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Artículo de método

Optimización de la recolección de lágrimas en ratones para el análisis de ARNm y proteínas

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DOI:

10.3791/66955

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19 de julio de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Farmacobiología, Centro de Investigación sobre el Envejecimiento, CINVESTAV Sede Sur

En este artículo

Resumen

La identificación de biomarcadores de ARN y proteínas a partir de lágrimas en modelos de ratón es muy prometedora para el diagnóstico temprano de diversas enfermedades. Este manuscrito proporciona un protocolo completo para optimizar la eficacia y la eficiencia del aislamiento de ARNm y proteínas de las lágrimas de ratón.

Resumen

La película lagrimal es un biofluido altamente dinámico capaz de reflejar cambios moleculares asociados a la patología, no solo en la superficie ocular sino también en otros tejidos y órganos. El análisis molecular de este biofluido ofrece una forma no invasiva de diagnosticar o controlar enfermedades, evaluar la eficacia del tratamiento médico e identificar posibles biomarcadores. Debido al volumen limitado de muestras, la recolección de muestras de lágrimas requiere habilidades específicas y herramientas adecuadas para garantizar una alta calidad y la máxima eficiencia. Se han descrito varias metodologías de muestreo de lágrimas en estudios en humanos. En este artículo, se presenta una descripción completa de un protocolo optimizado, diseñado específicamente para extraer información de proteínas relacionadas con el desgarro de modelos animales experimentales, especialmente ratones. Este método incluye la estimulación farmacológica de la producción de lágrimas en ratones de 2 meses de edad, seguida de la recolección de muestras mediante tiras de Schirmer y la evaluación de la eficacia y eficiencia del protocolo a través de procedimientos estándar, SDS-PAGE, qPCR y PCR digital (dPCR). Este protocolo se puede adaptar fácilmente para la investigación de la firma de la proteína lagrimal en una variedad de paradigmas experimentales. Al establecer un protocolo de muestreo de lágrimas asequible, estandarizado y optimizado para modelos animales, el objetivo era cerrar la brecha entre la investigación en humanos y animales, facilitando los estudios traslacionales y acelerando los avances en el campo de la investigación de enfermedades oculares y sistémicas.

Introducción

Las lágrimas se consideran un ultrafiltrado plasmático y también se han descrito como un fluido intermedio entre el suero plasmático y el líquido cefalorraquídeo debido a una superposición significativa en las biomoléculas que comparten1. Se ha reportado que las lágrimas humanas contienen proteínas, lípidos lagrimales, metabolitos y electrolitos2. Recientemente, también se han identificado otras biomoléculas como ARNm, miARN y vesículas extracelulares 3,4,5,6,7.

En los seres humanos, las lágrimas basales se localizan en la película lagrimal, que consta de tres capas: la capa lipídica externa, que mantiene la superficie lagrimal lisa para permitirnos ver a través de ella y evitar la evaporación de la lágrima; la capa acuosa intermedia, que mantiene el ojo hidratado, repele las bacterias, protege la córnea y constituye el 90% de la película lagrimal; Y por último, la capa de mucina, una familia de proteínas de alto peso molecular que están en contacto con la córnea y permiten que la lágrima se adhiera al ojo8. La distribución de las lágrimas a través de la superficie ocular comienza con la secreción de la glándula lagrimal. Luego, este líquido se guía a través de los conductos lagrimales para pasar sobre la superficie del ojo y fluir hacia los canales de drenaje. Cada parpadeo permite que las lágrimas se dispersen uniformemente por todo el ojo, manteniéndolo húmedo9.

La película lagrimal es un biofluido altamente dinámico capaz de reflejar los cambios moleculares que ocurren no solo en la superficie ocular sino también en otros tejidos y órganos. El análisis de la expresión diferencial en este biofluido representa un enfoque prometedor para el descubrimiento de biomarcadores en enfermedades humanas10,11. La utilización de la película lagrimal como fuente de biomarcadores para el diagnóstico precoz de diversas patologías se ha visto facilitada en gran medida por la presencia de métodos de recogida no invasivos. El método más común para la recolección de lágrimas en clínicas humanas y veterinarias involucra un soporte basado en membranas (tira de Schirmer), que opera según el principio de acción capilar, permitiendo que el agua en las lágrimas viaje a lo largo de una tira reactiva de papel o tubos capilares colocados en el saco conjuntival inferior del sujeto 12,13,14. A pesar de la limitación inherente a la obtención de un pequeño volumen de muestra a través de este método, el análisis bioquímico de la composición lagrimal mediante diversas técnicas sensibles ha facilitado la identificación de potenciales moléculas biomarcadoras11,15. Los protocolos para optimizar y evaluar la elución de proteínas lagrimales de tiras de Schirmer y capilares en pacientes humanos están bien documentados16,17. Sin embargo, las descripciones completas de los protocolos optimizados diseñados específicamente para extraer información molecular relacionada con las lágrimas de modelos animales experimentales están disponibles, pero son escasas. Los métodos existentes, como la inducción de lágrimas a través de la estimulación directa de la glándula lagrimal18, si bien permiten la recolección de mayores volúmenes, son invasivos y pueden causar molestias a los animales. Los métodos no invasivos, como la recolección de lágrimas de la superficie ocular, han sido descritos como una forma de aislar el ADN y los miRNAs19,21.

