Artículo de método

Sistemas AAV y modelos murinos para investigar la expresión ectópica de Neurod1 en células transducidas en momentos subagudos y crónicos posteriores al ictus isquémico

DOI:

10.3791/66965

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29 de noviembre de 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Division of Anatomy, University of Toronto, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 4Donnelly Centre for Cellular and Biomedical Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe la expresión ectópica mediada por virus de Neurod1 después de un accidente cerebrovascular isquémico cortical. Neurod1 se administra (1) utilizando el sistema Cre-Flex AAV en ratones de tipo salvaje durante la fase subaguda posterior al accidente cerebrovascular (7 días) y (2) utilizando un solo vector AAV en ratones reporteros condicionales durante la fase crónica posterior al accidente cerebrovascular (21 días).

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La expresión ectópica de factores neurogénicos in vivo ha surgido como un enfoque prometedor para reemplazar las neuronas perdidas en modelos de enfermedad. El uso de factores de transcripción básicos neuronales de hélice-bucle-hélice (bHLH) a través de sistemas de partículas similares a virus que no se propagan, incluidos retrovirus, lentivirus y virus adenoasociados (AAV), ha sido ampliamente reportado. Para experimentos in vivo , los AAV se utilizan cada vez más debido a su baja patogenicidad y potencial de traducibilidad. Este protocolo describe dos sistemas AAV para investigar la expresión ectópica de factores de transcripción en células transducidas después de un accidente cerebrovascular isquémico. En ambos sistemas, la expresión de Neurod1 está controlada por el promotor corto GFAP (gfaABC(1)D), que se regula al alza en los astrocitos reactivos después del accidente cerebrovascular, así como en las neuronas endógenas cuando se combina con la expresión del factor neurogénico. En el modelo de accidente cerebrovascular isquémico descrito, la isquemia focal se induce mediante la inyección de endotelina-1 (ET-1) en la corteza motora de ratones, creando una lesión rodeada de astrocitos reactivos que expresan GFAP y neuronas supervivientes. Las inyecciones intracerebrales de AAV se realizan para inducir ectópicamente la expresión de Neurod1 en las fases subaguda (7 días) y crónica (21 días) después del accidente cerebrovascular. A las pocas semanas de la inyección de AAV, se identifica un número significativamente mayor de neuronas entre las células transducidas en los ratones que expresan ectópicamente Neurod1 en comparación con los ratones que reciben virus de control de AAV. Las estrategias basadas en AAV utilizadas replicaron los resultados observados de un mayor número de neuronas que expresan el gen reportero en un modelo de accidente cerebrovascular cortical de leve a moderado. Este protocolo establece una plataforma estándar para explorar los efectos de la expresión ectópica de factores de transcripción administrados con sistemas basados en AAV, lo que contribuye a la comprensión de la expresión de factores neurogénicos en el contexto del accidente cerebrovascular.

Introducción

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El accidente cerebrovascular es una de las principales causas de discapacidad en todo el mundo1. Un accidente cerebrovascular ocurre cuando se interrumpe el flujo sanguíneo al cerebro. Esto puede ocurrir a través de un accidente cerebrovascular hemorrágico (~15% de los casos), donde se rompe un vaso sanguíneo en el cerebro, o a través de un accidente cerebrovascular isquémico, donde el flujo sanguíneo al cerebrose bloquea. Los accidentes cerebrovasculares isquémicos son los más prevalentes y representan ~ 85% de los casos de accidente cerebrovascular1. Un accidente cerebrovascular reduce el suministro de glucosa y oxígeno al cerebro, lo que provoca una muerte rápida de las células neuronales y un deterioro de la función neuronal.

El accidente cerebrovascular isquémico conduce a la pérdida de células en cuestión de minutos en el núcleo de la lesión a través de mecanismos de excitotoxicidad, estrés oxidativo y nitrosativo, desregulación del calcio, despolarización cortical, diseminación, edema, ruptura de la barrera hematoencefálica (BHE) e inflamación 2,3. Las células de las regiones periinfarto sufren la muerte celular apoptótica en cuestión de horas, y durante días, después del accidente cerebrovascular4. El ambiente periinfarto está expuesto a señales proinflamatorias y antiinflamatorias que conducen a la activación de la microglía y los astrocitos (astrocitos "reactivos"), que desempeñan diversas funciones después de una lesión 5,6,7,8. Los astrocitos reactivos experimentan una serie de cambios fenotípicos que incluyen la regulación positiva de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y la formación de un borde alrededor de la lesión a los pocos días después del accidente cerebrovascular que ayuda a limitar la extensión de la lesión, así como afecta la neuroplasticidad dentro del tejido lesionado 8,9,10.

La reprogramación celular directa permite la conversión de un tipo de célula madura en un tipo de célula madura diferente sin pasar por un estado pluripotente11. Convertir las células cerebrales residentes en nuevas neuronas para sustituir a las perdidas por lesiones presenta una vía atractiva para la restauración del cerebro. El ictus es un objetivo ideal para los tratamientos basados en células, dada la necesidad de métodos terapéuticos para reemplazar las neuronas perdidas, ampliar el marco terapéutico y, en última instancia, facilitar la recuperación funcional. Con este fin, ha habido muchos trabajos que demuestran la reprogramación de astrocito a neurona (AtN) in vitro e in vivo, utilizando una variedad de factores de transcripción neurogénica básicos-hélice-bucle-hélice (bHLH), incluyendo Ascl1, Neurog2, Neurod1 y, más recientemente, versiones mutadas de Ascl1 (Ascl1-SA6) que demostraron una mejor eficacia de reprogramación 11,12,13,14. Es importante tener en cuenta los muchos factores de diseño experimental que pueden afectar los resultados, la interpretación y las comparaciones entre estudios. Ghazale et al. demostraron que la eficiencia de reprogramación de AtN varió entre diferentes cepas de ratón, serotipos de AAV y promotores cuando se utilizó el mismo factor de transcripción bHLH14. Otras consideraciones, como el modelo de lesión, la región del cerebro, la dosis viral, el momento de la administración de genes, el factor de reprogramación y el modo de administración, afectarán los resultados. Informes recientes han demostrado que las neuronas transducidas preexistentes han sido malinterpretadas como neuronas reprogramadas15,16. Si bien los informes no niegan necesariamente que ocurra la conversión de AtN, estos estudios han resaltado la importancia de experimentos bien controlados, y varios artículos han propuesto recomendaciones para los próximos pasos en el campo 15,17,18,19. Lo que se desprende de la literatura es que la expresión ectópica de los factores de transcripción bHLH puede mejorar los resultados funcionales en una variedad de modelos animales de enfermedad/lesión neurodegenerativa 13,20,21,22,23,24.

