Artículo de método

Aplicación de códigos de barras de ADN para identificar plantas medicinales

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DOI:

10.3791/66925

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1 de noviembre de 2024

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1School of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Institute of Herbgenomics, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

En este artículo

Resumen

El presente protocolo describe el uso de la tecnología de códigos de barras de ADN para autenticar materiales medicinales de origen vegetal y la planta medicinal Angelica sinensis (Oliv.) Diels fue identificado como un ejemplo.

Resumen

Las plantas medicinales son recursos valiosos a nivel mundial y se utilizan en todo el mundo para mantener la salud y tratar enfermedades; sin embargo, la presencia de adulteración obstruye su desarrollo. El código de barras de ADN, una técnica para la identificación de especies por regiones estándar de ADN, facilita la identificación rápida y precisa de plantas medicinales tradicionales. El proceso de código de barras de ADN implica seis pasos básicos: 1) procesamiento de las plantas medicinales, 2) extracción de ADN total de alta calidad de las plantas medicinales utilizando el método de columna centrífuga, 3) amplificación del espaciador transcrito interno 2 de la región de ADN objetivo (ITS2) con cebadores universales de plantas y realización de secuenciación Sanger, 4) empalme y alineación de la secuencia para obtener la secuencia objetivo, 5) hacer coincidir la secuencia del código de barras con la biblioteca de códigos de barras para la identificación, 6) alinear la secuencia, comparar la variación intraespecífica e interespecífica, construir un árbol filogenético de unión de vecinos. Como se muestra en los resultados, el cebador universal puede amplificar la región objetivo. La herramienta básica de búsqueda de alineación local (BLAST) muestra que el porcentaje identificado fue del 100 %, y el árbol de unión de vecinos demuestra que las secuencias de empalme se agruparon con el clado A. sinensis OR879715.1 y el valor de soporte del clado es 100. Este protocolo proporciona una referencia para la aplicación de la tecnología de códigos de barras de ADN como un método eficaz para identificar plantas medicinales y adulterantes.

Introducción

Las plantas medicinales tienen una amplia gama de efectos farmacológicos y son sustancias importantes para el tratamiento y la prevención de enfermedades. La demanda del mercado de plantas medicinales en hierbas medicinales y productos farmacéuticos es enorme y sigue creciendo. Con el aumento del mercado de plantas medicinales, el problema de la adulteración ha obstaculizado el desarrollo de plantas medicinales. En la actualidad, la adulteración de plantas medicinales sufre por las siguientes razones: 1) la morfología similar de las plantas medicinales dificulta su identificación y uso correcto 1,2,3,4,5, 2) la creciente demanda de plantas medicinales ha llevado a una oferta insuficiente en el mercado 6,7, 3) las plantas medicinales son caras y tienen precios fluctuantes, y el uso de hierbas baratas en lugar de materiales económicamente valiosos ha llevado a la adulteración y a la especulación del mercado 8,9. Para resolver los problemas de identificación y uso adecuados de las plantas medicinales, existe la necesidad de una tecnología que permita a los no especialistas identificar la fuente10.

Existen limitaciones para identificar y utilizar adecuadamente las plantas medicinales solo por su apariencia y olor11. Para una identificación y control de calidad más precisos, se emplean métodos fisicoquímicos12. La cromatografía en capa fina (TLC), por ejemplo, es un método rápido para identificar hierbas medicinales y está incluida en la Farmacopea China. Sin embargo, requiere de estándares de referencia para identificar las plantas13. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) puede realizar pruebas cualitativas y cuantitativas, lo que la hace adecuada para las pruebas de calidad de medicamentos. Sin embargo, este instrumento es costoso y requiere conocimientos especializados para operar14,15. La tecnología de código de barras de ADN es una tecnología de identificación de especies rápida y precisa que identifica especies mediante el uso de secuencias de ADN estables para diferenciar entre plantas con morfología similar. Hebert et al. propusieron la tecnología de código de barras de ADN para identificar especies, que utiliza una secuencia de ADN reconocida y relativamente corta dentro del genoma16, Chen et al. propusieron ITS2 como una secuencia universal para la identificación molecular de plantas medicinales e identificaron más de 6600 plantas y encontraron una alta capacidad de identificación17. El estudio de plantas medicinales basado en ITS2 y fragmentos de genes de cloroplastos ha demostrado la capacidad de distinguir especies a nivel de especie, con aplicaciones en los campos de protección de recursos, regulación del mercado y comercio internacional 17,18,19. La aplicación de códigos de barras de ADN puede superar las limitaciones de los métodos tradicionales de identificación, lo que es útil para garantizar la calidad y la seguridad de las plantas medicinales, evitando el abuso de recursos y la confusión20. Ha demostrado ser beneficioso para el estudio de las plantas medicinales, apoyando el crecimiento de la industria herbal de manera sostenible y proporcionando una garantía de que el consumidor utiliza la medicación correcta 21,22,23,24.

