Protocolo optimizado para rollos suizos intestinales y tinción inmunofluorescente de tejido incluido en parafina

Resumen

El intestino es vital para la digestión y la absorción. Cada región (duodeno, yeyuno, íleon, colon) cumple funciones distintas debido a estructuras celulares únicas. El estudio de la fisiología intestinal exige un análisis meticuloso de los tejidos. Este protocolo describe la fijación y el procesamiento de tejidos mediante la técnica de rollo suizo, lo que garantiza una inmunotinción precisa a través de la preservación y orientación adecuadas de los tejidos.

Resumen

El intestino es un órgano complejo compuesto por el intestino delgado y el intestino grueso. El intestino delgado se puede dividir a su vez en duodeno, yeyuno e íleon. Cada región anatómica del intestino tiene una función única que se refleja en las diferencias en la estructura celular. La investigación de los cambios en el intestino requiere un análisis en profundidad de las diferentes regiones de los tejidos y las alteraciones celulares. Para estudiar el intestino y visualizar grandes trozos de tejido, los investigadores suelen utilizar una técnica conocida como rollos suizos intestinales. En esta técnica, el intestino se divide en cada región anatómica y se fija en una orientación plana. Luego, el tejido se enrolla cuidadosamente y se procesa para su inclusión en parafina. La fijación y orientación adecuadas del tejido es una técnica de laboratorio que a menudo se pasa por alto, pero es de vital importancia para el análisis posterior. Además, el laminado inadecuado del tejido intestinal puede dañar el frágil epitelio intestinal, lo que conduce a una mala calidad del tejido para la inmunotinción. Asegurar un tejido bien fijado y orientado correctamente con estructuras celulares intactas es un paso crucial que garantiza una visualización óptima de las células intestinales. Presentamos un método rentable y sencillo para hacer panecillos suizos para incluir todas las secciones del intestino en un solo bloque incrustado en parafina. También describimos la tinción optimizada con inmunofluorescencia del tejido intestinal para estudiar diversos aspectos del epitelio intestinal. El siguiente protocolo proporciona a los investigadores una guía completa para obtener imágenes de inmunofluorescencia de alta calidad a través de la fijación de tejido intestinal, la técnica de rollo suizo y la inmunotinción. El empleo de estos enfoques refinados preserva la intrincada morfología del epitelio intestinal y fomenta una comprensión más profunda de la fisiología y la patobiología intestinales.

Introducción

La arquitectura celular del intestino plantea un desafío único para mantener su integridad estructural cuando el tejido intestinal se preserva para la inmunotinción. El intestino delgado está formado por estructuras alargadas en forma de dedos conocidas como vellosidades¹. Estas vellosidades a menudo se deforman durante los procesos de incrustación. Asegurarse de que los investigadores dispongan de técnicas para incrustar correctamente los intestinos con el fin de lograr secciones transversales, lo que permite la visualización de todas las regiones del intestino, así como de las capas que componen el intestino (es decir, la muscular propia, la mucosa y la serosa), es crucial para un análisis experimental sólido². La fijación inadecuada, la fijación excesiva y el manejo inadecuado de los tejidos comprometerán la integridad del tejido, lo que provocará daños inadvertidos en el epitelio intestinal ^3,4. El daño del epitelio intestinal durante estos pasos puede disminuir significativamente la calidad de los análisis posteriores, como la inmunofluorescencia, independientemente de la eficacia de los protocolos de inmunohistoquímica y de los anticuerpos empleados.

La inmunotinción, al igual que la fijación adecuada de los tejidos, es una parte importante de la investigación biomédica. Cuando se hace bien, la inmunotinción puede iluminar aspectos previamente desconocidos de la estructura y función celular. La tinción con inmunofluorescencia de secciones de parafina puede ser un desafío debido a las modificaciones fisicoquímicas resultantes del proceso de fijación e inclusión de parafina⁵. La fijación y la inclusión de parafina dan como resultado un enmascaramiento de antígenos que puede interferir con la inmunofluorescencia, la detección de epítopos de interés⁶. La fijación tardía puede inducir la degradación proteolítica, lo que resulta en una tinción debilitada o ausente de los epítopos críticos⁷. Además, los anticuerpos suelen ser imprecisos con altos niveles de antecedentes. Los protocolos de inmunotinción que promueven la unión consistente y específica de anticuerpos y una alta relación señal-ruido pueden proporcionar información valiosa para los investigadores.

Aquí, proporcionamos un protocolo integral diseñado para obtener imágenes de inmunofluorescencia de alta calidad a través de la fijación de tejido intestinal, la preparación de Swiss roll⁸ y la inmunotinción. Haciendo hincapié en las directrices para preservar la integridad del intestino, el protocolo tiene como objetivo proporcionar a los investigadores una metodología sólida para mejorar la calidad y la fiabilidad de los estudios de imágenes de inmunofluorescencia. También hemos buscado utilizar recursos rentables, incluido el papel de filtro y la recuperación casera de antígenos, soluciones de bloqueo y diluyentes de anticuerpos para hacer que el protocolo sea más accesible para los laboratorios que pueden tener fondos restringidos. Al igual que con todos los protocolos experimentales, los investigadores deben optimizar el protocolo actual en función de su enfoque experimental y las áreas de interés.

