de ¹²⁹Xe con gases más ligeros (por ejemplo,_O2 o N₂) puede desplazar el ADC hacia valores más altos, por lo que la ventilación con mezclas de gases conocidas es necesaria para las comparaciones cuantitativas. Si se ventila con una mezcla de ¹²⁹Xe/O₂ , un aumento en la concentración de oxígeno antes de la entrega aumentará la relajación de T₁ y reducirá la magnetización de ¹²⁹Xe en el tubo de suministro de gas, disminuyendo así la SNR.

(iv) Desreclutamiento pulmonar: En animales anestesiados y ventilados mecánicamente, el colapso alveolar (atelectasia) puede ocurrir con el tiempo. Cuando esto sucede durante la ventilación a volumen constante, el mismo volumen corriente se redistribuye necesariamente a los alvéolos que permanecen reclutados. A medida que se desarrolla una atelectasia de moderada a grave, el resto del pulmón puede hiperinflarse, causando lesiones y un aumento de la ADC en esas regiones. Las maniobras regulares de reclutamiento y la PEEP previenen el colapso alveolar, evitan la distensibilidad pulmonar disminuida y minimizan el riesgo de lesión pulmonar que puede sesgar los resultados del ADC.

(v) Mal ajuste de los datos: Se debe tener en cuenta el método de estimación del ADC. El ajuste log-lineal es el más eficiente desde el punto de vista computacional, pero introduce sesgo en las imágenes de baja SNR. Por lo tanto, se aplica mejor a imágenes de alta SNR (>20). El método lineal ponderado reduce este sesgo y es apropiado en imágenes con SNR > 15. La estimación bayesiana puede producir estimaciones de ADC con baja incertidumbre incluso con SNR <10, pero es computacionalmente costosa⁹⁹.

(vi) Tiempo de difusión subóptimo: El tiempo de difusión óptimo está influenciado por la fuerza máxima del gradiente del escáner de resonancia magnética y el radio de la vía aérea acinar en ratones (radio ~ 100 μm⁴⁹), que es aproximadamente tres veces menor que el de los humanos. Para garantizar unas condiciones óptimas, el tiempo de difusión se establece para alcanzar una longitud de difusión mayor que el radio alveolar medio, pero menor que la longitud media de los conductos alveolares. El tiempo de difusión óptimo para la intensidad máxima del gradiente específica del sitio puede determinarse utilizando los métodos descritos por Sukstanskii y Yablonskiy⁴⁹. El uso de un tiempo de difusión subóptimo puede conducir a disminuciones no lineales en ¹²⁹Xe ADC, lo que complica la interpretación de los resultados.

(vii) Valores b subóptimos: Existe un equilibrio entre maximizar la SNR y maximizar la relación contraste-ruido (CNR) generada en las imágenes de valor b. Si se sacrifica CNR mediante el uso de solo valores b bajos (es decir, decaimiento de la señal difusiva como si se adquirieran solo las primeras 3 imágenes de valor b en la Figura 9), entonces la estimación del ADC será inexacta debido a un ajuste deficiente. Si la ponderación de difusión es demasiado fuerte, la SNR resultante será insuficiente y el ADC estará sesgado hacia valores más bajos.

