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Artículo de método

Microscopía correlativa de luz y electrónica de doble color para la visualización de interacciones entre mitocondrias y lisosomas

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DOI:

10.3791/67020

⸱

27 de septiembre de 2024

 , 
1Neural circuit research group, Korea Brain Research Institute

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un mecanismo para utilizar la microscopía óptica y electrónica correlativa para visualizar la interacción de mitocondrias y lisosomas marcados con mEosEM y APEX2, respectivamente.

Resumen

Los orgánulos celulares, como las mitocondrias y los lisosomas, muestran estructuras dinámicas. A pesar de la mayor resolución de la microscopía electrónica de transmisión para el análisis estructural, la microscopía óptica es esencial para la visualización de orgánulos dinámicos mediante el etiquetado específico del objetivo. El siguiente protocolo describe un método que combina microscopía correlativa de luz y electrónica de doble color (CLEM) para observar las interacciones entre las mitocondrias y los lisosomas. En este estudio, las mitocondrias se marcaron con mEosEM (Mito-mEosEM) y los lisosomas con TMEM192-V5-APEX2. Los resultados obtenidos de las imágenes CLEM permiten observar los cambios en las interacciones entre mitocondrias y lisosomas en condiciones de estrés externo. El tratamiento con bafilomicicina (BFA), que inhibe la función lisosomal, dio lugar a un aumento del contacto entre las mitocondrias y los lisosomas, lo que llevó a la formación de mitocondrias fragmentadas atrapadas dentro de los lisosomas. Por el contrario, el tratamiento con U18666A, que inhibe la exportación de colesterol de los lisosomas, hizo que los lisosomas estuvieran rodeados de mitocondrias, lo que indica una forma distinta de interacción. Este estudio presenta un método eficaz para observar las interacciones entre las mitocondrias y los lisosomas en células fijas. Además, las imágenes CLEM con sondas de doble color ofrecen una poderosa herramienta para futuras investigaciones sobre la dinámica de los orgánulos y sus implicaciones para la función y la patología celular.

Introducción

Las mitocondrias y los lisosomas son los principales orgánulos unidos a la membrana que son esenciales para el mantenimiento de la homeostasis celular. Las mitocondrias son orgánulos celulares altamente dinámicos modulados por eventos de fisión y fusión1. En general, las mitocondrias se conocen como la fuente de energía de la célula y son conocidas por su importante papel en la fosforilación oxidativa, la producción de ATP y el almacenamiento de metabolitos como calcium2. Además de su papel en el metabolismo energético, las mitocondrias están involucradas en una serie de otros procesos de señalización celular, incluyendo la apoptosis3,4, calcium signaling5,6 y el metabolismo de los lípidos7,8. De manera similar, los lisosomas son orgánulos celulares altamente dinámicos que desempeñan múltiples funciones como centros de reciclaje celular para mantener la limpieza celular a través de la degradación de proteínas, la autofagia, la endocitosis y la fagocitosis9. Aparte de su papel en la degradación, los lisosomas también desempeñan funciones en la fisiología celular, como la detección de nutrientes, la homeostasis10, el metabolismo de los lípidos11 y la desdiferenciación celular12.

A pesar de la existencia de numerosos estudios sobre las funciones de los orgánulos celulares individuales, nuestra investigación reciente se ha concentrado en la interferencia menos comprendida entre las mitocondrias y los lisosomas, que se ha demostrado que influye tanto en la fisiología como en la patología celular. Los contactos entre las mitocondrias y los lisosomas se han observado en varios tipos de células, incluidas las células cancerosas, las neuronas y las células derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC)13, y se observan principalmente bajo estrés celular o en enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson13,14 y la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth15. El contacto entre las mitocondrias y los lisosomas juega un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis metabólica a través del intercambio de iones (por ejemplo, Ca2+)16, cholesterol17 y iron18 entre los dos orgánulos. Además, el contacto entre las mitocondrias y los lisosomas desempeña un papel crucial en el control de calidad de los orgánulos celulares. Por ejemplo, las mitocondrias dañadas pueden ser objeto de degradación a través del proceso de mitofagia, en el que son engullidas por autofagosomas y entregadas a los lisosomas para su degradación. En consecuencia, se puede facilitar la eliminación de las mitocondrias disfuncionales antes de que causen más daño a la célula o a las mitocondrias normales. Esta interacción entre las mitocondrias y los lisosomas es crucial para mantener la homeostasis celular y prevenir la acumulación de orgánulos disfuncionales. Por lo tanto, solo las mitocondrias dañadas se eliminan selectivamente, lo que permite que las mitocondrias sanas funcionen de manera óptima dentro de la célula.

