Artículo de método

Desarrollo de un modelo de traumatismo craneoencefálico leve sin complicaciones, modificado por el método de pérdida de peso y evidenciado por resonancia magnética

DOI:

10.3791/67011

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11 de abril de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Imaging and Radiological Sciences, National Yang Ming Chiao Tung University, 2Department of Medical Imaging and Radiological Sciences, College of Medicine, Chang Gung University, 3Department of Medical Imaging and Intervention, Chang Gung Memorial Hospital at Linkou

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un protocolo para establecer un modelo animal de lesión craneal cerrada que replica el resultado de la neuroimagen de una lesión cerebral traumática leve sin complicaciones con la estructura cerebral preservada en la fase aguda y la atrofia cerebral a largo plazo. La resonancia magnética longitudinal es el método principal utilizado para la obtención de pruebas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las lesiones cerebrales traumáticas leves (mTBI, por sus siglas en inglés), conocidas como conmoción cerebral, representan más del 85% de las lesiones cerebrales en todo el mundo. En concreto, el TCE no complicado que muestra hallazgos negativos en las imágenes clínicas rutinarias en la fase aguda dificulta la atención precoz y adecuada en estos pacientes. Se ha reconocido que diferentes parámetros de impacto pueden afectar e incluso acelerar el progreso de los síntomas neuropsicológicos posteriores después de un TCE leve. Sin embargo, la asociación de los parámetros de impacto durante la conmoción cerebral con el resultado no se ha examinado ampliamente. En el presente estudio, se describió y demostró en detalle un modelo animal con lesión de cabeza cerrada (CHI) modificado del paradigma de lesión por caída de peso. Las ratas macho adultas de Sprague-Dawley (n = 20) fueron asignadas aleatoriamente a grupos de CHI con diferentes parámetros de impacto (n = 4 por grupo). Durante un período de estudio de 50 días, se realizaron estudios longitudinales de imágenes de RMN, incluidas imágenes ponderadas en T2 e imágenes de tensor de difusión, y evaluaciones conductuales secuenciales, como la puntuación de gravedad neurológica modificada (mNSS) y la prueba de caminata del haz. La tinción inmunohistoquímica para astrogliosis se realizó el día 50 después de la lesión. Se observó un peor rendimiento conductual en los animales después de CHI repetitivo en comparación con el grupo de lesiones únicas y simulación. Mediante el uso de resonancia magnética (RM) longitudinal, no se observó ninguna contusión cerebral significativa a las 24 h después de la lesión. Sin embargo, se demostró atrofia cortical y alteración de la anisotropía fraccional cortical (AF) en el día 50 después de la lesión, lo que sugiere la replicación exitosa del mTBI clínico sin complicaciones. Lo que es más importante, los cambios en los resultados neuroconductuales y las características de las imágenes observadas después de un TCE leve dependieron del número de impactos, los intervalos entre lesiones y el sitio de impacto seleccionado en los animales. Este modelo in vivo de mTBI combinado con la resonancia magnética preclínica proporciona un medio para explorar la lesión cerebral a escala de todo el cerebro. También permite la investigación de biomarcadores de imagen sensibles a mTBI en diferentes parámetros de impacto y niveles de gravedad.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La lesión cerebral traumática leve (mTBI, por sus siglas en inglés) se observa principalmente en atletas que practicandeportes de contacto, veteranos militares y personas involucradas en accidentes de tráfico. Representa más del 85 % de todos los traumatismos craneoencefálicos notificados2. La vasta etiología del TCE leve y su creciente incidencia mundial subrayan la inclusión del TCE leve como un factor de riesgo ambiental tentativo de la enfermedad neurodegenerativa de inicio tardío3. El TCE leve sin complicaciones se caracteriza por una puntuación de coma de Glasgow (GCS) de 13-15, sin que se observen anomalías estructurales en la tomografía computarizada (TC) o la resonancia magnética (RMN). Los síntomas comunes que experimentan los pacientes con mTBI sin complicaciones incluyen dolores de cabeza, mareos, náuseas o vómitos y fatiga. Sin embargo, la evaluación longitudinal de los resultados después de un TCE no complicado presenta desafíos considerables debido a la alta tasa de abandono en los pacientes4.

Las preocupaciones sobre el TCE repetitivo han aumentado, particularmente dentro de la comunidad de atletas profesionales de la Liga Nacional de Fútbol Americano (NFL), lo que posteriormente ha aumentado la conciencia entre los atletas no profesionales5. Se presume que la vulnerabilidad cerebral aumenta después de la lesión cerebral traumática inicial, y las agresiones posteriores pueden exacerbar los resultados de las lesiones. Los hallazgos recientes de la cohorte más grande de jugadores de fútbol con cerebro donado no solo implicaron la participación previa en el fútbol en la gravedad de la encefalopatía traumática crónica (CTE), sino que también sugirieron una correlación entre diferentes factores relacionados con el fútbol y el riesgo y la gravedad de la CTE6. Por lo tanto, la preocupación sobre la influencia del número de conmociones cerebrales y el régimen repetitivo en los resultados de las lesiones está creciendo. La investigación preclínica ha explorado los cambios neuropatológicos, la cascada neuroinflamatoria y el deterioro neuropsicológico después de un TCE repetitivo mediante el uso de varios modelos de traumatismo craneal cerrado (CHI) 7,8,9,10,11,12,13,14 . Sin embargo, no se ha examinado bien la investigación de los parámetros de impacto en el modelo mTBI sin complicaciones, que pueden imitar de cerca los impactos repetitivos en la cabeza con conmociones cerebrales relacionados con el deporte que resultan en deterioro funcional en la fase aguda y atrofia cerebral en la fase crónica.

