Artículo de método

Segmentación génica retroviral mediada por CRISPR/Cas9 para el estudio de la diferenciación de Th17 in vitro

1.3K vistas

⸱

DOI:

10.3791/66966

⸱

15 de noviembre de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Immune Therapy Institute, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Zhejiang University-University of Edinburgh Institute (ZJU-UoE Institute), Zhejiang University School of Medicine, Zhejiang University, 3Institute of Immunology and Department of Rheumatology, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Presentamos un protocolo para la transducción retroviral de ARN guía en células T primarias de ratones transgénicos Cas9, proporcionando una alternativa eficiente para la edición de genes en el estudio de la diferenciación Th17.

Resumen

Las células T auxiliares que producen IL-17A, conocidas como células Th17, desempeñan un papel fundamental en la defensa inmunitaria y están implicadas en los trastornos autoinmunes. Las células T CD4 pueden estimularse con antígenos y cócteles de citocinas bien definidos in vitro para imitar la diferenciación de las células Th17 in vivo. Se han llevado a cabo numerosas investigaciones sobre los mecanismos de regulación de la diferenciación Th17 utilizando el ensayo de polarización Th17 in vitro .

Los métodos convencionales de polarización Th17 suelen implicar la obtención de linfocitos T CD4 vírgenes de ratones modificados genéticamente para estudiar los efectos de genes específicos en la diferenciación y función de Th17. Estos métodos pueden llevar mucho tiempo y ser costosos, y pueden estar influenciados por factores extrínsecos de las células de los animales knockout. Por lo tanto, un protocolo que utiliza la transducción retroviral de ARN guía para introducir la eliminación de genes en las células T primarias de ratón knockin de CRISPR/Cas9 sirve como un enfoque alternativo muy útil. En este artículo se presenta un protocolo para diferenciar linfocitos T primarios naïve en linfocitos Th17 siguiendo la focalización génica mediada por retrovirales, así como los métodos de análisis de citometría de flujo posteriores para analizar la infección y la eficiencia de la diferenciación.

Introducción

Las células Th17, un subconjunto único de células T auxiliares CD4+, son vitales para erradicar bacterias y hongos extracelulares y desempeñan un papel importante en diversas enfermedades autoinmunes 1,2,3. La evidencia emergente sugiere que las células Th17 exhiben heterogeneidad, funcionando tanto en condiciones patógenas como no patógenas, influenciadas por factores ambientales y genéticos. Dilucidar los procesos reguladores que controlan la diferenciación de las células Th17, la plasticidad y la heterogeneidad es crucial para el avance de estrategias inmunoterapéuticas más efectivas.

Los animales modificados genéticamente se han utilizado ampliamente para revelar los reguladores clave de la diferenciación y las funciones de las células Th17. El uso de animales modificados genéticamente implica una manipulación completa in vivo, proporcionando autenticidad y un estudio sistemático de su papel en condiciones fisiológicas o modelos de enfermedades. Sin embargo, el cribado de alto rendimiento con este enfoque es en gran medida poco práctico. Los ensayos de polarización in vitro proporcionan una alternativa para estudiar la diferenciación de las células Th17. Se ha demostrado que la interleucina 6 (IL-6) en combinación con el factor de crecimiento transformante β1 (TGFβ1) promueve el desarrollo de células Th17 no patógenas, mientras que la IL-6, la IL-1β y la IL-23 están implicadas en la diferenciación de las células Th17 patógenas (pTh17)4,5.

La aparición de la tecnología CRISPR/Cas9 ha facilitado la edición precisa del genoma en bases específicas. Cuando se combina con la transducción retroviral, este enfoque proporciona un método genético potente, eficiente y económico para el cribado y el estudio funcional de posibles reguladores en las células Th17 6,7. En este estudio, mejoramos el procedimiento para la transducción retroviral dentro del sistema de polarización Th17. Usando un sistema retroviral, infectamos células T vírgenes activadas preestablecidas que expresan Cas9 de ratones. Las células se transducieron con construcciones de ARN guía (ARNg) impulsadas por el promotor U6, junto con genes que codifican proteínas reporteras fluorescentes bajo el control del promotor EF1a para facilitar la eliminación del gen diana. Luego, las células T transducidas se cultivaron en condiciones específicas de citocinas para inducir la diferenciación en células Th17. En particular, la eliminación de RoRγt redujo significativamente la producción de IL-17A en comparación con el grupo de control. La eficacia de este sistema depende de la optimización de la producción de retrovirus y de las condiciones de transducción de las células T primarias activadas, lo que proporciona un enfoque rápido y práctico para estudiar genes específicos en la diferenciación y función de Th17.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética de Bienestar de Animales Experimentales del Hospital Renji de la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái y cumplen con las directrices institucionales.