En este trabajo, este protocolo Neurod1, un factor de transcripción de interés, se expresa ectópicamente en células transducidas13,22. Se utiliza el modelo bien establecido de endotelina-1 (ET-1) de accidente cerebrovascular isquémico a la corteza sensoriomotora en ratones adultos. La inyección de ET-1 conduce a una vasoconstricción local que imita la fisiopatología del accidente cerebrovascular isquémico, incluyendo deterioro funcional 22,23,25. El promotor de GFAP corto comúnmente empleado (gfaABC(1)D) se utiliza para impulsar la expresión ectópica de Neurod1 en el sitio de la lesión y la región perilesional utilizando dos estrategias virales: (1) administración de AAV5-CAG-Flex::GFP+AAV5-GFAP-Neurod1-Cre en ratones de tipo salvaje y (2) administración de AAV5-GFAP-Neurod1-Cre en ratones reporteros tdTom-Cre. Para comprender mejor el potencial de expresión ectópica de Neurod1 en el cerebro lesionado por accidente cerebrovascular, se administraron AAV en la fase subaguda (7 días) o en la fase crónica (21 días), después del accidente cerebrovascular. En ambos paradigmas, se encontraron significativamente más neuronas marcadas a las pocas semanas de la expresión ectópica de Neurod1.

Protocolo

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Este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad de Toronto y se adhiere a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación (2ª Edición, Consejo Canadiense de Cuidado Animal, 2017). Para este estudio, el tdTom-Cre reportero de tipo salvaje (C57BL/6J) y transgénico (B6. Se utilizaron cepas de ratón Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 . Los ratones tenían entre 7 y 9 semanas de edad e incluían tanto machos como hembras. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cirugía de accidente cerebrovascular con endotelina-1

NOTA: Todos los instrumentos y materiales quirúrgicos se esterilizan en autoclave antes de la cirugía. El marco estereotáxico se esteriliza con PREempt. Las jeringas se esterilizan con PREempt, alcohol al 70 % y se preparan con PBS estéril antes de la cirugía. La endotelina-1 (ET-1) se almacena en hielo durante toda la cirugía.

  1. Antes de comenzar la cirugía, configure el área de recuperación colocando una jaula limpia sobre una almohadilla térmica ajustada a 37 ° C. Alternativamente, si se está utilizando una lámpara de calefacción, coloque solo la mitad de la jaula bajo el calor.
    1. Para anestesiar ratones con isoflurano, siga el protocolo aprobado por el Comité de Cuidado Animal. Coloque el ratón en la cámara de inducción anestésica y encienda el oxígeno a 1-1,5 L/min, luego ajuste el vaporizador de isoflurano a 3%-5% para iniciar la anestesia.
  2. Retire al animal de la cámara una vez que se acueste de lado y ya no pueda ponerse de pie, y colóquelo sobre una superficie limpia. Asegúrese de que el animal esté adecuadamente anestesiado confirmando la ausencia de un reflejo de pinzamiento del dedo del pie antes y durante la cirugía.
    1. Asegure el cono de la nariz extendido desde la máquina de anestesia en el animal y ajuste el isoflurano al 1%-2% para el mantenimiento. Minimice la exposición al isoflurano (5 min al 3%-5% para la inducción y el tiempo restante al 1%-2%), ya que el procedimiento puede tardar hasta 40 min en completarse.
  3. Use recortadoras de pelo de animales para quitar el pelo desde el cuello/detrás de las orejas hasta la nariz del animal para exponer la piel del cráneo para la cirugía.
  4. Pesar al animal y administrar la dosis adecuada de analgésico preoperatorio por vía subcutánea (Meloxicam (2,0 mg/kg)) en función del peso.
  5. Aplique un ungüento lubricante ocular en cada ojo del ratón para prevenir la desecación de la córnea durante la anestesia.
  6. Esterilice el área de la piel recortada por el pelo (paso 1.3) con etanol al 70%, seguido de alcohol de clorhexidina dos veces para formar un campo quirúrgico.
  7. Transfiera el mouse a un marco estereotáxico de ratón colocando primero su nariz en el cono de la nariz estereotáxica, luego estabilice el cráneo con barras en las orejas. Mantenga el ratón sobre una almohadilla térmica ajustada a 37 °C para obtener soporte térmico durante todo el procedimiento quirúrgico. Mantenga el isoflurano al 1%-2% para que el ratón muestre una frecuencia respiratoria de 1 respiración/s.
  8. Repita la aplicación de lubricante ocular para prevenir la desecación de la córnea durante el procedimiento si es necesario. Aplique un paño quirúrgico estéril en el cuerpo del ratón, debajo de las orejas, para ampliar el tamaño del campo estéril.
  9. Haga una incisión vertical paralela al plano sagital del animal desde detrás del punto medio de los ojos hasta la parte posterior de la cabeza (hueso parietal) con una hoja de bisturí # 10. Exponga el cráneo retrayendo suavemente la piel hacia los lados.
  10. Use un hisopo para romper la fascia en el cráneo y permitir que el cráneo se seque para exponer el bregma.
  11. Configure los brazos del manipulador con el soporte del taladro que lleva un taladro estereotáxico de alta velocidad con una broca de .018".
  12. Taladre 3 orificios de rebaba (.018" de diámetro) con un taladro estereotáxico de alta velocidad en las coordenadas de la corteza sensoriomotora derecha a 2.25 mm lateral al bregma y +0.0 mm rostral, +1.0 mm rostral y -1.0 mm caudal al bregma.
  13. Reemplace el taladro con una jeringa de 26 G con una aguja de 0.375" de largo.
  14. Cargue 1,5 μL de 400 μM ET-1 disuelto en PBS estéril en la jeringa. Para asegurar un buen flujo, libere un pequeño volumen de ET-1 hasta que se pueda observar una gota en la punta de la aguja. Use un hisopo estéril para limpiar el exceso antes de realizar una inyección.
  15. Baje la punta de la aguja más allá del cráneo en el orificio central de la fresa (en la corteza sensoriomotora derecha a + 0,0 anterior y 2,25 mm lateral al bregma) sin perforar la duramadre. Una vez alineado, baje la aguja 1 mm en el cerebro.
  16. Inyecte 1 μL de ET-1 dispensando 0,1 μL a la vez. Empuje el émbolo de la jeringa Hamilton hacia adelante para dispensar 0,1 μL y espere un minuto antes de inyectar los siguientes 0,1 μL, inyecte hasta que se haya dispensado 1 μL.
    1. Después de que se hayan dispensado los últimos 0,1 μL (0,1 μL x 10 inyecciones = 1 μL en total), mantenga la aguja en su lugar durante 10 minutos para evitar el reflujo y luego retírela lentamente hacia arriba para retirar la jeringa.
  17. Para asegurarse de que la aguja no se bloquee durante la inyección, suelte un pequeño volumen de ET-1 hasta que se pueda observar una gota en la punta de la aguja. Use un hisopo estéril para limpiar el exceso antes de realizar una inyección. Esterilice las jeringas antes de inyectar al siguiente animal con PREempt, seguido de alcohol al 70% y luego PBS estéril.
  18. Para cerrar la herida, sutura la piel suprayacente del cráneo con una sutura estéril de poliéster polysorb 4-0.
  19. Administre la pomada antibiótica con un hisopo de algodón en el área suturada para prevenir la infección postoperatoria.
  20. Retire el ratón del marco estereotáxico y transfiéralo a una jaula de alojamiento de animales limpia y precalentada en el área de recuperación. Apague el vaporizador de isoflurano y el oxígeno.
  21. Mantenga la jaula encima de una almohadilla térmica durante la recuperación de la anestesia. Alternativamente, si usa una lámpara de calefacción, coloque al ratón en el lado de la jaula debajo de la lámpara para que el ratón pueda moverse al lado frío de la jaula mientras se despierta de la anestesia para evitar el sobrecalentamiento. Monitoree el ratón a medida que sale de la anestesia en los próximos 5 a 10 minutos.
  22. Monitorizar al ratón durante los próximos 3 días (control de peso), proporcionar cuidados postoperatorios (comida húmeda triturada para garantizar la hidratación) y analgésicos (2 mg/kg de meloxicam, 2 veces al día por vía subcutánea, durante 2-3 días) de acuerdo con las normas establecidas por el comité local de cuidado de animales.