El documento describe los protocolos sobre cómo aplicar el código de barras de ADN para identificar plantas medicinales utilizando A. sinensis como ejemplo. El código de barras de ADN utiliza uno o más marcadores genéticos cortos estandarizados en el ADN de un organismo para reconocerlo como perteneciente a una especie en particular. Los métodos actuales para identificar las plantas medicinales tienen ciertas limitaciones. La identificación morfológica tradicional depende en gran medida de la amplia experiencia de los expertos, que puede verse influenciada por factores humanos, mientras que la identificación química es propensa a problemas como la adulteración de compuestos clave. Por el contrario, el código de barras de ADN proporciona un medio más preciso de identificación de especies, ofreciendo ventajas como velocidad, alta reproducibilidad y estabilidad. Además, esta tecnología permite la gestión centralizada y el intercambio de datos de secuencias de especies existentes a través de Internet y plataformas de información, mejorando significativamente la eficiencia y confiabilidad de la identificación de especies11,12. Debido a su similar morfología y partes medicinales, A. sinensis a menudo se confunde con otras especies y con frecuencia se utiliza indebidamente o se sustituye intencionalmente en el mercado25. Yang et al. identificaron A. anomala utilizando códigos de barras de ADN para distinguirla de los falsos fármacos26. Yuan et al. recolectaron 23 especies de Angélica y utilizaron códigos de barras de ADN para diferenciar entre las diversas especies27. Siguiendo los procedimientos descritos en este protocolo, los usuarios podrán autenticar los materiales medicinales de origen vegetal desde el preprocesamiento hasta la coincidencia final de la secuencia del código de barras con la base de datos de códigos de barras (Figura 1).

Protocolo

1. Preparación de la muestra

  1. El presente estudio utilizó como material experimental A . sinensis de dos años de edad con baja temperatura y larga insolación a una altitud de 2800 m del condado de Min, provincia de Gansu. Se seleccionaron tres plantas de las cuales se seleccionaron más de tres raíces para la experimentación. Enjuague las raíces primero con agua esterilizada y luego límpielas con un rociador de alcohol o hisopos con alcohol para evitar la contaminación que podría afectar la precisión de los resultados experimentales. Corta las raíces en trozos de menos de 5 mm con un bisturí esterilizado y mézclalas para su posterior análisis. (Figura 2).
    NOTA: Alternativamente, coloque las raíces en nitrógeno líquido para que queden crujientes, lo que facilita su rotura. Dependiendo de la forma, dureza y otras características de las plantas medicinales, use instrumentos para tratarlas.
  2. Prepare tres tubos de muestras experimentales para experimentos paralelos. Etiquete cada muestra como AS-1, AS-2 y AS-3. Tome aproximadamente 100 mg de pañuelo fresco o 20 mg de papel seco (secado al aire) y colóquelo en un tubo de centrífuga de 2 ml.
  3. Coloque dos perlas de acero inoxidable de 5 mm en los tubos de centrífuga de 2 ml. Transfiera los tubos a una trituradora de tejidos de alto rendimiento que funcione a 60 Hz durante 60 s.

2 Extracción de ADN de la muestra

NOTA: Este estudio utiliza un kit de extracción de ADN genómico de plantas, que se basa en el método CTAB. La extracción de ADN se realiza siguiendo el manual de instrucciones con algunas modificaciones, incluida la adición de un tampón de aislamiento nuclear (NIB) único. El protocolo mejora la pureza del ADN al separar primero los contaminantes del tejido y luego agregar un paso inicial de aislamiento de núcleos 28,29,30.