Protocolo

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Carolina del Sur aprobó todo el cuidado, mantenimiento y tratamiento de los animales. Se recolectó tejido intestinal de ratones C57BL/6J adultos (machos y hembras de 3 a 5 meses de edad, con un peso aproximado de 30 g) para su uso en el presente estudio.

1. Fijación del tejido intestinal

1. Diseccione cuidadosamente todo el intestino de un ratón sacrificado y colóquelo en un bote de pesaje o en una placa de Petri que contenga solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2. Retire los intestinos del PBS y use unas tijeras para eliminar suavemente el exceso de grasa y tejido conectivo. Cortar el tejido conectivo ayuda a que el tejido quede plano durante los pasos subsiguientes.
3. Divida el intestino en segmentos individuales con unas tijeras (es decir, duodeno, yeyuno, íleon, ciego y colon). Divida los segmentos en función de las características anatómicas y/o la longitud, siendo aproximadamente el 13% de la longitud intestinal el duodeno, el 58% el yeyuno, el 8% el íleon, el 6% el ciego y el colon el 15%⁹. El duodeno sigue al estómago y el íleon es la sección terminal del intestino delgado inmediatamente antes del ciego.
4. Libera el colon cortando donde se une al ciego con unas tijeras. Coloque el duodeno, el yeyuno, el íleon y el colon en el bote de pesaje o en la placa de Petri de PBS. Deseche el ciego o fíjelo de acuerdo con otros métodos publicados¹⁰.
5. Conecte una punta de pipeta P200 a una jeringa de 10 ml cortando el extremo grande de la punta con una cuchilla de afeitar. Llene la jeringa con PBS.
6. Inserte la punta de la jeringa en la abertura de un segmento intestinal con pinzas. Utilice las pinzas para sujetar el segmento intestinal en la jeringa y enjuague suavemente a una velocidad de ~50 μL/s para eliminar el contenido intestinal. Recoja el contenido intestinal en un bote de pesaje vacío o en una placa de Petri.
7. Coloque el segmento intestinal húmedo en línea recta sobre una tira de papel de filtro de celulosa etiquetado en seco (consulte la tabla de materiales). Asegúrese de que el segmento intestinal esté lo suficientemente húmedo como para adherirse correctamente al papel de filtro seco. Etiquete el papel de filtro con la información del número de ratón, genotipo, grupo experimental, etc. con un lápiz.
   NOTA: El uso de un bolígrafo para etiquetar el papel de filtro puede resultar en la pérdida de etiquetas durante la fijación.
8. Use tijeras de disección para cortar el intestino longitudinalmente a lo largo de la línea mesentérica. Corta ~5 mm a la vez, usando el borde inferior de las tijeras o un par de pinzas para colocar el tejido cortado plano sobre el papel de filtro. Continúe hasta que toda la sección del intestino esté cortada y colocada plana sobre el papel de filtro. Ten cuidado de cortar el intestino en una línea lo más recta posible, ya que esto hará que sea más fácil enrollar el tejido.
   NOTA: Se pueden usar tijeras de punta esférica durante este paso para evitar daños en los tejidos.
9. Coloque otro trozo de papel de filtro encima del segmento intestinal. Asegúrese de que el papel de filtro se intercale en el segmento intestinal, evitando que el intestino se enrosque o pierda su forma aplanada durante la fijación.
10. Engrapa los bordes del papel de filtro para asegurar el pañuelo en su lugar. No grapen el pañuelo. Coloque suficientes grapas alrededor del pañuelo para evitar que el pañuelo se desprenda del papel de filtro mientras se fija.
11. Repita los pasos 1.5-1.10 para cada uno de los segmentos intestinales (duodeno, yeyuno, íleon y colon).
12. Sumerja los tejidos en formol tamponado normal al 10% (o fijador de elección como paraformaldehído al 4%, fijador de Carnoy, etc.) durante la noche a 4 °C.
    PRECAUCIÓN: Asegúrese de usar el equipo de protección personal correcto, ya que los fijadores como el formalina son tóxicos.

2. Laminación y procesamiento de tejido intestinal

PRECAUCIÓN: Realice los pasos 2.1-2.6 en una campana ventilada.

