Identificación guiada por bioensayos de productos naturales para el biocontrol mediante cromatografía en capa fina-Bioautografía directa

Los patógenos agrícolas fúngicos causan pérdidas significativas en la calidad y el rendimiento de los cultivos en todo el mundo, lo que contribuye a los desafíos económicos y de suministro de un sistema mundial de producción de alimentos estable ^1,2. El daño de los patógenos puede prevenirse mediante el mejoramiento de cultivares resistentes a la infección y el uso de sistemas integrados de manejo de cultivos, incluidas las rotaciones de cultivos y las prácticas de manejo de la tierra para suprimir la proliferación de patógenos ^3,4. Aunque estos métodos reducen el daño a los cultivos, los pesticidas químicos generalmente se usan en conjunto para matar activamente las estructuras reproductivas de hongos en el campo y prevenir aún más el daño y la reducción del rendimiento. Aunque efectivo, el uso de plaguicidas químicos tiene muchos inconvenientes, incluido el daño a los ecosistemas circundantes, la disminución de la fertilidad del suelo, los riesgos asociados para la salud humana y el desarrollo de resistencia a patógenos, lo que hace que se requieran dosis más altas de pesticidas cada año ^5,6,7.

Los productos de control de plagas y patógenos basados en microbios se han considerado durante mucho tiempo como posibles alternativas o complementos a los plaguicidas sintéticos. Desde principios de 1900, Bacillus thuringiensis ha sido ampliamente utilizado para controlar plagas y patógenos agrícolas como tratamiento de semillas, como pulverización foliar y en el tratamiento directo del suelo⁸. Dichos productos han sido denominados bioplaguicidas y se caracterizan como microorganismos naturales o bioquímicos que pueden matar, suprimir o reducir el vigor de una plaga o patógeno objetivo. Los bioplaguicidas pueden controlar el crecimiento de un patógeno a través de varios mecanismos, pero lo más común es que lo hagan a través de la secreción de metabolitos secundarios⁹. Los metabolitos secundarios, a menudo denominados productos naturales, no están involucrados en el metabolismo primario, pero se producen como una ventaja evolutiva para superar a otros microorganismos¹⁰.

Los bioplaguicidas ofrecen muchas ventajas sobre sus homólogos sintéticos. Presentan un riesgo de baja toxicidad para el medio ambiente, la fauna y los seres humanos en comparación con los productos sintéticos de control de plagas ^9,10. Dado que la mayoría de los bioplaguicidas han existido naturalmente en el medio ambiente durante milenios, existen vías de biodegradación de los metabolitos microbianos en el medio ambiente, lo que limita la posibilidad de contaminación del suelo o del ecosistema y reduce los tiempos de residencia que contribuyen a que los plaguicidas sintéticos sean tan destructivos para el medio ambiente¹¹. Además, muchos bioplaguicidas utilizados para mitigar la infección por patógenos también exhiben propiedades promotoras del crecimiento de las plantas, lo que puede aumentar la biodisponibilidad de nutrientes e inducir resistencia sistémica de las plantas¹².

Lo más común es que los bioplaguicidas se apliquen en forma de inóculo microbiano y las NP sean secretadas por microorganismos vivos in situ^12,13. En tal caso, identificar la fuente de la actividad de un bioplaguicida es de gran valor. De este modo, se obtiene información sobre el mecanismo de acción del biopesticida, se ayuda a construir un caso para la protección de un microorganismo con una patente y puede tener un impacto científico significativo si sus estructuras son novedosas. Sin embargo, lo más importante es que la identificación de la fuente bioactiva informa sobre las posibilidades de formulación de un producto bioplaguicida posterior. Si la NP en sí misma es activa, se puede utilizar el microorganismo como fábrica de biomoléculas para la producción de biopesticidas a gran escala. Además, muchas NP que se han explorado para el control biológico también tienen aplicaciones potenciales en la medicina humana, lo que las hace aún más valiosas económicamente⁸.

Los ensayos de cromatografía en capa fina-bioautografía directa (TLC-DB) son un método económico y sencillo para el aislamiento e identificación de metabolitos bioplaguidas guiados por bioactividad. Aunque la técnica se utiliza comúnmente para separar las pruebas de bioactividad de los fitoquímicos de los extractos crudos de plantas, también tiene un gran potencial para el análisis de extractos microbianos¹⁴. TLC proporciona una separación rápida y económica de NP en un extracto microbiano crudo, y después de recubrirlo con una suspensión de patógenos medios, las zonas que contienen metabolitos activos se visualizan fácilmente. Esas zonas pueden extraerse de la placa y extraerse para su análisis químico mediante cromatografía líquida de ultra alta resolución junto con espectrometría de masas (UPLC-MS) para identificar metabolitos conocidos. Los metabolitos que no coinciden con los compuestos previamente reportados pueden ser aislados en mayores cantidades a través de cromatografía líquida para someterse a estudios de elucidación de estructuras utilizando técnicas como la espectroscopia de resonancia magnética nuclear y la cristalografía de rayos^{X 15}.

