Artículo de método

Inmunoensayo fluorescente de flujo lateral basado en nanoperlas de puntos cuánticos

DOI:

10.3791/67000

⸱

28 de junio de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Central Laboratory, Shanghai Skin Disease Hospital, School of Medicine, Tongji University, 2Department of Dermatology, Shanghai Skin Disease Hospital, Institute of Dermatology, School of Medicine, Tongji University, 3Department of Pharmacy, Changzheng Hospital, Naval Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este artículo, describimos un protocolo para la preparación de nanoperlas de puntos cuánticos (QDNB) y la detección de biomarcadores de enfermedades utilizando tiras de inmunoensayo de flujo lateral basadas en QDNB. Los resultados de la prueba pueden evaluarse cualitativamente bajo iluminación con luz ultravioleta y medirse cuantitativamente con un lector de tiras fluorescentes en 15 minutos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los puntos cuánticos, también conocidos como nanocristales semiconductores, son nuevas etiquetas fluorescentes para la obtención de imágenes y sensores biológicos. Sin embargo, los conjugados de anticuerpo de puntos cuánticos con dimensiones pequeñas (~10 nm), preparados a través de laboriosos procedimientos de purificación, exhiben una sensibilidad limitada en la detección de ciertos marcadores de enfermedades traza utilizando tiras de inmunoensayo de flujo lateral. En este trabajo, presentamos un método para la preparación de nanoperlas de puntos cuánticos (QDNB) utilizando un método de evaporación en emulsión de un solo paso. Utilizando el QDNB preparado, se fabricó un inmunoensayo de flujo lateral fluorescente para detectar biomarcadores de enfermedades utilizando la proteína C reactiva (PCR) como ejemplo. A diferencia de las nanopartículas de un solo punto cuántico, los conjugados de nanoperlas de puntos cuánticos y anticuerpos son más sensibles como etiquetas de inmunoensayo debido a la amplificación de la señal mediante la encapsulación de cientos de puntos cuánticos en una nanoperla compuesta de polímero. Además, el mayor tamaño de los QDNB facilita la separación por centrifugación al conjugar los QDNB con anticuerpos. Se fabricó el inmunoensayo de flujo lateral fluorescente basado en QDNBs y se midió la concentración de PCR en la muestra en 15 min. Los resultados de la prueba pueden evaluarse cualitativamente bajo iluminación con luz ultravioleta y medirse cuantitativamente con un lector fluorescente en 15 minutos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las tiras de inmunoensayo de flujo lateral (LFIA, por sus siglas en inglés) sirven como herramientas cruciales de detección rápida en el punto de atención 1,2, particularmente en el cribado de enfermedades durante epidemias. Sin embargo, las tiras reactivas tradicionales de LFIA a base de oro coloidal exhiben una baja sensibilidad de detección y solo proporcionan resultados cualitativos3. Para mejorar la sensibilidad de detección de LFIA, han surgido varias nanopartículas nuevas, incluido el látexcoloreado 4,5, las nanopartículas fluorescentes de conversión ascendente6, las microesferas fluorescentes resueltas en el tiempo 7,8 y los puntos cuánticos 9,10,11. Los puntos cuánticos (QD)12,13, también conocidos como nanocristales semiconductores, ofrecen longitudes de onda de emisión sintonizables, un amplio rango de excitación y una alta eficiencia de luminiscencia, lo que los convierte en etiquetas ideales para la obtención de imágenes biológicas.