Este protocolo tiene como objetivo establecer un método rentable y optimizado para recolectar y procesar lágrimas en ratones. El método prioriza la no invasividad y la obtención de volúmenes de lágrimas suficientes adecuados para el análisis molecular a través de técnicas como SDS-PAGE, qPCR y dPCR. La proteína extraída y la información sobre el contenido de ARNm se pueden utilizar para identificar posibles biomarcadores en los modelos experimentales existentes de la enfermedad.

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Protocolo

Todos los procedimientos aquí descritos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Cinvestav (CICUAL, # 0354/23). Los animales de laboratorio fueron tratados y manipulados en estricta conformidad con las pautas de uso animal de la revista y de acuerdo con la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y visual. La salud ocular antes y después de los procedimientos se evaluó mediante la evaluación de las secreciones oculares, los párpados hinchados, las anomalías oculares y los cambios de comportamiento.

1. Animales y preparación de reactivos

  1. Utilice tres ratones macho C57BL/6 de 2 meses de edad por réplica para el procedimiento, con un peso inicial de ~25 g (Figura 1). Procese cada mouse individualmente y colóquelo en una almohadilla térmica para mantener el calor.
  2. Para inducir la secreción lagrimal, prepare una solución madre de pilocarpina a 20 mg/ml con agua estéril.
  3. Corte las tiras reactivas de Schirmer a 5 mm de largo y doble cada tira en la muesca en un ángulo de 90°.
  4. Prepare 250 μL de agua estéril con un inhibidor de la proteasa (1 comprimido por 50 mL, según las instrucciones del fabricante).

2. Estimulación de la producción y recolección de lágrimas

  1. Pesar cada ratón individualmente para calcular la dosis adecuada de tratamientos.
  2. Para estimular la producción de lágrimas, administrar 30 mg/kg de pilocarpina por vía intraperitoneal con una jeringa de insulina de 6 mm (Figura 1B). Espere 2 minutos después de la inyección del medicamento para que se manifiesten sus efectos.
    NOTA: No fue posible obtener datos de animales no estimulados debido a la disponibilidad limitada de líquido lagrimal.
  3. Recoja las lágrimas colocando el extremo de cada fragmento de tira de Schirmer sobre el centro del párpado inferior con un par de pinzas y manténgalo en su lugar hasta que la lágrima alcance el límite de la tira (Figura 1C). Luego, reemplace la tira. Coloque secuencialmente 2 tiras de Schirmer en cada ojo, con un intervalo de 2 minutos entre tiras para la recolección. El proceso de recolección de lágrimas requiere alrededor de cuatro fragmentos de tira durante 10 minutos por ratón.
  4. Coloque los fragmentos de la tira Schirmer en tubos estériles sobre hielo para evitar la degradación de los componentes. Tan pronto como termine la recolección, comience el procesamiento de lágrimas.

3. Aislamiento de proteínas

  1. Colocar los fragmentos de tira en un tubo de microcentrífuga de 600 μL que contenga 20 μL de agua estéril con un inhibidor de la proteasa y centrifugar durante 1 h a 600 x g a 4 °C, como se muestra anteriormente17 (Figura 1D).
  2. Realice una punción con una aguja inyectora de acero inoxidable de 7,5 cm en la punta del tubo de 600 μL que contiene la muestra (Figura 1E). A continuación, transfiera este tubo perforado a un nuevo tubo esterilizado de 1,5 mL y centrifugue las muestras a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C, como se informó anteriormente17, para recuperar el volumen de lágrimas diluidas. El volumen de la película lagrimal (sobrenadante) estará en la parte inferior del tubo.
  3. Cree un grupo de proteínas combinando el sobrenadante recuperado de todas las muestras. En este experimento se obtuvo un volumen total de aproximadamente 200 μL.
    NOTA: La producción de lágrimas puede durar más de 1 hora. Durante este tiempo, aún se pueden recoger las lágrimas.
  4. Cuantificar el contenido total de proteínas de la piscina lagrimal utilizando el método estándar de Bradford22.