En este artículo se describe un sistema modelo para el descubrimiento e identificación de NPs bioplaguicidas utilizando TLC-DB con Bacillus spp. y el patógeno agrícola Sclerotinia sclerotiorum. La Figura 1 proporciona una descripción general esquemática del procedimiento TLC-DB.

Figura 1: Resumen esquemático de los pasos 4-7 del procedimiento de TLC-DB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Selección de los candidatos a biocontrol microbiano

1. Mediante ensayos de placa de competición, seleccione aislados microbianos que muestren antagonismo contra el patógeno de interés.
   NOTA: Se seleccionaron nueve aislados de Bacillus que exhibieron antagonismo contra S. sclerotiorum , incluyendo las especies de Bacillus atrophaeus, mojavensis y subtilis , para demostrar este protocolo.

2. Preparación de los medios

1. Preparar agar patata dextrosa (PDA) disolviendo 39 g de medio por litro de agua.
2. Prepare Pseudomonas F agar añadiendo 45 g de medio por litro de agua.
3. Preparar caldo de patata dextrosa (PDB) con agar al 1% añadiendo 24 g de medio, y 0,24 g de agar por litro de agua.
4. Prepare el caldo de levadura-glucosa-manganeso (YGM). Cree una solución tampón que consista en 2,5 g de KH₂PO₄ y 2,5 g de K₂HPO₄ en 100 ml de agua, y una solución salina que consista en 0,58 g de MnSO₄. H₂0, 0,5 g de NaCl y 0,05 g de FeSO 4,7H₂0 en 100 mL de agua.
   1. A continuación, agregue 1 g de extracto de levadura, 1,25 g de dextrosa, 400 mL de agua, 5 mL de la solución tampón, 5 mL de la solución salina y 90 mL de agua para asegurarse de que las sales metálicas no precipiten en la solución.
5. Esterilizar el medio en autoclave, verter el agar en placas de Petri de 100 x 15 mm y dejar enfriar todo a temperatura ambiente antes de usarlo.

3. Preparación de patógenos

1. Cultivar cinco placas de Sclerotinia sclerotiorum en PDA (preparado en el paso 2.1) e incubar a 25 °C durante 3 días.

4. Preparación del extracto de producto natural

1. Cultive cada aislado bacteriano en agar Pseudomonas F (preparado en el paso 2.2) y crezca hasta que se observen colonias individuales.
2. Subcultive colonias bacterianas individuales en 25 mL de medio YGM en tubos de centrífuga o cultivo e incube agitando durante 3 días.
3. Transfiera 5 mL de alícuotas de cada extracto a 1 L de YGM e incube en las mismas condiciones durante otros 3 días.
4. Centrifugar cada cultivo a 3000 x g durante 15 min a 25 °C para granular las células.
5. Decantar y lavar el sobrenadante tres veces con acetato de etilo para extraer los metabolitos del medio de cultivo.
6. Combine y seque la capa de acetato de etilo de cada uno mediante evaporación rotativa.
7. Vuelva a disolver el extracto en un mínimo de metanol, transfiéralo a un pequeño vial de centelleo y séquelo nuevamente por evaporación rotativa.
   NOTA: Si el extracto se seca hasta convertirse en un material aceitoso o resinoso, liofililice el material para obtener un polvo seco que se pueda pesar con precisión.

5. Preparación de la placa TLC

1. Prepara el plato TLC de 20 cm x 20 cm dibujando una línea a 2 cm de la parte inferior y a 2 cm de la parte superior del plato. En la línea inferior, coloque nueve puntos a 2 cm de distancia. Encima de la línea superior, coloque cuatro puntos a 4 cm de distancia.
2. Disolver 5 mg de cada extracto en 15 μL de metanol y aplicar 5 μL de cada extracto en los nueve puntos marcados en la línea inferior con una pipeta. Deje que cada mancha de extracto se seque en la placa TLC y aplique otras 5 μL de alícuota en la misma mancha. Repita hasta que todo el material esté cargado en la placa TLC.
3. Revele la placa TLC en un tanque de revelado utilizando una solución 1:2 de diclorometano y metanol hasta que el solvente alcance la línea marcada a 2 cm de la parte superior de la placa (aproximadamente 45 min).
4. Una vez desarrollado, retire la placa TLC y aplique una serie de controles positivos en los cuatro puntos marcados sobre la línea de disolvente. Se utilizan cuatro concentraciones del mismo control. Para S. scl., 0,5 μg/mL, 5 μg/mL, 50 μg/mL y 500 μg/mL de higromicina B son controles positivos.
5. Antes de que todo el solvente se evapore de la placa, colóquela en una caja de placa TLC esterilizada con etanol.

