Artículo de método

Integración de la evaluación del comportamiento animal y la red neuronal convolucional para estudiar la interacción sabor-olor entre el wasabi y el alcohol

DOI:

10.3791/66981

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16 de agosto de 2024

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1State Key Laboratory of Environmental and Biological Analysis, Department of Chemistry, Hong Kong Baptist University, 2Guangdong-Hong Kong-Macao Joint Laboratory for Contaminants Exposure and Health, School of Environmental Science and Engineering, Institute of Environmental Health and Pollution Control, Guangdong University of Technology, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Research and Development of Natural Drugs, and School of Pharmacy, Guangdong Medical University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo describe un conjunto de métodos para medir la capacidad supresora de inhalar bebidas alcohólicas en la sensación de escozor provocada por el wasabi.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las pastas comerciales de wasabi comúnmente utilizadas para la preparación de alimentos contienen un compuesto homólogo de isotiocianatos quimiosensoriales (ITC) que provocan una sensación irritante al consumir. Nunca se ha estudiado el impacto de inhalar bebidas alcohólicas dietéticas en la sensación de picante de wasabi. Si bien la mayoría de los estudios de evaluación sensorial se centran en alimentos y bebidas individuales por separado, existe una falta de investigación sobre el estudio olfativo de inhalar licor mientras se consume wasabi. Aquí, se desarrolla una metodología que combina el uso de un estudio de comportamiento animal y una red neuronal convolucional para analizar las expresiones faciales de ratones cuando huelen licor y consumen wasabi simultáneamente. Los resultados demuestran que el modelo de aprendizaje profundo entrenado y validado reconoce el 29% de las imágenes que representan el tratamiento conjunto de wasabi y alcohol pertenecientes a la clase del grupo wasabi-negativo-licor positivo sin necesidad de filtrado previo de materiales de entrenamiento. El análisis estadístico de las puntuaciones de la escala de muecas de ratón obtenidas de las imágenes de fotogramas de vídeo seleccionadas revela una diferencia significativa (P < 0,01) entre la presencia y la ausencia de licor. Este hallazgo sugiere que las bebidas alcohólicas dietéticas podrían tener un efecto decreciente en las reacciones provocadas por el wasabi en ratones. Esta metodología combinatoria tiene potencial para el cribado de compuestos individuales del ITC y el análisis sensorial de los componentes del aguardiente en el futuro. Sin embargo, se requieren más estudios para investigar el mecanismo subyacente de la supresión de la acritud del wasabi inducida por el alcohol.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La wasabia japonica, comúnmente conocida como wasabi, ha ganado reconocimiento en la preparación de alimentos 1,2. Es bien conocida la intensa experiencia sensorial que provoca al consumirla, caracterizada por lagrimeo, estornudos o tos. Esta acritud distintiva del wasabi puede atribuirse a un compuesto homólogo de isotiocianatos quimiosensoriales (ITC). Son fitoquímicos organosulfurados volátiles que se pueden clasificar en ω-alquenilo y ω-metiltioalquilo isotiocianatos3. Entre estos compuestos, el isotiocianato de alilo (AITC) es el producto ITC natural más predominante que se encuentra en plantas pertenecientes a la familia Cruciferae, como el rábano picante y la mostaza4. Las pastas comerciales de wasabi se preparan comúnmente a partir de rábano picante, lo que convierte al AITC en un marcador químico utilizado para el control de calidad de estos productos comerciales5.

El maridaje de bebidas alcohólicas dietéticas con platos con infusión de wasabi puede considerarse un ejemplo de disposición cultural6. Subjetivamente, esta combinación puede complementar el picante y el picante entre el wasabi y el licor, mejorando la experiencia culinaria en general. La evaluación cualitativa del comportamiento animal (QBA) es un enfoque metodológico integral que examina los cambios de comportamiento en los sujetos en respuesta a estímulos externos a corto o largo plazo utilizando términos numéricos7. Este método abarca pruebas de dolor, pruebas motoras, pruebas de aprendizaje y memoria, así como pruebas de emociones diseñadas específicamente para modelos de roedores8. Sin embargo, los estudios que investigan la evaluación sensorial sinérgica de la gustación junto con el olfato siguen siendo escasos en la literatura hasta ahora 9,10. La mayoría de los estudios sobre la sensación quimiestésica se limitan a examinar el consumo individual de alimentos y bebidas por separado11. En consecuencia, hay una escasez de investigación sobre la interacción sabor-olor que implica el acto de inhalar licor mientras se consume wasabi.