1. Retire con cuidado la pieza superior de papel de filtro (la que toca el lado luminal del intestino). Use pinzas para despegar cuidadosamente el intestino de la parte inferior del papel de filtro. Deseche el papel de filtro.
2. Llene tres botes de pesaje con PBS. Lave el pañuelo en PBS 3x para eliminar la formalina del tejido.
3. Usando pinzas de acción inversa (ver Tabla de Materiales), levante un pedazo de intestino a lo largo del borde corto con el lado luminal hacia arriba. Gire las pinzas para hacer rodar el pañuelo. Use un par de pinzas regulares para ayudar a guiar el tejido a medida que se enrolla. Si el pañuelo se dobla, desenrolle y vuelva a intentarlo.
4. Coloque el pañuelo en un bote de pesaje seco o en una placa de Petri. Sostenga el tejido en su lugar con pinzas en una mano. Abra con cuidado las pinzas de acción inversa y libere el tejido, utilizando las otras pinzas para desalojar el tejido de las pinzas de acción inversa.
5. Inserte un alfiler de disección de tamaño 00 o un alfiler de minucias en el pañuelo (consulte la tabla de materiales). Use cortadores de alambre para quitar la punta afilada del alfiler. Coloque el pañuelo en un casete grande y luego coloque el casete en un recipiente con 70% de etanol hasta que esté listo para procesar.
6. Repita los pasos 2.1-2.5 con todos los segmentos intestinales (duodeno, yeyuno, íleon y colon), colocando los cuatro rollos de tejido en el mismo casete grande (ver Tabla de Materiales). Asegúrese de que el casete esté etiquetado con un lápiz para evitar que la etiqueta se lave en las soluciones de etanol y xileno (consulte la Tabla de materiales).
7. Una vez que se hayan enrollado todas las muestras, colóquelas en un procesador de tejidos. Utilice los siguientes ajustes para el tejido intestinal: etanol al 70% durante 35 min; etanol al 90% durante 35 min; etanol al 95% durante 35 min; 100% etanol durante 35 min, 3x; xileno durante 35 min, 3x; Parafina durante 60 min, 3x. Los casetes se pueden dejar en cera de parafina derretida durante períodos de tiempo prolongados.
   PRECAUCIÓN: Asegúrese de usar el equipo de protección adecuado, ya que el xileno es un químico tóxico.

3. Incrustación de tejido intestinal

1. Precaliente moldes de inclusión grandes para mantener la parafina derretida.
2. Retire los casetes del procesador de pañuelos y colóquelos en un vaso de precipitados con parafina derretida.
3. En una estación de incrustación, coloque una pequeña cantidad de parafina en un molde. Retire los cuatro rollos suizos del casete y colóquelos todos en un molde, colocándolos lo más planos posible. Agrega más parafina para llenar el molde.
4. Mueva el molde a la placa fría y asegúrese de que todos los panecillos suizos estén planos en la parte inferior del molde. Coloque una tapa de casete pequeña etiquetada (consulte la Tabla de materiales) en el molde y agregue más parafina si es necesario.
5. Una vez que la cera se haya solidificado, retira el bloque del molde. El tejido ya está listo para ser cortado en rodajas de 5 μm y flotar en portaobjetos de vidrio cargados para la inmunotinción¹¹.

4. Adherencia del tejido y preparación del portaobjetos

1. Para asegurarse de que la sección de tejido de parafina preparada de 5 μm se adhiera al portaobjetos, caliente los portaobjetos de vidrio en un calentador de portaobjetos o bloque de calor ajustado a 60 °C durante 15-30 minutos. Los toboganes también se pueden dejar calentados durante más tiempo; Este paso no es urgente.
2. Deje que los portaobjetos se enfríen a temperatura ambiente (~ 15 min).

5. Desparafinación

1. Al comenzar la desparafinación de los portaobjetos, asegúrese de que el tejido permanezca en una solución y no se seque durante todo el curso de la inmunotinción.
2. Utilice una rejilla de portaobjetos (ver Tabla de Materiales) para sostener los portaobjetos de vidrio y colóquelos dentro de un plato resistente a los solventes (ver Tabla de Materiales) que esté lleno con un reactivo de aclarado/desparafinación (ver Tabla de Materiales). Asegúrese de que el reactivo cubra completamente el tejido de cada portaobjetos. Antes de sumergir completamente los portaobjetos en el reactivo de aclarado, sumerja o empuje la rejilla de portaobjetos varias veces en la solución de aclarado. Deje los portaobjetos sumergidos durante 10 minutos o más.
   NOTA: Es posible que este paso deba realizarse en una campana ventilada debido a los humos peligrosos, según el agente de limpieza elegido. La desparafinación del tejido en este paso no es sensible al tiempo, si se utiliza un agente de limpieza no tóxico.
3. Retire y agite la rejilla de portaobjetos para eliminar el exceso de reactivo de limpieza. En un plato nuevo resistente a los disolventes, repita el paso 5.2.
4. En un plato nuevo resistente a los disolventes, repita el paso 5.3. Deje los portaobjetos sumergidos durante 15 minutos o más. Este paso no es urgente.