  1. Añadir 800 μL de NIB preenfriado y colocar la muestra en un mezclador de vórtice, vibrando durante 5 min.
  2. Colocar en una centrífuga y procesar a 13.780 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante.
  3. Repita los pasos 2.1-2.2 durante 3 rondas adicionales.
    NOTA: NIB extrae ADN de mayor calidad y su preparación contiene algunos productos químicos peligrosos que deben manipularse en una campana extractora, lo que dificulta su manejo para los novatos. Sin embargo, este paso no es obligatorio. Los usuarios pueden optar por seguir esta recomendación u omitir estos pasos. Su formulación detallada se encuentra en la Tabla 1.
  4. Añadir 600 μL de tampón P1 y 5 μL de RNasa A (10 mg/mL). Coloque la muestra en un mezclador de vórtice y vórtice para mezclar. Incubar las muestras en un baño de agua a 65 °C durante 1,5 h, invirtiendo los tubos 2x-3x durante la incubación.
  5. Añadir 200 μL de tampón P2, mezclar bien, colocar en hielo durante 15 min y, a continuación, centrifugar a 13.780 x g durante 10 min.
  6. Aspire cuidadosamente el sobrenadante en una columna de filtro AF, centrifugar a 13.780 x g durante 2 min y transfiera el filtrado inferior recogido en el tubo de recolección a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 mL.
  7. Calcule el volumen de filtrado, agregue 1,5 veces el volumen de P3 y agite inmediatamente para obtener una solución mezclada.
  8. Añadir 650 μL de la mezcla preparada a una columna de adsorción (CA) y fermentar durante 5 min, luego centrifugar a 13.780 x g durante 30-60 s.
  9. Agregue el filtrado obtenido del paso 2.8 al aire acondicionado nuevamente, centrifugue y deseche el líquido residual. Repita el procedimiento con la solución mezclada restante del paso 2.7.
  10. Añadir 600 μL de solución de enjuague WB, centrifugar a 13.780 x g durante 30 s, desechar la solución de desecho y repetir el procedimiento 1 vez.
  11. Vuelva a colocar la columna AC en el tubo de recolección vacío, centrifugue a 13,780 x g durante 2 minutos y déjela a temperatura ambiente para eliminar el etanol residual.
  12. Tome la columna de adsorbente AC y colóquela en un tubo de centrífuga limpio de 1,5 mL. Añadir 45 μL de agua desionizada esterilizada (ddH2O) en el centro de la membrana adsorbente, que se ha calentado a 65 °C. Dejar a temperatura ambiente durante 5 min. Centrífuga a 13.780 x g durante 2 min.
  13. Añada la solución resultante de nuevo a la columna y centrifugar a 13.780 x g durante 2 minutos a temperatura ambiente.
  14. Recoja la solución filtrada. Utilice un espectrofotómetro para determinar la concentración de ADN; OD260 representa la absorbancia de los ácidos nucleicos. Utilice los siguientes criterios para el estándar de determinación de la calidad del ADN: OD260 / OD280 = 1.80-2.00, el rango normal; OD260/OD280>2.00; hay una gran cantidad de contaminación por ARN; OD260/OD280<1.80, hay proteínas, fenoles y otros contaminantes.

3 Amplificación y detección de fragmentos de diana

NOTA: Seleccione los cebadores de amplificación apropiados en función de las regiones de código de barras de ADN propuestas por la planta; Las condiciones de reacción se muestran en la Tabla 2.

  1. Configure las condiciones de reacción correspondientes a la amplificación del cebador. Utilice tubos de centrífuga de 0,2 mL llenos de 9,5 μL de ddH2O, 12,5 μL de 2x PCR Master Mix y 1 μL de cebador directo, cebador inverso y ADN molde para un volumen total de 25 μL. Prepare un control negativo, reemplazando la plantilla con agua.
  2. Añadir 20 mL de tampón 1x Acetato de Tris-EDTA (TEA) y 0,2 g de agarosa para calentar y preparar un gel de agarosa al 1%, luego añadir 2 μL de tinción de gel de ácido nucleico (10.000x) y mezclar bien. Vierta la mezcla en una bandeja de fundición de gel y deje que se solidifique para obtener el gel de agarosa. Añadir 3 μL del producto PCR y 2 μL de marcador de ADN 5000 pb al gel.
  3. Ajuste el voltaje a 120 V, la corriente a 400 mA y la electroforesis a 40 min. Utilice un versátil sistema de análisis de imágenes de gel para ver geles y comprobar los resultados.