Discusión

La resonancia magnética hiperpolarizada ^{con 129}X se está convirtiendo en una técnica sofisticada y potente para estudiar la microestructura y la función pulmonar en modelos animales pequeños. Este protocolo tiene como objetivo guiar la preparación inicial del sitio y describir los procedimientos experimentales necesarios para cuantificar la ventilación, la difusión y el intercambio de gases en pulmones de ratón con HP ¹²⁹Xe. Los requisitos previos clave para los experimentos incluyen establecer un maniquí de gas ¹²⁹Xe y garantizar que se suministre al animal una alta polarización de gas. Esto último requiere una planificación cuidadosa de los parámetros de polarización, la mitigación de las pérdidas de polarización durante el transporte de gas (por ejemplo, la construcción de un estuche portador magnético) y la caracterización (e idealmente evitación) de la relajación de T₁ dentro del campo marginal del imán de resonancia magnética preclínica^116,125. Paralelamente al desarrollo de la infraestructura necesaria de HP ¹²⁹Xe, es imperativo establecer protocolos y procedimientos sólidos de manejo de animales. Estos incluyen una sedación efectiva para permitir una ventilación mecánica robusta, una intubación no lesiva para permitir estudios longitudinales y estrategias de ventilación que equilibren la necesidad de administrar una magnetización alta de ¹²⁹Xe con condiciones de ventilación seguras y fisiológicamente relevantes.

Hasta cierto punto, los métodos, procedimientos y resultados descritos aquí dependen del hardware específico utilizado (p. ej., ventilador, polarizador y tipo de escáner de resonancia magnética). Si se dispone de equipos alternativos, las técnicas experimentales pueden modificarse con relativa facilidad. Además, se pueden optimizar los procedimientos diarios de aseguramiento de la calidad (Paso 1.2, Figura 4 y Tabla 1). El mantenimiento meticuloso de registros durante los ~30 minutos de control de calidad es fundamental durante el establecimiento de un nuevo sitio. Permite la detección temprana de problemas de hardware y la capacidad de descartarlos durante la resolución de problemas. Una vez que las variaciones diarias en las métricas de control de calidad estén bien caracterizadas, la calibración del ángulo de giro y el escaneo de control de calidad de ~ 21 minutos se pueden reducir para mayor eficiencia. Además, el enfoque general puede extenderse a otras especies comunes de animales pequeños (por ejemplo, ratas y conejos) ajustando las dosis de anestésico, la configuración del ventilador y los parámetros de adquisición. Los protocolos básicos se pueden utilizar para explorar la fisiología dependiente del ventilador, como el impacto de la frecuencia respiratoria, el volumen y los niveles de PEEP en el intercambio de gases o el reclutamiento alveolar. Si no se requieren datos longitudinales o se completa un estudio longitudinal, la cánula de intubación permite el lavado broncoalveolar o la fijación y extracción pulmonar rápida para análisis convencionales (p. ej., histología o mediciones morfométricas). Además, el potencial de modificación de este protocolo se extiende a las secuencias y parámetros de resonancia magnética, lo que representa un aspecto dinámico de la investigación de la resonancia magnética ¹²⁹Xe.

La colocación de la cánula es fundamental para la seguridad de los animales y la calidad de la imagen. Debido a que la cánula de intubación no está fijada rígidamente, por ejemplo, suturando alrededor de la tráquea, desplazamientos relativamente pequeños (por ejemplo, movimientos al conectar el equipo de monitoreo fisiológico) pueden romper el sello hermético con la tráquea. Este sello hermético es necesario para las maniobras de reclutamiento (~35 cm H₂O presión inspiratoria máxima), que son cruciales para mantener la distensibilidad pulmonar y prevenir la atelectasia. En caso de que la maniobra de reclutamiento no alcance la presión objetivo, el investigador debe sopesar las estrategias correctivas en el contexto de los objetivos del estudio (p. ej., imágenes ponderadas por difusión frente a imágenes de ventilación; punto de tiempo único frente a longitudinal). Las estrategias de mitigación pueden incluir 1) retirar la cánula y volver a tubarla, 2) ajustar la posición de la cánula para aumentar el contacto con las paredes traqueales mientras aún está insertada, y 3) continuar con el experimento sin obtener un sello hermético al gas. Desde el punto de vista de la fidelidad de los datos, la reintubación es la opción más sólida, pero puede llevar mucho tiempo y provocar un decaimiento no deseado de la magnetización ^{de 129}Xe. El ajuste de la posición de la cánula es más rápido, pero debe realizarse con precaución, ya que conlleva un mayor riesgo de lesiones. Continuar el experimento sin RM se utiliza mejor cuando el ratón va a estar ventilado durante <20 min para evitar cambios en la dinámica pulmonar inducidos por atelectasia¹¹⁷.