Sin embargo, la señal de fluorescencia emitida por los puntos cuánticos individuales sigue siendo débil, lo que da lugar a una sensibilidad de detección relativamente baja en los inmunoensayos. La encapsulación de numerosos puntos cuánticos dentro de microesferas puede amplificar las señales y mejorar la sensibilidad de los inmunoensayos basados en puntos cuánticos. Se han empleado varios métodos, como el autoensamblaje capa por capa 14,15,16,17,18, el método de hinchamiento19,20 y la encapsulación de microesferas de sílice 21,22,23,24, para encapsular puntos cuánticos dentro de microesferas. Por ejemplo, las etiquetas de nanoesferas de sílice funcionalizadas con puntos cuánticos se pueden lograr aumentando la carga de QD por inmunorreacción intercalada25. También se ha utilizado un secador por pulverización equipado con un atomizador ultrasónico para preparar nanoesferas QD-BSA26 a nanoescala. Sin embargo, los métodos antes mencionados adolecen de complejos pasos múltiples, extinción por fluorescencia y baja productividad.

En nuestro trabajo anterior27, se reportó un método de evaporación emulsión-solvente para encapsular puntos cuánticos dentro de nanoperlas de polímero. Esta técnica de preparación es simple, mantiene la eficiencia fluorescente de los QD, garantiza una alta eficiencia de encapsulación y permite una producción fácilmente escalable. Varios grupos de investigación han desarrollado con éxito tiras de LFIA utilizando QDNBs preparados a través de este método para aplicaciones, incluyendo la detección de toxinas alimentarias 28,29,30, la detección de biomarcadores de enfermedades infecciosas 31,32 y el monitoreo ambiental33.

Este protocolo presenta pasos específicos de preparación para nanoperlas de puntos cuánticos (QDNB), QDNB y conjugación de anticuerpos, preparación de LFIA basada en QDNB y medición de proteína C reactiva (CRP) en muestras de plasma humano.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Hospital de Enfermedades de la Piel de Shanghái (No. 2020-15). Todos los procedimientos experimentales con muestras de sangre humana se llevaron a cabo en un laboratorio de Bioseguridad Nivel II. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de nanoperlas QDs

NOTA: Para la síntesis de nanoperlas QD, se utilizó una técnica de evaporación de emulsión-solvente para sintetizar nanoperlas QD, con una proporción de fase oleosa a fase acuosa de 1:5. La mini emulsión se genera mediante ultrasonidos, y las nanoperlas se solidifican mediante la evaporación del disolvente (cloroformo). El hidróxido de sodio se utilizó para catalizar la hidrólisis de los grupos anhídrido en la superficie de las nanoperlas, convirtiéndolos en grupos carboxilo.

  1. Preparación de soluciones en fase oleosa y en fase acuosa
    1. Prepare 1 mL de fase oleosa: 0,4 mL de solución de poli (anhídrido estireno-comaleico) (PSMA) (50 mg/mL), 0,1 mL de solución QDs (100 mg/mL), llene cualquier volumen inferior a 1 mL con cloroformo.
    2. Preparar 5 mL de fase acuosa: SDS solución acuosa (0,5 % en peso).
  2. Preparación de la emulsión y solidificación
    1. Agregue 1 mL de fase oleosa y 5 mL de fase acuosa a un vial (15 mL) y coloque el vial en un agitador magnético. Encienda la alimentación del agitador magnético.
    2. Una vez que las fases de aceite y acuosa se hayan mezclado por completo, transfiera inmediatamente el matraz a la ultrasonicación programada (60 s, un pulso de 3 s seguido de una pausa de 3 s, 50% de amplitud) y encienda la alimentación.
    3. Observe la solución después de la ultrasonicación. La solución inicialmente de color carmesí pasó a una fase opalescente que aún conserva un matiz rojizo.
    4. Vuelva a colocar el vial en el agitador magnético a temperatura ambiente, agitando continuamente durante la noche. El cloroformo se evaporó gradualmente y la emulsión se solidificó en nanoperlas compuestas.
  3. Modificación de la superficie de las nanoperlas
    1. Añadir 0,1 mL de hidróxido de sodio 0,1 mM a la suspensión de nanoperlas durante 1 h. Los grupos anhídrido en la superficie de las nanoperlas se hidrolizan en grupos carboxilo.
  4. Purificación de nanoperlas
    1. Apague el agitador magnético y mueva las nanoperlas solidificadas a un tubo de centrífuga. Centrifugar el tubo a 13523 x g durante 10 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
    2. Agregue el volumen inicial de agua desionizada a la precipitación, cubra el tubo con su tapa, sumérjalo en el baño de agua ultrasónico y mantenga la inmersión hasta que el precipitado se disperse por completo.
    3. Repita los pasos 1.4.1-1.4.2 dos veces y, finalmente, transfiera las nanoperlas a la botella de vidrio. Guárdelo a 4 °C hasta su uso.
  5. Caracterización de nanoperlas
    1. Caracterizar el tamaño y la morfología de las nanoperlas QDs utilizando imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM)22.
      NOTA: Se pueden obtener diferentes tamaños de nanoperlas cambiando la proporción de la solución QDs y la solución PSMA. El tamaño de las nanoperlas QDs también se puede determinar a través de la dispersión dinámica de la luz (DLS)27.

