Extracción de ARN de un solo animal y un solo tubo para la comparación de niveles relativos de transcripción mediante qRT-PCR en el tardígrado Hypsibius exemplaris

Resumen

Este trabajo presenta un método de extracción rápida de ARN y comparación a nivel de transcripción para analizar la expresión génica en el tardígrado Hypsibius exemplaris. Mediante el uso de la lisis física, este método de alto rendimiento requiere un solo tardígrado como material de partida y da como resultado una producción robusta de ADNc para la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR).

Resumen

El tardígrado Hypsibius exemplaris es un organismo modelo emergente reconocido por su capacidad para sobrevivir a condiciones ambientales extremas. Para explorar los mecanismos moleculares y las bases genéticas de dicha extrematolerancia, muchos estudios se basan en la secuenciación de ARN (RNA-seq), que se puede realizar en poblaciones que van desde grandes cohortes hasta animales individuales. La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) y la interferencia de ARN (ARNi) se utilizan posteriormente para confirmar los hallazgos de RNA-seq y evaluar los requisitos genéticos de los genes candidatos, respectivamente. Dichos estudios requieren un método eficiente, preciso y asequible para la extracción de ARN y la medición de los niveles relativos de transcripción mediante RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR). Este trabajo presenta un método eficiente de extracción de ARN de un solo tardígrado y un solo tubo (STST) que no solo aísla de manera confiable el ARN de los tardígrados individuales, sino que también reduce el tiempo y el costo requeridos para cada extracción. Este método de extracción de ARN produce cantidades de ADNc que se pueden utilizar para amplificar y detectar múltiples transcripciones mediante PCR cuantitativa (qRT-PCR). El método se valida mediante el análisis de los cambios dinámicos en la expresión de los genes que codifican dos proteínas reguladas por el choque térmico, la proteína de choque térmico 70 β2 (HSP70 β2) y la proteína de choque térmico 90α (HSP90α), lo que permite evaluar sus niveles relativos de expresión en individuos expuestos al calor mediante qRT-PCR. STST complementa eficazmente los métodos existentes de extracción de ARN de tardígrado a granel y de un solo tardígrado, lo que permite un examen rápido y asequible de los niveles transcripcionales individuales de tardígrados mediante qRT-PCR.

Introducción

Los tardígrados son pequeños animales pluricelulares reconocidos por su capacidad para sobrevivir a condiciones extremas que son letales para la mayoría de las otras formas^{de vida.} Por ejemplo, estos animales pueden sobrevivir casi 1000 veces la dosis de radiación ionizante que es letal para los humanos 2,3,4,5,6,7,8,9,10, la desecación casi completa

Protocolo

Figura 1: Tubería de un solo tubo para la extracción de ARN de un solo tardígrado. (A) Esquema que muestra el protocolo para la extracción de ARN de un solo tardígrado, incluidos seis ciclos de congelación-descongelación y la posterior síntesis de ADNc. Posteriormente, las muestras se pueden utilizar para RT-PCR y qRT-PCR. (B) Imagen del cono de la micropipeta utilizada para la eliminación del agua. Barra de escala: 2 mm. (

Resultados

Desarrollo y optimización de la extracción de ARN de un solo tardígrado
Adaptando el protocolo de Ly et al., 2015⁴² para la extracción de ARN en tardígrados, se optimiza el sistema STST para maximizar la cantidad y calidad de la preparación (Figura 1A). Se realizó RT-PCR para los transcritos de actina, cuantificando el rendimiento de la transcripción mediante la amplificación de una región de 527 pb que abarca los exones 1 y 2 (las secuencias para .......