2. Parto por virus adenoasociados (AAV) (7 días - modelo subagudo o 21 días - modelo crónico) después de un accidente cerebrovascular

PRECAUCIÓN: Consulte las pautas institucionales de bioseguridad para trabajar con AAV. De acuerdo con las pautas de la Universidad de Toronto, esta cirugía se realiza en un gabinete de bioseguridad de nivel 2 de contención.

NOTA: Todos los instrumentos y materiales quirúrgicos se esterilizan en autoclave antes de la cirugía. El marco estereotáxico se esteriliza con PREempt. Las jeringas se esterilizan con PREempt, alcohol al 70% y se preparan con PBS estéril. Los AAV se almacenan en hielo durante toda la cirugía.

  1. Antes de comenzar la cirugía, configure el área de recuperación colocando una jaula limpia sobre una almohadilla térmica ajustada a 37 ° C. Alternativamente, si se está utilizando una lámpara de calefacción, coloque solo la mitad de la jaula bajo el calor.
    1. Para anestesiar ratones con isoflurano, coloque el ratón en la cámara de inducción anestésica y encienda el oxígeno a 1-1,5 L/min, luego ajuste el vaporizador de isoflurano a 3%-5% para iniciar la anestesia (siguiendo los protocolos aprobados por la institución).
  2. Retire al animal de la cámara una vez que se acueste de lado y ya no pueda pararse sobre una superficie limpia. Asegúrese de que el animal esté adecuadamente anestesiado confirmando la ausencia de un reflejo de pinzamiento del dedo del pie antes y durante la cirugía.
    1. Asegure el cono de la nariz extendido desde la máquina de anestesia en el animal y ajuste el isoflurano al 1%-2% para el mantenimiento. Minimice la exposición al isoflurano (5 min al 3%-5% para la inducción y el tiempo restante al 1%-2%), ya que el procedimiento puede tardar hasta 40 min en completarse.
  3. Pesar al animal y administrar la dosis adecuada de analgésico preoperatorio por vía subcutánea (Meloxicam (2,0 mg/kg)) en función del peso.
  4. Aplique ungüento lubricante para los ojos en cada ojo del ratón para evitar la desecación de la córnea al estar bajo anestesia.
  5. Esterilice el área de la piel recortada con etanol al 70%, seguido de alcohol de clorhexidina dos veces para formar un campo quirúrgico.
  6. Transfiera el mouse a un marco estereotáxico de ratón colocando primero su nariz en el cono de la nariz estereotáxica, luego estabilice el cráneo con barras en las orejas. Mantenga el ratón sobre una almohadilla térmica ajustada a 37 °C para obtener soporte térmico durante todo el procedimiento quirúrgico. Mantenga el isoflurano al 1%-2% para que el ratón muestre una frecuencia respiratoria de 1 respiración/s.
  7. Repita la aplicación de lubricante ocular para prevenir la desecación de la córnea durante el procedimiento si es necesario. Aplique un paño quirúrgico estéril en el cuerpo del ratón, debajo de las orejas, para extender el tamaño del campo estéril.
  8. Si aún está presente, corte las suturas con un par de tijeras quirúrgicas y retire la costra con un par de pinzas. Retrae la piel para exponer el cráneo.
    NOTA: Para el modelo crónico puede ser necesario extirpar la piel con la hoja de bisturí #10.
  9. Use un hisopo estéril para secar el cráneo y localizar los agujeros de las rebabas.
  10. Coloque los brazos manipuladores del aparato estereotáxico con un portaagujas que lleve una jeringa de 26 G con una aguja de 0,375" de largo.
  11. Cargue 3,4 μL de AAV (1 x 109 Genome Copies(GC)/μL para estudio agudo; 1 x 1010 GC/μL para estudio crónico) en la jeringa. Para asegurarse de que el flujo sea bueno, libere un pequeño volumen de AAV hasta que se pueda observar una gota en la punta de la aguja. Use un hisopo estéril para limpiar el exceso antes de realizar una inyección.
  12. Baje la punta de la aguja más allá del cráneo en el primer orificio de rebaba utilizado para ET-1 (en la corteza sensoriomotora derecha a + 0,0 anterior y 2,25 mm lateral al bregma) sin perforar la duramadre. Una vez alineado, baje la aguja 1 mm en el cerebro. (0 AP, +2.25 ML, −1.0 DV de bregma).
  13. Inyecte 1 μL de AAV (1 x 109 GC/μL para el estudio agudo; 1 x 1010 GC/μL para el estudio crónico) dispensando 0,1 μL a la vez. Empuje el émbolo de la jeringa Hamilton hacia adelante para dispensar 0,1 μL y espere un minuto antes de inyectar los siguientes 0,1 μL; inyectar hasta que se haya dispensado 1 μL. Después de que se hayan dispensado los últimos 0,1 μL (0,1 μL x 10 inyecciones = 1 μL en total), mantenga la aguja en su lugar durante 10 minutos para evitar el reflujo y luego retírela lentamente hacia arriba para retirar la jeringa.