Dado que se cree que la sensación de picadura inducida por el wasabi es una forma de nocicepción12, las evaluaciones del comportamiento animal son adecuadas para evaluar las respuestas sensoriales nociceptivas en animales roedores 8,13,14. Langford et al.15,16 desarrollaron un método para evaluar la nocicepción en ratones, conocido como puntuación de la escala de muecas de ratón (MGS)15,16. Este método de estudio conductual es un enfoque de evaluación relacionado con el dolor, que se basa en el análisis de las expresiones faciales exhibidas por los ratones experimentales. La configuración experimental es sencilla, ya que incluye una jaula transparente y 2 cámaras para la grabación de vídeo. Mediante la incorporación de tecnologías avanzadas 17,18,19 para la captura automática de datos, se pueden obtener medidas cuantitativas y cualitativas de comportamiento, mejorando el bienestar animal durante el monitoreo conductual 20. En consecuencia, el MGS tiene el potencial de ser aplicado en el estudio de los efectos de diversos estímulos externos en animales de una manera ininterrumpida y ad libitum. Sin embargo, el proceso de puntuación solo implica la selección de unas pocas (menos de 10) imágenes de fotogramas de video para su evaluación por parte de los panelistas, y es necesaria una capacitación previa. Puntuar un gran número de imágenes de muestra puede ser laborioso. Para superar este desafío que requiere mucho tiempo, varios estudios han empleado técnicas de aprendizaje automático para predecir la puntuación MGS 21,22. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el MGS es una medida continua. Por lo tanto, un modelo de clasificación multiclase sería más adecuado para evaluar un problema lógico y categórico, como determinar si las imágenes de ratones ingiriendo wasabi y oliendo licor simultáneamente se parecen a las de ratones normales.

En este estudio se propuso una metodología para investigar la interacción gusto-olor en ratones. Esta metodología combina estudios de comportamiento animal con una red neuronal convolucional (CNN) para analizar las expresiones faciales de los sujetos ratones. Dos ratones fueron observados tres veces en condiciones normales de comportamiento, durante la experiencia de nocicepción inducida por wasabi y mientras inhalaban licor en una jaula específicamente diseñada. Las expresiones faciales de los ratones se grabaron en vídeo y las imágenes de fotogramas generadas se utilizaron para optimizar la arquitectura de un modelo de aprendizaje profundo (DL). A continuación, el modelo se validó utilizando un conjunto de datos de imágenes independiente y se desplegó para clasificar las imágenes adquiridas del grupo experimental. Para determinar el grado de supresión de la acritud del wasabi cuando los ratones inhalaron simultáneamente licor durante el consumo de wasabi, los conocimientos proporcionados por la inteligencia artificial se corroboraron aún más a través de la validación cruzada con otro método de análisis de datos, la puntuación MGS16.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este estudio, se utilizaron dos ratones machos ICR de 7 semanas de edad que pesaban entre 17 y 25 g para la evaluación del comportamiento animal. Todos los procedimientos experimentales y de alojamiento fueron aprobados por el Comité de la Universidad Bautista de Hong Kong sobre el Uso de Sujetos Humanos y Animales en la Enseñanza y la Investigación. La sala de los animales se mantuvo a una temperatura de 25 °C y una humedad ambiental de 40%-70% en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h.

1. Diseño de la jaula

  1. Prepare ladrillos de estireno acrilonitrilo butadieno en 3 dimensiones diferentes para la construcción de jaulas: 8 mm x 8 mm x 2 mm, 16 mm x 16 mm x 6 mm y 32 mm x 16 mm x 6 mm.
  2. Prepare una placa de acrilonitrilo butadieno estireno (312 mm x 147 mm x 2 mm) como base de la jaula.
  3. Prepare una placa acrílica no transparente de 239 mm x 107 mm con un grosor de 2 mm para utilizarla como placa inferior.
  4. Prepare una placa acrílica transparente de 239 mm x 107 mm con un grosor de 5 mm para utilizarla como placa superior.
  5. Prepare una placa acrílica transparente de 107 mm x 50 mm con un grosor de 7 mm para utilizarla como placa terminal.
  6. Construya 2 paredes laterales opacas apilando ladrillos a una altura de 54 mm.
  7. Incruste las placas acrílicas en la jaula a base de acrilonitrilo butadieno estireno, como se ilustra en la Figura 1A.
  8. Prepare una cámara de chows construida con cinco placas acrílicas transparentes de 90 mm x 50 mm con un grosor de 2 mm, como se ilustra en la Figura 1B. Entre las 5 placas acrílicas transparentes, use 2 placas para los lados, 1 placa para la parte superior, 1 placa para la parte inferior y 1 placa para el terminal.
  9. Prepare una placa acrílica transparente de 60 mm x 50 mm y 2 mm como plato de introducción al chow y colóquelo en la cámara del chow.

