Este protocolo demuestra la combinación de imágenes y electrofisiología para detectar de forma fiable las despolarizaciones que se extienden en ratones adultos después de una lesión cerebral traumática leve.
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Artículo de método
Combinación de imágenes y electrofisiología para visualizar y registrar las despolarizaciones que se propagan en ratones
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En este artículo
Resumen
Resumen
Las despolarizaciones en expansión (SDs) son eventos masivos en el cerebro que a menudo pasan desapercibidos debido a su lenta propagación a través de la materia gris. Debido a que la detección de SD puede ser difícil de alcanzar, se confirma de manera óptima utilizando múltiples métodos. Este protocolo describe métodos para combinar imágenes y electrofisiología para detectar SD de una manera que la mayoría de los laboratorios pueden adoptar de manera confiable y fácil. Las MS ocurren después de lesiones cerebrales traumáticas, accidente cerebrovascular, hemorragias subaracnoideas, isquemia y aura de migraña. Históricamente, las SD se han registrado utilizando amplificadores de CC, que pueden resolver el lento desplazamiento extracelular y la depresión en la actividad de alta frecuencia. Sin embargo, los amplificadores de CC son casi imposibles de usar para grabaciones crónicas in vivo. Este protocolo emplea un amplificador de CA común para registros electrofisiológicos in vivo para confirmar la depresión de alta frecuencia, junto con imágenes no invasivas necesarias para detectar la onda de propagación de SD. Estos métodos pueden adoptarse y/o modificarse de manera confiable para la mayoría de los enfoques experimentales para confirmar la presencia o ausencia de SD después de una lesión cerebral.
Introducción
Las despolarizaciones dispersas (SDs) están asociadas con diversas afecciones neurológicas, incluyendo lesiones cerebrales traumáticas (TBI), accidente cerebrovascular, hemorragias subaracnoideas, isquemia y aura de migraña1. Las SD se han implicado en la progresión del daño tisular en accidentes cerebrovasculares y traumatismos craneoencefálicos2. El mecanismo exacto que subyace a la progresión de la pérdida de tejido sigue sin estar claro3,4. Sin embargo, las SD ocurren cuando las demandas metabólicas de las neuronas no se satisfacen con suficiente oxígeno y glucosa, ya que la función de la bomba de sodio-potasio dependiente de ATP se vuelve inadecuada para mantener los gradientes iónicos. Para comprender el papel de las SD en la pérdida de tejidos, se necesitan técnicas precisas para medirlas y estudiarlas, lo cual es crucial para avanzar en el conocimiento científico. Los SD son eventos neurológicos significativos que a menudo pueden pasar desapercibidos debido al diseño experimental y/o a las limitaciones de la instrumentación.
El papel de las despolarizaciones (DEs) en la progresión de las lesiones está siendo dilucidado actualmente, pero su papel en las lesiones cerebrales traumáticas leves (mTBIs) sigue sin estar claro. Estudios recientes utilizando las técnicas descritas en este manuscrito han demostrado que las SDs se inician en modelos de ratón mTBI de cráneo cerrado, incluso cuando no hay daño tisular manifiesto o sangrado5, 6. Estos estudios sugieren que los SD pueden contribuir a las deficiencias neurológicas agudas y a la neuroinflamación. Además, la presencia de SD inducidas por mTBI se ha asociado estrechamente con déficits conductuales agudos6,7. Por lo tanto, es probable que se inicien SD en todos los modelos de TCE, pero su papel sigue siendo difícil de determinar sin confirmación. Confirmar la presencia de SD es crucial para evaluar con precisión los resultados de las lesiones cerebrales traumáticas leves.
Las despolarizaciones en dispersión (SDs) se identifican por una caída significativa en el potencial extracelular, conocida como el "desplazamiento DC", y por una depresión de la actividad de alta frecuencia8. El "cambio de CC" normalmente tarda segundos en resolverse (~10 s)9. Para capturar el "cambio de CC", se requiere un amplificador de CC y electrodos de alambre plateado. Sin embargo, la electrofisiología in vivo generalmente se realiza con amplificadores de CA, que están diseñados para filtrar eventos de baja frecuencia para reducir los artefactos de movimiento. Desafortunadamente, este filtrado de baja frecuencia también elimina el "cambio de CC", además de que la plata es tóxica e inadecuada para grabaciones crónicas. Los amplificadores de CA de uso común pueden detectar la depresión de la actividad de alta frecuencia, pero sin el "cambio de CC" que lo acompaña, confirmar la presencia de una SD es un desafío.
