Circuitos inmunometabólicos en la infección para el avance de las terapias dirigidas al huésped

Resumen

Aquí, se presenta un protocolo para diseñar, construir y administrar un circuito sintético inducible basado en tetraciclinas. El efecto de los circuitos sintéticos sobre la eliminación de parásitos y la expresión de citoquinas se puede estudiar mediante la canalización de la tubería presentada. Este protocolo es relevante para los investigadores que estudian terapias basadas en circuitos sintéticos en enfermedades infecciosas.

Resumen

El inmunometabolismo es un determinante fundamental en la progresión de la leishmaniasis. El enfoque basado en la biología sintética ha atraído una atención significativa como un paso hacia la intervención terapéutica dirigida a los factores asociados al huésped que impulsan la leishmaniasis. La biología sintética implica la ingeniería de componentes genéticos de forma ortogonal y modular para modular con precisión los sistemas biológicos, impartiendo funciones novedosas a las células. En el estudio presentado, la elucidación de una línea sistemática para el desarrollo de un circuito sintético inducible controlado con tetraciclina (TetON) tuvo como objetivo administrar succinato deshidrogenasa como agente terapéutico para facilitar la eliminación de parásitos intracelulares de Leishmania . El protocolo descrito describe el diseño de un circuito sintético y su posterior validación. La estrategia propuesta también se concentra en la incorporación de circuitos sintéticos en la red troncal del plásmido como vehículo de entrega. Además, se utilizó maquinaria de administración que emplea nanopartículas basadas en poliplex para la entrega de circuitos sintéticos en líneas celulares de macrófagos murinos sin comprometer la morfología celular. Se llevó a cabo la estandarización del método para seleccionar las células transfectadas y determinar la concentración óptima de inducción para la expresión de circuitos sintéticos. Las observaciones revelan una clara reducción de la carga parasitaria intracelular en las células transfectadas en comparación con las células infectadas. Las citocinas proinflamatorias se expresaron después de la infección en células transfectadas e inducidas en circuitos sintéticos como mecanismo para promover la eliminación del parásito. Esto subraya el método basado en la biología sintética como un enfoque potente en la leishmaniasis al dirigirse a los factores del huésped asociados con la progresión de la enfermedad.

Introducción

El avance de la medicina holística e integrativa es un vínculo significativo que se ha identificado entre las alteraciones metabólicas en las células inmunitarias y su capacidad para modular el fenotipo de las células inmunitarias en las enfermedades infecciosas. El inmunometabolismo ofrece nuevas perspectivas para dilucidar la patogénesis de las enfermedades infecciosas prevalentes en los seres humanos. Además, proporciona técnicas prometedoras para el desarrollo de vacunas y fármacos mediante la identificación de nuevas dianas para la intervención¹. La reprogramación metabólica de las células inmunitarias se identifica en varias enfermedades infecciosas, incluida la leishmaniasis. Leishmania spp. es responsable de causar leishmaniasis, de la cual la Leishmania major (L. major) causa leishmaniasis cutánea (LC). Los parásitos principales de L. tienen un impacto significativo en el metabolismo de las células huésped, particularmente en los macrófagos, para la proliferación y la supervivencia como parásitos intracelulares². Por lo general, los macrófagos pueden polarizarse en subconjuntos activados clásicamente (M1) o alternativamente activados (M2) donde las células M1 poseen una alta secreción de citocinas proinflamatorias y producción de óxido nítrico (NO) a través del metabolismo de las especies de nitrógeno. Las células M2 exhiben niveles elevados de citocinas antiinflamatorias y muestran una alta actividad de arginasa a través del metabolismo del nitrógeno³. Así, ambos fenotipos no solo difieren por su respuesta inmunitaria, sino también por sus vías metabólicas.

La biología de sistemas de la leishmaniasis tiene como objetivo identificar dianas moleculares para el diseño de nuevas terapias a través del diseño y desarrollo de fármacos. La reconstrucción de las redes de señalización y las vías metabólicas ayuda a comprender la leishmaniasis como un modelo holístico y aporta información para la identificación del componente principal que impulsa el estado de enfermedad. El modelado matemático es uno de los enfoques analíticos aplicados más favorecidos para comprender las complejidades de la leishmaniasis⁴. Las redes inmunometabólicas y los modelos matemáticos permitieron identificar la succinato deshidrogenasa (SDHA) como un componente clave del fenotipo M1, que se expresa para eliminar el parásito⁵. La biología sintética tiene aplicaciones en el diagnóstico, el desarrollo de vacunas y la terapéutica de la leishmaniasis. El metabolismo dirigido a la modulación de la respuesta inmunitaria puede lograrse a través de herramientas de biología sintética. Para la modulación de la fosforilo ceramida sintasa de inositol, que regula el metabolismo de los esfingolípidos y altera la señalización inmunitaria del huésped, se utilizó un circuito genético que poseía un comportamiento biestable para ajustar sintéticamente la robustez intrínseca del modelo de infección por L. major ^6,7. Por lo tanto, la biología de sistemas y sintética puede proporcionar una plataforma de ingeniería genética basada en modelos para el desarrollo de la medicina de precisión en el sistema modelo de Leishmania.

El fenotipo M1 se caracteriza por la expresión de redes de señalización inmunometabólica donde la producción de citocinas inflamatorias y vías metabólicas mejora sinérgicamente la eliminación del parásito. La polarización M1 significa la producción de citocinas proinflamatorias como la interleucina-12 (IL-12), el interferón-gamma (IFN-γ) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α). Las vías metabólicas que están altamente enriquecidas en el fenotipo M1 incluyen la glucólisis, la vía del fosfato de pentosas y el ciclo del ácido tricarboxílico truncado (ciclo TCA)⁵. El ciclo truncado de TCA dirige la maquinaria de eliminación de parásitos a través del aumento de los niveles de succinato y citrato, que guían la producción de NO³. La acumulación de succinato por SDHA conduce a la activación del factor de transcripción factor 1-alfa inducible por hipoxia (HIF-1α), que induce la producción de IL-1β⁸. En el fenotipo M2, se observa oxidación de ácidos grasos, aumento en la utilización de glutamina y una mayor fosforilación oxidativa de la glucosa junto con la producción de citocinas antiinflamatorias como la interleucina-10 (IL-10), el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β), la interleucina-4 (IL-4) y la interleucina-13 (IL-13)³. M2 exhibe mitocondrias alargadas como una característica distintiva, lo que conduce a una mayor eficiencia en la generación de energía. Utilizan ácidos grasos, glucosa y glutamina como sustratos para alimentar el ciclo del TCA, generando así ATP a través de la fosforilación oxidativa a una tasa más alta para promover el crecimiento^{y la proliferación} de parásitos. La enzima SDHA responsable de la acumulación de succinato a través del TCA truncado no solo puede promover la producción de NO, sino también iniciar un consumo de oxígeno dependiente de succinato a través del transporte de electrones¹⁰. En los macrófagos infectados con Leishmania, la SDHA se regula a la baja en 2,17 veces, lo que indica que la respiración aeróbica también podría estar regulada a la baja¹¹. Con el fin de aumentar el consumo de succinato para inducir la producción de NO mediada por citocinas proinflamatorias y promover la eliminación del parásito, la expresión de SDHA es esencial.