4. Recopilación y análisis de datos

NOTA: Existe una amplia gama de software de análisis y ensamblaje de secuencias; utilizamos el código Codon Aligner V11.0.1 y MEGA11 como ejemplos para ilustrar.

  1. Utilice el alineador para abrir el archivo de secuenciación para observar el mapa de picos y empalmar los archivos de mapa de picos de secuenciación bidireccional.
    1. Seleccione Crear un nuevo proyecto y haga clic en Aceptar para ir a la página de inicio del software. Seleccione Agregar muestras en el menú Archivo, seleccione el archivo que se procesará como formato de seguimiento de secuencia e impórtelo directamente en el software como el archivo importado en Muestras sin ensamblar.
    2. Elija Contig y, a continuación, en la sección, elija Ensamblaje avanzado y, a continuación, elija Ensamblar en grupos. Los usuarios nuevos, después de seleccionar Ensamblar en grupos, verán este cuadro de diálogo: Elija Definir nombres. Modifique la opción Definir las partes del nombre de la muestra de acuerdo con el nombre del archivo y haga clic en Ensamblar. Se mostrará la secuencia alineada.
    3. Recupere las secuencias ITS2 completas de acuerdo con el análisis de modelo basado en el modelo oculto de Markov (HMM). Utilice las secuencias 5.8s (CGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCA) y 28s (CGACCCCAGGTCAGGCGGGGCCACC)31 para buscar la secuencia alineada desde el principio para eliminar las regiones 5.8s y 28s.
    4. Seleccione Ir y, a continuación, en la sección, seleccione Secuencia de búsqueda y haga clic en Aceptar para obtener la secuencia coincidente. Elija Contig, elija Eliminar en la sección para eliminar las regiones de 5.8s y 28s y las secuencias de baja calidad, y luego el software generará las secuencias de empalme para que coincidan.
  2. Utilice las secuencias de empalme obtenidas de los tres pasos experimentales paralelos para la identificación, seleccione la búsqueda BLAST utilizando la base de datos de nucleótidos en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y seleccione la Herramienta de Identificación de Especies y el Primer Específico ITS2 correspondientes en la base de datos de la Base de Datos del Genoma de la Farmacopea Global (GPGD).
    NOTA: NCBI32 y GPGD33 incluyen las secuencias de nucleótidos de plantas y animales medicinales y son reconocidas como bases de datos autorizadas. Sus principales métodos de identificación son los métodos basados en la comparación de secuencias34 (BLAST). El porcentaje de identidad de los resultados de identidad se utiliza para determinar si la especie con la mayor similitud es el género objetivo.
  3. Utilice MEGA11 para el alineamiento de secuencias, analice y compare la variación de secuencias intraespecíficas e interespecíficas, y construya un árbol filogenético de unión de vecinos.
    1. Descargue las secuencias de tres especies de Angélica y una especie de Peucedanum praeruptorum como un grupo externo del NCBI. Analice estas secuencias junto con la secuencia de resultados obtenida.
    2. Haga clic en Archivo, elija Abrir un archivo/sesión para importar el archivo y aparecerá un cuadro de diálogo. Elija Alinear > ADN y seleccione Alinear por ClustalW para la comparación de secuencias. Elija Análisis filogenético en datos y, a continuación, vuelva a la página de inicio. Haga clic en Construir/Probar árbol de unión de vecinos en FILOGENIA. El software genera un árbol filogenético.

Resultados

Calidad del ADN de la muestra

El rango de relaciones de absorbancia OD260/OD280 fue de 1,80-1,84. La cantidad de ADN medida por espectrofotómetro para cada muestra fue superior a 100 ng/μL (Tabla 3), lo que indica una buena calidad de extracción de ADN de la muestra. Esto indica que las muestras no estaban contaminadas por proteínas, ARN o reactivos durante el proceso de extracción y que eran de buena calidad y adecuadas para la amplificación posterior por PCR.

Análisis de PCR

Se realizó electroforesis en gel sobre el producto de PCR de las tres muestras experimentales paralelas. La configuración fue: Marcador, muestras 1-3 (AS-1, AS-2, AS-3) y control negativo (0), como se muestra en la Figura 3. Los tamaños de AS-1, AS-2 y AS-3 están todos entre 500 pb con bandas simples, brillantes y claras, y no hay bandas en el 0, lo que indica que el ADN extraído se amplificó a 500 pb utilizando cebadores ITS2.