La imagen con tensor de difusión (DTI), una técnica que evalúa la difusión de moléculas de agua, se ha utilizado comúnmente en estudios que investigan los efectos de mTBI. La anisotropía fraccional (FA), una métrica clave derivada de la DTI, cuantifica el grado de coherencia de la difusividad del agua y proporciona información sobre la organización estructural de los axones y los haces de fibras nerviosas. La perturbación de los valores de FA en la sustancia blanca (WM) se ha propuesto siguiendo mTBI en varios modelos 8,10,11,15,16,17. Además, la difusividad axial (DA) y la difusividad radial (RD), que indican integridad axonal y mielina, cambiaron después del mTBI en estudios preclínicos 10,15,16,18,19,20. Sin embargo, es probable que las discrepancias en los hallazgos de DTI entre estudios previos se deban a variaciones en la gravedad del mTBI, diferencias en los parámetros de impacto, diversos modelos de mTBI y puntos de tiempo de seguimiento inconsistentes después de la lesión9.

Por lo tanto, el presente documento de protocolo tiene como objetivo establecer un modelo animal de mTBI diseñado para evaluar los efectos acumulativos de mTBI único y repetitivo. Incorporamos evaluaciones integrales y longitudinales, incluidas evaluaciones del bienestar animal, los resultados conductuales, los parámetros DTI y el volumen cortical, para capturar los cambios dinámicos posteriores a la lesión y explorar los efectos de diferentes parámetros de impacto. Al demostrar tanto el deterioro funcional agudo como los cambios microestructurales a largo plazo, este modelo replica eficazmente las características clave de la mTBI sin complicaciones que no se abordaron completamente en estudios anteriores con animales. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para desarrollar un modelo de mTBI sin complicaciones utilizando un método modificado de caída de peso de cabeza cerrada 8,11 y realizar una evaluación longitudinal después de mTBI.

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Protocolo

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El estudio se realizó de acuerdo con las recomendaciones de las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud para la Investigación Animal (Guía para el Cuidado y el Uso de Animales de Laboratorio) y las directrices de Investigación Animal: Informe de Experimentos In Vivo. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Nacional Yang Ming Chiao Tung. Veinte animales fueron asignados aleatoriamente a 5 grupos (n = 4 por grupo): (i) impacto único en la corteza sensoriomotora (SMCx/simple), (ii) impactos dobles en SMCx con el intervalo de 1 h (SMCx/2 golpes/1 h), (iii) impactos dobles en SMCx con el intervalo de 10 minutos (SMCx/2 golpes/10 min), (iv) impactos dobles en el cerebro central con el intervalo de 1 h (Central/2 golpes/1 h), y (v) el grupo simulado con cirugía solo pero sin impacto directo en la cabeza, para la evaluación longitudinal de los resultados (Figura 1). Cabe destacar que los intervalos entre lesiones seleccionados para este estudio (intervalos de 1 h vs. 10 min) fueron diseñados para imitar los impactos subconmocionales repetitivos 8,10,11,13,21, que pueden ser hasta mil veces en una misma temporada, experimentados por los atletas que practican deportes de contacto 22,23.

1. Inducción de un traumatismo craneoencefálico cerrado (CHI)

NOTA: Las ratas Sprague-Dawley macho adultas de 10 a 12 semanas de edad y que pesan más de 250 g se alojan bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h con acceso ad libitum a alimentos y agua.