El circuito sintético ofrece terapias dirigidas de precisión que pueden alterar el sistema enfermo para lograr una oscilación biestable que puede restaurar un fenotipo saludable a nivel espacio-temporal. La entrega y la expresión del circuito sintético hacen que el sistema sea dinámico y robusto. Un factor fundamental que contribuye al avance de la biología sintética radica en la capacidad de ensamblar partes y elementos genéticos de manera modular para permitir la generación de arquitecturas complejas y funcionalidades personalizadas¹². Las limitaciones asociadas con las técnicas de expresión tradicionales han estimulado la aparición de circuitos sintéticos de plásmidos inducibles basados en operones de tetraciclina, lo que permite una evaluación rápida del plásmido y una fácil administración en varios tipos de células¹³. La proteína represora que responde a la tetraciclina (TetR), cuando existe como dímero, exhibe una fuerte afinidad de unión al operón tet (TetO), suprimiendo eficazmente la transcripción. Sin embargo, tras la interacción de su ligando, la doxiciclina (dox), TetR sufre una alteración estructural, lo que resulta en su disociación de TetO, lo que permite que la transcripción continúe sin obstáculos. Este circuito puede exhibir control de la traducción de proteínas¹⁴. Por lo tanto, a través de la metodología definida, se permitió que el circuito sintético de plásmido inducible basado en operones de tetraciclina diseñado expresara SDHA en el vector pEGFP-N1. La evaluación de la eficiencia de transformación del circuito y su rendimiento proporcionó información sobre la competencia de entrega. A través de la digestión restringida del vector, se confirmó la determinación de la eficiencia de la clonación. Además, se observó una línea celular de macrófagos de ratón RAW264.7 transfectada derivada de macrófagos peritoneales de ratones Balb/c para la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) dependiente de la dosis de doxiciclina en células transfectadas. Además, se corroboró el efecto de eliminación del parásito en las células transfectadas con una expresión del circuito sintético. Además, se observó la inducción y expresión de citoquinas proinflamatorias, que se dirigió a través de un aumento en el punto de tiempo de infección en el circuito sintético transfectado e inducido por las células, lo que se asoció directamente con el funcionamiento del circuito sintético.

Protocolo

1. Cultivo celular de células RAW264.7

NOTA: Utilice números de pasaje bajos para la experimentación. La línea celular RAW264.7 se adquirió del Repositorio Nacional de Células del Consejo de Innovación en Investigación en Biotecnología-Centro Nacional de Ciencias Celulares (BRIC-NCCS), Pune. Como la línea celular RAW264.7 es una línea celular de macrófagos, puede comenzar a diferenciarse con el aumento de los pasajes. Después de revivir las células, use la línea celular para la transfección después de 2 pasos.

1. Siembre 5 x 10⁵ células de la línea celular RAW264.7 en un matraz de 25^cm2 suplementado con 5 mL de Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco con 10% de Suero Fetal Bovino (FBS) y 100 UI/mL de penicilina como medio completo.
2. Mantenga las células para el crecimiento y la proliferación en una incubadora con 5% de CO₂ a 37 °C hasta que se logre una confluencia del 90%.
3. Deseche el medio y lave 3 veces con 1x solución salina tampón de fosfato (PBS). Agregue 1 mL de PBS al matraz, raspe las células con un raspador y recoja las células en un tubo de 1.5 mL.
4. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a 24 °C y resuspender el pellet con una pipeta de 1 mL en medio completo de DMEM de 1 mL.
5. Cuente las células en la cámara de recuento de células utilizando azul de tripán al 0,5% para identificar el porcentaje de células vivas.

2. Cultivo celular del parásito L. major

NOTA: L. major promastigotes (MHOM/Su73/5ASKH) fue un regalo de BRIC-NCCS. Los promastigotes deben tener un número de paso inferior a 10. El menor número de pasajes garantiza que el parásito esté sano y su capacidad para infectar a los macrófagos sea mayor.

1. Cultivo de L. major promastigotes (MHOM/Su73/5ASKH) en el medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado con un 20% de FBS como medio completo.
2. Semilla 1 x 10⁶ promastigotes en matraz de 25^cm2 sin ventilación que contiene 5 mL de medio completo. Incubar el matraz a 27 °C durante 5 días y observar el parásito promastigote L. major en fase estacionaria a 20x en un microscopio de campo claro.
   NOTA: Los promastigotes en fase estacionaria se pueden lograr en 4-7 días después del cultivo. Se caracterizan por su estado flagelado alargado y su motilidad reducida.

3. Diseño de un circuito sintético en plásmido como vector de entrega

1. Diseño de partes del circuito sintético
   1. Abra el software de la celda Tinker y vaya a la pestaña Piezas. Seleccione el componente Promotor de la biblioteca y colóquelo en el lienzo para simbolizar el promotor del citomegalovirus (CMV) dentro del circuito sintético. Recupere el sitio de unión del represor, análogo a TetO, desde la pestaña Partes y colóquelo junto al promotor en el lienzo, integrándolo sin problemas con el promotor CMV.
   2. Incorpore el operador de tetraciclina (TetO), los sitios de entrada internos de ribosomas (IRES) y la región codificante arrastrando y soltando el sitio de unión del represor, el sitio de unión del ribosoma (rbs) y la región codificante en el lienzo, integrándolos con los componentes genéticos existentes.
   3. Cambie el nombre de la región codificante a TetR, que denota el represor sensible a la tetraciclina, que funciona como un regulador negativo putativo dentro del circuito sintético. Fusionar estos elementos genéticos para facilitar la construcción de las piezas sintéticas.
   4. Incorpore una región espaciadora (sd1) en el lienzo, diseñada para ser escindida por proteasas celulares como el teschovirus-1 2A (P2A) porcino. Introducir una región codificante adicional que represente el gen de interés, etiquetarla como SDHA, en la construcción sintética e integrarla con los demás elementos.
   5. Adyacente a la región codificante de SDHA, integra otra región espaciadora escindible de proteasa (sd2), que será escindida por la proteasa celular P2A. Introduzca una región codificante que represente el gen reportero y etiquétela como GFP en el constructo.
      NOTA: La expresión de GFP puede proporcionar una estimación de la producción de SDHA y garantizar que el circuito sintético tenga un funcionamiento lógico¹³.
   6. Junto a GFP, agregue un terminador (ter1) y verifique las piezas ensambladas comprobando si todas las piezas están conectadas. El circuito debe aparecer en rojo al hacer clic en cualquier parte. Esto confirma la formación de un circuito genético funcional.
   7. En la pestaña Reacción, asigne tasas regulatorias, que incluyen parámetros y valores iniciales para la producción de proteínas, a TetR, SDHA y GFP para delinear la reacción de traducción dentro del circuito sintético.
   8. Agregue una molécula pequeña desde la pestaña Partes, nómbrala Doxiciclina (dox) y asígnele una función de onda seleccionando Entrada en la pestaña Partes y conexión y luego haciendo clic en Entrada de onda.
   9. En la pestaña Regulación , haga clic en Reacción represiva. Arrastra y suelta la tasa de reacción en el lienzo entre dox y TetR. Establezca la cinética de reacción entre dox y TetR haciendo doble clic en el icono de función de onda en dox y ajustando Doxyxycline.sin.amplitude a 10.
   10. Implemente la reacción reguladora transcripcional entre la proteína TetR y el sitio de unión del represor seleccionando la reacción en la pestaña Regulación y colocándola en el lienzo entre TetR y TetO.
   11. Al hacer doble clic en cada componente y reacción, establezca una concentración inicial y un parámetro para la simulación. Haga clic en Simulación, elija Determinista y simule el circuito para 100 unidades de tiempo. Ajuste el gráfico de simulación desde el panel de control, que aparece con el gráfico, y observe el patrón del gráfico para las proteínas SDHA y TetR.
2. Identificación de componentes genéticos a partir del registro de piezas iGEM
   1. Abra el Registro de Partes Biológicas Estándar (Tabla de Materiales) y haga clic en Buscar. Introduzca el nombre del componente genético, por ejemplo, promotor del CMV.
      NOTA: El proceso de búsqueda de ID de iGEM debe realizarse para todos los componentes genéticos del circuito sintético. Se enumeran los pasos para identificar el ID de iGEM del promotor de CMV; Posteriormente, se deben repetir los pasos para otros componentes.
   2. Para obtener la secuencia de nucleótidos del promotor de CMV, haga clic en la opción Obtener secuencia de piezas y guarde el archivo como un archivo de texto.
      NOTA: Es crucial tener en cuenta que las existencias de todas las partes genéticas están disponibles.
   3. Repita los pasos 3.2.1 y 3.2.2 para todas las partes genéticas (operador de tetraciclina, secuencia de Kozak, TetR, P2A y GFP) excepto SDHA.
   4. Para obtener la secuencia codificante de proteínas de SDHA, abra NCBI y elija Nucleótido en el menú desplegable junto a la ventana de búsqueda. Tipo: Succinato deshidrogenasa y Mus musculus y búsqueda de secuencia de nucleótidos.
   5. Haga clic en la opción CDS para obtener la secuencia de codificación de SDHA y guardar la secuencia en un archivo de texto.
   6. Fusione la secuencia de nucleótidos de todas las partes reguladoras genéticas en un archivo de forma secuencial. Agregue el codón de inicio (ATG) justo después de la secuencia de Kozak y elimine los codones de parada internos para evitar la formación de polipéptidos nacientes.
   7. Abra el sitio web de ExPASy¹⁵ y pegue la secuencia de nucleótidos. Haga clic en la opción Traducir la secuencia . Seleccione 5'3' Frame 1 y elimine los codones de parada, que se resaltarán en rojo en la sección de resultados.
      NOTA: Para identificar si la secuencia de nucleótidos se está traduciendo efectivamente en la secuencia polipeptídica deseada, se puede emplear una herramienta de traducción como ExPASy. Esto asegura la prevención de polipéptidos nacientes no deseados. La selección del vector pEGFP-N1 para expresar el circuito sintético es óptima, dado que el promotor de CMV y el gen GFP eran preexistentes dentro del vector. Todas las partes genéticas se ensamblaron utilizando un protocolo de clonación (que se subcontrató). Las enzimas de restricción utilizadas para clonar los insertos son NotI y XhoI. Estos sitios de enzimas de restricción se encuentran dentro del sitio de clonación múltiple del vector pEGFP-N1.