Comparación de los resultados de la secuenciación en la base de datos

Los resultados de la secuenciación identificaron A. sinensis con una similitud de secuencia del 100% al combinar los resultados de identificación de BLAST de la base de datos del NCBI, que es la misma que los resultados de identificación de especies de la base de datos GPGD (Tabla 4). El resultado de BLAST se determinó utilizando la puntuación de identidad porcentual más alta y el valor e más bajo. La identificación de especies se consideró exitosa cuando el porcentaje máximo de identidad más alto incluyó una sola especie y obtuvo una puntuación de >99%. Si una puntuación es ≤ 99%, compruebe la calidad del archivo de secuenciación o si el producto de PCR está contaminado.

Análisis filogenético de la identificación de especies

Los resultados mostraron que en el árbol filogenético construido de Nueva Jersey, las cuatro especies se agruparon en clados separados, y el P. praeruptorum como grupo externo se separó de los clados de Angélica . Las secuencias de empalme se agruparon con el clado A. sinensis OR879715.1, y el valor de soporte del clado (bootstrap) fue 100, y luego las otras dos especies, A. dahurica y A. cartilaginomarginata , se agruparon en un clado separado, demostrando así que las secuencias de empalme eran de A. sinensis (Figura 4).

figure-results-1
Figura 1: Diagrama de flujo de identificación de especies de plantas medicinales. (A) Planta de proceso, extracción de ADN y secuenciación de plantas medicinales, (B) comparación de la secuencia de especies utilizando bases de datos, y (C) empleo de árboles filogenéticos para la validación taxonómica para confirmar las relaciones filogenéticas entre las especies. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Flujo de trabajo de extracción de ADN de plantas medicinales. (A) Un total de 6 pasos están involucrados en la extracción de ADN de plantas medicinales. (B) Amplificación de instrumentos de PCR y proceso de ciclado de PCR. c) Electroforesis. D) Secuenciación Sanger y cromatograma de secuenciación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Electroforesis en gel de Angelica sinensis (Oliv.) Diels. Utilizando el marcador de ADN DL5000 como marcador molecular, AS-1, AS-2 y AS-3 se utilizan como muestras y 0 como grupo de control. Se realizó electroforesis en gel y los resultados mostraron que las muestras de AS-1, AS-2 y AS-3 tenían bandas a 500 pb, mientras que el control no mostró bandas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 4: Árbol filogenético de unión de vecinos creado a partir de 13 secuencias. Se descargaron un total de 10 secuencias de cuatro especies de plantas de la base de datos del NCBI, y se compararon las secuencias de empalme para analizar y comparar la variación de secuencias intraespecíficas e interespecíficas y para construir árboles filogenéticos de unión de vecinos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre del Material/Equipodosis
Polivinil pirrolidona10 g
Tris-HCl1 M 50 mL
Ácido etilendiaminotetraacético0.5 M 20 mL
NaCl20,45 g
β-mercaptoetanol10 mL
Agua desionizada esterilizada500 mL

Tabla 1: Reactivos de formulación tampón de aislamiento nuclear.

Código de barrasCebadorSecuencia de cebadores (5'-3')Secuenciación de amplificación por PCR
ITS 2R:3RGACGCTTCTCCAGACTACAAT94°C5 minutos
94°CAños 3040ciclos
56°CAños 30
F:2FATGCGATACTTGGTGTGAAT72°C45 años
72°C10 minutos

Tabla 2: Cebadores de códigos de barras de ADN y condiciones de reacción de PCR.

MuestrasExtracción de ADN (ng/μL)OD260/OD280
AS-11241.84
AS-21841.81
AS-31641.82

Tabla 3: Angélica sinensis (Oliv.) Diels extrajo ADN de calidad.

MuestrasLongitud de la secuencia alineada (bp)Secuencia de empalme Longitud (bp)GC(%)NCBI:Porcentaje BLAST(%)GPGD:Porcentaje de identificación de especies(%)
AS-1500 puntos básicos229 pb55.50%100%100%
AS-2504 puntos básicos229 pb55.50%100%100%
AS-3499 pb229 pb55.50%100%100%

Tabla 4: Comparación de los resultados de la secuenciación de la base de datos.