6. Rehidratación

1. Retire y agite la rejilla de portaobjetos para eliminar el exceso de reactivo de limpieza. En un plato nuevo resistente a los solventes lleno de etanol 100%, sumerja o empuje la rejilla de portaobjetos varias veces y deje los portaobjetos sumergidos durante 5 minutos. Este paso es urgente. Repite 2 veces.
2. Retire y agite la rejilla deslizante para eliminar el exceso de etanol 100%. En un plato nuevo resistente a los solventes lleno de etanol al 95%, sumerja o empuje la rejilla de portaobjetos varias veces y deje los portaobjetos sumergidos durante 5 minutos. Este paso es urgente. Repita 1 vez.
3. Retire y agite la rejilla deslizante para eliminar el exceso de etanol al 95%. En un plato nuevo resistente a los solventes lleno de etanol al 70%, sumerja o empuje la rejilla de portaobjetos varias veces y deje los portaobjetos sumergidos durante 5 minutos. Este paso es urgente.
4. Retire y agite la rejilla deslizante para eliminar el exceso de etanol al 70%. En un plato nuevo resistente a los solventes lleno de etanol al 50%, sumerja o empuje la rejilla de portaobjetos varias veces y deje los portaobjetos sumergidos durante 5 minutos. Este paso es urgente.
5. Retire y agite la rejilla deslizante para eliminar el exceso de etanol al 50%. En un plato nuevo resistente a los solventes lleno de agua desionizada (DI), sumerja o empuje la rejilla de portaobjetos varias veces y deje los portaobjetos sumergidos durante 5 minutos. Este paso es urgente.
   1. Para hacer una pausa aquí, coloque los portaobjetos en un recipiente con PBS hasta que se pueda reanudar la inmunotinción después del paso de rehidratación con agua de 5 minutos.

7. Recuperación de antígenos

1. Llene una nueva placa resistente a los disolventes con un tampón de recuperación de antígenos adecuado. Transfiera directamente el portaobjetos a esta solución. Asegúrese de que los portaobjetos estén completamente sumergidos en la solución de recuperación de antígenos, cubriendo completamente el tejido.
   NOTA: Las soluciones óptimas de recuperación de antígenos pueden variar según el anticuerpo particular que se utilice. Es posible que el investigador deba determinar la recuperación de antígenos necesaria para los anticuerpos individuales.
   1. Para hacer 1x tampón de recuperación de antígeno de citrato, agregue 2,94 g de citrato de sodio dihidratado (ver Tabla de materiales) por 1 L de agua desionizada. Una vez que el citrato de sodio dihidratado se haya disuelto, agregue cloruro de hidrógeno (ver Tabla de Materiales) hasta que la solución alcance un pH de 6. Por último, añadir 500 μL de Tween20 (ver Tabla de Materiales) por 1 L de agua desionizada.
   2. Para hacer 1x tampón de recuperación de antígeno Tris-EDTA, agregue 1,211 g de Tris Base y 0,292 g de EDTA en 1 L de agua desionizada. Una vez disuelto, ajustar a pH 9.
2. Cubra el plato resistente a los solventes que contiene la solución de recuperación de antígenos y los portaobjetos con una tapa y asegure la tapa con bandas elásticas.
3. Coloque el plato seguro resistente a los solventes en una olla a presión (consulte la Tabla de materiales) encima de la rejilla de metal o el salvamanteles. Asegúrese de que haya suficiente agua en la olla a presión para llegar a la rejilla de metal o al salvamanteles para que la presión pueda aumentar.
4. Coloque la tapa en la olla a presión y gírela en el sentido de las agujas del reloj para bloquear la tapa en su lugar. Gire la válvula límite de presión que se encuentra en la tapa hasta el ajuste de presión.
5. En la configuración del menú, seleccione alta presión en la olla a presión, luego, en la configuración de tiempo, configure la olla a presión en 30 min. Seleccione Inicio.
6. Después de 30 minutos, la olla a presión emitirá un pitido y se configurará automáticamente en la configuración de mantener caliente. Espere hasta que la presión se haya liberado naturalmente y la tapa se desenrosque libremente.
7. Use guantes resistentes al calor (consulte la tabla de materiales) para quitar el plato resistente a solventes de la olla a presión y retire la banda elástica y la tapa. Coloque el plato en un baño de hielo durante ~ 30 minutos para permitir que los portaobjetos se enfríen a temperatura ambiente. Este paso no es urgente.
8. Una vez que se haya enfriado a temperatura ambiente, retire la rejilla deslizante del plato resistente a los solventes y colóquela en un nuevo plato resistente a los solventes lleno de agua desionizada para eliminar la solución de recuperación de antígenos residuales. Asegúrese de que los portaobjetos estén completamente sumergidos.
9. Retire la rejilla deslizante del agua desionizada y colóquela en un plato nuevo resistente a los solventes lleno de PBS durante 5 minutos. Asegúrese de que los portaobjetos estén completamente sumergidos. Este paso no es urgente.