4. Transformación del circuito sintético en células de Escherichia coli (E.coli) DH5α

1. Preparación de células competentes para E. coli DH5α
   NOTA: Se recomienda esterilizar los reactivos en autoclave. Los reactivos se pueden almacenar a 4 °C hasta su uso.
   1. Cultivo 1 mL de inóculo fresco en 50 mL de Caldo Luria (LB) a 37 °C, 180 rpm. Haga crecer las células durante aproximadamente 2 h hasta que se logre una densidad óptica (OD) de 0,4-0,6 a 600 nm.
   2. Centrifugar las células a 4.696 x g a 4 °C durante 15 min. Deseche el sobrenadante manualmente en el matraz de descarte invirtiendo el tubo de centrífuga de 50 mL y recolectando el pellet de celda.
   3. Vuelva a suspender suavemente el pellet en 2 mL de cloruro de magnesio (MgCl2) 0,1 M helado con una pipeta de 1 mL. Aumente el volumen hasta 20 ml con MgCl_{2 helado.}
   4. Centrifugar el tubo a 4.696 x g durante 10 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender suavemente las células con una pipeta de 1 ml en 1 ml de cloruro de calcio 0,1M (CaCl₂) helado e incube en hielo durante 2 h. Utilice las células competentes recién hechas para la transformación.
2. Transformación de células competentes con construcción de circuitos sintéticos
   1. Mida 50 μL de células competentes y añada las células en un tubo de 1,5 mL. Coloque el tubo sobre hielo. Agregue 10 ng de construcción de circuito sintético a la alícuota y manténgala en hielo durante 3 minutos.
   2. Celdas de choque térmico a 42 °C durante 3 min en un bloque calefactor seco. Una vez finalizada la incubación en el bloque de calentamiento seco, vuelva a colocar las células en hielo durante 3 minutos, añada 1 ml de LB a las células e incube a 37 °C durante 1 h a 250 rpm.
   3. Una vez finalizada la incubación, centrifugar las células a 4.696 x g a temperatura ambiente (RT) durante 5 min y desechar el sobrenadante con una pipeta de 1 mL. Vuelva a suspender las células en 100 μL de LB y colóquelas en agar LB que contenga 50 μg/mL de kanamicina. Invertir la placa e incubar a 37 °C durante 24 h.

5. Aislamiento de la construcción del circuito sintético

1. En un tubo de centrífuga de 50 mL, tome 10 mL de medio LB y agregue 50 μg / mL de kanamicina como caldo de selección para cultivar células transformadas para el aislamiento de plásmidos. Recoge una colonia transformada con una punta de 200 μL y añádela al caldo de selección.
2. Utilizando un bucle de inoculación, seleccione otra colonia individual, escorone una placa utilizando la técnica pentagonal e incube a 37 °C durante 24 h para mantener los aislados de una sola colonia.
3. Cultive las células durante la noche a 180 rpm a 37 °C. Al día siguiente, centrifugar el cultivo a 4.696 x g durante 20 min a 24 °C. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante invirtiendo el tubo y agregue 1 mL de tampón de resuspensión (50 mM de clorhidrato de Tris (hidroximetil) aminometano (Tris-HCl), 10 mM de ácido etilendiaminérgico tetraacético (EDTA), 100 μg/ mL de RNasa A (pH-8.0)) al pellet y vuelva a suspender las células pipeteando suavemente.
   NOTA: Para resuspender el tampón, agregue RNasa A 5 min antes de agregar la mezcla al pellet de celda.
4. Incubar la mezcla durante 5 min en RT. Añadir 1 mL de tampón de lisis (0,2 N de hidróxido de sodio (NaOH), 1 % de dodecil sulfato de sodio (SDS)) a las células y mezclar invirtiendo el tubo durante 2 min. Incubar el tubo durante 5 min a RT.
5. Agregue 1 mL de tampón de neutralización a las células (acetato de potasio 3 M (CH₃CO₂K)) y mezcle invirtiendo el tubo varias veces. Centrifugar las células a 4.696 x g durante 20 min en RT y recoger el sobrenadante en un tubo de 1,5 mL.
6. Añadir 500 μL de isopropanol al sobrenadante y mezclar bien invirtiendo. Incubar el sobrenadante en hielo durante 15 min y luego centrifugar a 12.000 x g durante 30 min a 4 °C.
   NOTA: La incubación puede oscilar entre 5 min y 1 h. Durante este tiempo, se aconseja mezclar suavemente el contenido invirtiendo cada 5 min.
7. Deseche el sobrenadante, agregue 1 mL de etanol al 70% (refrigerado) al pellet y centrifugue a 12000 x g durante 5 min a 4 °C. Repita este paso una vez más.
8. Secar al aire el pellet y resuspender el plásmido obtenido en 20 μL de agua estéril libre de nucleasas (NFW). Mida la concentración de plásmido en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260/280 nm.
   NOTA: Agregue más NFW si la concentración de plásmido es muy alta para estimarla a través de nanogotas. El proceso de dilución de plásmidos debe realizarse en una campana laminar.

6. Electroforesis en gel de agarosa (AGE) de circuito sintético

1. Preparación de la muestra de plásmido para AGE
   1. En un tubo de 1,5 mL, mida 20 μL de 1x Tris-acetato-EDTA (TAE). Añadir 4 μL de tampón de carga 6x y mezclar bien pipeteando.
   2. Gire rápidamente el tubo, agregue 1 μg del vector plásmido de circuito sintético y mezcle bien pipeteando la mezcla. Esta mezcla de reacción se puede cargar en gel de agarosa.
      NOTA: Evite el pipeteo riguroso, ya que puede dañar la estructura del plásmido. En su lugar, dé un giro rápido para mezclar los reactivos.
2. Restricción de la digestión del circuito sintético
   1. En un tubo de 1,5 mL, agregue 2 μL de tampón de restricción 10x, 1 μL de NotI y 1 μL de enzima de restricción XhoI, y mezcle bien dando un giro rápido al contenido. Agregue 1 μg de vector plásmido de circuito sintético y gire rápidamente el contenido.
   2. Aumente el volumen del tubo a 20 μL agregando NFW al contenido y dando un giro rápido al tubo. Incubar el tubo a 37 °C durante 1 h.
   3. Después de la incubación, mantenga el tubo a 70 °C durante 15 min en un bloque de calentamiento seco para desactivar las enzimas de restricción. Enfriar el contenido del tubo y añadir 6 μL de tampón de carga a la mezcla de reacción. Mezcle el contenido girando rápidamente el tubo. Esta mezcla de reacción se puede cargar en gel de agarosa.
   4. Configure el gel de agarosa y ejecute el gel utilizando un protocolo descrito anteriormente¹⁶. Brevemente, cargue 20 μL de muestras en cada pocillo, cargue 5 μL de escalera de ADN de 1 Kb y haga funcionar el gel a 100 V. Desconecte la fuente de alimentación una vez completada la electroforesis, adquiera el gel en un generador de imágenes de gel y active la opción de fluorescencia para ver las bandas.