Las despolarizaciones dispersas (SDs) también se pueden detectar utilizando diversas técnicas de imagen. Lo más común es que las SD se visualicen con imágenes de contraste de moteado láser, que mide el flujo sanguíneo cerebral a través del cráneo intacto10. Las SD influyen significativamente en la vasculatura cerebral y el flujo sanguíneo. En la mayoría de las especies, aparte de los ratones, los SD inducen una onda de propagación de hiperperfusión que viaja con el borde delantero del SD11. Las SD también se pueden obtener imágenes utilizando indicadores fluorescentes de calcio o glutamato12, aunque esto requiere cargar el tejido con tintes o indicadores fluorescentes codificados genéticamente12,13. Curiosamente, las SD se pueden observar a simple vista debido a las señales ópticas intrínsecas (iOS) asociadas con la SD14. Los iOS son señales complejas compuestas por moléculas autofluorescentes como NAD(P)H y FADH15,16, hinchazón de tejidos17 y posibles cambios en el flujo sanguíneo cerebral. A pesar de su complejidad, las señales de iOS son fiables y se pueden capturar en ratones de tipo salvaje18. Este protocolo describe el método para obtener imágenes de iOS porque esta técnica se puede implementar en cualquier laboratorio sin la necesidad de virus especializados o animales transgénicos.
El objetivo general de este método es confirmar experimentalmente la presencia o ausencia de una despolarización (SD) generalizada después de una lesión cerebral traumática leve (mTBI) utilizando imágenes y electrofisiología simultáneas. La electrofisiología in vivo, facilitada por amplificadores avanzados, es una técnica comúnmente utilizada. Sin embargo, estos amplificadores no pueden detectar el "desplazamiento de CC" característico, por lo que se emplean técnicas de imagen, como se describe en este protocolo, para confirmar con confianza la presencia o ausencia de SD. La ventaja de combinar imágenes y electrofisiología es que las imágenes pueden detectar la propagación de la SD, mientras que la electrofisiología puede identificar la depresión de alta frecuencia asociada.
En general, este método es adecuado para investigar la presencia de despolarizaciones (SD) dispersas después de una lesión cerebral traumática (TCE). Su aplicación podría mejorar la comprensión de la función de la red cortical después de un traumatismo craneoencefálico y una desviación estándar. Este protocolo se puede adaptar de un modelo de impacto de cráneo cerrado a otros modelos, como el impacto cortical controlado, la percusión de fluidos o la caída de peso. La implementación de este protocolo en múltiples laboratorios podría dilucidar el papel de las SD en diferentes gravedades de LCT. Se puede utilizar cualquier modelo de TBI establecido, seguido de los procedimientos de imágenes y electrofisiología de iOS descritos en este protocolo.
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Protocolo
Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con el Comité de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Instituto en la Universidad de Nuevo México. Los ratones C57BL/6J se obtuvieron de una fuente comercial. Se utilizaron números iguales de ratones machos y hembras dentro del rango de edad de 8 a 14 semanas. Todos los ratones pesaron aproximadamente 20 g. Los detalles de los animales, reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales. El Archivo Complementario 1 contiene la lista de abreviaturas.
1. Preparación del cráneo para la obtención de imágenes y la electrofisiología
- Anestesiar al animal en una caja de inducción de isoflurano con 2%-3% de isoflurano en oxígeno al 100%, asegurando la profundidad de anestesia adecuada sin que se inmute por un pellizco en la pata.
- Administrar analgésicos preoperatorios (Buprenorfina de liberación lenta, 3,25 mg/kg, SQ) antes de colocar al animal en un marco estereotáxico y mantener la anestesia (isoflurano al 2%).
- Agregue ungüento oftálmico y mantenga la temperatura corporal del animal con una almohadilla térmica que tenga retroalimentación de la temperatura corporal.
- Afeita el vello por encima del cráneo donde se hará la incisión, por la línea media desde la fisura ocular hasta la lambda.
- Retire el vello cortado antes de esterilizar la piel con un exfoliante y una solución antiséptica y desinfectante. Termine con etanol al 70% y repita tres veces para asegurar un sitio quirúrgico estéril.
- Con una hoja de bisturí # 10, haga una incisión en la línea media desde la rostral hasta la caudal, seguida inmediatamente por la aplicación de pegamento de cianoacrilato de grado médico a la incisión. Extiende la piel lateralmente para exponer el cráneo.
- Agregue otra gota o dos de pegamento de cianoacrilato sobre el cráneo para agregar protección adicional al cráneo.