1. Producción de retrovirales

  1. Preparación de la construcción retroviral
    1. Utilice la herramienta CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public) para diseñar el sgRNA para el knockout8 de RORγt. Especifique el genoma de referencia como Mouse GRCm38 y elija la secuencia PAM como NGG (para SpyoCas9, Hsu (2013) tracrRNA) basado en el sistema de guía CRISPRko. Valide el nombre del gen objetivo u otros formatos de genes objetivo y envíe la entrada válida para obtener candidatos a sgRNA. Estableciendo otros parámetros en valores predeterminados, establezca el objetivo de sgRNA en RORγt (Rorc, Gene ID: 19885) para perturbar la diferenciación de Th17 y seleccione sgRNA no objetivo (abreviado sgNT, secuencia: GCGAGGTATTCGGCTCCGCGG) de las bibliotecas GeCKO v2 del ratón.
      NOTA: Esta herramienta ofrece una gama de opciones en las que se puede hacer clic para diseñar ARN guía, lo que permite una personalización conveniente para cumplir con requisitos específicos.
      1. Introduzca el nombre del gen objetivo en el cuadro de búsqueda de la columna Búsqueda rápida de genes. El sistema mostrará la identificación del gen y el nombre completo del gen objetivo para garantizar una selección precisa.
        NOTA: Hay opciones adicionales disponibles para validar diferentes formatos de genes diana.
    2. Elija un sgRNA dirigido a la secuencia Rorc (abreviado sgRorc) de acuerdo con el rango combinado alto y el orden de selección para evitar coincidencias fuera del objetivo y aumentar la eficacia en el objetivo (secuencia sgRorc: GTCATCTGGGATCCACTACG). Sintetice dos oligonucleótidos para sgRorc y sgNT: para el oligonucleótido directo, agregue la secuencia "gttttagagctagaaatagcaagttaaaat" al extremo 5' de cada secuencia guía; Para el oligo inverso, agregue la secuencia "tttcgtcctttccacaagatatataaagc" al extremo 3' de cada secuencia guía.
      NOTA: Por lo general, existen múltiples opciones para las secuencias de sgRNA. Es esencial seleccionar 2 o 3 secuencias de sgRNA dirigidas al mismo genotipo para evaluar su eficiencia de knockout. En nuestros experimentos preliminares, se seleccionaron dos ARNg diana de Rorc para la comparación (secuencia de sgRNA1: GTCATCTGGGATCCACTACG; secuencia de sgRNA2: CTTGAGTATAGTCCAGAACG). Los resultados experimentales indicaron que el ARNg presentado en el método actual (secuencia de ARNsg1) exhibe una mayor eficiencia de knockout entre los dos.
    3. Amplifique las secuencias codificantes de sgRorc y sgNT utilizando ADN polimerasa en PCR con los cebadores anteriores y clónelos en el vector pMX-U6-MCS (entre las regiones del promotor U6 y el andamio de ARNg) en el marco con la proteína fluorescente mCherry, respectivamente9. Configure el sistema de reacción (50 μL) como Tabla 1. Esos cebadores consisten en una secuencia de sgRNA (3'), que puede insertar el sgRNA en el vector, y un segmento de secuencia vectorial (5'), que puede amplificar el fragmento vectorial de longitud completa. Además, diseñe los cebadores directos e inversos con un solapamiento de aproximadamente 18 pb dentro de la región de sgRNA (pero no totalmente superpuestos), lo que facilita el ensamblaje del vector de clonación linealizado durante el proceso de ligadura.
      NOTA: Se debe obtener un fragmento vectorial linealizado en el sitio de la secuencia de sgRNA con cebadores por PCR de aproximadamente 5.551 kd.
    4. Purifica el constructo con un kit de extracción en gel y circularlo con un kit de clonación. Utilice los productos de recombinación para ensayos de transformación.
    5. Elija los clones individuales de las placas y verifique las secuencias codificantes de sgRorc o sgNT mediante secuenciación de primera generación, utilizando el cebador promotor U6 (secuencia: ATGGACTATCATATGCTTACCGTA).