Discusión

La tecnología de identificación molecular es más fácil de aprender y dominar que los métodos de identificación tradicionales. Supera las limitaciones de la identificación tradicional de las hierbas medicinales, ya que no se ve afectada por la etapa de crecimiento de la planta y no se basa en el juicio subjetivo ni en la acumulación de conocimientos especializados35. Otras especies se confunden con A. sinensis debido a su morfología y partes medicinales similares, pero con el uso del código de barras del ADN, se puede identificar definitivamente36.

Los pasos clave de este protocolo implican varias consideraciones críticas. En primer lugar, evitar la contaminación al manipular hierbas y extraer ADN es esencial para evitar que el ADN extraño o las impurezas comprometan los resultados. La limpieza adecuada de las muestras es necesaria para eliminar los contaminantes externos, mientras que la pulverización exhaustiva mejora la extracción de ADN al aumentar el área de superficie para la interacción con los reactivos. También es importante utilizar una cantidad adecuada de muestra para garantizar una mezcla eficiente con los reactivos, lo que permite una mejor citólisis y liberación de ADN. Por último, controlar el tiempo del baño de agua es crucial, ya que un calentamiento excesivo puede provocar la degradación del ADN, afectando a la calidad del ADN extraído. En conjunto, estos pasos garantizan la extracción exitosa de ADN de alta calidad para su análisis.

Las plantas medicinales contienen polisacáridos y polifenoles que afectan la extracción y amplificación del ADN. El uso de tampón de aislamiento nuclear reduce el efecto de estas sustancias y permite la lisis de núcleos, lo que resulta en una mejor extracción de ADNg de alta pureza 28,29,30. Actualmente, existen tres métodos principales de extracción de ADN: el método de columna centrífuga, el método CTAB y el método SDS. Sin embargo, este estudio eligió el método de columna centrífuga para los experimentos debido a su estabilidad, simplicidad, eficiencia y la capacidad de extraer altas concentraciones de ADN37, y calentar el tampón de elución puede ayudar a eluir el ADN con mejor calidad. Aquí, este estudio eligió cebadores específicos de ITS217,38, la secuencia corta de ITS2 sirve como una etiqueta de secuencia taxonómica eficiente en comparación con los otros cebadores39, que tienen una alta variación interespecífica y una gama más amplia de identificaciones. La posible razón del fallo de amplificación es la degradación del ADN en algunas muestras; otra posibilidad es que el par de cebadores universales ITS2 utilizado no funcione para ciertas especies o que utilice el juego alternativo de cebadores universales40. El resultado de BLAST se determinó utilizando la puntuación de identidad porcentual más alta y el valor e más bajo. La identificación de especies se consideró exitosa cuando el porcentaje máximo de identidad más alto incluyó una sola especie y obtuvo una puntuación de >99%40,41, para la puntuación ≤99%, verificar la calidad del archivo de secuenciación o si el producto de PCR está contaminado.

En resumen, el código de barras de ADN debe desempeñar un papel clave en el control de calidad de la medicina herbal tradicional y el comercio internacional de hierbas. Este documento proporciona algunas ideas sobre la extracción de ADN de plantas y una guía detallada sobre el uso de la tecnología de códigos de barras de ADN para identificar plantas medicinales. Destaca los puntos clave a tener en cuenta durante el proceso experimental. Por lo tanto, este documento proporciona referencias para la identificación básica de hierbas y ayuda a más personas a dominar rápidamente la tecnología. Sin embargo, en casos especiales en los que la eficiencia de la identificación de códigos de barras de un solo lugar es insuficiente, depende de la biblioteca de referencia. La construcción de una biblioteca de referencia con una alta cobertura de especies sería un paso importante hacia la identificación de especies utilizando códigos de barras de ADN42, y muchos investigadores han propuesto que la tecnología de códigos de barras multi-locus puede mejorar la eficiencia43,44. Además, con el desarrollo de la tecnología molecular, Zheng et al. combinaron la tecnología de códigos de barras de ADN con la tecnología de amplificación isotérmica de ADN y la detección de RPA-LFD para autenticar rápidamente plantas venenosas45 y también se han desarrollado algunos kits listos para usar46. La base de datos de códigos de barras de ADN está en constante mejora, lo que desempeña un papel importante en la promoción de la generalización, estandarización e internacionalización de los métodos de identificación de la medicina herbal.