4. Análisis SDS-PAGE

  1. Calentar las muestras de proteínas a 99 °C durante 4 min para desnaturalizar las proteínas. Agite las muestras brevemente para mezclar los componentes.
  2. Cargue 30 μg de contenido de proteína cuantificada de cada muestra en un gel SDS-PAGE al 10% (Tabla 1) y ejecute las muestras a 90 V durante 2 h utilizando un método estándar23.
  3. Después de la electroforesis, cubra el gel con solución de tinción (Tabla 1) e incube durante 30 min para teñir las proteínas.
  4. Enjuague el gel con la solución decolorante varias veces hasta que el fondo se aclare y las bandas de proteínas sean visibles.
  5. Adquiera imágenes con un sistema de documentación de gel.

5. Aislamiento de ARNm para qPCR y PCR digital

  1. Coloque las tiras en un tubo de microcentrífuga de 600 μL que contenga 20 μL de agua estéril. Realizar una punción en la punta del tubo que contiene la muestra, introducirla en un nuevo tubo esterilizado de 1,5 mL y centrifugar, como se informó anteriormente en lágrimas humanas3, durante 20 min a 2.000 x g a 4 °C (Figura 1E-H).
  2. Cree un grupo a partir de todas las muestras. El volumen recuperado de este experimento fue de aproximadamente 22 μL de sobrenadante por cada ratón, es decir, 66 μL de volumen total. Coloque los tubos sobre hielo seco para evitar la degradación de la biomolécula.
  3. Añadir 200 μL de solución monofásica de fenol e isotiocianato de guanidinio (obtenido comercialmente) y homogeneizar por pipeteo. Deje reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente. En esta etapa, las muestras pueden almacenarse a -20 °C durante varias semanas o a -70 °C durante varios meses.
  4. Añadir 40 μL de cloroformo y mezclar en un vórtice durante 15 s. Deje reposar durante 2 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar a 10.000 x g durante 15 min a 4°C.
  5. Transfiera con cuidado la fase acuosa (sin tomar la interfase) a un nuevo tubo de 1,5 mL.
  6. Añadir 0,5 μL de glucógeno (0,05 μg/μL) a 100 μL de isopropanol y mezclar mediante pipeteo. El glucógeno se precipita conjuntamente con el ARN y no interfiere con los pasos posteriores.
  7. Dejar reposar durante 10 min a -20 °C. Centrifugar a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C. Decanta rápidamente el sobrenadante.
  8. Añadir 200 μL de etanol frío al 75% y resuspender el pellet de ARN por vórtice. Centrifugar a 8.000 x g durante 5 min a 4 °C.
  9. Decantar el etanol. Sin invertir el tubo, déjalo secar al aire durante 20-30 min. Añadir 20 μL de agua sin RNasa y volver a suspender.
  10. Proceda a leer la densidad óptica en el espectrofotómetro de microvolumen a 260 nm y 280 nm para evaluar la pureza del ARN. Las muestras deben estar en hielo.
    NOTA: Las bandas ribosómicas 28S y 18S no se pueden observar utilizando un gel de agarosa debido a la naturaleza de la muestra. La presencia de otros ARN, como los miRNAs o los ARNm, puede ser analizada utilizando un bioanalizador, como se ha demostrado anteriormente18.
  11. Sintetice el ADNc a partir de ARN de lágrimas utilizando un kit comercial según el protocolo del fabricante.
    1. Comience con un ARN de entrada en un rango de 10 ng-5000 ng; según el kit utilizado, mézclalo con 1 μL de Oligo (dT) y hasta 12 μL de agua libre de RNasa. Girar a 500 x g durante 30 s e incubar a 65 °C durante 5 min.
    2. Añadir al tubo de mezcla 4 μL de tampón de reacción 5x, 1 μL de inhibidor de RNasa, 2 μL de mezcla de dNTP y 1 μL de transcriptasa inversa.
    3. Gire el tubo a 500 x g durante 30 s para bajar la mezcla. A continuación, incubar el tubo a 42 °C durante 60 min. Termine la reacción incubando el tubo a 70 °C durante 10 min.
  12. Debido a la baja concentración de ARNm en las lágrimas, se recomienda utilizar ADNc sin diluir para la qPCR24. Para este experimento se utilizaron 150 ng de ADNc. Realice qPCR con cebadores DNMT3a :
    Adelante: GCCGAATTGTGTGTGTGTGTGGATGACA, Reverso: CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA y GAPDH cebadores:
    Adelante: ACTGGCATGGCCTTCCGTGTGTTCTTA, Reverso: TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC siguiendo las instrucciones de los fabricantes y los procedimientos del equipo.
    1. Para el ciclo de qPCR, utilice el siguiente programa: Desnaturalización inicial: 95 °C durante 10 min seguido de 45 ciclos de C 95 °C - 15 s, 60 °C - 30 s y 72 °C - 30 s, finalizando con una extensión final a 72 °C durante 5 min.
    2. Realice un análisis de la curva de fusión para evaluar la presencia de dímeros de cebadores o amplicones inespecíficos en la reacción. La rampa de temperatura comenzó desde los 50 °C hasta los 99 °C finales, con una retención inicial de 90 s para el primer escalón y una retención de 5 s entre cada escalón.
    3. Para la dPCR25, realice diluciones en serie para optimizar la cantidad de ADNc que se requiere para detectar el ARNm de interés. En este experimento, utilice las siguientes diluciones de ADNc en agua sin nucleasas: 150 ng, 75 ng, 37,5 ng y 18,75 ng de ADNc. Se utilizaron cebadores para DNMT3a mencionados anteriormente. Para el ciclo de dPCR, utilice el siguiente programa: desnaturalización inicial: 95 °C durante 2 min seguido de 40 ciclos de 95 °C - 15 s y 60 °C - 30 s.