Microscopía correlativa de luz y electrónica (CLEM) es una técnica de imagen que recientemente ha recibido atención como método de investigación al combinar las ventajas de la microscopía óptica (LM) y la microscopía electrónica (EM) para proporcionar información estructural detallada a diferentes escalas. En CLEM, primero se obtienen imágenes de una muestra utilizando LM para identificar regiones específicas de interés, seguido de los pasos de preparación de la muestra EM, como la fijación, la deshidratación y la inclusión. A continuación, se observa la misma muestra bajo un microscopio electrónico. Aunque recientemente se han reportado métodos CLEM de células vivas19,20,21,22, sigue siendo un desafío combinar con precisión imágenes ópticas de muestras biológicas altamente dinámicas con imágenes de microscopía electrónica de células fijas en un solo plano. En el caso de los orgánulos altamente dinámicos, como las mitocondrias y los lisosomas, su localización precisa puede cambiar a medida que se observan en vivo bajo el microscopio óptico, y continúan moviéndose incluso durante el corto tiempo de retardo necesario para la fijación.

Por lo tanto, en este protocolo, se emplearon dos etiquetas moleculares diferentes que permanecen activas incluso dentro de soluciones fijadoras para visualizar la interacción entre las mitocondrias y los lisosomas, que desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis metabólica a través del intercambio de iones (por ejemplo, Ca2+)16, cholesterol17 y iron18 entre estos orgánulos. Las construcciones TMEM192-V5-APEX2 y Mito-mEosEM se utilizaron para observar las interacciones de las mitocondrias y los lisosomas en células cultivadas a nivel de EM y LM. En el caso de las mitocondrias, se seleccionó la etiqueta mEosEM por su capacidad para preservar la señal de fluorescencia durante la preparación de la muestra EM en una solución fijadora y OsO423. En el caso de los lisosomas, se utilizó la etiqueta APEX2, una proteína de aproximadamente 28 kDa, para estudiar la localización de una proteína específica tanto a nivel de EM como de LM24. En presencia de peróxido de hidrógeno, el sustrato del APEX2, Amplex-Red, forma un polímero insoluble que se puede observar mediante microscopía confocal en la ubicación de la marca. En este protocolo, se utilizó CLEM de doble color para visualizar la estructura de las interacciones entre los lisosomas y las mitocondrias en células fijas.

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Protocolo

El flujo de trabajo paso a paso para la preparación de muestras se muestra en Figura 1.

1. Cultivo celular y transfección

  1. Cultivo de células HeLa a una densidad de 1 × 105 células en placas de cultivo de 35 mm con fondo de rejilla de vidrio que contienen DMEM con 10% de suero fetal bovino y 100 U/mL de penicilina y estreptomicina a 37 °C.
  2. Al día siguiente de sembrar las células, cotransfecte las células con una confluencia del 30%-40% con los plásmidos TMEM192-V5-APEX2 y Mito-mEosEM utilizando el reactivo de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante (1 μg de ADN de TMEM192-V5-APEX2 y plásmido Mito-mEosEM con 3 μL de reactivo de transfección). Después de la transfección, tratar las células con DMSO o U18666A (2 μg/mL) y bafilomycin A1 (100 nM) durante 18 h.

