Method Article

Ensamblaje de organoides de la retina con microglía

DOI:

10.3791/67016

⸱

July 26th, 2024

 ,  , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microglía es una célula inmunitaria residente única en la retina que desempeña un papel crucial en diversas enfermedades degenerativas de la retina. La generación de un modelo de cocultivo de organoides retinianos con microglía puede facilitar una mejor comprensión de la patogénesis y el progreso del desarrollo de las enfermedades de la retina.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Debido a la accesibilidad limitada de la retina humana, los organoides retinianos (RO) son el mejor modelo para estudiar la enfermedad de la retina humana, que podría revelar el mecanismo del desarrollo de la retina y la aparición de la enfermedad de la retina. La microglía (MG) son macrófagos residentes únicos en la retina y el sistema nervioso central (SNC), que cumplen funciones inmunitarias cruciales. Sin embargo, los organoides de la retina carecen de microglía ya que su origen de diferenciación es el saco vitelino. La patogenia específica de la microglía en estas enfermedades de la retina sigue sin estar clara; Por lo tanto, resulta necesario el establecimiento de un modelo de organoide retiniano incorporado a la microglía. Aquí, construimos con éxito un modelo de cocultivo de organoides de retina con microglía derivada de células madre humanas. En este artículo, diferenciamos la microglía y luego la cocultivamos en organoides retinianos en la etapa inicial. Como incorporación de células inmunitarias, este modelo proporciona una plataforma optimizada para el modelado de enfermedades de la retina y el cribado de fármacos para facilitar la investigación en profundidad sobre la patogénesis y el tratamiento de las enfermedades relacionadas con la retina y el SNC.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Como fuente limitada de la retina humana, la diferenciación de las células madre humanas en organoides retinianos tridimensionales (3D) representa un modelo in vitro prometedor para simular la retina1. Contiene diferentes tipos de células en la retina, incluidos fotorreceptores, células ganglionares de la retina, células bipolares, células de Müller, células horizontales y astrocitos2. Este modelo permite emular y estudiar tanto los mecanismos de desarrollo de la retina como la patogénesis de las enfermedades de la retina. Sin embargo, debido al método de diferenciación direccional, los organoides de la retina se derivaron del neuroectodermo3, careciendo de muchos otros tipos de células que se originan en diferentes capas germinales, como la microglía del saco vitelino y las células perivasculares del mesodermo 4,5,6.

En la actualidad, se ha demostrado que muchas enfermedades de la retina, como la retinosis pigmentaria7, el glaucoma8 y el retinoblastoma9, están estrechamente relacionadas con la microglía dentro de la retina. Sin embargo, debido a la falta de modelos de investigación adecuados, los mecanismos específicos que ilustran la relación entre la microglía y estas enfermedades aún no están claros. Si bien los ratones han servido como un modelo favorable para el estudio de las enfermedades de la retina, estudios recientes han destacado diferencias significativas entre la microglía de ratón y la humana en términos de esperanza de vida, tasa de proliferación y ausencia de genes homólogos humanos10,11. Estos hallazgos sugirieron que las conclusiones extraídas de modelos de ratón pueden no ser del todo fiables, lo que pone de relieve la importancia de construir organoides de retina humana que contengan microglía.

En las últimas décadas, se han desarrollado diversos métodos para la diferenciación 3D de organoides retinianos12,13. Para facilitar la operación de cocultivo de microglía dentro de organoides de retina, hemos seleccionado un método de diferenciación que implica una transición de cultivo adherente a cultivo en suspensión. Este enfoque permite con éxito la incorporación de la microglía a los organoides de la retina, manteniéndolos durante al menos 60 días14.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Institucional del Hospital Tongren de Pekín, Universidad Médica de la Capital. La línea celular H9 de HESC pertenecía al Instituto de Investigación WiCell. Precalentar el medio de cultivo celular a temperatura ambiente (RT) durante 30 minutos antes del experimento.