  14. Para asegurarse de que la aguja no se bloquee durante la inyección, libere un pequeño volumen del AAV hasta que se pueda observar una gota en la punta de la aguja. Use un hisopo estéril para limpiar el exceso antes de realizar una inyección.
  15. Repita los pasos 2.11-2.14 para las inyecciones de AAV en los dos orificios de fresa restantes (en la corteza sensoriomotora derecha a +1 AP, +2.25 ML, −1.0 DV; y −1 AP, +2.25 ML, −1.0 DV mm de bregma. Esterilice las jeringas antes de inyectar al siguiente animal con PREempt, seguido de alcohol al 70% y, finalmente, PBS estéril.
  16. Para cerrar la herida, sutura la piel suprayacente del cráneo con una sutura estéril de poliéster polysorb 4-0.
  17. Administre una pomada antibiótica con un hisopo de algodón en el área suturada para prevenir la infección postoperatoria.
  18. Retire el ratón del marco estereotáxico y transfiéralo a una jaula de alojamiento de animales limpia y precalentada en el área de recuperación. Apague el vaporizador de isoflurano y el oxígeno.
  19. Mantenga el ratón dentro de la jaula y esterilice el exterior de la jaula con PREempt y alcohol al 70% antes de colocarlo encima de una almohadilla térmica para recuperarse de la anestesia.
    1. Alternativamente, si usa una lámpara de calentamiento, coloque al ratón en el lado de la jaula debajo de la lámpara para que el ratón pueda moverse al lado frío de la jaula mientras se despierta de la anestesia para evitar el sobrecalentamiento. Monitoree el ratón a medida que sale de la anestesia en los próximos 5 a 10 minutos.
  20. Monitorizar al ratón durante los próximos 3 días (control de peso), proporcionar cuidados postoperatorios (puré húmedo para asegurar la hidratación) y analgésicos (2 mg/kg de meloxicam, 2 veces al día por vía subcutánea, durante 2-3 días) de acuerdo con las normas establecidas por el comité local de cuidado de animales.

3. Preparación y disección de tejidos

  1. Para sacrificar al ratón, inyecte intraperitonealmente al ratón con tribromoetanol (Avertin) (conc. 12,5 mg/mL, 250 mg/PC(kg)) y espere de 2 a 3 minutos para la inducción completa. Asegúrese de que el animal esté adecuadamente anestesiado retirando al ratón de la jaula y confirmando la ausencia de un reflejo de pellizco del dedo del pie.
  2. En una campana extractora, realizar perfusión transcárdica26 con solución salina seguida de paraformaldehído al 4%. Rocíe la cabeza del animal sacrificado con etanol al 70% hasta que se empape.
  3. Corta la cabeza en la base del cráneo con un par de tijeras grandes. Corta la piel a lo largo de la línea media de todo el cráneo con unas tijeras rectas de iris de 4-1/2". Retrae la piel para exponer el cráneo.
  4. Desde la abertura de la cavidad espinal en el cuello, inserte las tijeras de iris y corte a través del cráneo a lo largo de la sutura sagital e interfrontal.
  5. A continuación, inserte unas tijeras en las dos cuencas de los ojos y corte la sutura frontal-nasal.
  6. Tenga especial cuidado de no dañar el cerebro. Abra las placas del cráneo hacia la izquierda y hacia la derecha hasta que el cerebro quede expuesto.
  7. Transfiera el cerebro a un frasco de centelleo con paraformaldehído al 4%. Mantener el cerebro en paraformaldehído al 4% a 4 °C durante 4 h.
  8. A continuación, el cerebro se crioprotege sustituyendo un 4% de paraformaldehído por un 30% de sacarosa. Mantener el cerebro en sacarosa al 30% a 4 °C hasta que el cerebro se hunda hasta el fondo del vial (~12 h).

4. Seccionar cerebros congelados

  1. Ajuste la temperatura de la cámara de criostato entre -20 °C y -26 °C.
  2. Haga un corte coronal a través del cerebelo y fije la parte plana y caudal del cerebro a un mandril de criostato con compuesto de temperatura de corte óptima (OCT).
  3. Coloque el mandril con el cerebro en el soporte del disco y alinee el bulbo olfativo con la hoja del cuchillo.
  4. Cortar el cerebro en rodajas coronales de 20 μm de grosor. Para evitar rayas o líneas de arañazos en las rebanadas de cerebro seccionadas, coloque un trozo de cinta adhesiva en la plataforma de sección para crear un pequeño espacio entre la placa antivuelco y la plataforma. Se puede usar un pincel para ajustar la orientación de la sección antes de capturarla en un portaobjetos de vidrio cargado positivamente.
  5. Guarde los portaobjetos que contengan secciones de cerebro a -20 °C.