2. Imágenes microscópicas confocales

  1. Después de tratar las células con bafilomycina y U18666A durante 18 h, retire el medio de cultivo y agregue inmediatamente 250 μL de solución fijadora tibia (30 °C-37 °C) (2,5% de glutaraldehído y 2% de paraformaldehído en una solución de cacodilato de sodio 0,1 M [pH 7,0]) mediante un pipeteo suave. Retire inmediatamente el fijador, reemplácelo con 1,5 ml de fijador nuevo e incube en hielo durante 30 minutos. A continuación, lave las células durante 3 x 10 min en 1 mL de tampón de cacodilato de sodio 0,1 M helado.
    NOTA: Los vapores de aldehído son tóxicos. Todos los experimentos deben realizarse en una campana extractora ventilada.
  2. Añadir 1 mL de solución fría de glicina 20 mM para apagar el aldehído e incubar en hielo durante 10 min. Lavar 3 x 10 min con tampón de cacodilato de sodio 0,1 M frío.
  3. Prepare una solución fresca que contenga 300 μM de Amplex-Red añadiendo 10 mM deH2O2 a una solución de cacodilato de 0,1 M. Añada 500 μL de solución Amplex-Red a la placa de muestra e incube durante 5 minutos en hielo.
  4. Retire la solución Amplex-Red y enjuague 3 x 10 min con tampón de cacodilato de sodio 0,1 M.
  5. Después de la tinción Amplex-Red, utilice un microscopio confocal para obtener imágenes del área alrededor de las células de interés en el modo de escaneo de mosaico de 3 x 3. Capture tanto el contraste de interferencia diferencial (DIC) como la señal de fluorescencia para identificar y registrar la cuadrícula y las letras en el plato de la cuadrícula utilizando un objetivo de 40x (o 60x).
    NOTA: Estas imágenes de descripción general sirven como un mapa para identificar células objetivo específicas en las muestras incrustadas en plástico.
  6. Visualice las celdas objetivo con un aumento alto utilizando un objetivo de 40x (o 60x) y adquiera una imagen de pila Z.
    NOTA: Esta imagen de gran aumento se superpone a una imagen de microscopio electrónico para crear una imagen correlativa.

3. Preparación de la muestra para el bloque EM

  1. Después de la imagen de LM, añadir 1 mL de tetróxido de osmio reducido al 1% (preparado conteniendo un 3% de ferrocianuro de potasio en tampón de cacodilato 0,3 M con un volumen igual de tetróxido de osmio acuoso al 2%) para la postfijación a 4 °C durante 1 h, y luego enjuagar durante 3 x 10 min con agua destilada a 4 °C.
    NOTA: Los vapores de tetróxido de osmio son tóxicos. Todos los experimentos deben realizarse en una campana extractora ventilada.
  2. Enjuague 3 x 10 min con agua destilada a temperatura ambiente, luego deshidrate en una serie de etanol graduado durante 15 min cada vez (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% y 100%) a temperatura ambiente.
  3. Mezcle etanol con resina epoxi en proporciones de volumen de 3:1, 1:1 y 1:3, preparando un total de 300 μL de cada mezcla. Vierte cada resina epoxi en el plato, dejándola incubar a temperatura ambiente durante 1 h. A continuación, utiliza la resina epoxi 100% para la impregnación durante la noche.
  4. Prepare la cápsula de inclusión o el tubo de PCR llenándolo con resina epoxi fresca, coloque el tubo o la cápsula boca abajo en la región de interés y colóquelo en un horno a 60 °C durante 48 h para polimerizar.

4. Seccionamiento e imágenes TEM

  1. Después de que la resina epoxi se haya polimerizado por completo, separe el vidrio inferior del bloque de polímero sumergiéndolo en nitrógeno líquido.
  2. Coloque el bloque de muestras en el portamuestras del ultramicrótomo y colóquelo en el bloque de recorte. Usa una cuchilla de afeitar para recortar la resina en forma trapezoidal o rectangular alrededor del objeto de interés.
  3. Coloque el bloque de muestras recortado en el portamuestras y ajuste el disco de diamante. Asegúrese de que el borde delantero del bloque de muestras esté perfectamente paralelo al borde del disco de diamante.
  4. Con un ultramicrótomo, corte secciones ultrafinas de aproximadamente 60-70 nm de las celdas incrustadas planas. Recoja las secciones en serie en una rejilla de ranura recubierta de formvar y séquelas en una placa caliente.
  5. Teñir la sección con el tinte de contraste durante 2 minutos y el citrato de plomo durante 1 minuto.
  6. Coloque la rejilla en el portamuestras TEM para su observación. Identifique la célula objetivo de interés en función de la imagen DIC del microscopio óptico. Visualice toda el área de la celda utilizando imágenes superpuestas en mosaico con un aumento de 1.700x.