  1. Colocar la rata en una pequeña cámara de inducción y anestesiarla con una mezcla de isoflurano (5%) y aire medicinal (2,5-3 L/min). Retira la rata de la cámara hasta que deje de responder a un pellizco de pata o cola.
  2. Coloca la rata en la almohadilla térmica.
    NOTA: Encienda la almohadilla térmica durante la cirugía para mantener la temperatura corporal de las ratas.
  3. Lleva a la rata a un marco estereotáxico y asegúrala con una barra de dientes. Administrar isoflurano al 2% utilizando el cono de nariz conectado con aire medicinal a un caudal de 1,5-2 L/min para su mantenimiento durante la cirugía.
  4. Coloque las barras de los oídos. Asegúrate de que la rata esté centrada y simétrica en el marco estereotáxico.
    NOTA: Todos los procedimientos quirúrgicos deben realizarse en condiciones asépticas. Los instrumentos se esterilizaron antes de la cirugía con un autoclave de vapor, y sus puntas se esterilizaron adicionalmente con un esterilizador de perlas durante el procedimiento. Para evitar la contaminación, se colocó un paño quirúrgico sobre el animal. El cirujano llevaba una gorra para cubrir el cabello, una máscara para cubrir el rostro y estaba equipado con una bata de laboratorio y guantes quirúrgicos durante el procedimiento24.
  5. Coloque el sensor del oxímetro de pulso en la pata trasera del animal para controlar la frecuencia respiratoria, la frecuencia cardíaca, el nivel de oxígeno en sangre y la temperatura corporal del animal.
  6. Inyectar 1 mL/kg de peso corporal de lidocaína (20 mg/mL) por vía subcutánea en el cuello de la rata como analgésico.
  7. Aplicar la crema depilatoria en la cabeza del animal y esperar 3 min. Limpie la crema con hisopos de alcohol isopropílico al 70%.
  8. Limpie el área afeitada varias veces con un hisopo de algodón estéril empapado en yodo. Elimine el residuo de yodo con un hisopo de algodón empapado en etanol al 70%.
  9. Cree una incisión en la línea media de aproximadamente 2-2,5 cm de longitud en la piel afeitada con una cuchilla quirúrgica estéril para acceder a la superficie del cráneo.
  10. Retire el tejido del hueso con una almohadilla de algodón para exponer el cráneo. Limpie la superficie del cráneo con un hisopo de algodón empapado en solución salina al 0,9 %, luego límpielo con una almohadilla de algodón seca.
    NOTA: Las suturas del cráneo y tanto el bregma como la lambda ahora se pueden identificar fácilmente.
  11. Identifique el bregma como el punto de referencia para conocer mejor el área de impacto en función de la coordenada.
    NOTA: En este protocolo, se utilizan dos conjuntos de coordenadas para la inducción de CHI: (-2,5,-2,0) (2,5 mm lateral 2,0 mm posterior al bregma) en la parte superior de la corteza sensoriomotora (SMCx), así como (0,-3,0) en la parte superior del cerebro central (central).
  12. Identifique las coordenadas elegidas en la superficie del cráneo y cemente un casco circular de acero inoxidable (10 mm de diámetro y 1 mm de grosor) sobre el área designada con cemento dental. Retire la almohadilla térmica y el oxímetro de pulso.
  13. Mueva el dispositivo estereotáctico y la rata en la mesa elevadora (14 cm de largo, 8 cm de ancho y 6,15 cm de profundidad) debajo del impactador CHI.
  14. Eleva el cuerpo de la rata con una esponja de espuma (19 cm de largo, 10 cm de ancho y 4 cm de profundidad, con una densidad de 18 kg/m3).
  15. Retire la rata de las barras de las orejas del marco estereotáxico. Mantenga a la rata quieta en la barra dental conectada con el cono de la nariz, suministrando un 2% de isoflurano. Asegúrese de que la cabeza y el cuerpo estén alineados a nivel en la dirección rostral-caudal.
  16. Ajuste la mesa elevadora para asegurarse de que no haya espacio entre el impactador CHI y el casco. Apague el isoflurano 5 s justo antes del impacto.
    NOTA: Para precisar el reflejo de enderezamiento por lesión cerebral, se realizó el cese temporal del isoflurano25.
  17. Deje caer un latón de 600 g desde una altura de 1 m a través de un tubo de acero inoxidable (1 m de altura con un diámetro interior de 20 mm para despejar una columna de pesos de latón inoxidable) hasta el impactador asegurado con una punta redonda apuntando al casco metálico.
    NOTA: Los animales del grupo simulado no sufrieron ningún impacto, ya que la gota de latón se liberó sin hacer contacto con el casco de la cabeza de la rata.
  18. Baje la mesa elevadora. Retire la rata del marco estereotáxico y colóquela en posición supina sobre una almohadilla térmica.
  19. Registre el momento del reflejo de enderezamiento, que es el momento en que el animal intenta cambiar de la posición supina a la posición prona26,27.
    NOTA: Los animales sometidos al CHI repetitivo fueron anestesiados nuevamente 3 min antes del2º impacto. Para los animales del grupo SMCx/doble/10 min que no volvieron a la posición prona a tiempo, el tiempo correspondiente del reflejo de enderezamiento se registró como 420 s.
  20. Después del registro del reflejo de enderezamiento, anestesiar a la rata con isoflurano de nuevo utilizando el paso 1.1.
  21. Inmovilice a la rata con el marco estereotáxico utilizando el paso 1.2.
    NOTA: Después de confirmar la estabilidad del casco en la parte superior del stull, repita los pasos 1.13-1.17 nuevamente para realizar el2º impacto.
  22. Quítese el casco. Retire todo el tejido conectivo y el cemento de la parte superior del cráneo.
  23. Cubre el cráneo con el cemento dental y deja que se seque. Verifique que el cemento dental esté rígido y duro con la parte posterior de la pinza.
    NOTA: El cemento dental se aplicó sobre el cráneo para eliminar los artefactos de susceptibilidad causados por las interfaces cráneo-aire o cráneo-sangre entre el cráneo y el cuero cabelludo después de la cirugía.
  24. Cierre la incisión con suturas quirúrgicas de nailon 4-0 con 4-5 nudos independientes.
    NOTA: La herida mide aproximadamente 2-2,5 cm de longitud. Asegúrese de que las suturas quirúrgicas no tengan acción capilar y estén hechas de material de seda o nylon. No suturar la incisión con un solo nudo para evitar la apertura de la herida por el rascado del animal.
  25. Aplique antibióticos tópicos (crema Dermanest) en el sitio quirúrgico para prevenir infecciones.
  26. Inyectar 1 mL/kg de peso corporal de carprofeno (50 mg/mL) por vía subcutánea en el cuello como analgésico postoperatorio.
  27. Coloca a la rata en una jaula limpia sobre una almohadilla térmica hasta que recupere la conciencia. Una vez que la rata se siente erguida, devuélvela a la jaula de casa.
  28. Por vía oral, administrar 5 mL de paracetamol (24 mg/mL) mezclado en 200 mL de agua al animal diariamente como analgésico durante 3 días consecutivos después de la cirugía.