Más allá de la necesidad obvia de un manejo seguro de los animales, la clave para desarrollar un programa de resonancia magnética de ratón HP ¹²⁹Xe robusto y confiable, y para solucionar sus desafíos, es el mantenimiento meticuloso de registros. Para la producción de HP ¹²⁹Xe, es aconsejable realizar un seguimiento de la potencia del láser, el tiempo de acumulación, el caudal y la polarización. Durante la obtención de imágenes fantasma y la espectroscopia, es mejor registrar la SNR de la imagen, la posición del pico, el ancho de línea espectral y la potencia de RF necesaria para obtener un pulso de 90°. Para la obtención de imágenes in vivo , se deben registrar datos de control de calidad similares junto con parámetros de monitoreo fisiológico (presión inspiratoria máxima, temperatura corporal, etc.) y una línea de tiempo detallada de los eventos de manejo de animales. Algunas piezas clave del equipo pueden facilitar la resolución de problemas de los ventiladores. Estos incluyen un sensor de_O2 , un espirómetro para animales pequeños y un manómetro para calibrar la ventilación y la presión de PEEP. Un osciloscopio y un voltímetro pueden ayudar a confirmar que la sincronización del ventilador es precisa y coincide con la compuerta del escáner de resonancia magnética. Por último, un gaussímetro de mano es indispensable para confirmar la integridad de un estuche de transporte magnético si es necesario para el transporte. En cuanto a la resolución de problemas de la secuencia de resonancia magnética, se recomienda utilizar tanto el maniquí de gas descrito en este protocolo como una jeringa llena de gas HP. El uso de una jeringa que contiene gas HP ¹²⁹Xe es particularmente beneficioso para la resolución de problemas de secuencias ponderadas por difusión, ya que la precisión de los datos se puede evaluar en función de si reflejan una verdad fundamental conocida: el coeficiente de difusión libre de ¹²⁹Xe puro dentro de la jeringa.

Hay que reconocer varias limitaciones a la hora de aplicar este protocolo. En primer lugar, depende de equipos especializados y experiencia, lo que reduce la accesibilidad para nuevos sitios. Sin embargo, con la reciente aprobación regulatoria para uso clínico en los EE. UU., se espera que aumente el número de sitios equipados con capacidades de resonancia magnética ¹²⁹Xe. La técnica también está limitada por las limitaciones inherentes del gas hiperpolarizado, incluida una vida útil de polarización relativamente corta y la necesidad de una adquisición rápida de datos. El uso de un ventilador mecánico generalmente mejora la SNR de la imagen e intrínsecamente evita los artefactos de movimiento, pero enmascara la dinámica natural de la respiración que podría capturarse mediante el empleo de un dispositivo de suministro de gas de respiración libre. Además, los hallazgos de modelos de animales pequeños que utilizan este protocolo deben interpretarse con cautela cuando se extrapolan a la fisiología humana, dadas las variaciones significativas de las especies. Otra limitación es la naturaleza desafiante de la intubación oral y la ventilación mecánica, que son difíciles en ratones que pesan menos de 25 g. Esto puede excluir a los machos menores de ~8 semanas y a las hembras menores de ~20 semanas, a menos que se utilicen equipos y procedimientos específicos. La limitación más evidente de este protocolo es la ausencia de programación de pulsos y técnicas avanzadas de reconstrucción de imágenes. La inclusión de estos métodos en un protocolo generalizado es poco práctica debido a sus intrincados detalles técnicos y conocimientos especializados. Por último, este protocolo describe métricas cuantitativas básicas como SNR, VDP y ADC, pero no medidas más avanzadas como la ventilación fraccional regional, la morfometría de difusión y las imágenes de intercambio de gases. Estas métricas avanzadas se implementarán más fácilmente una vez que se configure la infraestructura básica descrita aquí.