2. Evaluación del comportamiento animal

  1. Aloja a los compañeros de camada de 2 ratones machos ICR de 7 semanas juntos en una jaula normal.
  2. Proporcione a los compañeros de camada de 2 ratones acceso libre a gránulos de comida y agua del grifo durante un período de adaptación de 1 semana.
  3. Después de 1 semana, introduzca a los compañeros de camada de 2 ratones con una botella de etanol (~40% v/v).
    NOTA: Asegúrese de que solo se les permita inhalar o inhalar el etanol acuoso proporcionado ad libitum mientras se restringe el consumo de alcohol.
  4. Realice experimentos de comportamiento utilizando el modelo de ratón de 9 a 10 semanas de edad y la jaula de cubículo transparente que se muestra en la Figura 1A.
  5. Desmonte todas las placas acrílicas y las placas de acrilonitrilo butadieno estireno y límpielas a fondo. Comience enjuagándolos con agua ultrapura al menos 3 veces y luego séquelos con toallas de papel. A continuación, rocíelos con etanol al 75%, seguido de una limpieza con papel para lentes. Finalmente, déjalos secar al aire durante al menos 15 min.
  6. Pesa a los ratones y registra sus pesos corporales antes de cada repetición del experimento conductual.
  7. Prepara una mezcla de wasabi y mantequilla de cacahuete con un peso de 1 g de wasabi comercial y 4,5 g de mantequilla de cacahuete. Mézclalos en una bolsa de plástico con cierre.
    NOTA: Debido a la volatilidad de los isotiocianatos en el wasabi, es importante almacenar el wasabi comercial en un congelador a -20 °C.
  8. Pese y proporcione dos pastas de 0,5 g de mantequilla de maní o una mezcla de wasabi y mantequilla de maní en el plato de introducción de comida, como se ilustra en la Figura 1B, C.
  9. Coloque el plato de introducción de comida preparado en la cámara de los comidas, como se ilustra en la Figura 1B, C, para permitir que los 2 ratones tengan acceso ad libitum a la comida durante cada sesión de grabación de video.
  10. Llene la ranura inferior con 30 mL de líquido, ya sea agua pura o licor (~42% v/v de etanol), para facilitar la inhalación simultánea, como se indica en la Figura 1B, C.
  11. Comience a grabar usando las cámaras de 2 teléfonos inteligentes colocados en los soportes para teléfonos en cada terminal.
    NOTA: Las especificaciones de los videos son las siguientes: ancho de fotograma, 1920; altura del marco, 1080; velocidad de datos, 20745 kbps; velocidad de fotogramas, 30,00 fotogramas por segundo (fps).
  12. Coloque con cuidado a los 2 compañeros de camada entrenados de ratones en la plataforma de estudio de comportamiento animal diseñada desde la parte superior y asegure rápidamente la jaula con la placa superior.
    NOTA: Asegúrese de que este paso se complete dentro de los 15 s.
  13. Graba cada video durante 2-3 minutos.
    NOTA: Asegúrese de que toda la duración del experimento, desde la preparación de la mezcla de mantequilla de maní y wasabi hasta la finalización de la grabación de video, se limite a 5 minutos.
  14. Repite todo el experimento 3 veces.
    NOTA: Asegúrese de que cada réplica del experimento esté separada durante al menos 6 h.
  15. Imita diferentes escenarios.
    NOTA: Por ejemplo, en este trabajo, se utilizó un par de ratones en 4 grupos con 4 escenarios diferentes que se imitaron utilizando el entorno experimental descrito anteriormente. Estos escenarios incluyen el Escenario A para el estudio de antecedentes, el Escenario B para el estudio de control positivo, el Escenario C para el estudio de interacción sabor-olor entre el wasabi y el alcohol y el Escenario D para el estudio de control negativo. En la Tabla 1 se presenta un resumen de estos escenarios.

3. Reconocimiento de imágenes

Al igual que muchos estudios sobre el procesamiento de imágenes 23,24,25, se logró un modelo de clasificación mediante el entrenamiento de una CNN. El script para las operaciones DL se escribió en Python v.3.10 en Jupyter Notebook (anaconda3). Está disponible en el siguiente repositorio de GitHub: git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git. Para construir y entrenar la CNN, se utilizaron bibliotecas de código abierto, incluyendo numpy v.1.21.5, seaborn v.0.11.2, matplotlib v.3.5.2, cv2 v.4.6.0, sklearn v.1.0.2, tensorflow v.2.11.0 y keras v.2.11.0. Estas bibliotecas proporcionaron las herramientas y la funcionalidad necesarias para desarrollar y entrenar CNN para el reconocimiento de imágenes.