1. Generación de microglía humana

  1. Cultive las hESC en medio de células madre hasta que la densidad celular alcance el 80%-90%. Siembre al menos 1 x 106 celdas en cada pocillo.
  2. Aspire el medio de células madre y enjuague las células con 1x DPBS (1 mL/pocillo de la placa de 6 pocillos). El siguiente paso requiere 2 x 107-1 x 108 celdas. Si no es suficiente, combine celdas de 2 a 5 pocillos para realizar los siguientes pasos.
  3. Disocie las colonias de células madre utilizando la solución de EDTA de 0,5 mM durante unos 5 min en una incubadora a 37 °C (1 mL/pocillo de la placa de 6 pocillos).
  4. Verifique la morfología de la colonia después de 5 min. Cuando los bordes de las colonias están ligeramente enroscados con espacios sueltos, las células están listas para diferenciarse y aspirar el EDTA. De lo contrario, incube las células a 37 °C durante otros 1-2 minutos. No incubar durante más de 8 min.
  5. Enjuague suavemente las células de cada pocillo con 6 mL de medio A (Tabla 1) con 6 μL de solución 10 mM de inhibidor de ROCK Y-27632. Golpea suavemente el fondo del plato para ayudar a enjuagar las células. Establezca el día como día 0.
    NOTA: No pipetee las células. Las células formarán cuerpos embrioides (EB) al día siguiente.
  6. Después de 24 h, observe las células bajo el microscopio para confirmar la formación de EB. Recoja los EB en un tubo centrífugo de 15 mL con una pipeta de 10 mL y espere a que los EB se asienten en el fondo en 5 minutos.
  7. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender los EB con 6 mL de medio A fresco y transfiéralos a un nuevo pocillo de baja adherencia de placa de 6 pocillos. Cultivo en incubadora a 37 °C.
    NOTA: El propósito de la transferencia del pozo en el día 1 es reducir la influencia de una gran cantidad de células muertas durante el proceso de formación de EB, lo que puede afectar el estado de crecimiento celular.
  8. Refresque el Medio A fresco diariamente hasta el día 4 (6 mL/pocillo de placa de 6 pocillos).
  9. El día 4, cubra un plato de 10 cm con 3 ml de solución de gelatina de pescado al 0,1% durante al menos 1 h en una incubadora con 5% de CO2 a 37 °C.
    NOTA: Si el tiempo de recubrimiento es inferior a 1 h, es difícil realizar los siguientes pasos.
  10. Recoja cuidadosamente los EB en un tubo centrífugo de 15 ml con una pipeta de 10 ml y espere a que los EB se asienten en el fondo en 5 minutos.
  11. Retire la solución de gelatina al 0,1% y enjuague el plato de 10 cm una vez con 5-6 ml de 1x DPBS. Retire el DPBS.
  12. Vuelva a suspender suavemente los EB con 15 mL de medio B (Tabla 1) en el tubo centrífugo de 15 mL y transfiéralos a la placa de 10 cm recubierta. Cultivo en incubadora a 37 °C, 5% CO2 durante 1 semana.
    NOTA: En los primeros 7 días, no mueva el plato.
  13. Refresque con medio B fresco una vez a la semana hasta el día 49 (plato de 15 mL/10 cm) y examine las células bajo el microscopio una vez a la semana.
    NOTA: Después del día 49, se pueden encontrar varias células secretoras en el sobrenadante en la placa de cultivo.
  14. Centrifugar las células sobrenadantes a 200 x g durante 5 min a RT.
  15. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 2 mL de medio B fresco y transfiéralo a un nuevo pocillo de baja adherencia de placa de 6 pocillos. Incubar en una incubadora con 5% de CO2, a 37 °C.
    NOTA: En los próximos 7 días, no mueva la placa. La microglía podría adherirse al fondo del pozo de baja adherencia.
  16. En el día 56, reemplácelo con el medio C (Tabla 1) (2 mL/pocillo de placa de 6 pocillos). La microglía se adhiere a la parte inferior del pocillo de baja adherencia y se verá ramificada bajo el microscopio.
    NOTA: Al cambiar el medio C cada 3 días (2 mL/pocillo de placa de 6 pocillos), la microglía podría cultivarse en el medio C durante unos 15 días.