Divulgaciones

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la introducción de la persona talentosa del proyecto de subvención de fondos de investigación científica de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (030040015).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CTAB Kit de extracción rápida de ADN genómico de plantas ShanghaiHuiling Biotechnology Co.NG411MAdecuado para la extracción rápida de ADN genómico de alta calidad de diferentes tejidos de una amplia gama de plantas
DL5000Marker Nanjing vazyme Bio-technology Co.MD102-02Producto listo para usar, tome una cantidad adecuada de este producto directamente para la electroforesis cuando ejecute el gel.
ElectroforesisBeijing Liuyi Biotechnology Co.DYY-6CAdopte el diseño de pantalla táctil, puede mostrar el voltaje establecido, la corriente establecida al mismo tiempo, salida paralela
Ácido etilendiaminotetraacéticoBeijingpsaitongBiotechnologyCo., LtdE70015-100GReactivos de formulación de tampón de aislamiento nuclear.
Tinción de gel de ácido nucleico Goldview (10,000 veces)Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd10201ES03Cuando se usa electroforesis en gel de agarosa para detectar ADN, se une al ADN y produce una fuerte señal fluorescente.
Centrífuga de mesa de alta velocidadChangsha Zona de desarrollo industrial de alta tecnología Xiangyi Centrífuga Instrument Co.H1650Para una separación rápida y eficiente de muestras, esta centrífuga compacta y liviana ofrece una seguridad confiable
Trituradora de tejidos de alto rendimientoShanghai Jingxin Industrial Development Co.Tiss-48Un instrumento de vibración de alta frecuencia para moler muestras
http://www.gpgenome.com/Instituto de Materia Médica China, Academia China de Ciencias MédicasChinas-Labase de datos de HerbGenomics incluye secuencias de genoma, conjuntos de genes, genomas de orgánulos, datos de genoma de baja cobertura y secuencias de códigos de barras de ADN.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.:el Centro Nacional de Información Biotecnológica promueve la ciencia y la salud al proporcionar acceso a información biomédica y genómica.
Kylin-BellHaimen Qilinbel Fabricación de Instrumentos Co.VORTEX-5Mezcla rápida en forma de vórtice de alta velocidad, velocidad de mezcla, uniformidad, minuciosidad
LifeTouchHangzhou BORI Technology Co.TC-96 / G / H (b) BAdopción de tecnología de refrigeración termoeléctrica avanzada y tecnología TAS recién creada para mejorar su rendimiento general
Sistema de análisis de imágenes de gel multifuncionalCentro de operaciones del suroeste de Shanghai Tianneng Life Science Co.Tanon-Mini Space 2000Realiza experimentos rápidos de amplificación de genes con una función de gradiente para mapear las condiciones de amplificación y un rango de temperatura de gradiente de hasta 30 grados; C
NaClBeijing Solarbio Ciencia& Tecnología Co., Ltd.S8210-100Reactivos de formulación tampón de aislamiento nuclear.
Nanodrop OneGenes Ltd.ND ONECuantifique muestras de ADN, ARN y proteínas en segundos con solo 1-2 y micro; L de la muestra
Pirrolidona de poliviniloShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS30268-500gReactivos de formulación tampón de aislamiento nuclear.
Máquina de hielo copo de nieveShanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co.ZX-60XAdoptando el método de fabricación de hielo por extrusión rotativa, velocidad rápida de fabricación de hielo y alta eficiencia de producción de hielo
Perlas de acero inoxidable para homogeneizador de tejidosBeyotime Biotechnology.F6623Equipo para la molienda y mezcla de tejidos y otras muestras por vibración
Tampón de acetato de tris-EDTABeyotime Biotech IncST716TAE es un tampón de uso común para la electroforesis de ADN, empleado con frecuencia en la electroforesis en gel de agarosa.
Tris-HClBeijing Solarbio Science& Tecnología Co., Ltd.T8230Reactivos de formulación tampón de aislamiento nuclear.
Hervidor de aguaShanghai Senxin Experimental Instrument Co.DK-8DTermostato preciso y regulación de temperatura, control de temperatura preciso y confiable
β-mercaptoetanolShanghai Eon Chemical Technology Co.R054186-100ml   Reactivos de formulación tampón de aislamiento nuclear.
DNA

Referencias

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