5. Inmunohistoquímica y cuantificación

  1. Procesar las secciones para inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo primario contra NeuN, un marcador panneuronal, de acuerdo con los protocolos estándar22,26.
  2. Descongele las secciones de cerebro criopreservadas durante 5 minutos a temperatura ambiente. Lave las secciones tres veces con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 minutos cada una.
  3. Incubar las secciones en Triton X-100 al 0,3% en PBS durante 20 min a temperatura ambiente para que se permearan.
  4. Preparar la solución de bloqueo (5% de suero de cabra normal y 0,3% de Triton X-100 en PBS) e incubar las secciones en la solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente.
  5. Diluir el anticuerpo primario, anti-NeuN de conejo, en una proporción de 1:500 en la solución de bloqueo. Incubar las secciones con la solución de anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C.
  6. Lave las secciones tres veces con Triton X-100 al 0,3% en PBS, durante 5 minutos cada lavado.
  7. Diluir el anticuerpo secundario, cabra anti-conejo 568 o 488, en una proporción de 1:1000 en PBS. Incubar las secciones con la solución de anticuerpos secundarios durante 1 h a temperatura ambiente, protegidos de la luz.
  8. Realizar tres lavados con Triton X-100 al 0,3% en PBS, durante 5 min cada uno. Incubar las secciones con DAPI (1:10.000 en PBS) durante 5 min a temperatura ambiente.
  9. Lave las secciones tres veces más con PBS, durante 5 minutos cada una. Monte las secciones manchadas en un portaobjetos de vidrio con un medio de montaje de fluorescencia y un cubreobjetos de vidrio. Deje que los portaobjetos montados se sequen durante la noche.
  10. Imágenes de portaobjetos teñidos utilizando un objetivo de 20x con un microscopio confocal para obtener vistas de las células Reporter+ alrededor de la lesión del ictus en 3 secciones coronales diferentes (entre las regiones anatómicas del cruce del cuerpo calloso anterior y el cruce de la comisura anterior posterior) para cada animal.
    NOTA: La distancia de la propagación del AAV variará dentro del hemisferio. Sin embargo, según nuestra experiencia y el análisis posterior al procesamiento de tejidos de las células Reporter+, la propagación de AAV generalmente abarca aproximadamente +3 mm a -3 mm desde bregma. Se deben cuantificar las células Reporter+ alrededor de la lesión del accidente cerebrovascular (identificadas por la ausencia/tinción escasa de NeuN) en el área entre donde el cuerpo calloso cruza la línea media y las conexiones de la comisura anterior.
  11. Para la cuantificación de las neuronas transducidas, realice un análisis de colocalización. Cuente manualmente el número de células dobles positivas (Reporter+NeuN+) y el número total de células transducidas (Reporter+) en cortes de cerebro. Para los resultados en este trabajo, se contaron >3 campos de visión alrededor de la lesión (medial, lateral e inferior) de 3 secciones coronales por ratón.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Examinar los resultados celulares de la expresión ectópica de Neurod1 impulsada por el promotor corto de GFAP (gfaABC(1)D) en cepas reporteras de tdTom-Cre de tipo salvaje (C57BL/6J) y transgénicas (específicamente, B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 se utilizaron dos sistemas basados en AAV5 en ratones lesionados por ET-1 (Figura 1A-C). En un modelo subagudo de accidente cerebrovascular, Neurod1 se empaquetó en el sistema Cre-Flex AAV y se administró a ratones de tipo salvaje el día 7 después del accidente cerebrovascular (Figura 1B). El segundo vector Flex contiene la secuencia invertida para GFP impulsada por el promotor CAG que está flanqueada por sitios de recombinación heterotípicos y antiparalelos de tipo loxP (Figura 1B). Ambas construcciones virales se inyectan juntas al mismo tiempo después del accidente cerebrovascular. Una vez que Cre se expresa en las células transducidas, la GFP se invierte y se extirpa en los sitios de recombinación, orientando la secuencia en la dirección del sentido, lo que permite la expresión de GFP. Por lo tanto, las células que expresan Cre serán GFP positivas, lo que indica que han sido transducidas por los vectores Cre-Flex. En el modelo subagudo, los ratones se sacrificaron a los 21 días después de la transducción (es decir, 28 días después del accidente cerebrovascular), y el número de células transducidas (GFP+), así como el número de células NeuN+GFP+ (células transducidas que expresan NeuN), se contaron en el parénquima de los cerebros lesionados por el accidente cerebrovascular. Como se observa en la Figura 2A, las neuronas se pierden en el sitio de la lesión isquémica. La cuantificación de las células transducidas en el paradigma subagudo utilizando el sistema Cre-Flex AAV revela significativamente más neuronas marcadas (células NeuN+GFP+/GFP+) en los ratones tratados con Neurod1 en comparación con los ratones de control Stroke-Cre (43,05 +/- 5,50% frente a 18,43 +/- 3,03% de células NeuN+GFP+/GFP+, en Stroke-Neurod1 frente a Ratones tratados con Stroke-Cre (control), respectivamente) (p = 0,0172) (Figura 2B,C).

En un conjunto separado de experimentos, la conversión de AtN se realizó en un modelo crónico de accidente cerebrovascular (Figura 1B, C). El factor de transcripción Neurod1 se administró a ratones reporteros tdTom-Cre lesionados por ET-1 el día 21 después del accidente cerebrovascular (Figura 1C). De forma idéntica al sistema Cre-Flex utilizado en ratones de tipo salvaje, la expresión de Neurod1 fue impulsada por el promotor corto de GFAP. Sin embargo, en este sistema, se utilizó un único constructo de AAV con Cre recombinasa después de Neurod1 (Figura 1B). Por lo tanto, las células que expresan GFAP producirán Cre recombinasa, induciendo el reportero de tdTom, lo que indica células que han sido transducidas por AAV. Los ratones fueron sacrificados a los 77 días después del accidente cerebrovascular (8 semanas después del AAV) (Figura 1C). Como se observa en la Figura 3A, se observa una lesión cortical en el día 77 después del accidente cerebrovascular en ratones tdTom-Cre. Se cuantificó el número de células transducidas que expresan el marcador neuronal, NeuN+, (porcentaje relativo de células (NeuN+tdTom+/tdTom+) en la etapa crónica posterior al accidente cerebrovascular y se encontró que los ratones que recibieron Stroke-Neurod1 tenían significativamente más neuronas marcadas en comparación con los ratones de control Stroke-Cre (74,81 +/- 4,835% frente a 53,05 +/- 5,028% células NeuN+tdTom+/tdTom+ en Stroke-Neurod1vs. Ratones tratados con Stroke-Cre (control), respectivamente) (p = 0,0355) (Figura 3B, C).

