Extracción asistida por microondas de compuestos fenólicos y antioxidantes para aplicaciones cosméticas mediante tecnología basada en polioles

Resumen

Este protocolo detalla la utilización de un método de extracción asistido por microondas a base de polioles para extraer compuestos fenólicos y antioxidantes naturales, lo que representa un enfoque práctico y ambientalmente sostenible para el desarrollo de extractos listos para usar.

Resumen

La utilización de polioles como disolventes verdes para la extracción de compuestos bioactivos de materiales vegetales ha ganado atención debido a su seguridad y comportamiento inerte con los productos químicos bioactivos de las plantas. Este estudio explora la extracción sostenible de compuestos fenólicos y antioxidantes naturales de la piel de plata del café utilizando el método de extracción asistida por microondas (MAE) con solventes a base de poliol: glicerina, propilenglicol (PG), butilenglicol (BG), metilpropanodiol (MPD), isopentildiol (IPD), pentilenglicol, 1,2-hexanodiol y hexilenglicol (HG). Se realizó un análisis comparativo de extracciones de solventes convencionales y no convencionales, centrándose en su impacto sobre los compuestos bioactivos de MAE, abarcando parámetros como el contenido fenólico total (TPC), el contenido total de flavonoides (TFC) y las actividades antioxidantes como el ensayo de barrido de radicales 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH), el ensayo de barrido de radicales 2,2'-azino-bis(-3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS) y el ensayo de poder antioxidante reductor férrico (FRAP). Los valores más altos se observaron para TPC con extracción acuosa de 1,2-hexanodiol (52,0 ± muestra de 3,0 mg de GAE/g), TFC con extracción acuosa de 1,2-hexanodiol (muestra de 20,0 ± 1,7 mg de QE/g), DPPH con extracción acuosa de HG (muestra de 13,6 ± 0,3 mg de TE/g), ABTS con extracción acuosa de pentilenglicol (muestra de 8,2 ± 0,1 mg TE/g) y FRAP con extracción acuosa de HG (muestra de 21,1 ± 1,3 mg de Fe (II) E/g). Esta investigación tiene como objetivo avanzar en la tecnología de extracción ecológica a través de componentes naturales de plantas, promoviendo la sostenibilidad al minimizar el uso de productos químicos peligrosos y reducir el consumo de tiempo y energía, con aplicaciones potenciales en cosméticos.

Introducción

Hoy en día, existe una tendencia mundial hacia la concienciación medioambiental en la industria de la belleza, lo que ha llevado a los fabricantes a centrarse en la tecnología verde para la extracción de componentes vegetales^{utilizando alternativas} sostenibles. Por lo general, los solventes tradicionales como el etanol, el metanol y el hexano se utilizan para extraer componentes fenólicos de las plantas y antioxidantes naturales². Sin embargo, la presencia de residuos de disolventes en los extractos de plantas supone un riesgo potencial para la salud humana, ya que provoca irritación de la piel y los ojos³, especialmente en lo que respecta a su aplicación prevista en los cosméticos. En consecuencia, es un desafío eliminar estos residuos de solventes de los extractos, un proceso que exige una inversión considerable en tiempo, energía y recursos humanos⁴. Recientemente, el agua sobrecalentada, los líquidos iónicos, los disolventes eutécticos profundos y los disolventes bioderivados han surgido como enfoques prometedores para la extracción con disolventes verdes⁵. Sin embargo, su uso sigue estando limitado por la separación de productos en procesos acuosos. Para hacer frente a estos desafíos, el desarrollo de extractos listos para usar surge como una solución viable⁶.

Los polioles se utilizan a menudo en formulaciones cosméticas como humectantes debido a su buena polaridad y capacidad para retener la humedad del medio ambiente⁷. Además, se pueden utilizar polioles como la glicerina, el propilenglicol, el butilenglicol, el metilpropanodiol, el isopentildiol, el pentilenglicol, el 1,2-hexanodiol y el hexilenglicol para las extracciones de plantas. Se consideran disolventes no tóxicos, biodegradables, respetuosos con el medio ambiente, no reactivos y seguros para su uso en la extracción de plantas⁸. Además, los polioles pueden soportar el calor generado durante la extracción asistida por microondas (MAE) debido a sus elevados puntos de ebullición y polaridad⁹. La Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés) reconoce generalmente a estos polioles como productos químicos seguros (GRAS). A diferencia de los disolventes convencionales, como el etanol o el metanol, que pueden requerir una eliminación rigurosa del extracto debido a sus efectos potencialmente nocivos, los polioles ofrecen la ventaja de minimizar la energía, el tiempo y los costes asociados a^{los procesos de} eliminación de disolventes. Esto no solo agiliza el proceso de extracción, sino que también mejora la eficiencia general y la sostenibilidad del método de extracción. Investigaciones anteriores han empleado polioles como el propilenglicol y el butilenglicol como disolventes en la extracción de compuestos bioactivos de flores de Camellia sinensis ¹⁰ y pulpa de café¹¹, lo que revela un potencial significativo por su papel como disolventes alternativos sostenibles en el proceso de extracción de plantas. Por lo tanto, el desarrollo y la optimización continuos de un sistema de solventes polioles y agua tienen el potencial de avances significativos en química verde y prácticas industriales sostenibles.