2. Generación de ROs humanas y cocultivo de las ROs con microglía

  1. Cultivo de las hESCs en medio de células madre hasta que la densidad celular alcanza el 80%-90%. Siembre al menos 1 x 106 celdas en cada pocillo.
  2. Agregue Dispasa (1 mL/pocillo de la placa de 6 pocillos) a la celda de cultivo. Incubar a 37 °C durante 5 min. Aspire la solución de Dispasa del pocillo.
  3. Agregue el medio D (Tabla 1) (1 mL/pocillo de la placa de 6 pocillos) al pocillo. Cortar la célula en trozos pequeños con una pipeta de 10 μL.
  4. Recoja suavemente todas las piezas de células y el medio en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  5. Centrifugar a 200 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante.
  6. Resuspender suavemente las células en 200 μL de una matriz fría. Mueva el tubo de microcentrífuga 1,5 a una incubadora durante 20 minutos. Opere rápido porque la matriz se solidificará a temperatura ambiente (RT). Después de 20 minutos en la incubadora, la matriz se solidificará.
  7. Prepare un plato de 10 cm con 15 mL de Medio D. Resuspenda la Matrix con Medio D y agite suavemente la placa de Petri.
  8. Luego, coloque el plato en una incubadora durante 5 días. No mueva el plato. Establezca el día como día 0 (RO). Las células se adherirán en 3 días.
  9. El día 5 (ROs) y el día 10 (ROs), refresca el medio con el medio D.
  10. En el día 12 (ROs), retire el medio y agregue 3 mL de Dispasa a cada plato durante 5 min.
  11. Aspirar la Dispasa y añadir 15 mL de Medio E (Tabla 1).
  12. Microglía de cosecha: En el día 56 (MGs), aspirar suavemente el medio C, añadir Accutase (1 mL/pocillo de una placa de 6 pocillos) e incubar a 37 °C durante 3 min.
  13. Recoja las células de la microglía en un tubo centrífugo de 15 mL con una pipeta de 5 mL. Centrifugar las celdas a 200 x g en RT durante 5 min.
  14. Aspire suavemente el sobrenadante y suspenda la microglía con 1 mL de Medio E. Agregue la microglía a las ósmosis inversas digeridas el día 12.
    NOTA: En el día 12 (ROs), las celdas son adhesivas. En el día 13 (ROs), las células se encuentran suspendidas en el Medio E. Si el medio cambia de amarillo desde el día 12 (ROs) hasta el día 19 (ROs), refresque el medio con Medium E.
  15. En el día 19 (ROs), agregue los organoides al centro del plato girando suavemente el plato. Aspire suavemente el medio E y refresque el medio con el medio F.
  16. Transfiera los organoides con Medium F a un nuevo plato de suspensión.
  17. Cambie el medio una vez a la semana y seleccione organoides para los experimentos.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El procedimiento para la generación de organoides retinianos se describe en nuestro estudio previo15. Aquí, mostramos los resultados representativos de la microglía y el cocultivo de microglía y organoides de retina.

Aquí, demostramos cada etapa de la diferenciación de la microglía (Figura 1A). El día 0 representa la etapa de cultivo de células madre. Luego, las células madre fueron digeridas y cultivadas para la formación de EB. En los primeros 4 días del proceso, las células formarán EB (Figura 1B). Posteriormente, transferimos los EBs suspendidos a platos adherentes de 10 cm. Después de aproximadamente 7 días, las células son similares a las que se muestran en la Figura 1C. A medida que avanza el cultivo, las células adherentes secretan progenitores hematopoyéticos en el sobrenadante (Figura 1D). Este proceso tarda aproximadamente 45 días. En este punto, las células se pueden recolectar del sobrenadante y transferir a placas de 6 pocillos. Durante los próximos 7 días, la microglía madurará (Figura 1E) y estará lista para una mayor experimentación.

En el día 12 de la diferenciación de los organoides de la retina, las células adherentes se digieren en un cultivo en suspensión y se añade a los organoides de la retina el medio E que contiene microglía. La microglía migrará a los organoides de la retina. Con el fin de observar claramente la morfología de la microglía, añadimos la transfección de EGFP-lentivirus en las hESCs, lo que hizo que la microglía diferenciada expresara GFP con autofluorescencia (verde) (Figura 2A-C). También examinamos la estructura tisular de organoides de retina cocultivados con microglía utilizando el marcador de células fotorreceptoras CRX y el marcador de células microgliales IBA1 mediante ensayo de inmunofluorescencia en organoides retinianos cocultivados con microglía después de la diferenciación durante 50 días (Figura 2D).