7. Transfección de la construcción de circuito sintético en la línea celular RAW264.7

1. Preparación de muestras
   1. Prepare las muestras para determinar el efecto de eliminación de parásitos por circuito sintético inducido. La primera muestra son células RAW264.7 sin transfectar (control), la segunda son células RAW264.7 infectadas con L. major promastigotes durante 6 h (6 h infectadas), la tercera muestra fueron células RAW264.7 transfectadas con circuito sintético e inducidas con dox (IMT), las muestras de puntos de tiempo de infección son células RAW264.7 transfectadas con circuito sintético e inducidas con dox que está infectado con L. major promastigotes (IMTI) para diferentes puntos horarios 6 h (6 h IMTI), 12 h (12 h IMTI), 18 h (18 h IMTI) y 24 h (24 h IMTI).
   2. Para preparar todas las muestras, raspe las células RAW264.7 de un matraz^{de 25 cm2} y centrifugue a 300 x g durante 5 min en RT.
   3. Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio completo DMEM. Tome 10 μL de las células resuspendidas en un tubo de 100 μL, agregue 10 μL de azul de tripán al 0,5% a las células y mezcle bien.
   4. Cargue 10 μL de celda y mezcla de azul de tripano en el portaobjetos de la cámara de recuento de celdas y tome el recuento de células de 4 cámaras.
   5. Placas de celdas en placas de 96 pocillos con fondo de cubreobjetos a 2 x 10⁴ celdas por pocillo e incubar las celdas durante 24 h. Esta muestra es la muestra de control. Este paso permanece constante para la preparación de otras muestras.
      NOTA: Precaliente el medio a 37 °C en un baño de agua antes de usarlo.
   6. Para preparar una muestra infectada de 6 h, centrifugar 1 mL de promastigotes mayores de L . en fase estacionaria a 7.273 x g durante 10 min. Vuelva a suspender el pellet en 500 μL de medio completo DMEM y tome el recuento de células en una cámara de recuento de células siguiendo los pasos 7.1.3-7.1.4.
   7. Añadir al pocillo 2 x 10⁵L. de promastigotes mayores e incubarlos con 5% de CO₂ a 37 °C durante 6 h. Después de la incubación, lave las celdas 3 veces con PBS.
   8. Para preparar la muestra IMT, siembre las células siguiendo los pasos (7.1.2-7.1.5) y realice los pasos de transfección 7.2.1-7.2.6.
   9. Para preparar muestras de puntos de tiempo de IMTI, siga los pasos 7.1.2-7.1.5 y realice los pasos de transfección 7.2.1-7.2.6. Deseche el medio completo DMEM que contenga 500 μg/mL de Geneticin (G418) y 1 μg/μL de dox y lave las células 3 veces con 1x PBS.
   10. Añadir 2 x 10⁵L. de promastigotes mayores a los pocillos e incubarlos durante 6 h, 12 h, 18 h y 24 h. Después de la infección, deseche los promastigotes que contienen DMEM medios completos y lave los pocillos 3 veces con 1x PBS. Añadir 200 μL de medio completo DMEM que contenga 500 μg/mL de Geneticin (G418) y 1 μg/μL de dox a las células e incubar durante 24 h.
2. Transfección de circuito sintético
   1. En un tubo de 1,5 mL, agregue 24 μL de medio de suero reducido, que es un medio esencial mínimo mejorado. Al medio, agregue 1 μg de vector pEGFP-N1 clonado con plásmido de circuito sintético.
   2. En un tubo nuevo de 1,5 mL, agregue 24 μL de Medio Esencial Mínimo y agregue 1 μL de Polietilenimina (PEI; 1 μg /μL). Mezclar bien pipeteando la mezcla al menos 10 veces e incubar a RT durante 5 min.
   3. Transfiera la mezcla de PEI al tubo de 1,5 ml que contiene la mezcla de ADN. Mezcle bien pipeteando gota a gota al menos 10 veces. Incubar el ADN: PEI mezclar a RT durante 10 min.
   4. Deseche los medios de los pocillos en las placas inferiores de cubreobjetos de 96 pocillos y lave las celdas 3 veces con PBS. Con una pipeta, agregue suavemente el DNA:PEI gota a gota a las células y agite suavemente la placa. Incubar las células con 5% de CO₂ a 37 °C durante 3 h.
   5. Después de la incubación, añadir 200 μL de Medio Esencial Mínimo fresco a las células, agitar suavemente la placa e incubar durante 24 h con 5% de CO₂ a 37 °C.
      NOTA: La PEI es citotóxica; Por lo tanto, se recomienda no incubar las células después de la transfección durante más de 24 h.
   6. Al día siguiente, deseche los medios y lave las celdas 2 veces con PBS. Añada a las células un medio completo DMEM que contenga 500 μg/mL de Geneticin (G418) y 1 μg/μL de dox e incube durante 24 h.
3. Fijación de las muestras para microscopía confocal
   1. Para fijar todas las muestras, lavar las células con 1x PBS 3x, añadir 100 μL de paraformaldehído al 4% a las células e incubar a RT durante 10 min.
   2. Lave las células con PBS 3x. Una vez finalizado el lavado, añadir 1 μg/mL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) a las células e incubar a RT durante 15 min en la oscuridad.
   3. Después de la incubación, lave las células 3 veces con PBS. Observe las células bajo un microscopio confocal para determinar la expresión de GFP y la tinción de DAPI.

8. Adquisición de células transfectadas por microscopía confocal y cuantificación

1. Limpie el fondo de los pocillos con un pañuelo absorbente. Encienda los controles del microscopio de escaneo láser confocal. A continuación, encienda el compresor y la lámpara de mercurio.
2. Para operar la máquina, los controles del microscopio, el control del cabezal de escaneo, la llave láser, el módulo láser, la lámpara, el controlador del microscopio y la CPU deben encenderse secuencialmente.
3. En la computadora, abra el software (Tabla de materiales) y haga clic en Habilitar control de escenario XY. Se abrirá una ventana emergente que pedirá que se ejecute la limpieza para 7S3. Haga clic en No. Cierre el gráfico en vivo y ajuste las pantallas de configuración.
4. Al objetivo de 60x, agregue una gota de aceite de inmersión, coloque la placa inferior de cubreobjetos de placa de 96 pocillos en la plataforma y mueva la etapa en el plano X-Y para ajustar la posición del objetivo en el pozo. Haga clic en el ocular y seleccione Alexa-488 Channel. Haga clic en Obturador desactivado para enfocar las celdas en el ocular. Ajuste el ocular por núcleo y enfoque fino.
5. Haga clic en Shutter On presente en la caja de control del microscopio y mueva el objetivo para ajustar su posición y enfocar el área de interés para observar las celdas en Contraste de Interferencia Diferencial (DIC). Cambie al modo EPI en la caja de control del microscopio para observar las celdas en el filtro de longitud de onda Alexa-488 para la expresión de GFP. Las celdas deben aparecer en verde.
6. Haga clic en Obturador apagado, vaya a Imágenes LSM y elija la resolución de la imagen como 1.024 x 1.024. Haga clic en Agregar fase y arrastre para agregar un canal verde como fase.
7. En el programa Olympus, haga clic en LSM y luego haga clic en Live Button para observar las celdas en contraste de fase y el canal de Alexa de 488 nm. Presione Control y desplácese para enfocar las celdas del software para capturar imágenes.
8. Ajuste la ganancia y el desplazamiento para ajustar la intensidad de fluorescencia capturada por el detector. Haga clic en Capturar, asigne un nombre a las imágenes y haga clic en Guardar.
9. En el software de imágenes, haga clic en Archivo, seleccione todas las imágenes con la extensión .oir y haga clic en Abrir.
10. Haga clic en Vista de mosaico para visualizar imágenes en todos los canales. Para agregar una barra de escala a las imágenes, haga clic en Ver y luego elija la opción Barra de escala .
11. Para guardar imágenes de canales individuales como escala de grises de 16 bits, haga clic en Archivo y seleccione Exportar imagen. Seleccione la imagen y verifique las marcas de verificación en todos los canales. En la pestaña Seleccionar fotograma de la opción de vista dividida, elija Sí. En la pestaña de salida, elija el color RGB de 24 bits con la opción de información de grabación y elija tiff como tipo de archivo para la imagen. En la carpeta exportar a, elija la ubicación de archivo adecuada para guardar las imágenes y luego haga clic en Aceptar.
12. Para guardar las imágenes combinadas, siga los mismos pasos, excepto que, en la opción de vista dividida, elija No y, en la pestaña de salida, elija Canales combinados con información de grabación.
13. Para analizar la expresión de GFP en las celdas, abra Fiji en Windows y exporte el archivo tiff. Seleccione el color verde para analizar la expresión GFP.
14. Seleccione el área de la celda con la opción de la herramienta a mano alzada y haga clic en Analizar para medir la intensidad de la fluorescencia. Repite el proceso para 3 imágenes.
15. Exporte los datos a un software de análisis y realice pruebas estadísticas sobre los datos cuantificados.