    6. Seleccione el clon único deseado para la amplificación en el caldo LB. Extraiga ADN plasmídico de alta calidad de células bacterianas mediante el uso de un kit de plásmidos libre de endotoxinas.
      NOTA: Asegúrese de que la solución de plásmido tenga una alta calidad. Recomendamos que la concentración de la solución de plásmido sea de al menos 1 μg/μL.
  2. Preparación de células de envasado
    1. Prepare las células Platinum-E (Plat-E) utilizando el siguiente procedimiento: cultivo de células Plat-E con medio de águila modificado de Dulbecco (medio DMEM) que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS), 100 unidades/mL de penicilina y 0,1 mg/mL de estreptomicina en una placa de cultivo de 10 cm. A continuación, se hará referencia a él como medio de cultivo celular .
      NOTA: Para obtener la eficiencia de transfección adecuada, recomendamos utilizar celdas en la fase de crecimiento logarítmico con menos de 15 números de paso.
    2. Divida una placa completa de células Plat-E de 10 cm (~2,6 × 107 células) en una proporción adecuada en una nueva placa de 10 cm 1 día antes de la transfección para lograr una confluencia celular de aproximadamente el 80% al día siguiente, que es la condición óptima para la transfección. Realice el paso de células para una nueva placa de 10 cm en una proporción de 1:3 (semilla ~ 8 × 106 células en una nueva placa de 10 cm el día antes de la transfección).
      NOTA: La relación de división depende de la condición de crecimiento de las células, y se puede lograr una mayor eficiencia de transfección en las células que exhiben un crecimiento robusto. Realizamos el paso de celdas para una placa de 10 cm en una proporción de 1:3. Para diferentes placas de cultivo celular, como una placa de 6 cm, recomendamos que se siembren 1,5 × 106 células Plat-E el día antes de la transfección.
  3. Transfección
    1. Una hora antes de la transfección, sustituir el medio de cultivo celular por 8 mL de medio sérico reducido sin rojo de fenol con FBS al 5%, pero sin penicilina-estreptomicina, ya que puede interferir con el reactivo de transfección. Calentar el medio sérico reducido a 37 °C antes de usar.
    2. Prepare la mezcla de transfección que contiene la mezcla 1 y la mezcla 2: la mezcla 1 incluye 18 μg de ADN plasmídico (pMXs-U6-MCS-sgNT-mCherry/pMXs-U6-MCS-sgRorc-mCherry) y 6 μg de pCL-Ecotropic Retroviral Vector (pCL-Eco) en 1.000 μL de medio sérico reducido. La mezcla 2 contiene 48 μL de reactivo de transfección en 1.000 μL de medio sérico reducido. Agregue la mezcla 2 gota a gota en la mezcla 1 y mezcle suave y completamente. Incubar el complejo durante 15-20 min a 20-25 °C.
    3. Gotee con cuidado la mezcla en las celdas Plat-E, girando la placa suavemente para asegurar una distribución uniforme. Incubar las células a 37 °C bajo 5% de CO2 durante 6-12 h.
    4. Sustituya el medio por 10 mL de medio de cultivo celular fresco y continúe incubando las células a 37 °C, 5% de CO2 durante 48 h.
    5. Evalúe la eficiencia de la transfección en células Plat-E mediante la detección de la etiqueta vectorial retroviral, que actúa como proxy, mediante microscopía de fluorescencia o citometría de flujo.
      NOTA: Se detectó una fuerte señal de fluorescencia mCherry (la fluorescencia positiva supera el 80%) en una proporción considerable de células Plat-E transfectadas con el vector pMX-U6-MCS, lo que indica una transfección exitosa.
    6. Recolectar el sobrenadante de cultivo que contiene virus y centrifugar a 1.500 × g durante 10 minutos para eliminar los fragmentos celulares. Aliquotar el sobrenadante del virus 1 mL por vial y almacenar a -80 °C.
      NOTA: La filtración es un método alternativo para eliminar los residuos celulares. Recomendamos utilizar un filtro de jeringa con un tamaño de poro de 0,45 μm y una membrana de polietersulfona (PES) para minimizar la retención de partículas virales en la membrana del filtro.