NOTA: La aplicación de pegamento es sensible al tiempo, ya que el cráneo comenzará a volverse opaco cuando se exponga al aire durante más de 10 segundos. Esto oscurecerá la visualización de la SD a través de métodos de imagen. - Mientras se seca el pegamento, use tijeras quirúrgicas estériles para aumentar el tamaño de la incisión sobre el cerebelo. Una vez que el pegamento esté listo, comience la implantación de electrodos de tornillo de cráneo.
- Esterilice los tornillos del cráneo con un esterilizador de perlas durante 20-30 segundos antes de la implantación.
- Coloque los tornillos del cráneo en una región distante del sitio de iniciación de SD para mantener una ventana visual abierta.
NOTA: Para las grabaciones crónicas en la corteza visual primaria, se utilizan tres tornillos de cráneo. El primer tornillo se coloca aproximadamente a y = -6,00 mm del bregma, en el cerebelo, sirviendo como electrodo de referencia. Los electrodos de registro se colocan a y = -2,79 mm del bregma y x = ±2,5 mm de la línea media, dentro de los hemisferios izquierdo y derecho. - Con una broca de 0,8 mm, perfore agujeros piloto a través del cráneo. Para garantizar que no se dañe el tejido subyacente, lo ideal es -0,5 mm en z. Utilice tornillos #00-90 que estén presoldados a alfileres de oro con alambre de acero inoxidable.
- Gire los tornillos hacia abajo en el cráneo.1.5-2 vueltas completas harán que el tornillo atraviese el cráneo y entre en contacto con la superficie cortical.
- Enrolle el exceso de alambre alrededor del tornillo, permitiendo un poco de holgura en el cable para la colocación de la etapa principal más tarde.
- Usando los mismos procedimientos, coloque los otros tornillos de cráneo.
- Una vez que todos los tornillos de calavera estén en su lugar, conecte todos los pines dorados en el conector de cabecera deseado. Sostenga el conector en su lugar con el brazo estereotáxico y sostenga las clavijas del conector cerca por encima de las cabezas de los tornillos mientras se asegura de que los cables no se toquen.
- Selle toda el área con pegamento de cianoacrilato, asegurándose de no interrumpir el área de imagen frente a los tornillos del cráneo.
- Acumule cemento dental alrededor de la base de los alfileres de oro, asegurándose de que los alfileres de oro de los tornillos del cráneo no estén conectados a los alfileres de oro en la etapa de la cabeza.
- Deje que el cemento dental se cure antes de quitar el conector de la cabecera.
- Retire al animal del marco estereotáxico y colóquelo de nuevo en la jaula de la casa para que se recupere. Siga los cuidados postoperatorios estándar y mantenga a los animales en una almohadilla térmica mientras se recuperan de la anestesia.
NOTA: Después de la cirugía, los animales fueron alojados en un solo hogar y monitoreados diariamente para detectar el dolor. Siga las pautas institucionales locales para la analgesia. Si usa una buprenorfina de liberación lenta, controle el dolor y posiblemente administre una dosis adicional a las 72 h.
- Retire cualquier objeto que pueda engancharse en los electrodos, incluidos la carcasa y el enriquecimiento. Use ropa de cama estándar con acceso ad libium a alimentos y agua.
NOTA: Permita un período de recuperación de dos días entre la cirugía y el registro.
2. Detección de despolarizaciones dispersas con imágenes de señal óptica intrínseca (iOS) y electrofisiología AC-
- Anestesiar a los animales con isoflurano al 2% en oxígeno al 100%
NOTA: La parte de imágenes de este procedimiento debe tomar ~ 5 minutos, y la cantidad de exposición al isoflurano debe ser constante. - Coloque al animal en un marco estereotáxico. A través del cono de la nariz, mantenga el 1%-2% de isoflurano en oxígeno.
NOTA: Es fundamental mantener la profundidad adecuada de la anestesia, ya que se sabe que el isoflurano reduce las DEs. Se recomienda mantener 60-70 respiraciones/min durante todo el experimento. - Coloque al animal debajo de la cámara y asegúrese de que la cámara esté enfocada en la superficie cortical ajustando el anillo de enfoque.
- Aplique aceite mineral en el área de la imagen para aumentar la transparencia.
- Encienda las computadoras, el panel LED y el equipo de electrofisiología.
NOTA: El panel LED funciona mejor cuando se coloca frente al animal para iluminar la ventana de imágenes mientras las luces del techo están apagadas. La luz se configuró a ~ 2,400 lux (95% de potencia) con un ajuste de temperatura fría de 4000K. - Configuración de carga para iOS usando Micro-Manager19,20,21,22.
- Presione Live para ver el mouse debajo de la cámara y centre el cráneo del animal debajo de la cámara. Cierre la ventana "En vivo".