5. Costura de imágenes con imageJ Fiji.

  1. Para comenzar a unir imágenes, inicie imageJ Fiji25 y haga clic en Archivo | Nuevo | TrakEM2 (en blanco) | Seleccione la carpeta de almacenamiento para crear un nuevo proyecto TrakEM226 (Figura 2A1).
  2. Abra el conjunto de datos de imágenes de teselas arrastrando y soltando los datos de imagen de teselas sin procesar en el espacio de trabajo (Figura 2A2).
  3. Haga clic con el botón derecho del ratón y seleccione Alinear | Montar todas las imágenes de esta capa | elastic (correspondencias de bloques no lineales) y, a continuación, haga clic en Aceptar para aceptar los parámetros restantes de los valores predeterminados (Figura 2A3).
  4. Haga clic con el botón derecho del ratón y seleccione Exportar | Crear imagen plana para crear una imagen cosida y, a continuación, haga clic en Archivo | Guardar como para guardar la imagen.

6. Cambiar el tamaño de la imagen de fluorescencia

  1. Abra el software de ampliación de fotos (consulte la tabla de materiales). Haga clic en Archivo | Abra y seleccione la imagen de fluorescencia.
  2. Introduzca la anchura y la altura para que sean del mismo tamaño que la imagen del microscopio electrónico, y seleccione el algoritmo que se aplicará en el método de cambio de tamaño (Figura 2B1).
  3. Haga clic en Archivo | Guardar COMO para guardar la imagen redimensionada.

7. Registro de imágenes basado en puntos de referencia con el plugin Big Warp

  1. Abra ImageJ Fiji y arrastre y suelte la micrografía de fluorescencia redimensionada (imagen FM) y la micrografía electrónica cosida (imagen EM).
  2. Haga clic en Plugins | Visor de BigData | Big Wrap para iniciar el registro, luego haga clic en el menú desplegable para seleccionar la imagen FM como imagen en movimiento y la imagen EM como imagen de destino (Figura 2C1).
    NOTA: Cada imagen FM y EM tendrá tres nuevas ventanas emergentes (Imagen en movimiento de BigWrap, Imagen fija de BigWrap y Puntos de referencia) para mostrar puntos de referencia.
  3. Compare las imágenes FM y EM utilizando funciones como zoom (rueda del ratón), rotación de la imagen (mover el ratón mientras se mantiene pulsado el botón izquierdo) y mover (mover el ratón mientras se mantiene pulsado el botón derecho) y, a continuación, pulse la barra espaciadora del teclado para activar el modo de referencia, y pulse el botón izquierdo del ratón para marcar al menos tres puntos de referencia identificados en las imágenes FM y EM ( Figura 2C2, puntos rosas y flecha roja).
  4. Después de marcar todos los puntos de referencia identificados, vaya a Archivo | Exportar imagen en movimiento | OK y aparecerá una nueva ventana emergente con la imagen FM transformada (Figura 2C3).
    NOTA: La ventana emergente recién creada es una imagen FM transformada en función del punto de referencia. Revise la alineación y realice ajustes, si es necesario, agregando o modificando puntos de referencia y volviendo a calcular la transformación.
  5. Haga clic en Archivo | Guardar como para guardar la imagen FM transformada.

8. Superposición de imágenes CLEM

  1. En ImageJ, arrastre y suelte la imagen FM transformada y la imagen EM unida.
  2. Haga clic en la imagen | Tipo | Color de 8 bits para establecer el mismo tipo de imagen para las imágenes LM y EM (Figura 2D1).
    NOTA: La imagen EM debe convertirse dos veces en el siguiente orden: 8 bits -> color RGB -> color de 8 bits.
  3. Haga clic en la imagen | Color >| Fusionar canales para combinar las imágenes en una imagen compuesta seleccionando las imágenes FM y EM en el menú desplegable, respectivamente (Figura 2D2).
  4. Haga clic en Archivo | Guardar como para guardar la imagen CLEM.