2. Infección retroviral de linfocitos T CD4 + activados y diferenciación Th17

  1. Preparar y activar los linfocitos T CD4+ vírgenes primarios
    1. Cubra cada pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos con 2 μg/mL de anti-CD3e y 4 μg/mL de anti-CD28 en PBS estéril de 500 μL, envuelva la placa en parafilm para evitar la evaporación y la contaminación, y luego incube la placa a 4 °C durante la noche (o 37 °C durante 1-2 horas antes de colocar las células T CD4+ ) el día antes de aislar las células T CD4+ vírgenes.
      NOTA: Este paso es necesario para realizar la estimulación unida a placa para las células T de ratón antes de realizar la transducción viral.
    2. Al día siguiente, eutanasiar a los ratones que expresan Cas9 de 6 a 8 semanas de edad (ratones R26-CAG-Cas9) mediante asfixia con CO2 y esterilizarlos con etanol al 70%.
    3. Extraiga el bazo de ratón y colóquelo en PBS con 2% de FBS y 100 μM de EDTA (tampón FACS).
    4. Muele el bazo con vidrio esmerilado esterilizado (lado mate) en el tampón FACS, homogeneiza el tejido en una suspensión unicelular y filtra la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 μm en un tubo de 50 mL.
      NOTA: Asegúrese de moler el pañuelo de forma suave y consistente para mantenerlo húmedo. La molienda violenta del tejido puede afectar drásticamente a la supervivencia de las células.
    5. Girar la suspensión de células esplénicas a 800 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 2 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos. Déjelo reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos, luego agregue el tampón FACS para alcanzar un volumen total de 15 mL. Centrifugar los esplenocitos a 800 × g durante 5 min.
    6. Vuelva a suspender los esplenocitos y fíltrelos a través de un filtro de células de 40 μm. Ajuste el volumen final a 1 mL para el aislamiento de células T CD4+ .
    7. Aísle las células T CD4+ con kits de reactivos comerciales siguiendo las instrucciones del manual.
    8. Etiquete las células T CD4+ con una mezcla de anticuerpos fluorescentes (CD4, CD25, CD44 y CD62L) a 4 °C durante 30 min, lave las células con tampón FACS y aísle las células T CD4+ vírgenes con un clasificador de células de flujo. Esto dará como resultado la obtención de linfocitos T CD4+CD25-CD62Lde altoCD44y bajos ingenuos.
    9. Retire el sobrenadante de estimulación unido a la placa de cultivo celular de 24 pocillos (preparada en el paso 2.1.1) y enjuague cada pocillo dos veces con 500 μL de PBS. Placa 1 x 106 linfocitos T CD4+ vírgenes en 1 mL de medio de cultivo de linfocitos en un pocillo de la placa de cultivo celular de 24 pocillos. Incubar las células en la incubadora de células.
      NOTA: El medio de cultivo de linfocitos contiene 10% de FBS, 100 unidades/mL de penicilina y 0,1 mg/mL de estreptomicina, 1 mM de piruvato de sodio, 10 mM de HEPES y 50 μM de β-ME en el medio RPMI 1640.
  2. Infección retroviral
    1. Después de 18-24 h, recoja cada pocillo de células activadas en el tubo de 1,5 mL. Centrifugar a 800 × g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
    2. Vuelva a suspender el pellet celular en 1 mL de mezcla de infección (10 μg/mL de bromuro de hexadimetrina, 10 mM de HEPES en el sobrenadante del virus) y agregue 1 mL de la mezcla a un nuevo pocillo de una placa de cultivo celular de 48 pocillos. Mientras tanto, guarde suficientes celdas como control negativo (no transducido).
      NOTA: Es factible tener menos de 1 x 106 linfocitos T CD4+ naïve activados por pocillo, pero no se recomienda usar menos de 0,5 x 106 linfocitos por pocillo. Además, no se deben sembrar células en los pocillos periféricos de la placa de cultivo de 48 pocillos.
    3. Envuelva la placa con parafilm y centrifuga a 800 x g durante 90 min a 32 °C. Establezca acelerar y desacelerar en 3. Después de la centrifugación, retire el parafilm, incube las células en la incubadora durante 4 h y continúe con los pasos de diferenciación.
  3. Diferenciación de células infectadas en células Th17
    1. Preparar las células presentadoras de antígeno (APC) durante la infección retroviral. En primer lugar, obtenga esplenocitos de ratones de tipo salvaje siguiendo las instrucciones de los pasos 2.1.2 a 2.1.4. Resuspender los esplenocitos con 1 mL de medio de cultivo de linfocitos con 50 μg/mL de mitomicina en un tubo de 15 mL. Incubar los esplenocitos a 37 °C bajo 5% de CO2 durante 1 h.
    2. Una hora más tarde, agregue PBS hasta la marca de 15 mL para lavar los esplenocitos, centrifugar a 800 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante, resuspender los esplenocitos con 1 mL de medio de cultivo de linfocitos y contar el número de células. Las células APC se han preparado con éxito.
    3. Después de las 4 h de incubación de las células (como en el paso 2.2.3), recoja las células T CD4+ transducidas en tubos de 1,5 ml y centrifugue a 800 x g durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células infectadas en 600 μL de PBS para lavar. Centrifugar a 800 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
    4. Coloque 0,5 × 106 linfocitos T CD4+ transducidos en 1 mL de medio de cultivo de linfocitos con 1,5 x 106 linfocitos APC en un pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Suplementar con 2 μg/mL de anti-CD3e, 2 μg/mL de anti-CD28 y cóctel de diferenciación celular Th17, que contiene 10 μg/mL de anti-IFNγ, 10 μg/mL de anti-IL-12/IL23 p40, 10 μg/mL de anti-IL4, 2,5-3 ng/mL de hTGF-β y 20-30 ng/mL de IL-6. Cultivo de células durante 2 días.
    5. Recoja cada pocillo de células en los tubos de 1,5 ml, centrifugue a 800 x g durante 5 minutos y deseche el sobrenadante. Refresque 1 mL nuevo del medio de cultivo de linfocitos solo con 3 ng/mL de TGF-β y 30 ng/mL de IL-6. Coloque las células en un nuevo pocillo de placa de cultivo celular de 24 pocillos durante un período de cultivo prolongado. Analice las celdas 2 días después del cambio de medio.