2. Preparación de conjugados QDNB-anticuerpo

  1. Activación de grupos carboxilo
    1. Añadir 100 μL de QDNB preparado (10 mg/mL) en 200 μL de tampón de fosfato (PB, 20 mM, pH 6,0), luego añadir 6 μL de EDC (20 mg/mL).
    2. Incubar la mezcla durante 30 min a temperatura ambiente en una batidora rotativa.
    3. Después de la incubación, centrifugar la mezcla a 13523 x g durante 10 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
    4. Añada 100 μL de PB (20 mM, pH 6,0) a la precipitación, cubra el tubo con su tapa y sumerja el tubo en el baño de agua ultrasónico operativo hasta que el precipitado se disperse por completo.
  2. Conjugación de anticuerpo y nanoperlas
    1. Dispersar 100 μg de anticuerpo en 200 μL de PB (20 mM, pH 6,0) y añadir la suspensión de QDNB activada obtenida en el paso 2.1 en la solución de anticuerpos.
    2. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 min con rotación continua. Elimine el exceso de anticuerpos por centrifugación a 6010 x g durante 5 min (a temperatura ambiente) y luego deseche cuidadosamente el sobrenadante.
  3. Bloqueo de nanoperlas
    1. Añadir 200 μL de solución de caseína al 1% (en tampón PB de 20 mM, pH 7,4) al residuo (obtenido en el paso 2.2.2), cubrir el tubo con su tapa y sumergirlo en el baño de agua ultrasónico operativo hasta que el residuo se disperse por completo.
    2. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 2 h con rotación continua.
      NOTA: El objetivo de este paso es bloquear cualquier sitio no reaccionado en la superficie de QDNB.
  4. Almacenamiento de conjugados
    1. Añadir 100 μL de solución conservante (20 mM de tampón PB, pH 7,4, 1% BSA, 5% trehalosa, 6% sacarosa, 0,1% S9, pH 7,4) a la mezcla y almacenar a 4 °C para su uso posterior.

3. Preparación de tiras de inmunoensayo de flujo lateral

NOTA: La tira inmunocromatográfica está compuesta por una membrana de nitrocelulosa (NC), una almohadilla de muestra, una almohadilla conjugada, una almohadilla absorbente y una placa de cloruro de polivinilo (PVC) (Figura 1). Todas las soluciones deben prepararse y usarse de inmediato. Se recomienda que las tiras de inmunoensayo de flujo lateral se preparen en una sala limpia con humedad controlada.