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Resultados

Para visualizar las interacciones entre mitocondrias y lisosomas utilizando este protocolo de microscopía electrónica de correlación de doble color, empleamos Mito-mEosEM y TMEM192-V5-APEX2. Primero se obtuvieron imágenes de células fijadas mediante microscopía óptica, seguido del muestreo y obtención de imágenes por microscopía electrónica. Los resultados de las imágenes correlacionadas se muestran en la Figura 3A,B y en la Figura 4A. Siguiendo...

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Discusión

Este protocolo describe CLEM de dos colores para observar la interacción de mitocondrias y lisosomas en células fijas utilizando etiquetas mEosEM y APEX2 codificadas genéticamente. En las últimas décadas, los avances en microscopía han mejorado enormemente la capacidad de observar cambios en las redes de orgánulos32,33, y el estudio de las interacciones de orgánulos se ha vuelto cada vez más interesante. La microscopía de superresolución se ha utilizado para obse...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación básica KBRI a través del Instituto de Investigación del Cerebro de Corea financiado por el Ministerio de Ciencia y TIC (24-BR-01-03). Los plásmidos TMEM192-V5-APEX2 fueron amablemente proporcionados por Hyun-Woo Rhee (Universidad Nacional de Seúl). Los datos de TEM se adquirieron en las instalaciones centrales de investigación del cerebro en KBRI.

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Materiales

Software y abierto abierto
Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Productos químicos y reactivos
25% GlutaraldehídoCiencias de la Microscopía Electrónica16200Los humos de aldehído son extremadamente tóxicos. Úselo solo en la campana extractora.
Solución de peróxido de hidrógeno al 30%Merck107210
Solución de paraformaldehído al 4%BiosesangPC2031-100-00son extremadamente tóxicos. Úselo solo en la campana extractora.
Amplex RedThermoFisherA12222
Epon 812Ciencias de la Microscopía Electrónica14120
EtanolMerck100983
Fugene HDPromegaE2311Transfección de plásmidos
GlicinaSIGMAG8898
Citrato de plomo 3%Ciencias de la Microscopía Electrónica22410
Tetróxido de osmio al 4 % solución acuosaElectrónica Microscopy Sciences16320Muy tóxico. Úselo solo en la campana extractora.
Hexacianoferrato de potasio (II) trihidrato;SIGMAP3289
Cacodilato de sodio trihidratoSigma-AldrichC0250-500G
Acetato de uraniloCiencias de la Microscopía Electrónica22400
UranyLess Tinción EMCiencias de la Microscopía Electrónica22409
Construcción de plásmidos
Mito-mEosEMaddgene132706DOI:  10.1016/j.chembiol.2024.02.007
TMEM192-V5-APEX2Sharma N.  et al.N/ADOI:  10.1016/j.chembiol.2024.02.007
Tools
0.22 filtro de jeringa mmmSartorius16534
35 mm Cubreobjetos cuadriculadosMattekP35G-1.5-14-CGRD
BEEM Cápsulas de Inclusión TedPella130
Formvar Soportado Rejilla de cobre de una ranuraTed Pella01705
diamanteDiATOMEDU4530
Microtomo ultramicroscópicoLeicaARTOS Microscopía
confocal invertida
Microscopía electrónica de transmisiónFEITecnai G2
Algoritmos
Fiji/Image JNIH / códigohttps://imagej.nih.gov/ij/
Paquete de software ImageJ BigWarpNIH / códigohttps://imagej.net/plugins/bigwarp
Photozoom Pro 8 BenVistahttps://www.benvista.com/photozoompro

Alternative software
Image Resizer : https://imageresizer.com/
Gigapixel AI : https://www.topazlabs.com/gigapixel
ON1 redimensiona : https://www.on1.com/products/resize-ai/
Los humos de ldehído Cuchillo >de < Invertida Nikon A1 Rsi/Ti-E

Referencias

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