En general, los resultados demuestran la transducción basal de las neuronas y un mayor número de células transducidas que expresan NeuN+ con la entrega de Neurod1 en las fases subaguda y crónica posterior al accidente cerebrovascular en ratones indicadores de tipo salvaje y tdTom-Cre, con dos sistemas diferentes basados en AAV.

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Figura 1: Expresión ectópica de Neurod1, vectores y líneas de tiempo. (A) Representación gráfica de la inducción de un accidente cerebrovascular mediante la inyección de endotelina-1 (ET-1) en la corteza motora del ratón. El virus adenoasociado (AAV) se administra en 3 sitios, en el sitio de inyección de ET-1, así como en los sitios que rodean la lesión, 1 mm anterior y posterior. Panel ampliado que muestra células transducidas con AAV-Neurod1 en la corteza motora. (B) Esquema de los dos vectores AAV en el sistema Cre-Flex suministrados a ratones de tipo salvaje (panel superior). El vector 1 de AAV5 contiene el promotor corto de GFAP, el factor de transcripción Neurod1 y la secuencia de recombinasa Cre flanqueada por un sitio loxP (triángulo negro) y por un sitio lox2272 (triángulo blanco). El vector 2 de AAV5 lleva la secuencia reportera del gen GFP invertida flanqueada por un par de sitios loxP y lox2272. La transducción de ambos vectores en las células da como resultado la escisión e inversión mediada por Cre, lo que permite que la expresión de GFP marque las células transducidas. Neurod1 también se administró a ratones tdTom-Cre utilizando un vector AAV5 (panel inferior). En el vector 1 de AAV5 se empaquetan el promotor corto de GFAP, el factor de transcripción Neurod1 y la secuencia de recombinasa Cre. La expresión de Cre en las células transducidas impulsa la escisión del codón Stop en los sitios loxP (triángulo negro), lo que permite la expresión de tdTomato. (C) El sistema Cre-Flex se probó en ratones de tipo salvaje con AAV inyectados en el período subagudo posterior al accidente cerebrovascular (día 7 posterior al accidente cerebrovascular). Los ratones de tipo salvaje fueron sacrificados 21 días después de la transducción de AAV (28 días después del accidente cerebrovascular). El AAV se administró a los ratones tdTom-Cre en el período crónico posterior al accidente cerebrovascular (día 21 después del accidente cerebrovascular), y los ratones se sacrificaron 56 días después de la transducción del AAV (77 días después del accidente cerebrovascular). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: La administración ectópica de Neurod1 utilizando AAV Cre-Flex en la fase subaguda posterior al accidente cerebrovascular conduce a un mayor número de células transducidas que expresan NeuN. (A) Inmunotinción de secciones cerebrales coronales a través de la corteza motora en el día 28 después del accidente cerebrovascular de ratones de control Stroke-Cre (izquierda) y Stroke-Neurod1 (derecha). Se observa pérdida neuronal en el sitio de la lesión (líneas blancas discontinuas). En la corteza se observan células transducidas (GFP+, verde), neuronas (NeuN+, rojo) y células NeuN+GFP+ (naranja) colocalizadas. Barras de escala: 250 μm. (B) Imágenes representativas del tejido cerebral de control Stroke-Cre (arriba) y Stroke-Neurod1 (abajo) que muestran neuronas (NeuN+, rojo) y GFP+ transducido por AAV (verde). Los recuadros delineados en blanco muestran un primer plano de las celdas de cada canal individual. Las puntas de flecha blancas indican células transducidas por AAV (GFP+). Las flechas blancas indican células NeuN+GFP+ colocalizadas. Barras de escala: 125 μm. (C) Cuantificación de células NeuN+GFP+/GFP+ en ratones Stroke-Cre y Stroke-Neurod1. N = 3 ratones por grupo. Los datos se representan como promedio ± SEM. Prueba de Shapiro-Wilk (p = 0,3223). Prueba t no apareada, *p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: La administración ectópica de Neurod1 en ratones reporteros de tdTom-Cre en la fase crónica posterior al accidente cerebrovascular conduce a un mayor número de células transducidas que expresan NeuN. (A) Inmunotinción de secciones coronales del cerebro a través de la corteza motora en el día 77 después del accidente cerebrovascular en ratones de control Stroke-Cre y Stroke-Neurod1 . La pérdida neuronal se observa en el sitio de la lesión isquémica (líneas discontinuas blancas). Las células transducidas se marcan con tdTom (rojo) en el periinfarto. NeuN+tdTom+ (naranja) son células transducidas que expresan marcadores neuronales. Barras de escala: 250 μm. (B) Imágenes representativas del tejido cerebral de control Stroke-Cre (arriba) y Stroke-Neurod1 (abajo) que muestran neuronas (NeuN+, verde) y células transducidas AAV (tdTom+, rojo). Los recuadros delineados en blanco muestran un primer plano de las celdas de cada canal individual. Las puntas de flecha blancas indican células transducidas AAV (tdTom+). Las flechas blancas indican células NeuN+tdTom+ colocalizadas. Barras de escala: 125 μm. (C) La cuantificación de las células NeuN+tdTom+/tdTom+ en el paradigma crónico muestra significativamente más células transducidas que expresan NeuN+ (células NeuN+tdTom+/tdTom+) en los ratones tratados con Neurod1 . N = 3 ratones por grupo. Los datos se representan como promedio ± SEM. Prueba de Shapiro-Wilk (p = 0,2044). Prueba t no apareada, *p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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Este protocolo detalla dos sistemas de AAV y modelos de ratón para investigar la expresión ectópica de Neurod1 en el contexto de un modelo de accidente cerebrovascular cortical ET-1 leve-moderado. Es importante tener en cuenta una serie de pasos críticos relacionados con el accidente cerebrovascular ET-1 para la reproducibilidad y la consistencia de la lesión. Los orificios de las rebabas deben perforarse con cuidado sin perforar la duramadre para evitar lesiones quirúrgicas involuntarias. Es importante utilizar puntos de referencia consistentes, en este caso bregma, para asegurar una región de interés similar (corteza sensoriomotora en este estudio). Esto es particularmente importante para los estudios que utilizan evaluaciones conductuales, ya que la ubicación y el tamaño de la lesión afectarán los resultados funcionales 13,22,25,27. Lo más importante es que la tasa de inyección de ET-1 y la presión aplicada por el cirujano sobre la jeringa deben ser consistentes para obtener resultados reproducibles. Cabe destacar que la aguja de la jeringa puede obstruirse y debe limpiarse entre animales para garantizar una administración precisa de ET-1. Durante el análisis celular del tejido, si no se observa una lesión de accidente cerebrovascular, es probable que la aguja se haya obstruido durante la cirugía. Si el problema persiste, obtenga un nuevo lote de endotelina-1 del fabricante, ya que se han observado problemas de potencia dependientes del lote en el pasado.