  1. Exporte una serie de imágenes de fotogramas de vídeo de los clips de vídeo recopilados para generar un conjunto de datos para el entrenamiento del modelo mediante el Jupyter Notebook proporcionado, denominado Step1_ExtractingAndSavingVideoFrameImages.ipynb.
  2. Seleccione solo las imágenes con al menos 1 mouse consumiendo el pegado proporcionado. Se proporcionan ejemplos de las imágenes seleccionadas en la Figura complementaria 1, la Figura complementaria 2, la Figura complementaria 3, la Figura complementaria 4, la Figura complementaria 5, la Figura complementaria 6 y la Figura complementaria 7.
  3. Realice el aumento de datos volteando horizontalmente las imágenes generadas mediante la implementación del script proporcionado en Jupyter Notebook, denominado Step2_DataAugmentation.ipynb.
  4. Reserve los datos de imagen de cada segunda replicada para la validación externa del modelo CNN independiente. Utilice las imágenes de cada primera y tercera réplica para el entrenamiento y las pruebas del modelo interno.
  5. Preprocese los datos de imagen utilizados en el modelado de CNN mediante la ejecución del script en Jupyter Notebook, denominado Step3_CNNmodeling_TrainTest.ipynb, incluido el cambio de tamaño de la imagen, la conversión de color negro y la normalización de la señal de imagen.
  6. Divida los materiales de capacitación en conjuntos de datos internos de capacitación y prueba de forma aleatoria 8:2.
  7. Inicialice la arquitectura de CNN. Diseñe el número de salidas de CNN en función del número de escenarios que se van a examinar.
    NOTA: Por ejemplo, en este estudio, la red neuronal fue designada para clasificar 3 clases. Asegúrese de que se ha compilado el script para controlar el desequilibrio de datos en el peso de la clase.
  8. Encuentre la combinación de hiperparámetros que produce una pérdida mínima en las muestras de prueba internas para la construcción de CNN.
  9. Adopte la combinación óptima de hiperparámetros para construir la arquitectura CNN.
  10. Abra los Jupyter Notebooks proporcionados Step4_CNNmodel_ExternalValOriginal.ipynb y Step5_CNNmodel_ExternalValFlipped.ipynb. Validar el modelo obtenido utilizando las imágenes independientes (originales y volteadas) de la segunda réplica del experimento de comportamiento animal.
  11. Implemente el modelo obtenido y validado para clasificar las imágenes de fotogramas de vídeo generadas a partir del grupo experimental mediante Jupyter Notebook Step6_CNNmodel_Application.ipynb.
    NOTA: Por ejemplo, es el escenario C en este trabajo.

4. Puntuación manual de la escala de muecas del ratón

NOTA: Para validar los insights proporcionados por la predicción del modelo CNN, se aplicó otro método previamente desarrollado y validado por Langford et al.16. Este método consiste en puntuar el MGS en función de las 5 unidades de acción facial (AU) específicas del ratón: estiramiento orbital, protuberancia de la nariz, protuberancia de las mejillas, endurecimiento de las orejas hacia afuera y cambio de bigotes. A cada AU se le asigna una puntuación de 0, 1 o 2, lo que indica la ausencia, la presencia moderada o la presencia obvia de la UA, respectivamente. Este sistema de puntuación permite cuantificar y escalar cada AU para evaluar el nivel de nocicepción o malestar experimentado por los ratones.

  1. Captura 3 imágenes de fotogramas de vídeo de los compañeros de camada ingiriendo la pasta para cada clip de vídeo. Asegúrese de que cada fotograma esté separado por al menos 3 segundos.
  2. Bloquee el código y reordene aleatoriamente las imágenes de diferentes clases de escenarios en secuencia utilizando el archivo de plantilla proporcionado denominado "shuffleSlides.pptm" (archivo complementario 1) y ejecutando el código de macro incrustado.
  3. Invite al menos a 10 panelistas a puntuar las imágenes de muestra.
  4. Entrene a los panelistas para que puntúen muestras de imágenes utilizando el MGS. Proporcionar a los panelistas materiales de capacitación que incluyan el artículo original sobre MGS y su manual15,16.
  5. Calcule la puntuación MGS de cada sujeto animal en un fotograma capturado promediando todos los puntos de puntuación de las 5 AU faciales correspondientes. Presentar la puntuación MGS como la media ± error estándar de medición (SEM).
  6. Determine si existen diferencias estadísticamente significativas entre las diferentes clases de escenarios mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba post-hoc de comparación múltiple de Bonferroni.
    NOTA: Un valor de P < 0,05 se considera estadísticamente significativo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El objetivo principal de este estudio es establecer un marco sólido para investigar la interacción gusto-olor en ratones. Este marco incorpora el uso de la inteligencia artificial y la QBA para desarrollar un modelo de clasificación predictiva. Además, los conocimientos obtenidos de DL se validan de forma cruzada con una evaluación cuantitativa de MGS para un análisis interno independiente. La aplicación principal de esta metodología es examinar el grado de supresión de la nocicepción invocada por el wasabi cuando los ratones huelen bebidas alcohólicas dietéticas.