2. Resonancia magnética (RM)

NOTA: Las imágenes ponderadas en T2 y las imágenes con tensor de difusión se realizan utilizando un sistema PET/MR 7T secuencial antes de la CHI, así como en 1 y 50 días después de la lesión (Figura 1). Se realizó una resonancia magnética basal dentro de 1 semana antes del procedimiento de CHI. Para las evaluaciones de 1 y 50 días después de la CHI, las evaluaciones conductuales se realizaron por la mañana, seguidas de resonancias magnéticas por la tarde del mismo día.

  1. Anestesiar a la rata en una pequeña cámara de inducción llena de una mezcla de isoflurano (5%) y aire medicinal (2,5-3 L/min).
  2. Una vez que la rata no responda a un pellizco de pata o cola, suspenda temporalmente la anestesia cuando se transfiera a la cuna del animal en una posición boca abajo con la cabeza primero.
  3. Coloque la rata en el soporte de la cabeza conectado con un cono nasal, suministrando isoflurano al 2% con aire medicinal a un caudal de 1,5-2 L/min para el mantenimiento durante la adquisición de la imagen.
  4. Fije la cabeza con un pequeño trozo de cinta adhesiva para evitar movimientos durante la exploración.
    NOTA: Aplique un poco de pasta de dientes en la cabeza de la rata el primer día después de la CHI para prevenir artefactos de susceptibilidad magnética debido a la extirpación del cuero cabelludo28,29.
  5. Coloque una almohadilla de presión debajo del tórax de la rata para controlar la respiración. Pegue los clips del oxímetro a la extremidad trasera para controlar la frecuencia cardíaca.
  6. Inserte la sonda rectal para medir la temperatura rectal. Cubra a la rata con una manta térmica con agua tibia circulante y una envoltura de papel tejida durante el experimento para mantener la temperatura corporal.
    NOTA: A lo largo del experimento, controle las condiciones fisiológicas, incluida la frecuencia cardíaca, la frecuencia respiratoria y la temperatura rectal. Antes de escanear, verifique todas las señales fisiológicas de la rata para garantizar la calidad del monitor de signos vitales.
  7. Utilice el sistema de posicionamiento láser del escáner PET/MR para marcar el centro de la cabeza y lograr una alineación precisa.
  8. Mueva el animal al orificio de resonancia magnética automáticamente utilizando el sistema de transporte motorizado de animales hasta que el centro de la cabeza se alinee con el isocentro del escáner.
    NOTA: El sistema motorizado de transporte de animales integrado en el sistema PET/MR garantiza un posicionamiento preciso de los animales y agiliza el flujo de trabajo al pasar de una modalidad de imagen a otra.
  9. Obtener la secuencia de resonancia magnética.
    1. Realice la localización inicial y el ajuste general.
    2. Utilice el corte sagital central y alinee el8º corte desde la parte anterior con la decusación de la comisura anterior.
      NOTA: Los cortes coronales están colocados perpendicularmente al plano horizontal definido por la línea que conecta la comisura anterior y la base del cerebelo, lo que corresponde a un ángulo de aproximadamente 15° con respecto al eje largo del cuerpo calloso. Los parámetros clave del escaneo T2-RARE para el corte sagital medio son los siguientes: tiempo de repetición (TR) = 2500 ms, tiempo de eco (TE) = 44 ms, campo de visión (FOV) = 3,5 cm, tamaño de la matriz = 256 256, grosor del corte = 1 mm, número de cortes = 1, factor de RARE = 8, ancho de banda = 75 kHz, número de promedios = 1, tiempo de adquisición = 1 min 20 s.
    3. Utilice la adquisición rápida con mejora de la relajación (RARE) con supresión de grasa y una banda de saturación debajo del cerebro para obtener imágenes ponderadas en T2 como referencia anatómica (Figura 2).
      NOTA: Los parámetros clave del escaneo T2-RARE son los siguientes: tiempo de repetición (TR) = 3600 ms, tiempo de eco (TE) = 40 ms, campo de visión (FOV) = 2 cm, tamaño de la matriz = 256 256, grosor de corte = 1 mm, número de cortes = 16, factor de RARE = 8, ancho de banda = 75 kHz, número de promedios = 8, tiempo de adquisición = 7 min 40 s.