3. Evaluación de la eficiencia de la transducción y los resultados de diferenciación

  1. Después de dos días de cambio de medio, recoja las células y centrifugue a 800 × g durante 5 min y deseche el sobrenadante. Tratar las células diferenciadas con 50 ng/mL de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), 500 ng/mL de ionomicina y 5 μg/mL de brefeldina A en 500 μL de medio de cultivo de linfocitos en un nuevo pocillo de placa de cultivo celular de 24 pocillos a 37 °C en incubadora durante 4 h. Extraiga la mitad de las células para el análisis de citometría de flujo y lise la otra mitad de las células con tampón de extracción de ARN para el análisis de qPCR.
  2. Para el análisis de citometría de flujo
    1. Recoja las células en tubos de 1,5 ml. Añadir 1 mL de tampón FACS en los tubos y centrifugar a 800 × g durante 5 min para lavar las células.
    2. Vuelva a suspender el pellet celular con la mezcla de anticuerpos fluorescentes (CD4 y colorante de viabilidad fijable en 100 μL de PBS) y tiña las células a 4 °C durante 30 min.
    3. Lave las células con 300 μL de PBS y fíjelas con 300 μL de formaldehído (FA) tamponado con fosfato al 2% a 4 °C durante al menos 60 min.
    4. Una hora más tarde, lavar las células con PBS, volver a suspenderlas con 600 μL de tampón de permeabilización 1x y centrifugar a 800 × g durante 5 min.
    5. Deseche el sobrenadante y la tinción con anti-IL-17A en 100 μL de tampón de permeabilización 1x durante 60 min a temperatura ambiente o 4 °C durante la noche.
    6. Al día siguiente, lavar las células con tampón de permeabilización 1x y volver a suspenderlas en 200 μL de PBS. Análisis de las células por citometría de flujo10. Consulte la sección Resultados representativos.
  3. Para el análisis de qPCR, extraiga el ARN siguiendo las instrucciones del kit de extracción de ARN. Transcriba inversamente el ARN en ADNc para su almacenamiento o posterior análisis de qPCR. El diseño de estos cebadores debe adherirse a los principios generales de diseño de cebadores de qPCR y, al mismo tiempo, dirigirse específicamente a la región que abarca el sitio indel esperado, donde se ha producido la escisión mediada por ARNg. Cualquier reducción en la eficiencia de amplificación o pérdida de señal en este sitio puede servir como un indicador de knockout exitoso. Los cebadores de qPCR son los siguientes:
    Rorc F: TCCACTACGGGGTTATCACCT; R: AGTAGGCCACATTACACTGCT.
    IL17a F: TCAGCGTGTCCAAACACTGAG; R: CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT.

Resultados

En el estudio, clonamos el objetivo de sgRNA a Rorc y secuencias codificantes no dirigidas a sgRNA en el vector pMX-U6-MCS con proteína fluorescente mCherry (Figura 1A,B). La producción de retrovirus se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo descrito en la Figura 2. La transfección se inició el día 0 y la recolección retroviral se produjo el día 2. La eficiencia de la transfección se puede probar mediante la intensidad de fluorescencia de mCherry (Figura 1C). Antes de cosechar el virus, se clasificaron y activaron las células T CD4+ vírgenes. A continuación, estos linfocitos T CD4+ activados se infectaron mediante infección por espín, seguido de la continuación de los pasos de diferenciación descritos. Finalmente, se evaluó la eficiencia de la transducción y los resultados de la diferenciación mediante análisis de citometría de flujo y análisis de qPCR.

La Figura 3 ilustra la estrategia de compuerta aplicada para clasificar las células T CD4+ vírgenes. Después de seleccionar la población celular principal y las células singlete (como se muestra en las dos primeras puertas de la Figura 3), las células FVD-CD4+ se comprimieron para distinguir las células T CD4 en células polarizadas a Th17 de las de las APC. Finalmente, la IL-17A producida por las células T CD4 representa la eficiencia de diferenciación Th17, que indica la eficiencia de knockout. El porcentaje de células mCherry positivas refleja la eficiencia de la infección retroviral, mientras que la eficiencia de knockout se indica por el porcentaje de células IL-17A positivas. Para mejorar la viabilidad celular y minimizar la duración de la clasificación, los esplenocitos se enriquecieron utilizando un kit de aislamiento de células T CD4+ de ratón, lo que resultó en una eficiencia de enriquecimiento superior al 90%.

La eficacia de la infección por retrovirus, indicada por la presencia de células mCherry positivas, suele ser de alrededor del 40% (Figura 4A). Aunque la eficiencia de la infección se puede aumentar a través de la concentración del virus, este enfoque se produce a expensas de una duración experimental prolongada y costos más altos. En nuestros experimentos, las células infectadas cultivadas sin el cóctel de diferenciación celular Th17 sirvieron como control negativo de diferenciación Th17, designado como Th0. Se utilizó un sgRNA no dirigido como control positivo, denominado sgNT. Para la edición de genes, empleamos ARNg dirigido al gen RORγt (sgRNA-Rorc), lo que redujo significativamente la eficiencia de diferenciación de Th17 (Figura 4A). Esta intervención también condujo a una disminución sustancial en los niveles de expresión de Rorc e IL-17a (Figura 4B).