Reconocimiento del 29% de las imágenes de cotratamiento con wasabi-alcohol pertenecientes a la clase del grupo wasabi-negativo-licor-positivo por el modelo de aprendizaje profundo
La reacción facial exagerada puede ocurrir en los seres humanos tras el consumo comercial de pasta de wasabi. Una experiencia similar también se pudo observar en ratones (Video Suplementario 1). Debido a que la nocicepción sensorial está bien correlacionada con las expresiones faciales en roedores, se monitorearon los comportamientos de 2 compañeros de camada para determinar su respuesta cuando se les proporcionaban comidas que contenían o carecían de wasabi comercial. En este estudio, se entrenó a un CNN utilizando técnicas de DL. Debido a que se realizaron 3 réplicas para cada escenario, los materiales de imagen delas réplicas 1 y 3 se utilizaron para el ajuste y las pruebas internas de los hiperparámetros del modelo CNN. La evolución de la arquitectura CNN en este estudio se detalla en la Tabla 2. La arquitectura optimizada de la CNN consistía en una capa de entrada con una resolución de 268 x 268 píxeles, seguida de 4 capas de convolución bidimensionales, cada una con 8 filtros. Además, se incorporaron 2 capas de agrupación, 2 capas de descarte, una capa de aplanamiento y 2 capas densas para la tarea de clasificación de 3 clases. Consulte el Archivo Complementario 2 para la arquitectura CNN.

El modelo de este estudio se entrenó utilizando un conjunto de datos de 35.486 imágenes y se probó en 8.872 imágenes a lo largo de 7 épocas. El rendimiento del modelo entrenado durante el entrenamiento, incluidas métricas como la pérdida, la relación precisión-recuperación, la precisión y la sensibilidad (o recuperación), en los conjuntos de datos internos de entrenamiento y prueba se puede ver en la figura complementaria 8A-D. El modelo demostró su exactitud, precisión y sensibilidad de 1 tanto para el entrenamiento interno como para los conjuntos de pruebas. Esto indica que las predicciones del modelo se alinearon con las clases reales de las imágenes en los conjuntos de datos internos de entrenamiento y de prueba. Después del entrenamiento del modelo, las imágenes de la2ª réplica se utilizaron para garantizar y validar de forma independiente que el sobreajuste no era un problema para el modelo CNN alcanzado. El modelo mostró su robustez de predicción por los valores de exactitud, precisión y sensibilidad de 1 para 4.820 imágenes en el estudio de fondo (escenario A), 3.900 imágenes en el estudio de control positivo (escenario B) y 2.731 imágenes en el estudio de control negativo (escenario D). El modelo predictivo obtenido se implementó para clasificar las imágenes de fotogramas de video de ratones olfateando alcohol y consumiendo mantequilla de maní que contenía wasabi (escenario C) en diferentes escenarios de estudio, es decir, escenarios A, B y D. Los resultados muestran que el 0% y el 29% de las imágenes se clasificaron en las clases de estudio de fondo (escenario A, agua pura y mantequilla de maní sin wasabi presentes) y estudio de control negativo (escenario D, bebida espirituosa china y mantequilla de maní sin wasabi presentes), respectivamente, mientras que el 71% de las imágenes se clasificaron como las clases de grupo de control positivo (escenario C, donde estaban presentes agua pura y mezcla de wasabi y mantequilla de maní). Estos hallazgos implican que la presencia de licor dietético podría reducir la nocicepción evocada por el wasabi en ratones. Para evaluar lo que la máquina aprendió de los materiales de capacitación proporcionados, se generaron mapas de características para cada capa de convolución. Como se muestra en la Figura Suplementaria 9A-D, se observó que la atención de la máquina se centraba en una variedad de rasgos faciales como los ojos, la órbita, la nariz, los bordes de las mejillas y el cuerpo, las orejas, y también en la superficie de contacto de los chows. Sobre la base de estas observaciones, se llevó a cabo otro método de análisis de datos, el MGS. El MGS se centra en las AU faciales de ratones, lo que permite una evaluación estadística y una mayor validación de la capacidad de supresión de la presentación de bebidas alcohólicas a la nocicepción inducida por wasabi.

La puntuación manual de la escala de muecas del ratón valida estadísticamente las predicciones de aprendizaje automático.
La intensidad de la nocicepción evocada por wasabi se evaluó utilizando la puntuación MGS, que asigna puntuaciones que van de 0 a 2, donde la puntuación 0 representa la menos grave y la puntuación 2 indica la respuesta más grave. En este estudio, las puntuaciones de MGS de 24 ratones (es decir, 2 ratones se presentaron en las 12 imágenes seleccionadas como Figura Suplementaria 10, Figura Suplementaria 11, Figura Suplementaria 12, Figura Suplementaria 13 mostrada) fueron evaluadas por 22 panelistas entrenados. El análisis de la camada de 2 ratones, con experimentos por triplicado, mostró que las precisiones intra-lote y las precisiones entre lotes tenían una derivación estándar relativa que oscilaba entre 0%-25% y 9%-33%, respectivamente. Esto indica una buena precisión y consistencia en el proceso de puntuación de MGS. Se observó una diferencia significativa entre las puntuaciones de MGS de los ratones que recibieron una pasta de mantequilla de maní (Figura 3A, 0,73 ± 0,04) y los que recibieron una mezcla de wasabi y mantequilla de maní (Figura 3B, 1,59 ± 0,11). Esto valida la configuración experimental para el estudio del comportamiento animal y confirma la eficacia del wasabi en la inducción de respuestas nociceptivas. A pesar de que el vapor de alcohol liberado por debajo de la bebida alcohólica proporcionada (~42% v/v de alcohol) podría ser irritante, la puntuación MGS (Figura 3D, 0,86 ± 0,16) no mostró una diferencia significativa en comparación con el grupo control (Figura 3A, 0,73 ± 0,04). Sin embargo, se observó una diferencia significativa entre las puntuaciones de MGS de los ratones provistos con la mezcla de wasabi y mantequilla de maní (Figura 3B, 1,59 ± 0,11) y los expuestos al vapor de alcohol durante el consumo de wasabi (Figura 3C, 0,95 ± 0,07) con un valor de P de <0,05. Estos hallazgos sugieren que la aplicación conjunta de wasabi y bebidas alcohólicas podría disminuir potencialmente la irritación inducida por el wasabi, alineándose con la perspectiva de la inteligencia artificial. Se justifica una investigación más profunda para explorar el ingrediente efectivo dentro del licor chino proporcionado que contribuye a la supresión de la acritud del wasabi, probablemente atribuible a la presencia de etanol.