    4. Utilice un EPI de espín-eco de 4 disparos para adquirir imágenes de tensor de difusión (Figura 2).
      NOTA: Los parámetros clave del escaneo DTI son los siguientes: TR = 3000 ms, TE = 28 ms, campo de visión (FOV) = 2 cm, tamaño de la matriz = 96 96, espesor = 1 mm, número de cortes = 16, duración del pulso (δ) = 5 ms, tiempo entre los dos pulsos (Δ) = 15 ms, número de B0 = 5, número de direcciones = 30, valor b = 1000 s/mm3, ancho de banda = 150 kHz, número de promedio = 4, tiempo de adquisición = 14 min.
    5. Finalice el protocolo de escaneo. Deslice la cuna del animal fuera del imán. Retira al animal de la cuna.
    6. Transfiere a la rata a una jaula limpia con una almohadilla térmica debajo para mantener su temperatura corporal. Regresa a la rata a su jaula una vez que recupere la conciencia.
  10. Preprocesamiento de imágenes
    NOTA: Utilice MRtrix3, el software Statistical Parametric Mapping (SPM) y scripts personalizados de MATLAB para el procesamiento y análisis de datos.
    1. Elimine el ruido de las imágenes DTI mediante el comando MRtrix3 (dwidenoise)30.
    2. Elimine los artefactos de timbre de Gibb de las imágenes DTI mediante el comando MRtrix (mrdegibbs)30.
    3. Corregistre imágenes DTI en imágenes ponderadas en T2 de un solo sujeto a través de escaneos longitudinales utilizando funciones SPM (spm_coreg.m y spm_powell.m).
    4. Realice el stripping de cráneos en imágenes ponderadas en T2 mediante el contorno manual del área del cerebro corte por corte, seguido de la eliminación de píxeles con una intensidad inferior al umbral calculado determinado por el método31 de Otsu (script personalizado de MATLAB thr_otsu2.m).
    5. Realizar el corregistro entre sujetos entre animales del mismo grupo experimental utilizando funciones SPM (spm_coreg.m y spm_powell.m). Aplique la mascarilla cerebral a las imágenes DTI correspondientes.
      NOTA: La extracción del cráneo se realiza para disminuir el tiempo de procesamiento de la computadora.
    6. Calcule mapas tensoriales basados en DTI (script personalizado de MATLAB, tensormap.m).
    7. Cálculo de mapas de FA (script personalizado de MATLAB, calFA.m)
      NOTA: Todos los scripts personalizados de MATLAB están disponibles a través de la siguiente base de datos (https://doi.org/10.57770/9ZESXD).
  11. Análisis de imágenes-FA
    1. Dibuje regiones de interés (ROI) en la corteza y el cuerpo calloso (CC) para los tres cortes de imagen consecutivos debajo de la coordenada CHI.
      NOTA: Todos los ROI fueron dibujados manualmente e inspeccionados visualmente para detectar errores graves por 2 investigadores experimentados cegados a los grupos experimentales.
    2. Extraiga y promedie el valor de FA de los ROI.
      NOTA: Para el cuerpo calloso debajo de la corteza, los píxeles con valores de FA < 0,35 se excluyeron en el ROI seleccionado para eliminar los efectos de volumen parcial. Para la corteza, se reclutaron para el análisis todos los píxeles con valores de FA < 0,35 en el ROI.
  12. Análisis de imagen-Volumen
    1. Dibuje manualmente ROI cubriendo las regiones corticales durante 11 cortes de imagen consecutivos en Bregma de -7 a +3 mm.
      NOTA: Todos los ROI fueron dibujados manualmente por 2 investigadores experimentados ciegos a los grupos experimentales.
    2. Suma el total de píxeles de las ROI en los sectores y transfórmalos en el volumen multiplicando el grosor del sector (1 mm).
    3. Normalizar el volumen cortical después del CHI con el volumen correspondiente antes del CHI de cada animal.
      NOTA: Normalice los datos para eliminar las diferencias individuales en el volumen del cerebro entre los animales antes de la presentación.

3. Evaluación del comportamiento

NOTA: Los experimentos conductuales se realizan utilizando la prueba de equilibrio de caminata del haz y mNSS antes de CHI, así como en 1 y 50 días después de CHI (Figura 1). Toda la evaluación fue realizada por al menos dos observadores para garantizar la exactitud, consistencia y objetividad de los datos recopilados.