8. Bloqueo de la tinción de fondo inespecífica

1. Prepare una cámara humidificada tomando una caja deslizante grande y quitando la cubierta de cartón adherida a la tapa. En la base de la caja deslizante, coloque las toallas de papel húmedas verticalmente hacia abajo. Asegúrese de que las toallas de papel húmedas queden planas.
2. Retire una diapositiva de una en una de la rejilla de portaobjetos sumergida en PBS. Limpie con cuidado el exceso de PBS en el portaobjetos de vidrio, evitando el pañuelo desechable.
3. Con un bolígrafo hidrofóbico (ver Tabla de materiales) forme una barrera que rodee el tejido dibujando una caja alrededor del tejido con el bolígrafo hidrofóbico. Tenga cuidado de evitar el pañuelo y no use el lápiz hidrofóbico demasiado cerca del pañuelo.
4. Coloque el portaobjetos delineado horizontalmente sobre las toallas de papel húmedas. Agregue tampón de bloqueo para cubrir el tejido (~ 100 μL).
   1. Para hacer un tampón de bloqueo, agregue 100 μL de gelatina de piel de pescado de agua fría (Gelatina Teleostein; ver Tabla de Materiales) a 9.85 mL de PBS. Por último, añadir 50 μL de Triton X-100 al 20% (ver Tabla de Materiales) y mezclar hasta que se disuelva.
5. Repita los pasos 8.2 y 8.4 para cada diapositiva. Cierre la cámara humidificada e incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante 90 min.

9. Bloqueo de ratón sobre ratón

1. Cuando se utilice un anticuerpo primario de ratón para inmunoteñir tejido de ratón, realice un paso de bloqueo adicional. Los reactivos de bloqueo de ratón contra ratón (bloque de ratón contra ratón; véase la Tabla de materiales) están disponibles comercialmente; Siga las instrucciones comerciales cuando prepare el bloque de ratón contra ratón.
2. Golpee suavemente la solución de bloqueo e inmediatamente agregue el bloque de ratón contra ratón preparado para cubrir el tejido (~ 100 μL). Repita el procedimiento para cada portaobjetos que contenga tejido de ratón, que se teñirá utilizando un anticuerpo primario cultivado en ratones.
3. Incubar secciones de tejido en la caja de la cámara humidificada a temperatura ambiente durante 15 min.
4. Retire los portaobjetos de la cámara humidificada y colóquelos directamente en una rejilla de portaobjetos sumergida en PBS. Deje las diapositivas en PBS durante 5 minutos para lavar el bloque de mouse contra mouse.

10. Anticuerpos primarios

1. Para cada portaobjetos, seleccione los anticuerpos primarios de interés que se cultivan en diferentes especies. Diluya los anticuerpos primarios en el diluyente de anticuerpos según las instrucciones del fabricante. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: E-CADHERIN (1:100), MUC2 (1:200), PCNA (1:500), LAMININ (1:200), β-CATENIN (1:200) y LAMP1 (1:50).
   NOTA: Si el fabricante no proporciona las diluciones recomendadas, la dilución 1:100 es un buen punto de partida. Si el anticuerpo primario de interés está conjugado con un fluoróforo, véase el paso 12.2.
   1. Para hacer el diluyente de anticuerpos, agregue tampón de bloqueo 1:20 al PBS, si usa el tampón de bloqueo de gelatina de pescado descrito anteriormente.
2. Retire los portaobjetos del PBS o de la cámara humidificada, golpee suavemente el exceso de solución de bloqueo o PBS y vuelva a colocarlos horizontalmente en la cámara humidificada. Asegúrese de que la barrera creada con el lápiz hidrofóbico en el paso 8.3 permanezca; Vuelve a delinear el tejido si es necesario.
3. Añadir anticuerpos primarios de interés adecuadamente diluidos para cubrir el tejido (~100 μL).
4. Cierre la cámara humidificada e incube los portaobjetos en una superficie plana a 4 °C en la oscuridad durante la noche.

11. Lavar las diapositivas

1. Retire los portaobjetos de la cámara humidificada, retire suavemente los anticuerpos primarios y colóquelos en una rejilla de portaobjetos sumergida en PBS durante 5 minutos.
2. Retire la rejilla de portaobjetos y colóquela en un plato nuevo resistente a los solventes lleno de PBS durante 5 minutos. Repita el paso 1 veces.

12. Contratinción de anticuerpos secundarios y núcleos

1. Para cada portaobjetos, seleccione fluoróforos de anticuerpos secundarios diseñados para unirse a las especies de anticuerpos primarios. Diluir fluoróforos de anticuerpos secundarios o anticuerpos primarios conjugados en diluyente de anticuerpos secundarios. Los anticuerpos secundarios utilizados fueron burro anti-cabra 488 (1:200), burro anti-conejo cy3 (1:200), burro anti-ratón 647 (1:200), burro anti-conejo 647 (1:200) y burro anti-rata cy3 (1:200). El anticuerpo primario γ-ACTINA conjugado con el fluoróforo 647 se utilizó en una dilución de 1:100.
   1. Para hacer un diluyente de anticuerpos secundario, agregue tampón bloqueante 1:100 al PBS, si usa tampón bloqueante de gelatina de pescado como se describe anteriormente.
2. Retire los portaobjetos del PBS, golpee suavemente el exceso de PBS y colóquelos horizontalmente de nuevo en la cámara humidificada. Asegúrese de que la barrera creada con el lápiz hidrofóbico en el paso 8.3 permanezca; Vuelve a delinear el tejido si es necesario.
3. Añada fluoróforos de anticuerpos secundarios adecuadamente diluidos o anticuerpos primarios conjugados de interés para cubrir el tejido (~100 μL).
4. Cierre la cámara humidificada e incube los portaobjetos a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 h.
5. Diluir 10 mg/mL de Hoechst (ver Tabla de Materiales) o DAPI usando PBS para una concentración final de 1 μg/mL de Hoechst o DAPI usando PBS y agregar directamente al tejido (~100 μL). Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
6. Retire los portaobjetos de la cámara humidificada y colóquelos en un estante de portaobjetos que esté sumergido en PBS durante 5 minutos en la oscuridad.
7. Retire la rejilla deslizante y colóquela en un nuevo plato resistente a los solventes lleno de PBS durante 5 minutos en la oscuridad. Repita el paso 1 veces.