Aunque la resonancia magnética con gas HP ¹²⁹Xe en animales pequeños requiere muchos recursos y supone un reto experimental, tiene el potencial de avanzar significativamente en la investigación pulmonar preclínica. Ofrece un medio mínimamente invasivo y sensible para cuantificar la ventilación regional, el tamaño del espacio aéreo alveolar y la dinámica del intercambio gaseoso. Como tal, puede proporcionar un medio único para evaluar la fisiología pulmonar, la progresión de la enfermedad y las intervenciones terapéuticas a lo largo del tiempo. Por lo tanto, representa una mejora con respecto a las técnicas preclínicas tradicionales, que incluyen histología, análisis bioquímicos, modalidades de imágenes ionizantes y mediciones de mecánica pulmonar invasiva. Además, la resonancia magnética ^{con 129}Xe para animales pequeños sigue siendo un subcampo de investigación en desarrollo activo, y equilibrar la física de imagen relevante con los requisitos preclínicos representa importantes oportunidades de investigación por derecho propio. Por último, a medida que la resonancia magnética clínica ^{con 129}Xe sea más ampliamente aceptada y utilizada clínicamente, las oportunidades para los estudios traslacionales de ratón a humano y viceversa seguirán creciendo con el tiempo.

Figura complementaria 1: Diagrama de circuito para el estuche de transporte magnético. Un solenoide hecho de alambre de cobre esmaltado, L1, está conectado en paralelo con V1, una batería recargable de plomo-ácido sellada de 12 voltios. La resistencia de la resistencia R1 se puede seleccionar para controlar la corriente a través de V1 y L1. Una lámpara LED indicadora de panel, R2 y D1, también está cableada en paralelo con V1. Un interruptor de encendido y apagado, S1, está conectado en serie con V1. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Resultados de la calibración del ventilador para nitrógeno. El volumen de salida de 30 respiraciones se midió por triplicado. Se realizó una regresión lineal para determinar la presión motriz necesaria para producir volúmenes de gas relevantes. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Hoja de referencia de ajustes de presión del ventilador. La pendiente y la intersección resultantes de la regresión lineal de cada gas se utilizan en la ecuación S1. Esta ecuación se utilizó para determinar la presión motriz necesaria para producir un volumen corriente de 10 ml/kg de peso corporal ideal para mezclas de gases de 70% N₂ + 30% O₂ y 70% ¹²⁹Xe + 30% O₂ para pesos animales pertinentes. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa de 1 mL	fisher scientific	Referencia No.14-955-464	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464
cilindro graduado de 10 mL	Cole-Parmer	UX-34502-69	https://www.coleparmer.com/i/cole-parmer-essentials-graduated-cylinder-glass-hexagonal-base-10-ml-2-pk/3450269?PubID=UX&persist=true&ip=no& gad_source=1& gclid=CjwKCAi A6KWvBhAREiwAFPZM7h3do -ssjascARuVviKd7V7kC5ztdIB6 _70DnMr-K3qk9RKeJ7-IrhoCeT 0QAvD_BwE