figure-results-1
Figura 1: Ejemplo de sgRNA subclonado en un vector retroviral y eficiencia de transfección. Se utilizó el vector pMX-U6-MCS como construcción inicial. El andamio de ARNg, junto con las secuencias de ARNg (la parte naranja) dirigidas al sitio codificado (A) y al Rorc (B), se insertaron aguas abajo del promotor U6 (la parte verde como sección para la secuenciación con cebadores U6). Las ubicaciones de los cebadores que contienen sgRNA y los sitios de cebadores de secuenciación se indican debajo del vector circular Los nombres completos de las abreviaturas en el plásmido son los siguientes. Abreviaturas: AmpR = resistencia a ampicilina, carbenicilina y antibióticos relacionados; LTR = repetición terminal larga; MMLVψ = señal de empaquetamiento del virus de la leucemia murina de Moloney; gag = gen gag truncado del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV) que carece del codón de inicio. (C) Imágenes microscópicas de mCherry en células Plat-E transfectadas con ADN plasmídico. Barra de escala: 500 px. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Ilustración esquemática del protocolo. El día antes de la transfección, la densidad de las células Plat-E debe ajustarse a un rango adecuado. Al día siguiente (día 0), realice la transfección y reemplace el medio 12 h después. El día 1, clasifique y active las células T ingenuas de ratones que expresan Cas9. Posteriormente (día 2), recoja el sobrenadante de cultivo que contiene el virus y combínelo con las células T activadas para la transducción retroviral. A continuación, las células infectadas se diferencian en células Th17 durante 3-4 días y se analizan mediante FACS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Estrategia de compuerta para clasificar las células T vírgenes CD4. La tinción de superficie se realizó en las células T CD4 enriquecidas para marcar CD4, CD25, CD44 y CD62L. La estrategia de compuerta empleada fue la siguiente: inicialmente, los linfocitos se comprimieron en función de los parámetros de dispersión directa y dispersión lateral. Posteriormente, se identificaron células individuales utilizando FSC-H y FSC-W. A continuación, se comprimieron los linfocitos CD4+CD25- para excluir los linfocitos T reguladores (Tregs). Por último, se identificaron los linfocitos T CD44 CD62Lbajo y alto ingenuo. Las células T CD4+ vírgenes aisladas se recolectaron para experimentos posteriores. Abreviaturas: FSC = dispersión directa; SSC = dispersión lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 4: Ejemplo de transducción exitosa de células T activadas y diferenciación Th17. (A) La eficiencia de diferenciación de Th17 se reduce significativamente, lo que es editado por el ARNg RORγt (activación en mCherry + IL-17a + población). (B) Expresión relativa de ARNm de Rorγt e IL-17a en Th0 (células infectadas cultivadas sin cóctel de diferenciación celular Th17), sgNT (sgRNA no dirigido) y sgRNA-Rorc (sgRNA dirigido al gen RORγt ). p < 0,001 (prueba t de Student de dos colas no apareada; los datos se presentan como media ± SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Componentes de la reacción PCRPrograma de PCR
ComponenteVolumen (μL)PasoTemp.HoraCiclo
2 × Phanta Mix (Tinte Plus)25195 ºC3 minutos1
ddH2020295 ºC15 s
Imprimación-F (10 μM)2356 ºC15 s
Imprimación-R (10 μM)2472 ºC5 min 30 sIr al paso 2
35 ×
Plantilla (~30 ng)1572 ºC5 minutos1
612 ºC∞

Tabla 1: Componentes de reacción de PCR y programa de PCR para la construcción de vectores de ARNg.

Discusión

La edición del genoma CRISPR/Cas9 a través de la administración retroviral es un método sólido para explorar las funciones de las células T auxiliares. Este protocolo ofrece un enfoque rápido y eficaz para examinar genes específicos implicados en la diferenciación y función de Th17. Se deben seguir cuidadosamente varios pasos críticos para lograr resultados óptimos. En primer lugar, para mejorar la eficiencia de la eliminación de genes, los ARNg deben seleccionarse cuidadosamente. Dado el riesgo de efectos fuera del objetivo en la edición génica CRISPR/Cas9, es prudente elegir 2-3 ARNg con puntuaciones altas, como se identifica en la sección 1.1.1 del protocolo, para experimentos posteriores11,12. En segundo lugar, un título viral alto es esencial para una infección exitosa. El mantenimiento adecuado de la línea de celdas de envasado Plat-E es crucial. Las células deben alcanzar aproximadamente el 80% de confluencia el día de la transfección, ya que tanto el número de células inadecuado como el excesivo comprometerán los títulos del virus. Si las células Plat-E no están disponibles, la co-transfección de células 293T de riñón embrionario humano con el vector pCL-Eco también puede producir títulos virales altos 13,14. Mantener una alta concentración de plásmidos de al menos 1 μg/μL es importante para lograr un alto título de virus. Es esencial cosechar la suspensión del virus antes de que se vuelva amarillo limón, ya que el virus exhibe sensibilidad a la alteración del pH. Por lo tanto, el pH del medio de cultivo debe regularse cuidadosamente dentro de un rango apropiado. El virus debe almacenarse a -80 ºC para mantener su integridad y protegerse de los repetidos ciclos de congelación-descongelación15.