Discusión

Este estudio presenta un método eficiente para la extracción de ARN para qRT-PCR de un solo tardígrado. La comparación directa de la metodología STST con un kit de extracción de ARN de un solo tardígrado existente reveló que la extracción de ARN STST produce cantidades >200 veces mayores de transcripciones de ARN de actina, reduce el costo a menos de un dólar por muestra y reduce el tiempo requerido para la extracción en un 30%. Para aplicar la STST a una pregunta biológica relevante, ev.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10 y micro; l Puntas de barrera premium de baja fijación, con bastidores, estériles	Genesee Scientific	23-401	denominadas pipetas P 10 con punta de filtro estéril  Consejos
1000 y micro; L  Puntas de pipeta de primera calidad, de baja unión, en bastidores, estériles	Genesee Scientific	23-165RS	denominadas pipetas estériles con punta de filtro P 1000  Consejos
200 y micro; L  Puntas de barrera premium de baja fijación, con bastidores, estériles	Genesee Scientific	23-412	denominadas pipetas estériles con punta de filtro P 200  Puntas
4 Estrellas Recto Fuerte Pinza de Punto Medio	Excelta	00-SA-DC	Referido como Pinzas
Largas Rack de PCR de 96 pocillos con tapa surtida, 5 Racks/Unidad	Genesee Scientific	27-202A	Referido como Rack de PCR
Andwin Scientific  CINTA DE AUTOCLAVE SIN PLOMO 3M 1"	Thermo Fisher Scientific	NC0802040	Referido como cinta de autoclave
Cinta de autoclave	Thermo Fisher Scientific	AB1170	Referido como PCR Sellados de placa
Benchling V8	Benchling	N/A	referido como Benchling
BioRadPlaca PCR de 96 pocillos	BioRad	HSS9641	denominado placa PCR
Bata de laboratorio BULWARK FR:	Grainger	26CF64	Referido como bata de laboratorio
C1000 Touch Bio-rad Thermocycler	BioRad	1851148	conoce como termociclador
Termociclador C1000 Touch Bio-rad con módulo óptico CFX	BioRad	1845097	denominado termociclador qPCR
Chloroccoccum hypnosporum.	Carolina	152091	conoce como Algae
Corning  Botellas de almacenamiento de medios reutilizables PYREX	Thermo Fisher Scientific	06-414-1E	Referida como botella de vidrio segura para autoclave de 2 L
Daigger & Empresa Vortex-Genie 2 Mezclador de laboratorio	Thermo Fisher Scientific	3030A	referido como Vortexer
Preparación Micro Direct-zol	Investigación Zymo	R2060	Referido como kit de extracción de ARN
Dumont 5 Pinzas de Biología	Herramientas de Ciencia Fina	11254-20	Referido como Pinzas Finas
EDTA	Fisher Scientific	S311-500	Denominado EDTA
FIJI v 2.14.0/1.54f	ImageJ,N	/A	Referido como FIJI/ImageJ
Filamento para Pippette Puller	Tritech Research	PC-10H	referido como Gafas de Impacto Económico de Filamento
Fisherbrand	Fisher Scientific	19-181-501	referido como Gafas de salpicaduras
Micropipeta de vidrio O.D. 1mm ID 0.58, Longitud 10 cm	TriTech Research	GD-1	Referenciada como micropipeta de vidrio
Cepa Hypsibius exemplaris Z151	Carolina	133960	Referidos como Tardígrados  o H. exemplaris
Nitrógeno Líquido Dewar 1 L	Agar Scientific	AGB7475	Referido como contenedor crio-seguro
Kit de síntesis de ADNc de primera cadena Maxima H Minus	Thermo Fisher Scientific	K1651	denominado cDNA Synthesis Master Mix
Extractor de micropipetas de vidrio de doble etapa Narishige	Investigación Tritech	PC-10	Denominado extractor de micropipetas
Guantes de nitrilo	Fisher Scientific	17-000-314	denominados guantes de nitrilo
PLACA DE PETRI, PS, 35/10 mm, CON RESPIRADEROS	Grenier	627102	Denominada placa de Petri de 35 mm
PIPETMAN P10, 1– 10 y micro; L, eyector de metal	Gilson	F144055M	denominado P 10 pipeta
PIPETMAN P1000, 100– 1000 y micro; L, eyector de metal	Gilson	F144059M	denominado P 1000 pipeta
PIPETMAN P200, 20– 200 y micro; L, Eyector de metal	Gilson	F144058M	Referido como P 200 Pipeta
Pound esta arcilla para modelar de 4 colores	Superávit Científico Americano	96517P001	Referido como Clay
Prisma v10.0	GraphPad	N/A	referido a un prisma
Tubos de PCR de 8 tiras de 0,2 mL sin ARNasa con tapones;	Invitrogen	AM12230	conoce como tubo de PCR estéril
Inhibidor de la RNasina ribonucleasa	Promega	N2111	Referido como inhibidor de la ARNasa
Agua de manantial	Nestlé Pure Life	44221229	denominado Agua de Manantial
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	BIO RAD	1725271	denominado Indicator Dye Super Mix
Sistema de microscopio estereoscópico con óptica e iluminación	TriTech Research	SMT1	referido como microscopio de disección
Supertek Scientific  Tirrill	Burners Thermo Fisher Scientific	S09572B	denominado Bunsen Burner
centrífuga de mesa	Qualitron	DW-41-115-NEW	Referida como centrífuga de mesa
Tempshield   Guantes criogénicos	Fisher Scientific	11-394-305	denominados guantes criogénicos
Thermo Scientific  Placas de Petri Nunc	Thermo Fisher Scientific	08-757-099	Denominadas placas de Petri de 100 mm
Tris base	Fisher Scientific	T395-500	Referido como Tris o Tris Base
Tritón X-100	Fluka	93443	Denominado detergente 1
TWEEN 20	Sigma aldrich	P1379-500	Conocido como Detergente 2
Células de cultivo	PCPW-0500	nucleasas con certificación PCR/RT-PCR	denominadas agua estéril sin nucleasas

de carcasa dura Agua - sin