Ejemplo de código que ya está disponible. Todo el código para realizar el reconocimiento de imágenes asociado con el envío actual está disponible en un repositorio público de GitHub: git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git. Cualquier actualización también se publicará en el repositorio de GitHub con una cita del DOI final de este trabajo.

figure-results-1
Figura 1: Configuración experimental para el estudio del comportamiento animal relacionado con el dolor. (A) Toda la configuración para grabar en video las expresiones faciales de 2 ratones mediante el uso de las cámaras de 2 teléfonos inteligentes colocados en el teléfono se encuentra en cada terminal. (B) La cámara de los chows utilizada para proporcionar dos pastas de 0,5 g de mantequilla de maní o una mezcla de wasabi y mantequilla de maní a 2 ratones ad libitum , y se llenaron 30 mL de líquido (agua o licor de ~ 42% v / v) en la ranura debajo de las pastas para inhalación concurrente. (C) Una mirada más cercana de la ranura que se llenó con 30 mL de líquido y contenía 2 pastas de mezcla de wasabi y mantequilla de maní. La mezcla se preparó mezclando 1 g de wasabi comercial en 4,5 g de mantequilla de maní. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Arquitectura del modelo de red neuronal convolucional y su entrada y salida. Se utilizaron imágenes de 3 escenarios diferentes para el entrenamiento, incluido el escenario A para el estudio de antecedentes, el escenario B para el estudio de control positivo y el escenario D para el estudio de control negativo. Las imágenes del escenario C para el estudio de interacción sabor-olor wasabi-alcohol se clasificaron en los escenarios A, B o D después del entrenamiento del modelo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Las puntuaciones de la escala de muecas de ratón (MGS) de los ratones a los que se les proporcionaron diferentes comidas. La puntuación MGS es de 0 a 2, donde la puntuación 0 representa la menos grave y la puntuación 2 para la más grave. La escala MGS de referencia fue adaptada de Langford et al. (2010)16. La mueca de los ratones a los que se les proporcionó (A) mantequilla de maní para su consumo obtuvo una puntuación de 0,73 ± 0,04; (B) una mezcla de wasabi y mantequilla de maní (1 g de wasabi comercial en 4,5 g de mantequilla de maní) para ingerir obtuvo una puntuación de 1,59 ± 0,11; (C) una mezcla de wasabi y mantequilla de maní para la ingestión, mientras que la inhalación de alcohol estaba disponible desde el aguardiente proporcionado por debajo (~ 42% v/v de alcohol), puntuó 0.95 ± 0.07; (D) la mantequilla de maní para el consumo, mientras que la inhalación de alcohol estaba disponible desde el fondo proporcionado aguardiente, puntuó 0.86 ± 0.16. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ns, no hubo diferencia significativa a través del análisis de varianza unidireccional con la prueba post-hoc de comparación múltiple de Bonferroni bajo un intervalo de confianza del 95%. Las barras de error representaban el error estándar de mediciones (SEM). Se realizaron mediciones por triplicado para 2 ratones en cada escenario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Resumen de los cuatro escenarios imitados en la evaluación del comportamiento animal. Observaciones: a La mezcla se preparó mezclando 1 g de wasabi comercial en 4,5 g de mantequilla de maní. b Aguardiente chino que contiene ~42% v/v de alcohol. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Resumen del rendimiento del modelo. Los hiperparámetros de un tamaño de lote de 64, el número de filtro de la1ª capa de convolución 2D de 8 sin la siguiente caída, el número de filtro de la2ª capa de convolución 2D de 8, el número de filtro de la3ª capa de convolución 2D de 8 con 0,1 de caída, el número de filtro de la4ª capa de convolución 2D de 8, y el número de filtro de la capa densa de 64 con un abandono de 0,5 produjo la pérdida más baja para el conjunto de pruebas divididas internas. Estos hiperparámetros se adoptaron para entrenar un modelo de clasificación de 3 grupos (escenario A, B y D) para predecir las imágenes del escenario C. El escenario A fue para el estudio de fondo. El escenario B fue para el estudio de control positivo. El escenario D fue para el estudio de control negativo. El escenario C fue para el estudio de la interacción sabor-olor entre el wasabi y el alcohol. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura complementaria 1: Ejemplos de materiales de formación para el aprendizaje profundo de la clase del escenario A (estudio de antecedentes). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Ejemplos de materiales de capacitación para el aprendizaje profundo de la clase del escenario B (estudio de control positivo). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Ejemplos de materiales de capacitación para el aprendizaje profundo de la clase del escenario D (estudio de control negativo). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 4: Predicciones y ejemplos de materiales independientes de la clase del escenario A (estudio de antecedentes) para la validación del modelo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 5: Predicciones y ejemplos de materiales independientes de la clase del escenario B (estudio de control positivo) para la validación del modelo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura 6 complementaria: Predicciones y ejemplos de materiales independientes de la clase del escenario D (estudio de control negativo) para la validación del modelo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 7: Predicciones y materiales de ejemplo de la clase de escenario C (estudio de interacción sabor-olor wasabi-alcohol) para la aplicación del modelo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 8: Rendimiento predictivo del modelo óptimo de aprendizaje profundo. (A) Pérdida de capacitación y pérdida de validación interna a lo largo de 7 épocas; (B) Curvas de precisión-recuperación, (C) Precisión y (D) Recuperación del entrenamiento y validación interna a lo largo de 7 épocas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura 9 suplementaria: Mapas de características de cada capa de convolución. Mapas de características de la (A) primera, (B) segunda, (C) tercera y (D) última capa de convolución en los escenarios A, B y D, ordenados de mayor a menor. El escenario A era para el estudio de antecedentes. El escenario B fue para el estudio de control positivo. El escenario D fue para el estudio de control negativo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 10: Imágenes seleccionadas para la puntuación manual de la escala de muecas del ratón para el escenario A (estudio de antecedentes). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 11: Imágenes seleccionadas para la puntuación manual de la escala de muecas del ratón para el escenario B (estudio de control positivo). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 12: Imágenes seleccionadas para la puntuación manual de la escala de muecas del ratón para el escenario C (estudio de interacción entre el sabor y el olfato wasabi-alcohol). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 13: Imágenes seleccionadas para la puntuación manual de la escala de muecas del ratón para el escenario D (estudio de control negativo). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario 1: Muecas de ratones después del consumo de wasabi con presencia o ausencia de bebidas alcohólicas subproporcionadas. De 0 s a 8 s, el videoclip presentó las expresiones faciales normales de los ratones al consumir mantequilla de maní. De los 8 s a los 17 s, ilustró las muecas de los ratones al ingerir wasabi. Los ratones mostraron endurecimiento orbital, protuberancia de la nariz, protuberancia de las mejillas, apretamiento de las orejas hacia afuera y cambio de bigotes. De los 17 a los 29 s, se presentó que la nocicepción inducida por el wasabi podía suprimirse cuando el alcohol estaba disponible debajo. Desde los 29 s hasta el final, mostró una colección de muecas en diferentes escenarios descritos anteriormente. Tenga en cuenta que el video proporcionado solo se usa a título ilustrativo. Su calidad es diferente de los requisitos de calidad descritos para el reconocimiento y modelado de imágenes. Haga clic aquí para descargar este video.