  1. Prueba de equilibrio de la marcha de la viga
    1. Encienda la cámara de video e inicie el temporizador.
    2. Coloque las ratas en un extremo de la barra de equilibrio (3 cm de profundidad, 3 cm de ancho, 80 cm de largo y 60 cm por encima del suelo).
    3. Detenga el temporizador una vez que la rata complete un viaje de ida y vuelta, se caiga o se congele durante 3 minutos.
      1. Durante el experimento, observe la condición del animal para la evaluación utilizando mNSS 11,32,33,34. Siga estos estándares para la evaluación:
      2. Si la rata mantiene el equilibrio con una postura estable en la viga, asigne una puntuación de 0.
      3. Si la rata agarra el costado de la viga, asigne una puntuación de 1.
      4. Si la rata cae con una extremidad fuera de la viga, asigne una puntuación de 2.
      5. Si la rata cae con las dos extremidades arrancadas o gira sobre la viga (>60 s), asigne una puntuación de 3.
      6. Si la rata intenta mantener el equilibrio en la viga pero se cae (>40 s), asigne una puntuación de 4.
      7. Si la rata intenta mantener el equilibrio en la viga pero se cae (>20 s), asigne una puntuación de 5.
      8. Si la rata no intenta mantener el equilibrio o colgarse de la viga y se cae dentro de los 20 segundos, asigne una puntuación de 6.
      9. Si la rata no logra completar la tarea, considérala como si hubiera tomado el tiempo máximo de 3 minutos y asígnale una puntuación de 6.
    4. Programe días de prueba en puntos de tiempo específicos.
      NOTA: Excluya a las ratas que no completaron el viaje de ida y vuelta de la caminata del haz durante dos ensayos antes de la CHI de la cirugía posterior y la evaluación conductual de seguimiento.
  2. Puntuación de gravedad neurológica modificada (mNSS)
    NOTA: la evaluación de mNSS incluye pruebas motoras, pruebas sensoriales, ausencia de reflejos, movimientos anormales, equilibrio de la viga y caminar en el suelo 32,33, que se realizó rápidamente a diario.
    1. Realizar pruebas motoras.
      1. Levanta a la rata por la base de la cola y observa los reflejos de sus extremidades durante unos 15 s para evaluar la flexión y extensión adecuadas.
      2. Si se observa una flexión normal en la extremidad anterior, asigne una puntuación de 0. Si no se observa ninguna flexión, asigne una puntuación de 1.
      3. Si se observa una flexión normal en la extremidad posterior, asigne una puntuación de 0. Si no se observa ninguna flexión, asigne una puntuación de 1.
      4. Si la cabeza se mueve >10° al eje vertical dentro de los 30 segundos después de levantar a la rata por la cola, asigne una puntuación de 0. Si no es así, asigne una puntuación de 1.
        NOTA: Se asignarán un máximo de 3 puntuaciones en esta sesión de la prueba.
    2. Realizar pruebas de colocación de extremidades.
      NOTA: La prueba de colocación se realiza para evaluar la coordinación entre la función sensorial (visual, táctil y propiocepción) y motora.
      1. Baje lentamente la rata hacia la superficie de la mesa. Observa si las patas de las ratas alcanzaban y se estiraban hacia la superficie.
      2. Si las ratas llegaron a la superficie con ambas extremidades estiradas y hacia adelante, asigne una puntuación de 0. Si hay un retraso o no hay respuesta, asigne una puntuación de 1.
      3. Coloque la rata en la superficie y tire de la pata contra el borde de la mesa. Observa si su pata vuelve a una posición normal en la superficie de la mesa.
      4. Si se observan respuestas de colocación inmediatas y normales, asigne una puntuación de 0. Si se observan respuestas de colocación tardías, asigne una puntuación de 1. Si no hay respuesta, asigne una puntuación de 2.
        NOTA: Se asignarán un máximo de 3 puntuaciones en esta sesión de la prueba.
    3. Observe la ausencia de reflejos y movimientos anormales.
      1. Observe los movimientos de cabeza para evaluar el reflejo del pabellón auricular al tocar el meato auditivo con el extremo de algodón de un hisopo de algodón.
      2. Si se observa un reflejo normal, asigne una puntuación de 0. Si no se observa ningún reflejo, asigne una puntuación de 1.
      3. Evalúe la presencia del reflejo corneal tocando la córnea con el extremo de algodón de un hisopo de algodón.
      4. Si se obtiene una respuesta normal, asigne una puntuación de 0. Si no se provoca ninguna respuesta de parpadeo, asigne una puntuación de 1.
      5. Haz un aplauso corto y fuerte. Observa la presencia del reflejo de sobresalto.
      6. Si se observa un reflejo, asigne una puntuación de 0. Si no se observa ningún reflejo, asigne una puntuación de 1.
      7. Observa si la rata tiene convulsiones, mioclonía o miodistonía.
      8. Si se produce alguno de ellos, asigne una puntuación de 1.
        NOTA: Se asignará un máximo de 4 puntuaciones en esta sesión de la prueba.
    4. Realice la prueba de equilibrio de viga, como se describió anteriormente (paso 3.1).
      NOTA: Se asignará un máximo de 6 puntuaciones en esta sesión de la prueba.
    5. Realice la prueba de caminar en el suelo.
      1. Prepare la arena de campo abierto (75 cm de largo, 50 cm de ancho y 40 cm de profundidad). Asegúrese de que esté limpio y libre de señales de olor anteriores.
      2. Coloque una rata en el centro de la arena de campo abierto y observe cómo camina la rata en la arena.
      3. Si la rata realiza una caminata regular, asigne una puntuación de 0.
      4. Si la rata no puede caminar recta, asigna una puntuación de 1.
      5. Si la rata cae hacia el lado parético después de colocarla en el suelo, asigna una puntuación de 3.
        NOTA: Se asignarán un máximo de 3 puntuaciones en esta sesión de la prueba.
    6. Suma todas las puntuaciones; La puntuación máxima posible es 18.
      NOTA: La puntuación más alta indica un peor resultado.