18 G - catéteres PFTE venosos (no estériles)	Terumo Surflo	SROX1832CA	https://www.shopmedvet.com/product/iv-catheter-18-x-1-25inch?r=GSS17&p=GSS17&utm_source= google& utm_medium=google_ compras& gad_source=1& gclid= CjwKCAiA0bWvBhBjEiwAtEsoW 4oTvZkAgWQCda6ocVtQlulVrG 2536FNbu5soMVSFN8xK_g1Uh pXIRoCGwoQAvD_BwE
20 G - catéteres PFTE venosos (no estériles)	Terumo Surflo	SROX2051CA	https://www.shopmedvet.com/product/iv-catheter-20-x-2inch?r=GSS17&p=GSS17&utm_source =google& utm_medium=google_ compras& gad_source=1& gclid= CjwKCAiA0bWvBhBjEiwAtEsoW 87ggCkgToD_XF_UgpQBTpmN dgSNfCml6TkDKlW8k27Dq_daR itPuhoCnBQQAvD_BwE
22 G - catéteres PFTE venosos (no estériles)	Terumo Surflo	SROX2225CA	https://www.shopmedvet.com/product/iv-catheter-22-x-1inch?r=GSS17&p=GSS17&utm_source= google& utm_medium=google_ compras& gad_source=1& gclid =CjwKCAiA0bWvBhBjEiwAtEso W9IM6mpee6m7e-lBfR8dZhSN KYbMUs7qgEU4gYCRTW_rJAs W_lGkthoCm30QAvD_BwE
400 mL bolsas de tedlar	Jensen Productos inertes	GST-001S-3507TJC	NA
Jeringa de 60 mL	scientific	Catálogo No.14-955-461	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955461
70% de alcohol	Cole-Parmer	UX-80024-34	https://www.coleparmer.com/i/labchem-isopropyl-alcohol-70-v-v-500-ml/8002434?PubID=UX&persist=true&ip= no& gad_source=1& gclid=CjwKC AiA6KWvBhAREiwAFPZM7gGh p8g7MBHBBKadaRCAwfEMgV gna5fhYRsuXIuqoqOiToCC4fem nhoCGMEQAvD_BwE
Dewar para nitrógeno líquido	Terra Universal	4LDB	https://www.laboratory-equipment.com/tw-4ldb-liquid-nitrogen-dewar-ic-biomedical.html?srsltid=AfmBOooxwMtOA1Z2TweR P8V5Iy5EvYT3alZuzoiY 3UF3Ib9RgFnDxVTfWP0
Lubricante ocular	Refresh	REFRESCAR P.M.	https://www.refreshbrand.com/Products/refresh-pm
Lámpara de fibra óptica	AmScope	HL250-AY	https://amscope.com/products/hl250-ay?tw_source=google & tw_adid=& tw_campaign= 16705014684& gad_source= 1& gclid=CjwKCAiA6KWvBhA REiwAFPZM7p-DpyvHJaGxR pAD1385hzGf1oPdKHHLFDR Sp8yrtxry11SNJeJnKxoCtAoQ AvD_BwE
Gaussmeter	Apex Magnets	GMHT201	https://www.apexmagnets.com/magnets/accessories/ht-digital-gaussmeter-with-peak-hold-can-display-gauss-or-tesla
Recipiente de vidrio (fantasma)	Ace Glass	8648-24	https://aceglass.com/results.php?t=8648-24&t=8648-24
Almohadilla térmica	Office Depot	9206211	Almohadilla térmica PureRelief Express Designer Series 12 x 15 Palm Aqua - Office Depot
Hiperpolarizador	Polarean	9820	https://polarean.com/xenon-mri-platform/
Placa de intubación	Hallowell EMC	000A3467	https://hallowell.com/product/rodent-tilting-workstand/
Suministros de intubación	Lista de piezas publicada en otro lugar	NA	https://app.jove.com/t/50318/a-simple-method-of-mouse-lung-intubation
Cilindro de xenón enriquecido isotópicamente	Isótopos de Linde	XE-129(1%)N2(10%)HE CGMP 302SZ	NA