  1. Preparación de la membrana NC
    1. Prepare la solución de recubrimiento de la línea de prueba (línea T) y la línea de control (línea C): diluya el anticuerpo de captura de CRP y la IgG anti-conejo de cabra con PB hasta una concentración final de 1 mg/mL.
    2. Coloque correctamente el tablero de PVC y retire el papel protector ubicado a 25 mm del borde del tablero de PVC. Alinee y adhiera la membrana NC a lo largo del borde inferior del papel protector restante a la placa de PVC.
    3. Dispense las soluciones de recubrimiento de la línea T y la línea C sobre la membrana NC a una tasa de inyección de 1 μL/cm, asegurándose de que se coloque a 20 mm de distancia del borde superior, formando una línea de prueba (1 mm de ancho).
    4. Coloque la membrana NC en condiciones con una humedad inferior al 30% y un rango de temperatura de 18-26 °C para el secado. El tiempo de secado debe ser de al menos 24 h.
      NOTA: Asegúrese de que los bordes superior e inferior de la membrana NC estén al ras con los bordes correspondientes de las áreas adyacentes. Las membranas NC no deben tocarse con las manos. La humedad durante este paso debe controlarse dentro del rango de 45% a 65%. Antes de continuar, la solución de recubrimiento de la línea T, la solución de recubrimiento de la línea C y la membrana NC deben equilibrarse a la misma temperatura.
  2. Preparación de la almohadilla conjugada
    1. Sumerja la almohadilla conjugada en la solución de tratamiento de la almohadilla conjugada (tampón PB de 20 mM, pH 7,4, 1% BSA).
    2. Coloque la almohadilla conjugada empapada en un horno de secado para el tratamiento de secado (temperatura ambiente) durante la noche.
    3. Adherir suavemente la almohadilla conjugada modificada sobre la placa de PVC.
    4. Diluir la solución conjugada de QDNB-anticuerpo preparada con la solución conservante (20 mM de tampón PB, pH 7,4, 1% BSA, 5% trehalosa, 6% sacarosa, 0,1% S9, pH 7,4).
    5. Dispense la solución conjugada de QDNB-anticuerpo en la almohadilla conjugada a una velocidad de inyección de 1 μL/cm y seque la almohadilla conjugada durante 24 h.
      NOTA: La relación de dilución específica debe ajustarse de acuerdo con el objetivo de detección.
  3. Preparación de la almohadilla de muestras
    1. Sumerja la almohadilla de muestra en la solución de tratamiento de la almohadilla de muestra (20 mM de tampón PB, pH 7,4, 1% BSA, 5% trehalosa, 6% sacarosa, 0,1% S9, pH 7,4).
    2. Coloque la almohadilla de muestra empapada en un horno de secado (45 °C) y seque durante 24 h.
  4. Ensamblar la tarjeta y cortarla en tiras
    1. Como se muestra en la Figura 1, coloque sucesivamente el papel absorbente (almohadilla absorbente), la almohadilla conjugada y la almohadilla de muestra en la placa de PVC con membrana NC.
    2. Corta la tarjeta en tiras de 3,8 mm de ancho.
  5. Embalaje de las tiras
    1. Envuelva las tiras reactivas en un casete de plástico y selle una bolsa de papel de aluminio que contenga un desecante.

4. Operación del ensayo y evaluación cualitativa

NOTA: Se recomienda que las operaciones con muestras de sangre humana se realicen en un laboratorio de Bioseguridad de Nivel II. Las muestras de plasma humano se obtuvieron de un laboratorio clínico (de sujetos humanos no identificados). Típicamente, la sangre humana se recolectó utilizando un tubo de vacío de EDTA y el plasma se aisló de acuerdo con el protocolo estándar34. Centrifugar a 3.000 × g durante 10 min a temperatura ambiente para la separación por plasma. Recoja la capa superior de plasma amarillo con una pipeta y almacene el plasma en un tubo de 1,5 ml a -80 °C hasta su uso.