Archivo complementario 1: shuffleSlides.pptm. Presentación complementaria habilitada para macros de Microsoft PowerPoint, denominada "shuffleSlides.pptm". Este archivo se preparó para mezclar imágenes para la prueba a ciegas de la puntuación de la escala de muecas del ratón. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: La arquitectura de la CNN. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

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El método propuesto para estudiar la interacción gusto-olfato en este trabajo se basa en el método original de codificación conductual para la expresión facial del dolor en ratones, que fue desarrollado por Langford et al.16. Varios artículos publicados recientemente han introducido CNN para el seguimiento automático de la cara del ratón y la posterior puntuación MGS 21,26,27,28. La aplicación de CNN ofrece una ventaja sobre el método original, ya que se deriva de la generación de una serie de imágenes de fotogramas de vídeo que se pueden utilizar para entrenar un modelo de predicción. Por el contrario, el método original requería preseleccionar un número limitado de imágenes para MGS, lo que puede introducir subjetividad y sesgo.

Entre los métodos basados en CNN publicados anteriormente, todos han sido desarrollados para evaluar el grado de angustia o malestar tras una inyección directa de un agente causante de dolor en la circulación sanguínea26,28. Una desventaja de este enfoque de introducción de drogas es que se requiere una cantidad significativa de esfuerzo para filtrar las imágenes de fotogramas de video que no capturan el perfil de la cara del ratón. En este estudio, el agente causante de la nocicepción, el wasabi, se proporciona ad libitum. Además de enmascarar el ingrediente volátil AITC, la mantequilla de maní también es capaz de atraer a los sujetos del ratón para que presenten un gesto claro de vista frontal, lo que facilita la captura de sus perfiles faciales durante la grabación de video. Además, este enfoque elimina cualquier interferencia potencial del dolor causado por la inserción de la aguja. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el movimiento de ingestión de los ratones puede interferir con la puntuación MGS para la protuberancia de la nariz y la mejilla. Para abordar esto, se debe realizar un experimento de control de referencia proporcionando a los ratones mantequilla de maní pura.

En ciertos algoritmos basados en CNN para el estudio del comportamiento animal, solo se selecciona un subconjunto de unidades de acción facial de ratón a partir de imágenes de entrenamiento y se programa para ser capturado21,22. Estos métodos computacionales se basan en características predefinidas que se asocian con la sensación de nocicepción, mientras que potencialmente descuidan otras características importantes específicas de sujetos individuales de ratón. Como resultado, puede provocar la pérdida de información. Por el contrario, este estudio adopta un enfoque diferente al utilizar la imagen completa de la cara del ratón para entrenar un modelo de CNN. Se ha demostrado que este método basado en el uso de solo imagen (IOU) es más eficiente para la clasificación de imágenes25. Por lo tanto, el enfoque de modelado de CNN propuesto en el presente estudio es similar a algunos métodos propuestos que primero entrenan un modelo de CNN utilizando la imagen completa sin anotación de región y luego validan el modelo a través de la evaluación humana manual27,29. Este enfoque puede retener más información en las imágenes y evitar la introducción de subjetividad.

Sin embargo, una limitación de la configuración experimental en este trabajo es que los ratones se alojaron como compañeros de camada de 2 en lugar de en hábitats individuales. Esta decisión fue intencionada, teniendo en cuenta que los ratones son animales sociales y suelen prosperar en entornos grupales. Un hallazgo interesante es que, durante el período de entrenamiento de los animales, solo 2 compañeros de camada en 1 jaula de las 3 jaulas fueron entrenados para adaptarse a la presencia del espíritu chino. Como resultado, solo se realizaron experimentos por triplicado exclusivamente con estos 2 compañeros de camada. Para los materiales de capacitación para el modelado de CNN, también se tomó una imagen individual que contenía a los dos compañeros de camada como muestra individual sin realizar ninguna segmentación. Este enfoque nos permitió capturar la interacción entre los compañeros de camada y analizar sus comportamientos junto con las expresiones faciales de manera colectiva.

Al igual que el método de puntuación MGS basado en imágenes, se espera que el método propuesto en este estudio pueda ser transferible a otros tipos de animales, como felinos y caballos 30,31. Mediante la aplicación de la metodología propuesta, un método de introducción de comidas inductoras de alimentos con la aplicación de visión por computadora podría ser un enfoque para facilitar el estudio del comportamiento animal, específicamente para la interacción gusto-olor en varios animales.

Divulgaciones

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Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Z. Cai desea agradecer el apoyo financiero del Fondo Charitable Kwok Chung Bo Fun para el establecimiento de la Cátedra Kwok Yat Wai de Análisis Ambiental y Biológico.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Etanol absoluto (EtOH)VWR Chemicals BDHCAS# 64-17-5
Ladrillos de acrilonitrilo butadieno estirenoTienda insignia de Jiahuifenghttps://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
Placas de acrilonitrilo butadieno estireno Tiendainsignia de Jiahuifenghttps://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
isotiocianato de alilo (AITC)Sigma-AldrichCAS# 57-06-7
Dimetilsulfóxido anhidroSigma-AldrichCAS# 67-68-5
Aguardiente chinoYanghe Qingcihttps://www.chinayanghe.com/article/45551.html
Wasabi comercialS& B ALIMENTOS INC.
Ácido fórmico (FA)VWR Chemicals BDHCAS# 64-18-6
GraphPad Prisma 5GraphPadhttps://www.graphpad.com
acetonitrilo de grado HPLC (ACN)VWR Chemicals BDHCAS# 75-05-8
Metanol de grado HPLC (MeOH)VWR Chemicals BDHCAS# 67-56-1
Microsoft Excel 2016Microsofthttps://www.microsoft.com 
Microsoft PowerPoint 2016Sistemahttps://www.microsoft.com
Milli-QMilliporehttps://www.merckmillipore.com
Mouse:Centro de Servicios para Animales de Laboratorio ICR (Universidad China de Hong Kong, Hong Kong, China)N/A Mantequilla
maníSkippyhttps://www.peanutbutter.com/peanut-butter/creamy
Python v.3.10Fundación de software Pythonhttps://www.python.org 
Placas acrílicas transparentesTaobao Storehttps://item.taobao.com/item.htm?_u=32l3b7k63381&id=60996545797
0& spm=a1z09.2.0.0.77572e8dFPM
EHU
https://www.sbfoods-worldwide.com de agua Microsoft de

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