9. Ensayo de carga de parásitos

1. Mientras visualiza las células en un microscopio confocal, cuente el número total de parásitos presentes en los macrófagos individuales.
2. Examine aleatoriamente 100 macrófagos y observe el número de parásitos intracelulares. Prueba estadística de rendimiento entre infectados y puntos de tiempo de muestras IMTI para examinar el efecto de la expresión de SDHA en el recuento de parásitos.

10. Cuantificación de IL-10 e IL-12 mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

1. Prepare las muestras según los pasos 7.1 y 7.2 y recoja los medios en un tubo de 1,5 ml. Mantenga el medio en hielo o guárdelo a -20 °C hasta su uso posterior. Siga las instrucciones del manual del kit del usuario y realice ELISA para IL-10 e IL-12.

11. Perfil de citocinas mediante PCR cuantitativa de transcripción inversa en tiempo real (qRT-PCR)

1. Prepare las muestras según los pasos 7.1 y 7.2. Deseche el sobrenadante con una pipeta y añada 500 μL de reactivo TRIzol e incube las células durante 2 min en RT.
   NOTA: Los pasos de aislamiento de ARN deben realizarse en una cabina de flujo laminar como precaución de seguridad contra la contaminación por ARNasa.
2. Recoja las muestras en un tubo de 1,5 mL, agrégueles 100 μL de cloroformo y mezcle invirtiendo los tubos 5x-8x. Incubar las muestras durante 15 min en RT. Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
3. Se observarán tres capas, recogerá la capa superior acuosa clara en un tubo fresco de 1,5 mL. Añadir 500 μL de isopropanol a la capa acuosa, mezclar bien invirtiendo 10x e incubar las muestras durante 15 min a RT. Después de cada 5 minutos, vuelva a mezclar las muestras invirtiendo los tubos.
4. Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y lave el pellet 2x con etanol al 75% hecho en pirocarbonato de dietilo al 0,1% (DEPC) que contiene agua durante 5 min y centrifugar a 8.000 x g a 4 °C.
   NOTA: El agua que contiene DEPC degrada las RNasas y, por lo tanto, se recomienda utilizarlo para el aislamiento de ARN.
5. Por último, seque el pellet al aire durante 5 min a RT, disuélvalo en 20 μL de agua que contenga DEPC y mida la concentración de ARN aislado, relación 260/280 y 260/230, utilizando un espectrofotómetro.
   NOTA: La relación 260/280 debe ser aproximadamente 2.0, lo que generalmente es indicativo de una forma pura de ARN, y la proporción 260/230 debe estar entre 2.0-2.2 para considerar que el ARN aislado está libre de compuestos químicos no deseados como TRIzol.
6. Para la preparación de 20 μL de cada muestra de ADNc, descongele los reactivos en hielo y déles una vuelta corta durante 15 s en RT. Dé una vuelta corta a todos los reactivos e incluso a las muestras de ARN antes de usar.
7. En un tubo de 100 μL esterilizado en autoclave, tome 0,8 μL de dNTP 25x, 2 μL de 10x Primer, 2 μL de tampón 10x. Añadir 1 μg/μL de concentración de ARN y añadir 0,5 μL de enzima transcriptasa inversa. Aumente el volumen a 20 μL utilizando agua que contenga DEPC.
8. Dé una vuelta corta a las muestras de ADNc durante 1 minuto en RT. Mantenga las muestras en hielo.
9. Encienda el termociclador, desenrosque el panel superior para aflojar el soporte y coloque las muestras en el bloque. Después de colocar las muestras, enrosque bien la tapa.
10. Una vez que el sistema esté encendido, haga clic en Ejecutar. Seleccione la opción Principal , luego ingrese al menú Programas y seleccione la opción CDNA . Defina el volumen de muestra como 20 μL y haga clic en EJECUTAR. El termociclador ejecuta el programa en cuatro pasos. El primer paso es de 25 °C durante 10 minutos, el segundo es de 37 °C durante 2 h, el tercero es de 85 °C durante 5 minutos y el paso final es de 4 °C para siempre.
11. Una vez que el ciclo entra en el cuarto paso, haga clic en Entrar y finalice el ciclo. Recoja las muestras y proceda a la qRT-PCR. Almacene muestras de ARN a -80 °C y muestras de ADNc a -20 °C.
12. Para la detección de citocinas, descongele los reactivos necesarios 2x PCR Master mix, ADNc y sondas para TNF-α, IFN-γ, TGF-β y NFW en hielo.
    NOTA: Todos los reactivos, mezclas de reacción y muestras deben mantenerse en hielo.
13. En un tubo de 100 μL, prepare una muestra de ADNc añadiendo 1 μL de ADNc y 3,5 μL de NFW. Para preparar la mezcla maestra, tome 5 μL de mezcla maestra y agregue 0,5 μL de sonda en un tubo de 100 μL. Mezcle el contenido dando un giro corto. Calcule el número de muestras y genes objetivo y prepare la mezcla de reacción en consecuencia.
    NOTA: Agregue NFW y mezcla maestra al fondo del tubo de 100 μL. Agregue ADNc y sonda a la pared del tubo de centrífuga como precaución para garantizar que se agregue volumen y para evitar la mezcla cruzada de cualquier reactivo.
14. Coloque las tiras de 8 pocillos en el enfriador de PCR. Transfiera 5,5 μL de mezcla maestra y vial que contiene sonda al fondo de cada pocillo en las tiras de 8 pocillos. En consecuencia, repita el paso para todos los genes diana.
15. Transfiera 4,5 μL de la mezcla de ADNc y NFW a la pared del pocillo en tiras de 8 pocillos. En consecuencia, repita el paso para todas las muestras.
16. Selle las tiras con las tapas y dé un giro corto de 10 s para mezclar los genes y las muestras en el pocillo. Coloque la tira en la ranura de muestra qRT-PCR y cierre la ranura.
17. En el escritorio, inicie el software e inicie sesión como invitado. Aparecerá una ventana emergente en la pantalla. Haga clic en Continuar sin conexión.
18. En el menú Configuración, haga clic en Configuración avanzada. En Propiedades del experimento, escriba el nombre del experimento en la pestaña Nombre del experimento. En la opción ¿Qué tipo de experimento desea configurar?, seleccione Cuantificación-CT comparativa (δδ ct).
19. ¿En qué velocidad de rampa desea utilizar en el instrumento? , haga clic en Rápido (~ 40 minutos para completar una carrera). En el menú de configuración de placas, defina los nombres de los genes en la opción Definir objetivos y escriba los nombres de las muestras en Definir muestras.
20. En la pestaña Método de ejecución, escriba 10 μL en Volumen de reacción por pocillo. Justo antes de mantener la etapa, haga clic en Agregar etapa y seleccione Etapa de espera. Cambie la temperatura a 50 °C y el tiempo a 2 min. En la segunda etapa de espera no realice ningún cambio, que será de 95 °C durante 1 s.
21. En la etapa de ciclismo Paso 1, cambie la temperatura a 95 °C y el tiempo a 3 s. En el paso 2, cambie la temperatura a 60 °C y el tiempo a 30 s. Haga clic en Ejecutar para iniciar el ciclo de qRT-PCR.

12. Análisis estadístico

NOTA: Para todos los datos, la media se representa como una barra y la desviación estándar representa la barra de error en un gráfico de barras (valor p< 0,05 se considera significativo).

1. Abra el software de análisis de datos e inserte los datos obtenidos del experimento confocal.
2. Para el análisis de microscopía confocal, aplique el ANOVA ordinario de un factor con la prueba de corrección de Tukey para la comparación de múltiples grupos para la expresión de GFP. Considere los datos con p < 0,05 como estadísticamente significativos. Prepare una representación gráfica de los datos con la media representada como una barra y la desviación estándar representando la barra de error.
3. Para el ensayo de carga de parásitos, cree una nueva hoja e introduzca los datos de recuento de parásitos de 100 macrófagos. Aplique ANOVA de un factor ordinario con corrección de Tukey entre todas las muestras. Considere los datos con un valor de p< 0,05 como estadísticamente significativos.
4. Para ELISA, realice un ANOVA de dos factores con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Para qRT-PCR, realice un ANOVA de un factor con la prueba de corrección de Tukey.