- Presione Multi-D Acq.
- En la ventana Adquisición multidimensional, seleccione los puntos de tiempo deseados.
NOTA: Se recomienda un recuento de 750 imágenes en un intervalo de 250 ms. - Guarde las imágenes en la ruta de archivo y el prefijo de nombre deseados.
- Conecte los alfileres de oro del animal al conector del escenario principal y luego al escenario principal.
- Configuración de carga para el software Intan.
- Haga clic en el icono Elegir formato de archivo y, en la ventana emergente, seleccione Un archivo por formato de tipo de señal. Esto guardará el archivo como un ".dat" para su uso posterior en MATLAB.
- En la pestaña BW, en Ancho de banda de hardware, seleccione Ancho de banda del amplificador de 0,13 a 500 Hz.
- En Filter Display Selector, seleccione WIDE para cubrir la gama más amplia de señales.
- Para seleccionar la ruta de archivo deseada para guardar, haga clic en el icono Seleccionar nombre de archivo.
- Realizar el impacto utilizando un impactador electromagnético.
NOTA: Los ajustes del impactador son 4 m/s de velocidad de impacto y 5 mm de deflexión.- Encienda el impactador y asegúrese de que la punta se retraiga y se extienda correctamente moviendo la palanca de 3 vías para retraer la punta y extender la punta. La punta debe extenderse antes de colocar al animal debajo de la punta.
- Moviéndose rápidamente, coloque al animal en una cama de espuma y deslice la cama por debajo de la punta.
- Alinee la punta del impactador en la línea media y 1 mm rostral de bregma.
- Baje la punta del impactador hasta que toque firmemente la parte superior de la cabeza del animal.
NOTA: No empuje la punta hacia abajo en la cabeza. - Empuje la palanca para retraer la punta del impactador y luego bájela manualmente 5 mm antes de activar la palanca de impacto.
- Retire inmediatamente al animal de la cama de espuma y colóquelo debajo de la cámara para obtener imágenes dentro de los 5 segundos, ya que la SD se inicia por el impacto.
- Inicie la creación de imágenes de iOS haciendo clic en ¡Adquirir! en la ventana Adquisición multidimensional. Imagen durante 4 min para capturar toda la SD.
- Inicie el registro de electrofisiología haciendo clic en el icono Grabar en el software Intan.
- Retire al animal de la almohadilla de espuma y permita que el animal se recupere en una arena abierta o en una jaula casera.
NOTA: Se recomienda que la electrofisiología se registre durante al menos 1 h para permitir que se recupere la función de la red cortical. - Una vez finalizada la grabación, desconecte al animal de la cabecera y del conector y vuelva a colocarlo en su jaula.
NOTA: Se recomienda dejar pasar 24 h entre cada impacto y cada sesión de grabación. El animal puede permanecer en su jaula doméstica durante todo el tiempo fuera de las sesiones de grabación.
3. Visualización y cuantificación de imágenes iOS
- En ImageJ19,20,21,22, abra la pila de imágenes haciendo clic en la secuencia Archivo > Importar > imagen.
- Desplácese manualmente por las imágenes para asegurarse de que no haya movimiento ni ningún otro artefacto.
- Para generar el gráfico de la SD, cree un ROI utilizando el cursor para dibujar un cuadrado.
NOTA: Se recomienda utilizar un cuadrado de 30 x 30 píxeles. Se puede usar cualquier forma o tamaño, pero asegúrese de que el tamaño del retorno de la inversión no cambie entre los animales. - Cree un gráfico haciendo clic en Imagen > Pilas > Perfil del eje Z. En el gráfico recién creado, haga clic en el botón en vivo. Vuelve a la pila de imágenes de la SD y mueve el ROI hasta que el gráfico muestre la curva SD. El gráfico debería verse como una onda Sin con un aumento inicial seguido de una caída por debajo de la línea de base y un lento retorno a la línea de base en unos pocos minutos><. NOTA: Los gráficos se pueden expresar como unidades arbitrarias (AU) o como porcentaje de línea base utilizando las primeras imágenes como promedio de referencia.
- En el gráfico generado, haga clic en Lista para generar una lista de valores que se pueden trazar en otro software de generación de gráficos o Matlab.
- Para la visualización, convierta la imagen en escala de grises en una tabla de búsqueda en ImageJ por imagen > Tablas de búsqueda > Fire.
4. Análisis electrofisiológico
NOTA: Se recomienda que la experiencia del laboratorio de Buzsaki y su código generado por MATLAB se utilicen en gran medida para visualizar y analizar datos de electrofisiología. El análisis requerirá la descarga de MATLAB con un código de activación institucional y el archivo zip "Buzcode" de Buzsaki lab a través de GitHub (https://github.com/buzsakilab/buzcode).