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Resultados

El protocolo descrito en este artículo proporciona un método fácil y asequible para obtener información molecular a partir del líquido lagrimal utilizando técnicas comúnmente disponibles en la mayoría de los laboratorios de biología molecular. Además, el protocolo puede ampliarse mediante el empleo de técnicas altamente sensibles como ELISA para la detección de actividad enzimática.

Después de estos procedimientos, el rendimiento total de proteínas fue de aproximadamente 3-4 μg/μL. El análisis...

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Discusión

El líquido lagrimal es fácilmente accesible, y la determinación de biomarcadores en las lágrimas puede emplearse como una técnica complementaria exitosa para el diagnóstico temprano de diversas enfermedades humanas27. Si bien el análisis bioquímico de la composición de las lágrimas en modelos animales experimentales complementa este enfoque y promete avances significativos en la comprensión de las bases moleculares de las enfermedades, existe una escasez de datos y protocolos disponibles, lo que n...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de VELUX STIFTUNG [proyecto 1852] a M.L. y becas de posgrado de CONAHCYT a M.B. (836810), E.J.M.C. (802436) y A.M.F (CVU 1317418). Un sincero agradecimiento a todos los miembros del laboratorio, del Centro de Investigación sobre el Envejecimiento y del Departamento de Farmacobiología (Cinvestav) por sus contribuciones a las estimulantes discusiones.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-mercaptoetanolGibco1985023
2x Tampón LaemmliBio-Rad16-0737
Ácido acéticoQuímica Meyer64-19-7
AcrilamidaSigma-AldrichA4058
Reactivo BradfordSigma-AldrichB6916
CloroformoSigma-Aldrich1003045143
Coomassie Azul R 250Biológica de EE. UU.6104-59-2
EtanolQuímica Rique64-17-5
Escalera de ADN GeneRuler 1kb plusThermofisher científicoReferencia SM1331
GlicerolBiológica de EE. UU.G8145
GlicinaSANTA CRUZSC- 29096
GlucógenoRoche10901393001
HclQuímica Rique7647-01-0
Alcohol isopropílicoQuímica Rique67-63-0
MetanolQuímica Meyer67-56-1
Microtubos 1,5 mlAxygenMCT-150-C
Microtubos 600 µ lAxygenMCT-060-C
NaClSigma-AldrichS3014
Tubos de PCR y TirasNovasbioPCR 0104
PilocarpinaSigma-AldrichP6503-10g
Inhibidor de la proteasaRoche11873580001
Kit de PCR QIAcuity EvaGreen (5 ml)Qiagen250112
QIAcuity Nanoplate 26k 24 pocillos (10)Qiagen250001
Real qPlus 2x Master Mix VerdeAmpliqonA323402
Kit de síntesis de ADNc RevertAid First StradThermofisher científicoK1622
Tiras reactivas de SchirmerLaboratorio SantgarSANT1553
SDSSigma-AldrichL3771
TEMEDSigma aldrich102560430
Reactivo TRISigma-AldrichT9424-200MLSolución monofásica de fenol e isotiocianato de guanidinio
TrisBiológica de EE. UU.T8650
Base TrisChem Cruzsc-3715A

Referencias

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