figure-results-1
Figura 1: Diagrama esquemático y línea de tiempo de la célula de microglía derivada de hESC. (A) El protocolo comienza con la descongelación y el paso de hESC en una placa de 6 pocillos. (B) Los EB homogéneos formados que contienen medio A. (C) Los EB se transfieren a una placa recubierta y los progenitores hematopoyéticos se forman en los días 4-56. (D,E) En el día 56, se recolecta el sobrenadante con células (D) y se transfiere a una placa de 6 pocillos de baja adherencia para formar microglía en el día 63 (E). Barra de escala: 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Imágenes representativas a lo largo de la línea de tiempo durante el cocultivo de microglía y organoides retinianos. (A) Imágenes representativas de células de microglía derivadas de EGFP-hESC. (B) Cocultivo de microglía EGFP+ con organoides retinianos después de la diferenciación durante 18 días. (C) Cocultivo de microglía EGFP+ con organoides retinianos después de la diferenciación durante 30 días. Barra de escala: 300 μm. (D) CRX (marcador de células fotorreceptoras; rojo) e IBA1 (marcador microglial; verde) se utilizaron para detectar la estructura tisular de organoides retinianos cocultivados con microglía después de 50 días de diferenciación. DAPI (azul) tiñe el núcleo. Barra de escala: 30 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Composición de los medios utilizados en este estudio. En la tabla se enumeran los componentes necesarios para preparar el volumen de 500 mL de cada medio. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Debido a la disponibilidad restringida de la retina humana, nuestra comprensión actual de las respuestas inflamatorias de la retina casi proviene de modelos animales. Para superar esta limitación, se diferenciaron los organoides de la retina. El desarrollo de modelos de organoides retinianos ha sido un área activa de investigación, con el objetivo de recapitular la complejidad de la retina humana para el modelado de enfermedades y el desarrollo terapéutico. Varios estudios han reportado la generación exitosa de organoides retinianos a partir de células madre pluripotentes humanas 1,2,12,13. Sin embargo, la mayoría de estos modelos carecen de la presencia de microglía, que se sabe que desempeña un papel crucial en el desarrollo de la retina y la patogénesis de la enfermedad. Estudios recientes han intentado integrar la microglía en organoides de la retina o en modelos de organoides cerebrales 16,17,18, pero el método detallado no está claro. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado paso a paso para el cocultivo de microglía con organoides de la retina en la etapa temprana, ambos derivados de la misma línea hESC. Si bien algunos estudios han explorado el papel de la microglía en las enfermedades de la retina utilizando modelos animales o sistemas de cultivo celular 7,8,9, el modelo de cocultivo presentado aquí ofrece un sistema basado en humanos más relevante fisiológicamente para estudiar las interacciones microglía-retina y sus implicaciones en la patogénesis de la enfermedad.

Los pasos críticos son el estado celular de las células madre humanas y la diferenciación de la microglía y los organoides de la retina. La microglía y las ósmosis inversa deben diferenciarse paso a paso, y se deben utilizar los reactivos y la placa correctos (placa tratada con cultivo de tejidos o placa de suspensión) en diferentes etapas. Este modelo puede ayudarnos a comprender el proceso de cómo la microglía contribuye a la aparición de enfermedades de la retina. Tiene implicaciones significativas para el futuro cribado de fármacos y las investigaciones sobre los mecanismos de las enfermedades. Sin embargo, los métodos que publicamos actualmente todavía tienen algunas limitaciones. Debido al prolongado período de diferenciación de la microglía y a la falta de métodos de criopreservación adecuados, debemos planificar sabiamente nuestro tiempo para la diferenciación de la microglía y los organoides de la retina para el cocultivo.

Además de los organoides de la retina, creemos que la integración de células inmunitarias en otros modelos de organoides también puede fomentar el desarrollo de organoides. Por lo tanto, es crucial probar otros sistemas de organoides. La integración de varios tipos de células y organoides para formar órganos completos representa un modelo prometedor para el futuro.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conocimiento de ninguna afiliación, membresía, subvenciones o participación financiera que pueda afectar la objetividad de este estudio.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82101145) y la Fundación de Ciencias Naturales de Pekín (Z200014).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcctuaseStemcell Technologies07920
Advanced DMEM/F12Thermo12634-010
Anticuerpo anti-CRX(M02)abnovaH00001406-M02; dilución según las instrucciones del fabricante
Anticuerpo Anti-IBA1Abcamab5076; dilución según las instrucciones del fabricante
B27Life Tecnologías17105-041
Dispasa (1U/mL)Tecnologías de células madre07923
DMEM básicoGibco10566-016
DMEM/F12Gibco10565-042
DPBSGibcoC141905005BT
EDTAThermo 15575020
F12Gibco11765-054
FBSIndustria Biológica04-002-1A Gelatina
SigmaG7041-100G
GlutamaxGibco35050-061
H9 línea celularWiCell Research Institute
IL-3RD Systems 203-IL-050
IL-34PeproTech200-34-50UG
KSRGibco10828028
MatrixCorning356231
M-CSFRD Systems 216-MC-500  
MEM Solución de aminoácidos no esencialesSigmaM7145
N2Life Technologies17502-048
NeurobasalGibco21103-049
Pluma/estreptococoGibco15140-122
Medio de células madre Stemcell Technologies5990
TaurineSigmaT-8691-25G
X-ViVOLONZA04-418Q
Y27632SelleckS1049
β-mercaptoethanolLife Technologies21985-023
sólido

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