En tercer lugar, para lograr una alta eficiencia de infección, las células primarias deben activarse adecuadamente. La activación celular inadecuada compromete significativamente la eficiencia de la infección viral16. Antes de la infección viral, el estado de activación de las células T debe confirmarse microscópicamente, ya que las células activadas exhiben un tamaño notablemente mayor que las células inactivadas. Vale la pena señalar que nuestro protocolo de diferenciación Th17 se ha optimizado específicamente para ratones C57BL/6, por lo que pueden ser necesarios ajustes para otras cepas de ratones. En cuarto lugar, para lograr los resultados deseados de diferenciación de Th17, es crucial mantener las condiciones celulares óptimas. Durante la infección por espín, es importante colocar las células en los pocillos cerca del centro para ayudar a mantener la viabilidad celular. Después de la infección por espín, la incubación de las células durante 4 h (paso del protocolo 2.2.4) es crucial para su recuperación. Además, al transferir células, es importante un pipeteo suave para mantener la viabilidad de las células. Diferentes condiciones de estimulación pueden afectar la diferenciación de Th17. En este experimento, la incorporación de células presentadoras de antígenos en el sistema de diferenciación mejoró significativamente la eficiencia de diferenciación en comparación con la estimulación unida a placas anti-CD3e y anti-CD28. Por último, es crucial garantizar que todas las citocinas utilizadas sigan funcionando durante el transporte y el almacenamiento. Las citocinas pueden perder rápidamente la estabilidad en ciclos repetidos de congelación y descongelación o en soluciones de reconstitución inadecuadas. El tratamiento en frío y alícuotas iguales son necesarios para que las citocinas conserven sus funciones a lo largo de los procedimientos.

Este protocolo para generar células Th17 knockout de genes específicos tiene varias limitaciones. En primer lugar, es difícil lograr una eficiencia de transducción completa en las células T primarias de ratón. Es posible que algunas células no sufran la eliminación génica prevista durante la diferenciación Th17. En segundo lugar, las células T primarias tienen una vida útil limitada in vitro. Después de aproximadamente una semana, estas células tienden a morir, lo que plantea desafíos para experimentos posteriores. En tercer lugar, nuestro protocolo se basa en ratones transgénicos Cas9 y cuando intentamos incorporar la secuencia Cas9 en el plásmido central, esto resultó en una reducción significativa de los títulos virales. Por último, observamos que este protocolo no es adecuado para analizar las funciones de los genes implicados en las primeras etapas de la activación ingenua de los linfocitos T CD4+ , ya que dichas células deben ser activadas antes de la transducción retroviral.

A pesar de sus limitaciones, este protocolo se ha aplicado con éxito en diversos estudios, facilitando la exploración de reguladores genéticos clave implicados en la diferenciación de Th17. Permite evaluar los cambios en la eficiencia de diferenciación de Th17 después de la eliminación de genes diana en células T activadas. Además, este protocolo es adecuado para evaluar otros aspectos de la función de las células Th17, como la proliferación celular, la supervivencia, la estabilidad del factor de transcripción, la secreción de citocinas y las respuestas inmunitarias. Además, nuestro laboratorio ha demostrado su eficacia en la transducción retroviral y la diferenciación de células T reguladoras inducidas (iTregs). Aunque no se han probado todos los tipos de células T, este protocolo también puede ser aplicable en otros subconjuntos, como las células T Th1, Th2 y CD8+ . En general, esta técnica sirve como una herramienta valiosa para llevar a cabo la eliminación de genes en las células inmunitarias, lo que ofrece un potencial significativo para descubrir señales genéticas críticas que regulan las funciones inmunitarias.