Nitrógeno líquido	Linde	NI LC160-22	https://www.lindedirect.com/store/product-detail/nitrogen_n2_nitrogen_liquid _lc160_22_psi_ni_lc160_22 /ni-lc160-22?cat_id=shop& node=b89
Luer de deslizamiento macho	Cole-Parmer	UX-21943-27	https://www.coleparmer.com/i/diba-omnifit-t-series-solvent-waste-cap-adapter-polypropylene-male-luer-slip-x-1-16-id-hose-barb-5-pk/2194327
Manómetro	Grainger	3T294	https://www.grainger.com/product/3T294?gucid=N:N:PS: Pagado:GGL:CSM-2295:4P7A1P: 20501231& gad_source=1& gclid =CjwKCAiAi6uvBhADEiwAWiyR dltxrPJmmcm0bFiYLuPrB25HV QFdEfKMBqvgJBNdQUs3DZ7b TLr8CRoCanAQAvD_BwE& gclsrc=aw.ds
Ventilador Minivent	aparato harvard	73-0044	https://www.harvardapparatus.com/minivent-ventilator-for-mice-single-animal-volume-controlled-ventilators.html
Perforador de orejas de ratón	fisher scientific	13-812-201	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-animal-ear-tag-punch/13812201
Depresor de lengua de ratón	Herramientas médicas	VRI-617	https://medical-tools.com/shop/rodent-tongue-depressor.html
Báscula de peso para ratón	Cole-Parmer	UX-11712-12	https://www.coleparmer.com/i/adam-equipment-cqt2000-core-portable-balance-2000g-x-1g-220-v/1171212?PubID=UX&persist=true&ip=no&gad _source=1& gclid=CjwKCAiA6K WvBhAREiwAFPZM7iYnAG5Ilc Z5DZWrdJ6wcLDZSCSfNJHOH m2PQOpyyWe0TjFa75R3tBoCjB sQAvD_BwE
escáner de resonancia magnética	Sistema horizontal Bruker	7T Biospec	https://www.bruker.com/de/products-and-solutions/preclinical-imaging/mri/biospec.html
multímetro	Home Depot	1007898529	https://www.homedepot.com/p/Klein-Tools-600-Volt-Digital-Multi-Meter-Manual-Ranging-MM325/320822947
Abundancia natural xenón	Isótopos de Linde	Aguja NA 2036 de la ONU
	fisher scientific	305194	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-general-use-precisionglide-hypodermic-needles-20/148266C?keyword=true
Soporte de jeringa seguro para agujas	fisher scientific	NC2703873	https://www.fishersci.com/shop/products/ndlsafe-ii-syr-uncap-deca/NC2703873#?keyword=needlesafe
Cilindro de nitrógeno	Linde	NI M-K	https://www.lindedirect.com/store/product-detail/nitrogen_n2_nitrogen_nf_k/ni-m-k?cat_id=shop&node=b89
Bombona de oxígeno	Linde	OX M-K	https://www.lindedirect.com/store/product-detail/oxygen_o2_oxygen_usp_k/ox-m-k?cat_id=shop&node=b90
Sensor de oxígeno	Apogee instruments	MO-200	https://www.apogeeinstruments.com/mo-200-oxygen-sensor-with-handheld-meter/
Sensor de oxígeno cabezal de flujo en línea	Apogee instruments	AO-002 https://www.apogeeinstruments.com/ao-002-oxygen-meter-sensor-flow-through-head/
Válvula PEEP	Hallowell EMC	000A6556A	https://hallowell.com/product/adjustable-peep-valve-with-exhaust-port-range-5-20cm-disposable/
Puntas de pipeta	fisher scientific	Ficha No.02-707-108	Puntas de ahorro de espacio para racks apilables de Fisherbrand: 101-1000 L estándar; Azul; Volumen: |
Válvula de émbolo Fisher Scientific	Ace glass	8648-20	https://www.aceglass.com/results.php?t=8648