4. Inmunohistología

  1. Realizar perfusión transcardíaca35.
    NOTA: La perfusión transcardíaca se realiza después de la resonancia magnética 50 días después de la CHI (Figura 1).
    1. Coloque a la rata en una pequeña cámara de inducción y anestesiéela con isoflurano (5%) hasta que no responda a un pellizco de pata o cola.
    2. Administrar 50 mg/kg de peso corporal de zoletil (50 mg/mL) y 10 mg/kg de peso corporal de xilacina (Roumpun, 23,32 mg/mL) mediante inyección intraperitoneal para anestesia profunda.
    3. Coloca a la rata en posición supina.
    4. Realice una incisión transversal de aproximadamente 4-5 cm de longitud debajo del tórax con unas tijeras.
    5. Localiza el diafragma y córtalo para exponer el corazón.
    6. Utilice pinzas hemostáticas para pinzar la arteria pulmonar y luego haga una incisión de aproximadamente 0,5-1 cm de longitud en la aurícula derecha.
    7. Conecte la aguja a la tubería conectada a la bomba de infusión.
    8. Inserte la aguja en el ventrículo izquierdo.
    9. Enjuagar al animal mediante perfusión transcardíaca (40 mL/min) con 500 mL de solución salina al 0,9% hasta que la sangre se elimine.
    10. Perfundir al animal a través de perfusión transcardíaca (40 mL/min) con 500 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% para su fijación.
    11. Retira la cabeza de la rata y pela con cuidado el tejido cerebral del cráneo.
    12. Conservar el cerebro en aproximadamente 20 mL de PFA al 4% en el frasco durante 48 h para la postfijación.
  2. Realizar el procesamiento de tejidos y la tinción de IHQ36,37.
    NOTA: Realice la tinción inmunohistoquímica en secciones de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina utilizando el kit del sistema de detección secundaria de inmunoperoxidasa.
    1. Utilice secciones de tejido fijadas en formol e incrustadas en parafina.
    2. Realizar la desparafinación y tratar los portaobjetos con 3% deH2O2 para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena. Realizar la recuperación de antígenos utilizando tampón de citrato a 90 °C.
    3. Realice la tinción inmunohistoquímica utilizando el kit del sistema de detección secundaria de inmunoperoxidasa.
      NOTA: Los procedimientos de tinción se llevan a cabo siguiendo las recomendaciones del fabricante.
    4. Use hematoxilina para contratinción de muestras.
    5. Monte las muestras con un reactivo antidecoloración.
    6. Utilice anticuerpos anti-proteína ácida fibrilar (GFAP) para la tinción inmunohistoquímica.
    7. Adquiera las imágenes de las ROI utilizando un escáner de portaobjetos de microscopio óptico (Figura 6).

5. Análisis estadístico de los resultados del comportamiento y de la imagen

NOTA: En el presente estudio, el análisis estadístico se realizó en el programa SPSS; Sin embargo, el análisis estadístico se puede realizar en otras cajas de herramientas estadísticas.

  1. Cargue los datos en formato ancho en un archivo SPSS *.sav.
  2. Llevar a cabo un análisis de varianza de medidas repetidas (ANOVA) para comparar el comportamiento (peso normalizado, mNSS y duración de la caminata del haz) y los resultados de la imagen (valores de FA en la corteza y CC) a lo largo del tiempo entre los grupos.
    1. Haga clic en Analizar > modelo lineal general > medidas repetidas.
    2. Asigne un nombre en el cuadro Nombre del factor dentro del sujeto (por ejemplo, tiempo) y ponga '3' en el cuadro Número de niveles (tres niveles con diferentes puntos de tiempo de seguimiento). Asigne un nombre en el cuadro Nombre de medida (por ejemplo, mNSS) en el cuadro de diálogo Definir factor(es) de medidas repetidas .
    3. Cargue las variables dentro del sujeto (datos adquiridos en pre-, D1 y D50 post-CHI) que deben probarse y especifique el factor entre sujetos (por ejemplo, grupos de animales con diferentes parámetros de impacto) en el cuadro de diálogo Medidas repetidas .
    4. Seleccione Bonferroni como prueba post hoc para factor(es) (por ejemplo, grupos de animales) en el cuadro de diálogo comparaciones múltiples post hoc para medias observadas .
      NOTA: Para corregir las comparaciones múltiples, el error de tipo I se ajustó utilizando las correcciones de Bonferroni (0,05/3) para las comparaciones a lo largo del tiempo. La significación estadística se definió como p < 0,05 (SPSS ajustado).
  3. Realizar un análisis de ANOVA de un factor para comparar el reflejo de enderezamiento y el cambio de volumen cortical entre los grupos.
    1. Haga clic en Analizar > comparar medias > ANOVA de un factor.
    2. Cargue las variables (reflejo de enderezamiento y cambio de volumen cortical) en la Lista de dependientes y los grupos como el Factor en el cuadro de diálogo ANOVA de un factor .
    3. Seleccione Bonferroni como prueba post hoc en el cuadro de diálogo ANOVA de un factor: Comparaciones múltiples post hoc .
      NOTA: Para corregir las comparaciones múltiples, el error tipo I se ajustó utilizando correcciones de Bonferroni (0,05/5) para las comparaciones entre grupos. La significación estadística se definió como p < 0,05 (SPSS ajustado).