  1. Pipetear 10 μL de muestra de plasma o solución de calibrador en 1 mL de un tampón PBS que contenga 0,1% de Tween 20. A continuación, transfiera 100 μL de la muestra diluida preparada a la almohadilla de muestra de la tira reactiva.
  2. Después de una carrera de 15 minutos, observe las señales de fluorescencia de la línea T y la línea C bajo la exposición a la luz ultravioleta para obtener resultados cualitativos.
  3. Inserte la tarjeta de tiras en un lector de ensayo de flujo lateral fluorescente para obtener las intensidades de fluorescencia para el análisis cuantitativo.
    NOTA: En este ejemplo, se emplea el método de inmunoensayo sándwich 35,36; Una línea roja (línea de control) indica un resultado negativo, mientras que las dos líneas rojas (líneas de prueba y de control) indican un resultado positivo. La ausencia de la línea de control indica que la prueba realizada no es válida.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los procedimientos de preparación de QDNB se ilustran esquemáticamente en la Figura 1A. La fase oleosa que contenía QDs y polímero en cloroformo se mezcló con la fase acuosa, y se obtuvo una miniemulsión por sonicación. La emulsión se solidificó por evaporación gradual del cloroformo. La micrografía electrónica de transmisión (TEM) de QDNB se presenta en la Figura 2A. Los QDNBs tienen una morfología esférica, con diámetros medios de 96 nm, medidos sobre 50 QDNBs en imágenes TEM. Las nanopartículas QD se observan claramente dentro de las nanoperlas, lo que indica una encapsulación exitosa. La Figura 2B y la Figura 2D muestran los espectros de fluorescencia y absorción de QDNB, respectivamente.

El QDNB y el anticuerpo se conjugaron utilizando la química de la carbodiimida, como se muestra en la Figura 1B. El conjugado QDNB-anticuerpo se utilizó para preparar LFIA basada en QDNB. La estructura de la LFIA se ilustra en la Figura 1C. Si el antígeno CRP está presente en la muestra, los conjugados QDNB-anti-CRP se acumulan en la línea de ensayo.

Como se muestra en la Figura 3, la medición se lleva a cabo añadiendo 100 μL de muestra diluida al orificio de la muestra. Después de un tiempo de reacción de 15 minutos, los resultados de la prueba se pueden leer cualitativamente bajo iluminación con luz ultravioleta. Los resultados cuantitativos se pueden obtener utilizando un lector de tiras fluorescentes, y la concentración de la muestra se puede calcular utilizando una ecuación de calibración integrada en el software del lector de tiras37,38.

figure-results-1
Figura 1: Ilustración del inmunoensayo fluorescente de flujo lateral basado en nanoperlas de puntos cuánticos. (A) Procedimientos para la preparación de QDNB. (B) Principio de los conjugados QDNB-anticuerpo. (C) Principio de LFIA basado en QDNB para la detección de PCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Caracterización de QDNBs. (A) Imagen TEM de QDNBs. Barra de escala: 100 nm. (B) Espectros de emisión fluorescente de QDNB. (C) Espectros de absorción de QDNB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Procedimientos de inmunoensayo de flujo lateral para PCR. (A) Ilustración de la detección. (B) Fotografías de tiras de LFIA basadas en QDNB que detectan muestras de PCR en un rango de 0-30 mg/L bajo luz ultravioleta. (C) Lector fluorescente para la cuantificación de resultados. D) Fotografía de los resultados cuantitativos. (E) Detección de proteína C reactiva (PCR) mediante transformación logística seguida de regresión lineal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este trabajo se describe un protocolo para la preparación de nanoperlas de puntos cuánticos (QDNB)27 y el uso de QDNB para la preparación de inmunoensayos fluorescentes de flujo lateral (LFIA). Se demuestra la medición cualitativa y cuantitativa de la PCR en muestras. Este LFIA basado en QDNB también se puede aplicar a otros biomarcadores de enfermedades25,32, toxinas alimentarias29,30, virus 16,27 y más.

Los pasos críticos de este protocolo son la preparación de los conjugados QDNB y QDNB-anticuerpo. El tamaño de partícula de QDNB y el contenido de QD en las nanoperlas deben optimizarse para obtener QDNB altamente fluorescente con señales de fondo bajas en el LFIA. Los pares de anticuerpos de captura y detección son fundamentales para el inmunoensayo y deben examinarse para obtener las mejores coincidencias de varios proveedores. Se debe optimizar la conjugación del anticuerpo con QDNB, incluida la relación anticuerpo/QDNB, el pH del tampón y los reactivos de bloqueo. En concreto, debe evitarse la agregación de QDNBs y anticuerpos optimizando el pH del tampón, la concentración de sal y el tiempo de reacción en los procedimientos de conjugación.