- En el software de electrofisiología Intan, asegúrese de que los datos brutos exportados se guarden en formato ".dat><". NOTA: Matlab se puede instalar desde el sitio web de MathWorks. Es necesario un código de activación institucional o individual para la compra y el uso de Matlab. Se necesita cierta experiencia previa con la ejecución de código en Matlab para realizar este análisis.
- Utilice la función de bz_LoadBinary de código Buzaki para cargar los datos en Matlab.
NOTA: Ejemplo "'datos' = bz_LoadBinary ('ruta del archivo de datos completos','frecuencia', frecuencia de muestreo, nChannels, número de canales); - Filtre el ruido de CA usando un filtro de muesca centrado a 60 Hz.
NOTA: Ejemplo notch_freq = 60; [b,a] = iirnotch(notch_freq/(sampling_frequency/2), notch_bandwidth/(sampling_frequency/2)); filtered_data = filtfilt(b, a, datos); - Aísle la actividad de alta frecuencia utilizando un filtro de paso de banda con un rango de 0,5-100 Hz, de acuerdo con las recomendaciones del grupo COSBID para analizar y visualizar despolarizaciones de dispersión (SD).
- Calcule el espectrograma de potencia usando el comando pspectrum en MatLab.
- Para visualizar, trace el espectrograma de alta frecuencia y el espectrograma de potencia en la misma escala de tiempo y en una columna.
NOTA: A partir de los gráficos, habrá una extensión de la depresión de alta frecuencia y pérdida de potencia.
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Resultados
Figura 1 ilustra una representación gráfica del montaje experimental. Los tornillos de registro se colocan en la corteza visual primaria, con un electrodo de tornillo craneal situado en el vermis cerebeloso como electrodo de tierra. Los tornillos craneales y los pasadores de oro se fijan al cráneo mediante pegamento de cianocrilato y cemento dental. Es fundamental limitar el cemento dental a la parte caudal del cráneo para dejar espacio para el impacto y la obtención de imágenes. La ubicació...
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Discusión
La propagación de las despolarizaciones es crucial en varios modelos de enfermedades, incluida la lesión cerebral traumática (TBI), el accidente cerebrovascular y la migraña1. La detección precisa de las SD es esencial para comprender su papel en los déficits conductuales agudos y/o la activación del sistema neuroinmune después de lesiones cerebrales traumáticas leves (mTBI)23,24. Para mitigar el riesgo de perder SD cuando se utiliza un so...
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Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el P20GM109089 de NIGMS y las subvenciones del PR200891 del Departamento de Defensa.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| #00-90 x .118 Tornillo de máquina | US Micro Tornillo | 00.90-118-M-SS-P, Amazon | |
| 0.8 mm diámetro broca | Broca PCB | WYTP21, Amazon | |
| 16-A Headstage | Intan | C3335 | |
| 2.1 mm Broca micro fresas | Fine Science Tools | 19007-21 | |
| Amplificador de CA | Intan | RHD sistema | |
| C57BL/6J ratones | Laboratorio Jackson | Jax#000664 | |
| Cámara CCD | Mightex | TCE-1304-U | |
| Lente de extensión | Zeikos | ZE-ETN | |
| Ethiqa XR (Buprenorfina de liberación lenta) | Midwest Veterinary Supply | Número de producto: 267.10000.3 | |
| Pin de conector de oro (hembra) | A-M Systems | 520100 | |
| Pin de conector de oro (macho) | A-M Systems | 520200 | |
| ImageJ2/Fiji | Image J | NA | |
| Impactor One | Leica | 39463930 | |
| Panel de panel LED | Supon | L122t | |
| MATLAB | MathWorks | Código de activación institucional o individual Pegamento | |
| cianoacrilato de grado médico | MasterBond | MB287 | |
| Micro-Manager Camera Software Image | J | NA | |
| Taladro/pulidor de clavos | Makartt Nail Drill Lima de uñas eléctrica | JD700 | |
| Conectores Omnetic | Omnetics | A79014-001 | |
| RHX Software de adquisición de datos | Intan | NA | |
| Acero inoxidable Alambre sin recubrimiento (0.005") | A-M Systems | 792800 | |
| Marco estereotáxico | Instrumentos Kopf | 1923-B | |
| Teets cemento dental 'curado en frío' | A-M systems | 525000, 526000 | |
| Lente de cámara XLR | Nikon | NIKKOR 50 mm f/1.8-16 |
Referencias
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