Los pasos para el procedimiento quirúrgico para administrar AAV son similares a los del protocolo de inducción de accidente cerebrovascular ET-1. Por lo tanto, las consideraciones antes mencionadas son críticas. Además, el título y el volumen viral de AAV deben ser consistentes para garantizar que la eficiencia de la transducción se pueda comparar entre grupos. En este protocolo, se administró 1 x 109 GC/μL de AAV para el estudio agudo y 1 x10 10 GC/μL de AAV para el estudio crónico. Es crucial seleccionar una dosis viral que sea lo suficientemente baja como para minimizar la mala expresión artefactual y, al mismo tiempo, lo suficientemente alta como para garantizar una transducción celular suficiente, lo que permite la detección de diferencias entre los grupos experimentales. Se ha determinado que el rango de dosis viral óptimo para estos estudios es de 10 7-1010 GC/μL 13,24. Los títulos más altos de AAV no solo dan como resultado un etiquetado extenso de las neuronas en el grupo de control, sino que también se ha demostrado que inducen astrocitosis, alteran la barrera hematoencefálica y regulan al alza las respuestas inflamatorias28,29. Los estudios que investigan la administración de factores de transcripción mediados por virus después de un accidente cerebrovascular han utilizado diferentes sitios de administración para las inyecciones de AAV. Un estudio describió el marcaje exitoso de células transducidas utilizando una sola inyección de AAV en el sitio de la lesión del accidente cerebrovascular13. Otros estudios se enfocan de una a tres áreas alrededor del área del infarto30. En este artículo, la VAA se administró en tres localizaciones, con una inyección en las coordenadas del sitio de la inyección de ET-1 y 2 alrededor del sitio de la lesión (una inyección a 1,0 mm anterior y una inyección a 1,0 mm posterior) con el objetivo de transducir astrocitos reactivos en el borde glial perilesional9. Durante el análisis celular del tejido, si no se observa ninguna o muy pocas células fluorescentes (1-10 células/sección), es posible que la aguja se haya obstruido durante la inyección o que el AAV se haya congelado demasiadas veces, lo que lleva a la inactivación del virus.

La eficiencia de la transducción se examinó en diferentes momentos en el modelo de accidente cerebrovascular leve-moderado, y los resultados demuestran que se marcan significativamente más neuronas en los cerebros tratados con Neurod1 tanto en el momento subagudo como en el crónico después del accidente cerebrovascular. El trabajo que se muestra aquí es el primero en demostrar la transducción de Neurod1 en la fase crónica posterior al accidente cerebrovascular y revela que las neuronas expresan ectópicamente Neurod1 hasta 8 semanas después del accidente cerebrovascular. Si bien los hallazgos de que se observa un mayor número de neuronas transducidas en cerebros lesionados por accidente cerebrovascular que recibieron Neurod1 en comparación con los vectores de control son consistentes con el papel de Neurod1 en la conversión de AtN, la interpretación de los resultados celulares requiere un conocimiento sólido de las limitaciones del paradigma experimental. La gran mayoría de los estudios publicados que investigan la conversión de AtN utilizan GFAP como promotor, ya que GFAP está regulado al alza en astrocitos reactivos en enfermedades neurodegenerativas, incluido el accidente cerebrovascular 4,31. Sin embargo, se ha demostrado que también se produce una baja expresión de GFAP en las neuronas32. Esto es consistente con los hallazgos reportados aquí, en los que un porcentaje de células transducidas en el grupo de control (Stroke-Cre) son neuronas preexistentes32. En concreto, los grupos de control de Stroke-Cre de este protocolo mostraron un marcaje de 18,43 +/- 3,03% y 53,05 +/- 5,028% de células NeuN+Reporter+, lo que representa el marcaje de neuronas preexistentes, lo que indica la expresión impulsada por el promotor de GFAP en las neuronas. De hecho, la expresión dirigida de Neurod1 depende de una serie de factores, incluido el tropismo viral. Se ha demostrado que AAV5 transduce neuronas con diferente eficiencia en diferentes regiones del cerebro, incluida la corteza sensoriomotora, lo que indica que los serotipos de AAV tienen tropismo celular regional, lo que debe tenerse en cuenta en los estudios que inducen la expresión ectópica de factores de transcripción31,33. Las distensiones del ratón también pueden afectar a la transducción del AAV14,34. Un estudio que comparó la transducción de AAV en el cuerpo estriado de ratones de tipo salvaje (C57BL/6J) y FVB/N encontró un tropismo celular variable y una eficiencia de transducción en las dos cepas34.