En comparación con otros métodos de preparación para nanoperlas de puntos cuánticos, este protocolo tiene las ventajas de simplicidad, fácil operación y alta productividad. Además, las nanoperlas compuestas de polímero son biocompatibles, a diferencia de las nanoperlas de sílice, que generalmente requieren una modificación adicional de la superficie con polímeros. Sin embargo, los QDNBs preparados con este protocolo no son tan monodispersos como los preparados con nanoperlas de polímero19 o sílice21 . El tamaño de partícula de los QDNB suele oscilar entre 70 nm y 200 nm.

Las tiras de inmunoensayo de flujo lateral (LFIA) basadas en QDNB se preparan de manera similar a otras LFIA fluorescentes. Debido a los altos rendimientos cuánticos de los QD y a la amplificación de la señal de los QDNB, el LFIA basado en QDNB que utiliza este protocolo es más sensible que otros LFIA basados en microesferas fluorescentes, como las microesferas fluorescentes resueltas en el tiempo y las microesferas de fluoresceína. Además, la estabilidad de QDNB es superior a la fluoresceína tradicional, lo que proporciona a los LFIA basados en QDNB un tiempo de almacenamiento más largo.

Sin embargo, el cadmio en la superficie de los puntos cuánticos es propenso a la quelación con grupos sulfhidrilo en las proteínas, especialmente en ambientes acuosos. Evitar el uso de altas concentraciones de proteínas es fundamental para la estabilidad de las LFIA basadas en QDNB. El cadmio es tóxico y su uso es limitado en algunas situaciones, lo que requiere la preparación de puntos cuánticos sin cadmio con altos rendimientos cuánticos y estabilidad.

En resumen, se proporciona un método versátil para preparar nanoperlas de puntos cuánticos en un solo paso, y es escalable para la producción industrial. Utilizando los QDNB preparados, se crearon tiras de inmunoensayo fluorescentes de flujo lateral para la detección cualitativa y cuantitativa de biomarcadores de enfermedades. El QDNB ideal para LFIA es un nanocordón de tamaño pequeño encapsulado con numerosos QDs sin extinción por fluorescencia.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pengfei Zhang es uno de los fundadores de Shanghai Kundao Biotech y tiene posibles intereses financieros en esta empresa.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo contó con el apoyo del Proyecto del Comité de Ciencia y Tecnología de Shanghái (STCSM) (22S31902000) y el Programa de Incubación de Investigación Clínica del Hospital de Enfermedades de la Piel de Shanghái (NO. lcfy2021-10).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
(dimetilamino)propil)-N'-etilcarbodiimida clorhidratoSigma-Aldrich03450
Papel de absorbancia Kinbio BiotechCH37K
Albúmina sérica bovinaSigma-AldrichB2064
CaseínaSigma-AldrichC8654
CdSe/ZnS punto cuánticoSuzhou Mesolight Inc.CdSe/ZnS-625
CholoroformoSino Pharm10006818
anticuerpo CRPHytest Biotech4C28
Lector de ensayo de flujo lateral fluorescenteSuzhou Helmence Precision InstrumentFIC-H1
Almohadilla de fibra de vidrioKinbio BiotechSB06
Cabra anti-conejo IgGSangon Biotech D111018
Membrana de nitrocelulosa Copolímero demaleico estireno) CN140
 Sigma-AldrichS458066
Conejo IgGSangon BiotechD110502
Dodecil sulfato de sodioSino Pharm30166428
Hidróxido de sodioSino Pharm10019718
poli(anhídrido satorios

Referencias

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