Divulgaciones

Los autores afirman que no hay conflictos de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a Dou Liu, Dongliang Xu y Pinpin Hou de las instalaciones centrales del Instituto de Inmunoterapia de Shanghái por su apoyo en la utilización de los instrumentos. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China Grants 31930038, U21A20199, 32100718 y 32350007 (a Linrong Lu); 32100718 (a Xuexiao Jin); Equipo de investigación innovador de universidades locales de alto nivel en Shanghái SHSMU-ZLCX 20211600 (a Linrong Lu); Programa Interno de Incubación RJTJ24-QN-076 (a Zejin Cui). La Figura 2 se preparó con Figdraw.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,5 M EDTA (pH 8,0)SolarbioE1170
Placa de cultivo de células y tejidos de 100 mmBIOFILTCD010100
1 M Hepes (Ácido libre, estéril)SolarbioH1090
placa de cultivo celular y tisular de 24 pocillosNEST702002
placa de cultivo celular y tisular de 48 pocillosNEST748002
Brefeldin Una solución (1.000x)BioLegend420601
Brilliant Violet 650 anti-ratón Anticuerpo CD4 (RM4-5)BioLegend100546
Anticuerpo monoclonal CD3e (145-2C11), grado funcional, eBioscienceInvitrogen16-0031-82
Anticuerpo monoclonal CD44 (IM7), PE, eBioscienceInvitrogen12-0441-83
Anticuerpo monoclonal CD62L (L-selectina) (MEL-14), APC, eBioscienceInvitrogen17-0621-82 
Contador de célulasNexcelom BioscienceCellometer Auto 2000
Cell Strainer (40 μ m)biosharpBS-40-CS
Filtro de células (70 μ m)biosharpBS-70-CS
Centrífuga Eppendorf5425  Centrífuga R
 eppendorf5810 R
ChamQ SYBR Color qPCR Master MixVazymeQ411-02
ClonExpress II Kit de clonación de un solo pasoVazymeC112
DH5α Células competentesSangon BiotechB528413
Miniprep de ARN de zoldirecto ZYMO RESEARCHR2050
DMEM MedioBasalMediaL110KJ
EasySep Kit de aislamiento de células T CD4+ para ratonesSTEMCELL19852
eBioscience Tinte de viabilidad fijable eFluor 660Invitrogen65-0864-18
Kit de mini plásmido EndoFree IITIANGENDP118-02
ExFect Transfection ReagentVazymeT101-01
Suero fetal bovino, Premium PlusGibcoA5669701
FITC anticuerpo IL-17A antiratón (TC11-18H10.1)BioLegend506907
Solución de formaldehídoMacklinF864792
HiScript IV RT SuperMix para qPCR?+limpiador de ADNg?VazymeR423-01
IonomicinaBeyotimeS1672
Mitomicina CMaokang Biotechnology7/7/1950
Ratón GRCm38NCBIRefSeq v.108.20200622
OPTI-MEM Medio de suero reducidoGibco31985070medio de suero reducido
Pacific Blue anti-ratón Anticuerpo CD4 (RM4-5)BioLegend
PE/Cyanine7 anticuerpo CD25 de ratón (PC61)BioLegend102015
PE/Cyanine7 anticuerpo CD4 de ratón (GK1.5)BioLegend100422
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)Gibco15140122
PMA/TPA BeyotimeS1819
R26-CAG-Cas9 ratones Centro de Organismos Modelo de ShangháiCat. Nº NM-KI-00120
Proteína recombinante humana TGF-beta 1 (expresada por CHO), CFR& D Systems11409-BH
Recombinante Murine IL-6PeproTech216-16
Analizador de células de investigaciónBD BiosciencesBD LSRFortessa
Clasificador de células de investigaciónSONYMA900
RPMI 1640 MedioBasalMediaL210KJ
Termociclador SimpliAmp Sistema de PCRApplied BiosystemsA24811
Solución de piruvato de sodio (100 mM)Sigma-AldrichS8636
Ultra-LEAF Anticuerpo CD28 anti-ratón purificado (37.51)BioLegend102121
Ultra-LEAF Purificado anti-ratón IFN-γ Anticuerpo (XMG1.2)BioLegend505847
Ultra-LEAF Anticuerpo IL-4 purificado contra el ratón (11B11)BioLegend504135
Anticuerpo anti-ratón IL-12/IL-23 p40 purificado Ultra-LEAF (C17.8)BioLegend505309
β-Mercaptoetanol (50 mM)SolarbioM8211
100531

Referencias

  1. Wu, B., Wan, Y. Molecular control of pathogenic th17 cells in autoimmune diseases. Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).
  2. Dong, C. Th 17 cells in development:: An updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
  3. Patel, D. D., Kuchroo, V. K. Th17 cell pathway in human immunity: Lessons from genetics and therapeutic interventions. Immunity. 43 (6), 1040-1051 (2015).
  4. Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic Th17 cells in the absence of TGF-β signalling. Nature. 467 (7318), 967-U144 (2010).
  5. Lee, Y., et al. Induction and molecular signature of pathogenic th17 cells. Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).
  6. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  7. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  8. Doench, J. G., et al. Optimized sgrna design to maximize activity and minimize off-target effects of crispr-cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  9. Holst, J., et al. Generation of t-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1 (1), 406-417 (2006).
  10. Ordonez, P., Bishop, K. N., Stoye, J. P., Groom, H. C. T. Analysis of SAMHD1 restriction by flow cytometry in human myeloid U937 cells. J Vis Exp. (172), (2021).
  11. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).
  12. Bae, S., Park, J., Kim, J. -S. Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of cas9 rna-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  13. Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral transduction of helper T cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function. J Vis Exp. (117), e54698(2016).
  14. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  15. Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: Size matters. BMC Res Notes. 9, 312-312 (2016).
  16. Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J Vis Exp. (44), 2307(2010).

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Transducci n retroviralc lulas T CD4citometr a de flujopolarizaci n in vitroROR gamma TARN gu a nicoregulaci n inmunitaria
Segmentación génica retroviral mediada por CRISPR/Cas9 para el estudio de la diferenciación de Th17 in vitro
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.