6. Ensayo de bioautografía directa

1. Esterilizar en autoclave los materiales que se utilizarán en el ensayo (componentes de vidrio del pulverizador de cromatografía, espátula metálica, cuatro hojas de papel toalla, celulosa o papel de filtro, agua y medios) en un vaso de precipitados grande cubierto con papel de aluminio.
   NOTA: Los materiales de papel (toalla de papel, papel de celulosa) deben envolverse en papel de aluminio para evitar que se mojen en el autoclave.
2. Conecte una fuente de aire, un manómetro y un rociador de cromatografía utilizando un tubo de PTFE esterilizado con etanol. Conecte un filtro HEPA entre el pulverizador de cromatografía y el manómetro.
3. Recoja la estera micelial de las cinco placas de patógenos con la espátula de metal estéril en un tubo de centrífuga de 50 ml con una espátula estéril.
   NOTA: Use un pequeño volumen de caldo líquido para ayudar a desalojar los micelios si es necesario, y transfiéralo con una pipeta estéril.
4. Agregue 25 mL de PDB modificado con agar y perlas de vidrio estéril al tubo de centrífuga de 50 mL y vórtice durante 5 min para romper la estera micelial.
5. Transfiera la suspensión micelial a un rociador de cromatografía usando una jeringa estéril con una punta de aguja para asegurarse de que los trozos grandes de micelio no obstruyan el rociador de cromatografía.
6. Coloque las placas TLC desarrolladas anteriormente sobre toallas de papel estériles en una campana de flujo laminar para reducir el contacto de las manos con la placa mientras aplica la suspensión de medios.
7. Aumente la presión de aire a aproximadamente 4 bares y aplique tres capas de la suspensión a la placa TLC, permitiendo que la placa se seque completamente entre aplicaciones.
   NOTA: Se encontró que tres capas es la cantidad óptima. Menos que esto, y el patógeno no tiene suficientes medios para crecer. Más que esto, el medio es demasiado espeso, lo que puede no permitir el contacto de patógenos con metabolitos activos.
8. Agregue 500 ml de agua estéril en una caja de plástico esterilizada y coloque hojas de celulosa dobladas esterilizadas o papel de filtro en cada lado para retener la humedad.
9. Coloque la placa de ensayo completa en cuatro placas de Petri vacías en la caja.
10. Incube el ensayo durante 3 días a 1 semana o hasta que una capa uniforme de micelio crezca uniformemente a través de la placa TLC, excepto alrededor de los controles positivos y la zona de inhibición (ZOI).

7. Análisis de espectrometría de masas por cromatografía líquida

1. Tome una imagen del ensayo completado utilizando fotografía.
2. Calcule el factor de retención para cada zona de inhibición dividiendo la distancia desde la línea inferior hasta la ZOI por la distancia desde la línea inferior hasta la línea superior.
3. Raspe la sílice de las zonas de inhibición y colóquela en tubos de microcentrífuga.
4. Agregue 500 μL de metanol a cada tubo y vórtice para extraer los metabolitos de la sílice.
5. Centrifugar a 8.500 x g a 20 °C durante 10 min y transferir el sobrenadante a un vial pequeño.
6. Evaporar hasta la sequedad por evaporación rotativa o bajo una corriente de nitrógeno.
7. Vuelva a suspender el extracto en 50 μL de metanol en un vial de LC.
8. Analizar los metabolitos en la zona de inhibición por LC-MS y compararlos con los metabolitos en el extracto crudo para determinar qué metabolitos en el extracto crudo son responsables de la inhibición del patógeno¹⁶.
9. Utilizando el género y la especie del microorganismo fuente y las masas identificadas en la ZOI, busque en la bibliografía y en las bases de datos pertinentes, como Antibase y el Dictionary of Natural Products, para identificar los metabolitos.

Tras la separación de los extractos microbianos por TLC, los metabolitos deben dispersarse verticalmente a lo largo de la placa TLC. Bajo luz visible, puede ser difícil ver metabolitos que no se absorben en el rango de luz visible. Por lo tanto, las imágenes bajo luz ultravioleta pueden ayudar a ver la separación de metabolitos, como se ve en la Figura 2A, B. Después del período de incubación, el patógeno debe parecer crecer uniformemente en toda la placa, excepto en los controles positivos y las zonas de inhibición donde residen los metabolitos activos, como se muestra en la Figura 2C.

Figura 2: Separación de extractos microbianos por TLC. (A) Placa TLC desarrollada que contiene nueve extractos de Bacillus fotografiados bajo luz visible y (B) bajo luz ultravioleta de 320 nm antes de la aplicación de inóculo fúngico. (C) Ensayo de bioautografía completado con crecimiento de patógenos observado en toda la placa, excepto donde el crecimiento se inhibe alrededor de los controles positivos y ZOI de cada extracto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los metabolitos extraídos de las zonas de inhibición se analizan mediante LC-MS y se comparan con el extracto crudo para determinar las NPs responsables del antagonismo contra el patógeno. Los metabolitos coincidentes deben tener el mismo tiempo de retención y las mismas especies de iones moleculares para que se consideren compatibles. Una vez identificados los metabolitos activos, el cultivo bacteriano puede cultivarse a granel para aislar metabolitos activos de interés para el estudio estructural o biológico.

La Dra. Susan Boyetchko falleció antes de la presentación de este trabajo (8 de febrero de 2023). Todos los demás autores han declarado no tener conflictos de intereses.