13. Montaje y preparación para la microscopía

1. Retire una diapositiva a la vez del estante de diapositivas sumergida en PBS, manteniendo las diapositivas restantes sumergidas en PBS en la oscuridad. Golpee suavemente el exceso de PBS y, si es necesario, use una toallita sin pelusa para limpiar cuidadosamente el exceso de PBS en el portaobjetos de vidrio, evitando el pañuelo desechable.
2. Agregue una o dos gotas de medio de montaje antidecoloración (consulte la Tabla de materiales) en el centro del pañuelo.
3. Sostenga un cubreobjetos limpio (consulte la Tabla de materiales ) por los bordes y bájelo lentamente sobre el portaobjetos en un ángulo de 45°. Asegúrese de que el medio de montaje se extienda uniformemente sobre el tejido.
4. Comenzando en el centro del pañuelo, presione suavemente el cubreobjetos con dos dedos para ayudar a eliminar las burbujas de aire y el exceso de medio de montaje. Si es necesario, continúe presionando hacia los bordes y mantenga una presión suave en todo momento.
5. Corte el extremo pequeño de una pipeta P200 sin filtrar y conéctelo a la punta de una pipeta serológica conectada a una aspiradora.
6. Siguiendo los bordes del cubreobjetos, use la aspiradora para eliminar el exceso de medio de montaje.
7. En una nueva caja de portaobjetos, coloque horizontalmente el portaobjetos plano y deje que se seque en la oscuridad a temperatura ambiente.
8. Repita este proceso para cada diapositiva.

Resultados

Se realizó tinción con hematoxilina y eosina (H&E), como se describió previamente¹². Utilizando el método optimizado, los panecillos suizos intestinales incluían los tres segmentos del intestino delgado y el intestino grueso en un solo portaobjetos. Tener todo el intestino acomodado en un portaobjetos permite a los investigadores analizar los cambios en todas las partes del intestino y ahorra costos en reactivos de corte y tinción (Figura 1). Además, exponer todos los segmentos intestinales a las mismas soluciones simultáneamente durante la inmunotinción ayuda a garantizar resultados precisos. La micrografía de H&E muestra la arquitectura intestinal preservada de todas las porciones del intestino delgado y del intestino grueso (Figura 2). La medición de las vellosidades duodenales no mostró diferencias significativas en la altura de las vellosidades en el tejido intestinal no abierto en comparación con este método de rollo suizo, lo que sugiere que la apertura del intestino no altera la arquitectura del tejido (Figura 2D). La inmunotinción de rollos suizos intestinales muestra las distintas capas del intestino, así como todo el eje de la cripta vellosa. Las imágenes fluorescentes muestran niveles bajos de fondo de la tinción de anticuerpos primarios y secundarios y representan claramente las células individuales presentes en el epitelio. En la figura 3 se muestra la morfología de los diferentes segmentos intestinales y la tinción de las células caliciformes (células MUC2 positivas)¹³, la membrana apical (γ-ACTINA)¹⁴, la membrana lateral de las células epiteliales (E-CADHERINA)¹⁵ y los núcleos. Este protocolo es adecuado para identificar muchos compartimentos celulares diferentes, incluyendo células proliferativas (PCNA)¹⁶, intersticio (LAMININ; Figura 4A) ¹⁷, el dominio lisosomal (LAMP1)¹⁴ y el epitelio (β-CATENINA; Figura 4B) ^{Artículo 18}.