Resultados

La disposición de las partes genéticas que forman el circuito sintético para expresar el circuito sintético se muestra en la (Figura 1A). Las partes correspondientes se clonaron en el vector pEGFP-N1 de forma ortogonal y modular, que se representa en la Figura 1B. La simulación del circuito sintético reveló una dinámica oscilatoria tanto en SDHA como en el represor de tetraciclina. Esta observación sugiere un patrón de expresión recíproca caracterizado por funciones de onda periódicas. El aumento en la concentración de SDHA puede atribuirse a la inducción de doxiciclina, mientras que la expresión de TetR puede ser el resultado de la disminución de los niveles de doxiciclina (Figura 1C). Dada la expresión oscilatoria inducible de SDHA y TetR observada in silico, se diseñó e implementó una estrategia para la entrega de circuitos sintéticos a través del vector plásmido pEGFP-N1.

Las partes de iGEM identificadas para el estudio incluyen BBa_K1493803 para TetO, BBa_K4344028 para la secuencia de Kozak, BBa_C0040 para TetR y BBa_K1537016 para P2A, respectivamente. El ID de acceso de NCBI para SDHA es NM_025848. Estos componentes se ensamblaron para construir un circuito sintético TetON inducible por doxiciclina, que abarca un total de 1317 pares de bases (Archivo Suplementario 1). Como TetO funciona como un elemento regulador del ADN, su secuencia no fue traducida. Se eligió la secuencia aguas abajo de la secuencia de Kozak, que se extiende desde 5' TetR hasta el extremo 3' de P2A, posicionada aguas abajo de SDHA, para la validación in silico de la traducción. La observación reveló la ausencia de codones de parada internos, lo que garantiza una traducción ininterrumpida a lo largo de toda la longitud de la secuencia (Archivo Suplementario 2). Las partes reguladoras de un circuito sintético que comprende 1317 pb se insertaron entre los sitios de restricción NotI y XhoI, que están a 5' aguas arriba de EGFP (Figura 1B). Los resultados de la secuenciación ponen de manifiesto que la secuencia de inserción se clonó en el plásmido (Archivo Suplementario 3).

La introducción de un circuito inmunometabólico en la cepa de E. coli DH5α condujo al crecimiento de colonias transformadas que exhiben resistencia a la kanamicina, el antibiótico empleado como marcador selectivo durante la transformación bacteriana. La abundante presencia de colonias transformadas en la placa de selección fue mayor, lo que sugiere que las células competentes mostraron un alto potencial de transformación, indicativo de la eficiencia del protocolo de transformación utilizado (Figura 1D).

Se aisló una sola colonia y se sembró en 10 mL de LB suplementado con kanamicina para el aislamiento del plásmido. El rendimiento de plásmidos derivado de un cultivo de 10 mL se detalla en la Tabla 1. Para este procedimiento se empleó un método estándar para el aislamiento de plásmidos. Las soluciones tampón se prepararon el día antes del aislamiento del plásmido y se optimizaron las condiciones de incubación para maximizar el rendimiento del plásmido. La concentración de plásmidos obtenida superó 1 μg/μL, con relaciones 260/280 y 260/230 que superaron 1,8 y 2,0, respectivamente. Estos hallazgos indican que los plásmidos aislados eran de alta pureza y desprovistos de contaminantes como proteínas, EDTA, carbohidratos y fenol.

Se evaluó el desplazamiento de la movilidad electroforética para el circuito sintético aislado. La digestión de restricción se realizó utilizando enzimas de restricción NotI y XhoI, ya que fueron los sitios de restricción donde se insertó el circuito sintético. Se observaron dos bandas en gel de agarosa al 1%, una banda cercana a 1500 pb y otra entre 4 kb y 5 kb. Dado que el tamaño del inserto es de 1317 pb, es probable que la banda a 1500 pb corresponda al inserto. El vector pEGFP-N1 tiene un tamaño de 4,7 kb. Por lo tanto, se supone que la banda cercana a 5 kb es el vector pEGFP-N1. En consecuencia, se dedujo que un circuito sintético completo e intacto estaba presente dentro del vector de entrega. Además, se detectó una banda de aproximadamente 6 kb para el circuito sintético intacto no digerido, lo que indica que el vector pEGFP-N1 alberga un inserto de casi 1,3 kb dentro del vector plásmido (Figura 1E).

Figura 1: Diseño y validación de circuito sintético. (A) Representación de circuitos sintéticos mediante el ensamblaje de partes genéticas y componentes reguladores. (B) Gráfico de simulación determinista que muestra la expresión periódica de SDHA y TetR a 100 unidades de tiempo. (C) Circuito sintético transformado de colonias de E. coli DH5α resistentes a kanamicina. La unidad es una unidad de 100 tiempos, ya que es una simulación determinista. (D) Electroforesis en gel de agarosa de circuito sintético intacto y digerido por restricción utilizando enzimas de restricción NotI y XhoI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Concentración de plásmido (μg/mL)	260/280	260/230
1248.5	1.95	2.45
1123.1	1.89	2.43
1155.8	1.87	2.41
1056.8	1.94	2.47

Tabla 1: Rendimiento de la construcción de circuito sintético obtenida después del aislamiento del plásmido. La tabla muestra la concentración de plásmido en μg/mL, su relación 260/280 y 260/230.

En las células control e infectadas, la intensidad de fluorescencia observada fue baja para GFP. Sin embargo, se observó que la transfección del circuito sintético con una proporción de plásmido y PEI de 1:1 con 500 μg/mL de G418 y la inducción con 1 μg/μL de dox inducían una alta expresión de GFP en las células IMT. En las células IMTI a las 6 h, la expresión de GFP también fue significativamente mayor, aunque la expresión de GFP fue menor que en la muestra de IMT (Figura 2A,B). Además, se observó un aumento en la expresión de GFP en las muestras de IMTI de 12 h, IMTI de 18 h y IMTI de 24 h. Este aumento puede deberse a un aumento en el tiempo de infección, que podría haber inducido mayores alternancias metabólicas en macrófagos por parásito residencial¹⁷. Los niveles intracelulares de SDHA podrían verse afectados debido a un aumento en el tiempo de infección¹⁸. A medida que el dox se complementó con estas muestras de IMTI, los niveles de SDHA a través de circuitos sintéticos podrían haber aumentado, lo que condujo a un aumento en la expresión de SDHA.

La tinción con DAPI se realizó para identificar el número de parásitos residenciales en los macrófagos. En 6 h L. de macrófagos principales infectados, el número observado de parásitos intracelulares fue de 6 células por macrófago, que es mayor en comparación con la muestra IMTI de 6 h, que tenía 1-2 parásitos intracelulares por macrófago. Después de la transfección y la inducción de dox, se observó una reducción significativa en la carga parasitaria intracelular en diferentes puntos temporales de la infección (Figura 2C). Las observaciones sugirieron que los circuitos sintéticos pueden haber inducido efectos de eliminación de parásitos al estimular la expresión de SDHA.

Figura 2: Microscopía de barrido láser confocal. Imágenes de muestras de control, infectadas, IMT e IMTI. (A) Análisis de la expresión de GFP en todas las muestras experimentales con una barra de escala de 50 μm para control, 6 h infectadas e IMT, 20 μm para IMTI de 6 h, 10 μm para IMTI de 12 h, IMTI de 18 h, IMTI de 24 h respectivamente. Los canales utilizados fueron DIC, DAPI, GFP e imágenes fusionadas de todos los canales. (B) ANOVA de un factor con la prueba de corrección de Tukey de todas las muestras experimentales (n = 3) para la expresión de GFP (p < 0.05 se considera significativo) Las barras de error representan la desviación estándar. (C) Se realizó un análisis de ANOVA de una vía con la prueba de corrección de Tukey de la carga parasitaria en 100 células de macrófagos para muestras de (A) (n = 3) (p < 0.05 se considera significativo). Las barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La detección de los niveles de IL-10 e IL-12 en los medios de todas las muestras reveló que las concentraciones de IL-10 e IL-12 fueron más altas a las 6 h después de la infección, con una regulación a la baja en los niveles de citocinas después de la infección a las 24 h. No hubo diferencias significativas en los niveles de IL-10 e IL-12 tras la transfección e inducción de circuitos sintéticos. Además, hubo una diferencia no significativa en los niveles de IL-10 e IL-12 en las muestras de puntos de tiempo IMTI (Figura 3). La muestra infectada a las 6 h ya ha sido reportada para mostrar expresión de IL-10 e IL-12^19,20, observándose una diferencia no significativa en IL-10 e IL-12 nos llevó a investigar el efecto del circuito sintético sobre otras citocinas.