Una ventaja del sistema Cre-Flex es que se puede utilizar para el etiquetado a largo plazo en ratones de tipo salvaje, lo que puede reducir el problema de la expresión inespecífica de Cre presente en las líneas de ratones Cre-reportera15,35. Una desventaja del sistema Cre-Flex es que puede producirse la expresión de transgenes independientes de Cre debido a que entre el 0,1% y el 0,8% de las partículas virales han recombinado los sitios LoxP durante la producción viral36. Estos hallazgos resaltan la importancia de los experimentos de rastreo de linaje, por ejemplo, el pre-etiquetado de astrocitos antes de la administración de AAV utilizando la línea de ratón Aldh1l1-CreERT2, para asegurar que la conversión de AtN no se sobreestime al informar las conclusiones15. Los estudios han sugerido que la activación del promotor humano de GFAP (como se utiliza en estos estudios) a través de la regulación cis por genes posteriores (como Neurod1) puede dar lugar a la expresión de GFAP en las neuronas endógenas, lo que conduce a un mayor número de neuronas marcadas en el grupo de tratamiento15,32. En conjunto, estos estudios y los hallazgos aquí presentados resaltan la importancia de los experimentos de rastreo de linaje, por ejemplo, el pre-etiquetado de astrocitos o neuronas antes de la administración de AAV, para diferenciar entre neuronas preexistentes y endógenas durante el análisis15.

Al considerar los próximos pasos que podrían reducir la transducción neuronal, sería útil diferentes serotipos de AAV y/o el uso de un promotor específico de astrocitos menos promiscuo19. Un número cada vez mayor de informes que describen la heterogeneidad de los astrocitos puede afectar aún más la especificidad de la expresión génica si diferentes subpoblaciones de astrocitos son más susceptibles a la conversión de AtN en general 37,38,39,40.

La edad de los animales utilizados en modelos preclínicos de lesiones o enfermedades también es una consideración importante que puede introducir resultados variables. Por ejemplo, en el caso de los neurotraumatismos, la edad puede afectar a la reactividad de los astrocitos, lo que afectaría a los resultados del estudio para la conversión de AtN41. Además, las líneas reporteras inducibles por Cre pueden perder especificidad de expresión con el tiempo, lo que puede afectar a las medidas de resultado42. Hasta la fecha, la reprogramación en animales mayores no ha sido investigada exhaustivamente43.

El protocolo describe la administración de AAV en 2 fases después del accidente cerebrovascular: (1) la fase subaguda (a los 7 días) y (2) la fase crónica (a los 21 días) después del accidente cerebrovascular isquémico. No se ha examinado la expresión ectópica de Neurod1 en un modelo de accidente cerebrovascular crónico; Por lo tanto, la observación de que se marcan significativamente más neuronas en esta etapa tardía tiene implicaciones importantes para futuros estudios destinados a promover la recuperación del accidente cerebrovascular en el accidente cerebrovascular crónico. Los estudios que examinen el potencial de la expresión ectópica de Neurod1 para mejorar los resultados del accidente cerebrovascular deberán incorporar evaluaciones conductuales, ya que los resultados funcionales después del accidente cerebrovascular son las medidas de éxito clínicamente más relevantes para una intervención terapéutica 13,22,25,27.

Actualmente no hay tratamientos disponibles para los pacientes que sufren discapacidades inducidas por el accidente cerebrovascular en las fases subaguda y crónica posteriores al accidente cerebrovascular, con la excepción de la rehabilitación, que tiene un beneficio limitado. Se ha demostrado que la expresión forzada de genes neurogénicos bHLH en la glía mejora los resultados funcionales después del accidente cerebrovascular22,30. Los hallazgos son consistentes con los estudios de reprogramación de AtN que demuestran que la expresión ectópica de Neurod1 aumenta la transducción neuronal a las 3 y 7 semanas después de la entrega de AAV en comparación con los ratones que reciben el vector de control. Lo más importante es que varios artículos han esbozado recomendaciones para el estudio de controles, diseño e interpretaciones en el campo de la reprogramación de AtN 17,18,19,22. Con este fin, este protocolo ha descrito sistemas AAV y modelos de ratón para la expresión ectópica de factores de transcripción después de un accidente cerebrovascular, que se pueden utilizar para informar y avanzar en futuras investigaciones sobre los mecanismos celulares subyacentes a las observaciones.

Divulgaciones

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Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Agradecimientos

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Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación del Corazón y el Accidente Cerebrovascular, el Instituto de Medicina Regenerativa de Ontario, el Fondo de Excelencia en Investigación del Primer País de Canadá (Medicine by Design, MbD) y el Premio a la Innovación Connaught (Universidad de Toronto).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
#77 Broca (.018")David Kopf Instruments8177
AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCreVector 
con aguja Polysorb™ Poliéster CV-15 3/8 Aguja de punta cónica circular tamaño 4 - 0 TrenzadoCovidienGL-881
Anticuerpo Anti-NeuN (conejo) Millipore SigmaABN78 
C57BL/6 RatonesCharles River027
Solución de clorhexidinaPartnarPCH-020
Contec™   PREempt™ Solución desinfectante RTUFisher Scientific29-636-6212
CryostatThermo Scientific HM525 NX 
Endotelina 1Millipore Sigma05-23-3800-0.5MG
Pluma Maquinilla de afeitar de seguridad Hojas de micrótomoPluma12-631P
Fisherbrand  Cubreobjetos: RectángulosFisher Scientific12-545M 
Medio de montaje de fluorescenciaAgilent TechnologiesS3023 
JeringaHamilton Hamilton Company7634-01
Taladro estereotáxico de alta velocidadDavid Kopf Instruments1474
Solución Metacam (Meloxicam)Boehringer Ingelheim
O.C.T CompoundFisher Scientific23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCreVector BuilderP190924-1001suq
Pomada Polyderm USPTARO2181908
SOMNI Scientific™   La almohadilla térmica para temperatura animalFisher Scientific04-777-177
Instrumentos estereotáxicosDavid Kopf Instruments Modelo902
Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio, blancoFisherbrand12-550-15
tdTomato Reporter Ratones El sistema
V-1VetEquip901806
Sutura absorbible de Biolabs de anestesia para animales de laboratorio de mesa Jackson Laboratory 007914

Referencias

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