Figura 1: Flujo de trabajo para la preparación y el procesamiento de panecillos suizos intestinales. (A) Los segmentos intestinales se lavan con una jeringa que contiene PBS y luego se lavan con PBS. (B) A continuación, el tejido intestinal húmedo se coloca sobre papel de filtro seco. (C) El intestino se corta longitudinalmente en papel de filtro y (D) se extiende suavemente. (E) Se coloca un pedazo de papel de filtro sobre el intestino abierto, y el intestino se intercala suavemente entre el papel de filtro y se grapa. Los segmentos intestinales se fijan durante la noche y (F) se enrolla con fórceps. (G) El intestino se desplaza suavemente de las pinzas de acción inversa y (H) tiene una apariencia de roseta. (I, J) El tejido intestinal se fija con alfileres y se coloca en un casete grande. (K) Los cuatro segmentos intestinales se colocan en el mismo casete para el procesamiento y la inclusión de tejidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Tinción de hematoxilina y eosina en los cuatro segmentos del intestino. (A) El escaneo de azulejos demuestra la capacidad de visualizar todo el intestino en un solo portaobjetos con rollos suizos individuales del duodeno, yeyuno, íleon y colon. (B) Micrografía de un rollo suizo intestinal y (C) recuadro de mayor aumento para mostrar la arquitectura de las vellosidades y las criptas. (D) La cuantificación de la longitud de las vellosidades del intestino delgado no muestra diferencias significativas entre el tejido suizo enrollado y el tejido sin abrir. Barras de escala = 1000 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Tinción con inmunofluorescencia de los cuatro segmentos del intestino. Los ratones control C57BL/6J adultos se inmunoteñieron para los núcleos (cian), el marcador de membrana lateral, E-CADHERIN (verde), las células caliciformes identificadas por MUC2 (amarillo) y el marcador de borde de cepillo apical, γ-ACTIN, (magenta). Barras de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Tinción de inmunofluorescencia del intestino. (A) Una micrografía representativa de la tinción de inmunofluorescencia del intestino del ratón destaca los núcleos (cian), las células proliferativas, PCNA (verde) y la lámina propia, LAMININA (magenta). (B) Imagen de inmunofluorescencia que identifica los núcleos (cian), el marcador de membrana celular β-CATENINA (verde) y el marcador de lisosoma LAMP1 (magenta) en el intestino. Barras de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Aquí, presentamos un método optimizado para la fijación de tejidos utilizando la técnica del rollo suizo para preservar la arquitectura intestinal y promover una inmunotinción precisa. Una vez dominada, esta técnica puede utilizarse para investigar una amplia variedad de cuestiones de investigación relacionadas con la fisiología intestinal y la biología celular¹⁹. Se han publicado varios métodos de laminación suizos optimizados que son muy útiles^20,21. Una ventaja de esta técnica es la facilidad de abrir con precisión el intestino en papel de filtro. Esto permite que el tejido se fije plano, evitando que el tejido se curve hacia adentro al rodar, lo que es especialmente útil cuando se analiza tejido inflamado con músculos engrosados. Además, es esencial destacar el papel fundamental del corte de tejidos para lograr resultados fiables. El corte adecuado garantiza la preservación de la arquitectura del tejido y facilita la inmunotinción precisa, lo que en última instancia contribuye al éxito de los análisis posteriores¹¹. El enfoque optimizado es menos difícil en comparación con otros protocolos, lo que produce resultados consistentes entre diferentes individuos. La técnica propuesta en este artículo también proporciona una arquitectura de tejido bien conservada, versatilidad e inmunotinción altamente reproducible utilizando diversos anticuerpos.

Un aspecto crítico de este protocolo es el tiempo de fijación y procesamiento. La fijación y el procesamiento inadecuados de los tejidos pueden perjudicar los análisis histoquímicos. El tejido que está demasiado fijado se vuelve quebradizo, mientras que el tejido poco fijado permanece demasiado blando. Tanto los tejidos sobrefijados como los subfijados son difíciles de seccionar y comprometen la inmunotinción. Una vez diseccionado en papel de filtro, el tejido debe colocarse inmediatamente en formol para reducir las alteraciones post-mortem²². En este protocolo, el tejido murino se fija en formol durante la noche. Varios estudios han utilizado este tiempo de fijación 20,23,24. Sin embargo, Boenisch et al. demostraron que la inmunotinción es consistente en el tejido fijado en formol hasta por 4 días²⁵. Se requiere la optimización del tiempo de fijación y del fijador en función de los análisis deseados. Por ejemplo, el fijador de Carnoy es a menudo el preferido para las manchas de moco²⁶. La elección de los fijadores y la duración del tiempo de fijación deben ser optimizadas por cada investigador en función de su enfoque experimental. Se recomienda el uso de un procesador de tejidos automatizado para garantizar tiempos de procesamiento precisos y consistentes. Nuestro laboratorio utiliza pequeños alfileres para mantener el tejido intestinal en su lugar como rollos. Sin alfileres, el tejido puede desenrollarse durante el procesamiento. Como estos alfileres son bastante pequeños y afilados, se deben tomar precauciones. Aconsejamos utilizar cortadores de alambre para quitar el extremo afilado del alfiler antes del procesamiento del tejido. Algunos núcleos histológicos no aceptan tejido con clavos; Por lo tanto, es mejor verificar antes de usar. Un enfoque alternativo es usar agar para anclar el tejido antes de procesar²⁷ o se podrían usar esponjas de casete en casetes para ayudar a mantener los rollos.