Figura 3: ELISA de IL-10 e IL-12 para identificar sus niveles secretores en medios de diferentes muestras. Las muestras (n = 2) incluyen control, 6 h infectados, 24 h infectados, IMT, 6 h IMTI, 12 h IMTI, 18 h IMTI, 24 h IMTI. Se realizó un ANOVA de dos vías con el análisis de la prueba de corrección de Tukey (p <,05 se considera significativo). Las barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La detección de los niveles de transcripción de TNF-α, IFN-γ y TGF-β en muestras infectadas de 6 h, IMT y 24 h IMTI reveló que se observó un aumento significativo de TNF-α a 2,5 veces en la muestra de IMTI de 24 h en comparación con las muestras de infección e IMT (Figura 4). En la muestra de IMTI de 24 h, se observó un aumento de 35 veces en los niveles de IFN-γ en comparación con las muestras de infección y IMT. Los niveles de TGF-β, aunque mostraron una regulación positiva significativa a 1,5 veces en la muestra de IMTI de 24 h, el cambio relativo del pliegue fue menor en comparación con TNF-α e IFN-γ, lo que sugiere que las citocinas proinflamatorias están significativamente reguladas al alza en la muestra de IMTI de 24 h.

Figura 4: Análisis qRT-PCR de citoquinas. (A) TNF-α, (B) IFN-γ y (C) TGF-β para muestras de 6 h infectadas, IMT y 24 h IMTI (n=2). Se realizó un ANOVA de un factor con la prueba de corrección de Tukey (p < 0,05 se considera significativo). Las barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Ficha complementaria 1: Secuencia de nucleótidos de partes genéticas ensambladas para formar el circuito sintético. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Secuencia traducida de circuito sintético que expresa TetR, P2A y SDHA. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Ficha complementaria 3: Resultado de la secuenciación del circuito sintético clonado en el plásmido pEGFP-N1. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Los resultados obtenidos ponen de manifiesto la eficiencia de la tubería, que ha sido canalizada para el diseño e implementación de un circuito sintético. La construcción de este circuito sintético fue un paso hacia el desarrollo de la medicina de precisión para enfermedades infecciosas como la leishmaniasis. A través del ensamblaje in silico de partes genéticas y la simulación determinista, se monitorizó el distinguido efecto modulador del sistema TetON. El efecto del circuito, en particular, podría haber llevado a la expresión biestable recíproca de TetR y SDHA/GFP. La expresión de SDHA fue periódica, lo que podría indicar que solo en presencia de doxiciclina su expresión se incrementó. Para observar los cambios potenciales en los patrones de expresión durante un período, se seleccionó una unidad de tiempo de 100. Los resultados identifican que el circuito sintético mostró un comportamiento periódico para TetR y SDHA/GFP, probablemente atribuible a su naturaleza ortogonal²¹. El ensamblaje de piezas genéticas del registro de partes iGEM desempeñó un papel fundamental, ya que proporcionó los componentes genéticos necesarios para la construcción de circuitos sintéticos²². La disposición modular de las partes genéticas es esencial, ya que la traducción y el funcionamiento del circuito pueden verse afectados, lo que puede conducir a una expresión ineficiente y a un efecto modulador en las células²³.

El tamaño de la inserción del circuito sintético fue de aproximadamente 1,3 kb para garantizar que el tamaño del vector no sea demasiado grande, lo que puede reducir potencialmente la eficiencia de la transformación²⁴. La selección de un vector apropiado es un paso crítico, ya que debe poseer partes genéticas, que son esenciales para aumentar el número de copias en el sistema bacteriano y producir copias de plásmidos altas, y su maquinaria de expresión debe adaptarse bien en el sistema de los mamíferos²⁵. El vector pEGFP-N1 está bien caracterizado en la línea celular RAW264.7 y posee una estructura plásmida compacta con un sitio de clonación múltiple²⁶. Se emplearon soluciones tampón estandarizadas en laboratorio para el aislamiento de plásmidos con el fin de garantizar la producción de plásmidos puros y altamente concentrados, lo que se validó mediante estimación espectrofotométrica y AGE. La inserción del circuito sintético en el vector pEGFP-N1 se validó mediante digestión de restricción, y las muestras se analizaron en AGE y secuenciación. Los resultados de AGE representaron una banda de inserción de 1,3 kb, una banda de 4,7 kb del vector pEGFP-N1 y una banda de 6 kb de todo el circuito sintético.

La transfección se realizó utilizando proporciones 1:1, 1:2 y 2:1 de ADN: PEI, donde la proporción observada de 1:1 funcionó mejor sin alterar la morfología celular (datos no mostrados). Se recomienda utilizar una concentración de 400 μg/mL - 1000 μg/mL de G418 para la selección de células transfectadas²⁷. Se utilizaron 500 μg/mL de G418 para la selección de las células transfectadas, ya que suprimió eficazmente el crecimiento de las células no transfectadas sin comprometer el crecimiento celular o la morfología de las células transfectadas (datos no mostrados). Dada la importancia del fenotipo celular en la eficiencia de la transfección, particularmente en líneas celulares de macrófagos, que pueden sufrir diferenciación y volverse difíciles de transfectar, se utilizó un número de paso bajo de la línea celular RAW264.7 para la transformación²⁸. El número de pasos celulares también podría ser un factor crítico en la eficiencia de la transfección. Un número de paso alto puede conducir a una transfección ineficiente²⁹. Dox es el inductor preferido para el sistema de inducción Tet-ON debido a su alta eficiencia de unión a TetR, distribución tisular favorable, baja toxicidad y una vida media de 24 h³⁰. Después de la transfección, las células fueron inducidas con dox durante 24 h, y se observó la expresión de GFP. Para las células RAW264.7, la concentración de dox utilizada para la inducción de circuitos sintéticos fue de 1 μg/mL, que se encuentra en el rango recomendado de 1-2 μg/mL³¹ (datos no mostrados). Sin embargo, la regulación de la concentración de SDHA después de la inducción fue indeterminada. En general, la determinación y estandarización del número de paso celular, la concentración de ADN: PEI, la concentración de marcadores de selección de transfección en mamíferos y la concentración de inducción de doxiciclina son factores cruciales en el proceso de transfección.

Tras la inducción del circuito sintético post-infección en diferentes momentos temporales, se observó una reducción significativa de la carga parasitaria intracelular. Una comparación de las cargas de parásitos entre las muestras infectadas y las IMTI reveló una menor carga en las células inducidas con el circuito sintético, probablemente atribuible a la expresión de SDHA. Dado que la expresión de SDHA se asocia con la producción de NO, se observó que las células IMTI tienen una forma morfológica irregular y rugosa, que ocurre en la línea celular RAW264.7 cuando se produce NO³². Los niveles de IL-10 e IL-12 después de la infección a las 6 h fueron los más altos, ya que se ha informado que ambas citocinas están reguladas al alza en este momento, lo que experimenta una modificación fenotípica adicional para producir IL-10 más que IL-12¹⁹. Dado que los niveles de IL-10 e IL-12 no alteraron significativamente la post-transfección y en muestras de IMTI, se realizó un perfil de citocinas para detectar respuestas de citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias.