Bobina preclínica	Doty scientific	a medida	https://dotynmr.com/products/bmax-xy-low-e/
Reguladores de presión	Cole-Parmer	UX-98202-11	https://www.coleparmer.com/i/cole-parmer-single-stage-regulator-1500-scfh-capacity-346-cga-fitting/9820211?PubID=UX&persist=true&ip=no& gad_source=1& gclid=CjwKCAi A6KWvBhAREiwAFPZM7pruR xCAiaj52nA_8Y1nveQZRsD6B f0QO65o2DKFYqRoz0PopSkX QxoCxqcQAvD_BwE
Ventilador con caída de presión Lista de	piezas publicada en otro lugar	NA	https://sites.duke.edu/driehuyslab/resources/
Tubo de PVC para fantasma	Home Depot	193682	https://www.homedepot.com/p/IPEX-1-2-in-x-10-ft-White-PVC-SCH-40-Potable-Pressure-Water-Pipe-30-05010HD/319692959
Sistema de calefacción para animales	SAI SAII	Modelo 1030	https://i4sa.com/product/model-1030-monitoring-gating-system/
Saline	Farris Laboratories Inc.	0409488820-1	https://www.farrislabs.com/products/bacteriostatic-sodium-chloride-0-9-30ml-bottle?variant=42807174824167¤cy =USD& utm_medium=product_ sincronizar& utm_source=Google& utm_ content=sag_organic& utm_ campaign=sag_organic& utm_ campaign=gs-2021-09-24& utm _source=google& utm_medium =smart_campaign& gad_source =1& gclid=CjwKCAiA6KWvBh AREiwAFPZM7oS3-hFDETO_2f6OWOoKyBMb WuDuWqYxdWRYUWEkY M2Py73VfGzVtRoC2FQQAvD_BwE
Contenedor de objetos punzantes	fisher scientific	22-730-455
https://www.fishersci.com/shop/products/sharps-container-47/p-7250579#?keyword=needle%20safe Resina epoxi	Grainger	3KMY7	https://www.grainger.com/product/3KMY7?gucid=N:N:PS:Paid:GGL:CSM- 2295:4P7A1P:20501231& gad_ fuente=1& gclid=CjwKCAiA6KW vBhAREiwAFPZM7voahkm8tda t1Euql1A8DFhC6AZVJ0wXzCE PfE6iUzrIJXV-Hl8o4xoCQLYQA vD_BwE& gclsrc=aw.ds
Lubricante de silicona para desmoldear el espirómetro	https://www.grainger.com/product/CRC-Mold-Release-Agent-16-oz-19MW95 Grainger	19MW95
	ADInstruments	FE141
https://www.adinstruments.com/products/spirometer Spirometer - cabezal de flujo de ratón	ADInstruments	MLT1L	https://www.adinstruments.com/products/respiratory-flow-heads
Tubo - 1/4 de diámetro	exterior Clippard	URH1-0402-CLT-050
https://www.clippard.com/part/URH1-0402-CLT-050 Tubo - 1/8 de diámetro	exterior Clippard	URH1-0804-CLT-050
https://www.clippard.com/part/URH1-0402-CLT-050 Bomba	de vacío Cole-Parmer	UX-60062-11	https://www.coleparmer.com/i/environmental-express-diaphragm-pump-high-volume-120v/6006211?PubID=UX&persist=true&ip=no&gad _source=1& gclid=CjwKCAiA6K WvBhAREiwAFPZM7uFGwmW pRelHNFgZVvJJV09vDUVyfyG HoKeZTiFNIiVTe-05IpJJPxoCO PoQAvD_BwE
Alambre - calibre 18	Digikey	2328-18H240-ND	https://www.digikey.com/en/products/detail/remington-industries/18H240/15202027?s=N4 IgjCBcoOwBxVAYygMwIYBsDOB TANCAPZQDa4YATPAGwgC6h ADgC5QgDKLATgJYB2AcxAB fQmAAMAFkqIQKSBhwFiZEA GZNATi0SGzNpE48BwsSErqw 6uQqV5CJSOQCsMF%2Bq11 GIVuy58QqLmss4gALbogvy4L AAEAO683LgMIkA
Estación de medición de polarización de xenón	Polarean	NA	https://polarean.com/xenon-mri-platform/