La inmunotinción es un protocolo que requiere optimización para cada anticuerpo. Se recomienda el uso de anticuerpos validados por knockout siempre que sea posible. Este método para la fijación y el procesamiento de tejidos da como resultado una tinción clara, lo que permite una fácil identificación de la unión de anticuerpos en comparación con la señal de fondo cuando se utilizan anticuerpos no validados. La elección del fijador, la recuperación del antígeno y la dilución del anticuerpo pueden afectar a la especificidad del anticuerpo. Recomendamos que los investigadores evalúen cuidadosamente y optimicen el protocolo ajustando la fijación, la recuperación de antígenos y el tiempo de incubación de cada anticuerpo. Para obtener los mejores resultados, los anticuerpos deben probarse en varias diluciones para determinar la concentración óptima y en diferentes tampones de recuperación de antígenos. La recuperación de epítopos mejora la inmunotinción al romper los puentes de metileno formados durante la fijación. En este protocolo, se utiliza la recuperación de epítopos inducida por calor en lugar de la recuperación de epítopos inducida por proteolíticos porque es más probable que la digestión enzimática altere la morfología del tejido²⁸. Los tampones de recuperación de epítopos inducidos por el calor más comunes son el tampón citrato, el tris-HCl y el tris-EDTA, siendo el tampón citrato el más suave para la morfología tisular²⁹. La elección del tampón varía y debe determinarse para cada anticuerpo. Muchos tampones de recuperación de antígenos, soluciones de bloqueo y diluyentes de anticuerpos están disponibles comercialmente. Sin embargo, estas soluciones pueden ser extremadamente costosas y prohibitivas. Proporcionamos recetas de soluciones comunes de recuperación de antígenos y soluciones de bloqueo y diluyentes de anticuerpos para garantizar la rentabilidad.

Una limitación de este método es que la fijación y el procesamiento pueden alterar el tejido y enmascarar los epítopos. Un enfoque alternativo es la inmunotinción de tejido fresco congelado. El tejido fresco congelado se congela rápidamente, lo que permite evitar la exposición a fijadores tóxicos, preservar la estructura de la proteína y mejorar la accesibilidad de algunos epítopos. Sin embargo, la arquitectura y la morfología de los tejidos son más pobres que las del tejido fijo e incluido en parafina. Otros desafíos del papel tisú fresco congelado incluyen los materiales y la logística necesarios para seccionar y almacenar bloques y portaobjetos congelados. El análisis de los rollos suizos frente a las tiras de tejido intestinal muestra diferencias en la altura y anchura de las vellosidades y diferencias en las células inmunitarias de la lámina propia, como se describe en un informe anterior³⁰. Estos resultados sugieren que los panecillos suizos intestinales alteran algunas características intestinales, que deben tenerse en cuenta a la hora de planificar experimentos. Además, se requiere la revalidación de anticuerpos, ya que muchos anticuerpos que se unen específicamente al tejido incluido en parafina fijado en formalina no se tiñen bien en el tejido fresco congelado³¹.

La inmunotinción del tejido intestinal se puede utilizar para responder a una amplia variedad de preguntas sobre la biología y la fisiología de las células gastrointestinales. Esta técnica es ampliamente utilizada para identificar alteraciones epiteliales en el contexto de la inflamación intestinal, después de una infección bacteriana y durante la progresión del cáncer. El método presentado aquí es ideal para la preservación del tejido intestinal porque es rentable, no es técnicamente desafiante y es altamente reproducible. Para garantizar los mejores resultados, fomentamos la optimización de los pasos descritos en este protocolo en función del diseño experimental y la hipótesis que se está probando.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
β-CATENIN	GeneTex	GTX101435
			Papel Whatman grueso
Portaobjetos de vidrio cargado	Thermo Fisher Scientific
Coverslip	Epredia	152440
Pines de disección tamaño 00	Phusis	B082DH4TZF
E-CADHERIN	R& D Systems	AF748
Guantes para congelador	Tempshield	UX-09113-02
Bloque calefactor	Premiere	XH-2001	Calentador de diapositivas
Histo-Clear II	Microscopía electrónica Sciences	64111-04	Reactivo de limpieza
Hoescht	Thermo Fisher Scientific	62249
Ácido clorhídrico	Sigma Aldrich	320331
Bolígrafo hidrofóbico	Millipore	402176
LAMININ	GeneTex	GTX27463
LAMP1	Santa Cruz	SC-19992
Casetes grandes	Tissue-Tek	4173
Pines de minucias	Fine Science Tools	NC9679721
Reactivo de bloqueo ratón contra ratón	Vector Laboratories	MKB-2213	Bloque de ratón
contra ratón MUC2	GeneTex	GTX100664
PCNA	Tecnología de señalización celular	2586S
Olla a presión	Cuisinart	B000MPA044
ProLong oro antidecoloración	Thermo Fisher Scientific	P36934	Medio de montaje
Pinzas de acción inversa	Dumont	5748
Gradilla de portaobjetos	Tissue-Tek	62543-06
Juego de tinción de portaobjetos	Tissue-Tek	62540-01	Platos resistentes a los disolventes y estructura metálica
Casetes pequeños	Fisherbrand	15-200-403B
Citrato de sodio dihidratado	Fisher Bioreactivos	BP327-1
Teleostein Gelatina	Sigma	G7765	Tampón de bloqueo
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	A16046
Tween 20	Thermo Fisher Scientific	J20605-AP
Toallitas	KimTech	34155
Xilenos	Fisher Chemical	1330-20-7
γ-ACTIN	Santa Cruz	SC-65638