Se identificaron los niveles de expresión de TNF-α, IFN-γ y TGF-β en muestras de infección a las 6 h y de IMT a las 24 h. Para eliminar los parásitos intracelulares, el TNF-α y el IFN-γ son principalmente esenciales, ya que inducen ráfagas oxidativas a través de la producción de NO. Los macrófagos M2 polarizados expresan TGF-β, que regula a la baja las citocinas proinflamatorias³³. La muestra de IMTI a las 24 h mostró una mayor expresión de TNF-α e IFN-γ que TGF-β, lo que sugiere que los macrófagos, tras la transfección e infección con L. major, podrían haberse polarizado a un fenotipo que expresa citocinas proinflamatorias. El estudio, por lo tanto, proporciona información sobre las alteraciones fenotípicas inducidas tras la transfección con un circuito sintético y destaca la dinámica de la infección. Se puede investigar el efecto de los circuitos sintéticos como terapéuticos, ya que su inducción ha aumentado significativamente la expresión de citocinas proinflamatorias en comparación con las citocinas antiinflamatorias. Por lo tanto, el estudio no solo estableció la construcción y entrega de circuitos sintéticos, sino que también demostró su potencial terapéutico en un modelo de leishmaniasis a través de la regulación positiva de citocinas proinflamatorias en células huésped desafiadas por Leishmania.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10 μ L puntas	Tarson	521050
10X tampón de restricción	BioLabs	R0146S	Restricción digestión
1mL puntas	Tarson	521016
1mL	tubo Eppendorf	30121023
200 μ Puntas en L	Tarson	521010
matraz de 25cm2	Corning	430639	Para cultivo celular
4',6-diamidino-2-fenilindol	ThermoFischer Scientific	D1306	tinción nuclear
50 ml	Corning	352070
placas de 60 mm	Falcon	353002
6X TrackIt Cian/Orange Tampón	de cargaThermoFischer Scientific	10488085	Carga de muestras para AGE
96 placa de fondo de cubrepozos	ThermoFischer Scientific	160376	Para la obtención de imágenes confocales y la transfección Micro
placa de prueba de 96 pocillos Pocillos de fondo plano	Tarson	941196
Agarose	Sigma	A9539	para AGE
Montaje de electroforesis en gel de agarosa	GeNei	93	para AGE
Flujo laminar bacteriano	ESCO Lifesciences 2120765		Para la transformación
Cloruro de calcio	Merck	C4901	Tampón / Preparación de reactivos
Flujo de aire laminar para cultivo celular	ThermoFischer Scientific	1323TS	Para cultivo celular
Raspador	Genetix	90020	Para cultivo celular
Esparcidor celular	Fischer Centrífuga Scientific	12822775
para tubos de 1,5 ml	Centrífuga Eppendorf	EP5404000537
para halcón de 50 ml	ThermoFischer Scientific	75004210
Clorode	Fischer Scientific	67-66-3	Para aislamiento de ARN
incubadora de CO2	ThermoFischer Scientific	3110	Para cultivo celular
Cubeta	Eppendorf	6138000018	Estimación de la concentración de plásmidos
CYTIVA IQ 500 generador de imágenes en gel	Cytiva	29655893	para AGE
DEPC TRATADO H2O 1000 ML	ThermoFischer Scientific	750023	Para el aislamiento de ARN
Doxiciclina	Merck	33429	Para la inducción de células transfectadas
Bloque calefactor seco	Labnet		Para la transformación e inactivación de enzimas de restricción
Medio Eagle modificado de Dulbecco	Ciencia		Para cultivo celular
Etanol	Sigma-Aldrich	1.00983	Tampón / Preparación de reactivos
Bromuro de etidio	Sigma	E7637	Para AGE
Ácido etilendiaminérgico tetraacético	Fischer Scientific	12635	Tampón / Preparación de reactivos
Microscopio de campo claro Evos	ThermoFischer Scientific	AMEX1000
ExPasy	https://web.expasy.org/translate/		para la construcción de circuito sintético
Suero fetal bovino	Gibco	16000-044	Para cultivo celular
FV31S-SW software	Olypmus		Adquisición de imágenes
Geneticin	Gibco	1563411	para la transfección Método
montaje de Gibson para la clonación	BIOMATIK		Construcción de un circuito sintético
Prisma Graphpad			Análisis estadístico
Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad	ThermoFischer Scientific	4368814	para la síntesis de ADNc
Isopropanol	Fischer Scientific	13825	Tampón / Preparación de reactivos
Kanamicina	Sigma	60615	Para transformación y selección de colonias
Caldo Luria Bertini	Himedia	M1245	Para cultivo E.coli
Cloruro de magnesio	Fischer Scientific	BP214	Tampón / Preparación de reactivos
Micro Filt Flujo de aire laminar vertical	Microfilt
MicroAmp Fast Tira de 8 tubos, 0,1 mL	ThermoFischer Scientific	4358293	para qRT-PCR
MicroAmp Tiras ópticas de 8 tapas	ThermoFischer Scientific	4323032	para horno microondas qRT-PCR
	LG	MC-7649DW	para AGE
Mm00434228_m1 (IFN-γ)	ThermoFischer Scientific	4331182	Sondas Taqman
Mm00443258_m1 (TNF)	ThermoFischer Scientific	4331182	Sondas Taqman
Mm01321739_m1(TGFB)	ThermoFischer Scientific	4331182	Sondas Taqman
Kit ELISA de ratón IL-10	ThermoFischer Scientific	BMS614	para ELISA
Kit ELISA de ratón IL-12	ThermoFischer Scientific	BMS616	para ELISA
Multiskan Sky con pantalla táctil + μ Placa de caída	ThermoFischer Scientific	51119600DP	para mezcladores de microplacas ELISA
MX-M Mezclador de placas de cultivo celular de 96 pocillos ajustable 0-1500 rpm Agitador agitador de laboratorio	DIAB
Centro Nacional de Biotecnología	https://www.ncbi.nlm.nih.gov		de información para la construcción de circuitos sintéticos
Cámara de Neubauer	Marienfeld superior	640010	Para el recuento de células
Matraz sin ventilación de 25cm2	Corning 353014		Para el cultivo de parásitos
NotI	BioLabs	R3189M	Enzima de restricción
Agua libre de nucleasas	Biodesign	1QIA	Preparación de reactivos
Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 software	Olypmus		Procesamiento de imágenes
Olympus FV 3000	Olympus		Para la adquisición de imágenes confocales
Medios OPTI-MEM	Medios 31985070 Gibco		para la transfección
Vector pEGFP-N1 clonado con circuito sintético	Biomatik
Penicilina	ThermoFischer Scientific	15070063	Para cultivo celular
Polietilenimina	MERCK	764965	para transfección
Acetato de potasio	Fischer Tampón	de YBP364500	/ Preparación de reactivos
Cloruro de potasio	Fischer Scientific	BP366	Tampón / Preparación de reactivos
Fosfato de potasio Monobásico	Sigma	P5655	Tampón / Preparación de reactivos
Paquete de alimentación	BIORAD	1645070	para AGE
Registro de partes biológicas estándar https://parts.igem.org/Main_Page			para la construcción de circuitos sintéticos
RNAiso Plus	Takara	38220090	para el aislamiento de ARN
ARNasa A	ThermoFischer Scientific		12091021 Preparación de tampones / reactivos
Roswell Park Memorial Institute Medio	Nacional de Ciencias		Para el cultivo de parásitos
incubadora Shaker	REMI	CIS 24 plus	Para el cultivo de E.coli
Cloruro de sodio	Qualigens	Q27605	Tampón / Preparación de reactivos
Dodecil sulfato de sodio	Sigma-Aldrich	L3771	Tampón / Preparación de reactivos
Hidróxido de sodio	Fischer Scientific	15895	Tampón / Preparación de reactivos
Fosfato de sodio Dibasic	Sigma	S5136	Tampón / Reactivo preparación
Espectrofotómetro	Eppendorf		Estimación de la concentración de plásmidos
Spin win	Trason	1020
StepOne plus Sistema de PCR en tiempo real	Tecnologías de vida 272006777		Para el software qRT-PCR
StepOne versión 2.3	Tecnologías		Para qRT-PCR
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), sin AmpErase UNG	ThermoFischer Scientific	4366072
Tinker cell			Construcción y simulación de circuitos sintéticos
Escalera de ADN TrackIt 1 Kb Plus	ThermoFischer Scientific 10488085	para
Clorhidrato de aminometano Tris (hidroximetil) Himedia		MB029	Tampón / Preparación de reactivos
Tris-acetato-EDTA	SERVA	42549.1	Tampón / Preparación de reactivos
Azul de tripano	Sigma	T8154	Para recuento de células
XhoI	BioLabs	R0146S	Enzima de restricción