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Resultados

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La Figura 2 muestra resonancias magnéticas longitudinales de animales representativos con CHI simulado y repetitivo en el SMCx. No se encontró fractura de cráneo significativa ni contusión cerebral en las imágenes ponderadas en T2 a 1 y 50 días después de la CHI. No se encontró edema significativo ni deformación de la WM en los mapas de AF a los 1 y 50 días después de la CHI. Todos los animales sometidos a CHI en este estudio sobrevivieron a toda la duración experimental de 50 días, demostra...

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Discusión

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Este estudio tuvo como objetivo establecer un modelo animal de lesión cerebral traumática leve (mTBI) no complicada para evaluar los efectos acumulativos de lesiones únicas y repetitivas, así como los resultados de los impactos en diferentes regiones cerebrales. El modelo de lesión de cabeza cerrada (CHI), adaptado del paradigma de lesión de cabeza cerrada y caída de peso, fue diseñado para imitar las conmociones cerebrales que comúnmente experimentan los atletas y las personas con prote...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses potenciales que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (NSTC) de Taiwán (NSTC 113-2314-B-A49-047).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AcetaminofénLaboratorios del Centro IncN02BE01
Antibióticos (crema Dermanest)Commwell Pharmaceutial Co., Ltd49391
Tampón retrival de antígeno (tampón de citrato 100x)AbcamAB93678
Anticuerpo antiproteína ácida fibrilar (GFAP)Tecnología Bioworld, IncBS6460
Barra de equilibrioHecho a medidaHecho a medida3 cm de profundidad, 3 cm de ancho, 80 cm de largo y 60 cm por encima del suelo
Aparato de comportamiento
Casco circularHecho a medidaHecho a medidaAcero inoxidable, 10 mm de diámetro, 1 mm de espesor
Lesión cerrada en la cabeza
Impactador de lesiones en la cabeza cerradaHecho a medidaHecho a medidaUn tubo de acero inoxidable (1 m de altura con un diámetro interior de 20 mm), un impactador asegurado con una punta redonda (acero inoxidable, 10 mm de diámetro de punta) en la parte inferior del tubo, un peso (acero inoxidable, 600 g).
FormalinaTecnología Bioworld, IncC72
Instrumento de anestesia con gas (vaporizador)RWD Life Science Co.Vaporizadores y accesorios de anestesia animal R580S
HematoxilinaBioman Scientific Co., Ltd17372-87-1
Inmunohistología
Kit de sistema de detección secundaria de inmunoperoxidasaLaboratorios Bio-Check LtdK5007
IsofluranoPanion y BF Biotech Inc.8547
LidocaínaTecnología de paso Co., LtdN01BB02
escáner de portaobjetos para microscopio ópticoOlimpoBX63
Sistema de control y compuerta de animales pequeños compatible con RMInstrumentos SAModelo 1025 El kit de monitorización con la almohada respiratoria, los electrodos de ECG y la sonda rectal
MRI
Consejo operativo de resonancia magnéticaBrukerBiospecSoftware Paravision 360.
Sistema de resonancia magnéticaBrukerBiospecEscáner PET/MR (PET en línea), 7 T, 105 cm  diámetro interior del orificio con gradiente establecido.
Arena de campo abiertoHecho a medidaHecho a medida75 cm de largo, 50 cm de ancho y 40 cm de profundidad
Oxímetro de pulsoCorporación de Ciencias de la Vida STARR. MouseOx PlusRatón y Oxímetro de pulso para ratas
Adaptadores para ratasRWD Life Science Co.68021
Estadísticas SPSS 29IBMVersión 29.0
Marco estereotáxicoRWD Life Science Co.G1124901-001
Bobina de volumenBrukerBiospecDiámetro interior de 40 mm, transceptor para excitación por radiofrecuencia y recepción de señales.
XilacinaBayer Taiwan Company Ltd
ZoletilVirbacBN8M3YA

Referencias

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