Generalmente, los compuestos bioactivos que se encuentran en las plantas se sintetizan como metabolitos secundarios. Estos compuestos se pueden clasificar en tres grupos principales: terpenos y terpenoides, alcaloides y compuestos fenólicos¹². Se utilizan varios métodos de extracción en diferentes condiciones para aislar compuestos bioactivos específicos de las plantas. Los compuestos bioactivos de los materiales vegetales pueden extraerse utilizando técnicas convencionales o no convencionales. Los métodos tradicionales incluyen la maceración, la extracción por reflujo y la hidrodestilación, mientras que los métodos no convencionales consisten en la extracción asistida por ultrasonidos, la extracción asistida por enzimas, la extracción asistida por microondas (MAE), la extracción asistida por campo eléctrico pulsado, la extracción con fluidos supercríticos y la extracción con líquidos presurizados¹³. Estos métodos no convencionales están diseñados para mejorar la seguridad mediante la utilización de solventes y auxiliares más seguros, mejorando la eficiencia energética, evitando la degradación de los componentes bioactivos y reduciendo la contaminación ambiental¹⁴.

Además, MAE es una de las sofisticadas tecnologías verdes para extraer compuestos bioactivos de las plantas. Los procedimientos de extracción convencionales requieren cantidades significativas de tiempo, energía y altas temperaturas, que con el tiempo pueden degradar los compuestos bioactivos sensibles al calor¹³. A diferencia de las extracciones térmicas convencionales, MAE facilita la extracción de compuestos bioactivos al generar un calentamiento localizado dentro de la muestra, alterando las estructuras celulares y mejorando la transferencia de masa, aumentando así la eficiencia de la extracción de compuestos. El calor se transfiere desde el interior de las células vegetales mediante microondas, que operan sobre las moléculas de agua dentro de los componentes de la planta¹³. Además, MAE ha avanzado para mejorar la extracción y separación de compuestos activos, aumentando el rendimiento del producto, mejorando la eficiencia de la extracción, requiriendo menos productos químicos y ahorrando tiempo y energía, al tiempo que evita la destrucción de compuestos bioactivos¹⁵.

Esta investigación se centra en la extracción de compuestos fenólicos vegetales y antioxidantes naturales mediante extracción asistida por microondas (MAE) utilizando diferentes tipos de polioles como disolventes. Se determina el contenido fenólico total (TPC), el contenido total de flavonoides (TFC) y las actividades antioxidantes (DPPH, ABTS y FRAP) de los extractos de MAE a base de polioles. Además, el MAE a base de polioles se compara con el MAE utilizando disolventes convencionales como el agua y el etanol. Se espera que esta investigación contribuya al desarrollo de una tecnología de extracción ambientalmente sostenible para componentes naturales, promoviendo la sostenibilidad al reducir la dependencia de productos químicos peligrosos, acortando los tiempos de procesamiento y minimizando el consumo de energía en la producción de materias primas para aplicaciones potenciales dentro de la industria cosmética.

Protocolo

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación experimental

1. Preparación de muestras de plantas
   1. Recoger el café fresco (Coffea arabica) y secarlo a 60 °C en una bandeja secadora durante 72 h¹¹.
   2. Muela el café seco Silverskin (CS) hasta convertirlo en un polvo fino con un molinillo y guárdalo a temperatura ambiente para su posterior análisis^11.
      NOTA: En este estudio, se recolectó CS fresca (C. arabica) en Baan Doi Chang, distrito de Mae Suai, Chiang Rai, Tailandia. El CS es un subproducto obtenido durante el proceso de descascarillado que elimina la capa de pergamino de los granos de café secos después de que las cerezas han sido procesadas para eliminar las capas externas de la fruta¹⁶.
2. Productos químicos
   1. Utilice reactivos químicos de calidad analítica, a excepción de los disolventes del experimento.
      NOTA: En el experimento se utilizaron disolventes de grado cosmético.
   2. Utilice los disolventes (agua, etanol, glicerina, propilenglicol, butilenglicol, hexilenglicol, isopentildiol, 1-2 hexanodiol, pentilenglicol y metilpropanodiol) para la extracción de CS con MAE.

2. Proceso de extracción

1. Preparación de muestras y disolventes
   1. Prepare la muestra y los solventes para el procedimiento MAE de^{acuerdo con un} protocolo 9 previamente informado con algunas modificaciones.
   2. Prepare cada disolvente a una concentración del 60% diluyendo 60 mL de cada disolvente con agua destilada y ajustando el volumen a 100 mL para extracciones por triplicado.
      NOTA: Utilice agua 100% destilada para la extracción de agua.
   3. Pesar 0,67 g de CS y mezclar con 20 mL de cada disolvente de extracción en una proporción de 1:30 en un recipiente de reacción (Figura 1A) para MAE.
      NOTA: La cantidad máxima sólido-líquido para cada recipiente es de 2 g de muestra y 20 mL de disolvente.
   4. Agregue una barra agitadora magnética a cada recipiente para garantizar una distribución uniforme del calor y el solvente dentro de la muestra, mejorando la eficiencia del proceso de extracción y promoviendo un mejor rendimiento de extracción.
      NOTA: Si se aplican solventes no polares al proceso de extracción, se pueden usar barras agitadoras de teflón en lugar de barras agitadoras magnéticas para proporcionar un calentamiento efectivo a través del sistema de microondas.
   5. Cierre cada recipiente firmemente con una herramienta especial (Figura 2) y coloque todos los recipientes en la cámara MAE (Figura 1B).
2. Configuración del instrumento y procedimiento de extracción asistida por microondas
   1. Realizar el procedimiento de extracción de acuerdo con el protocolo de referencia con algunas modificaciones⁹.
   2. Abra la pantalla del monitor para configurar el método haciendo clic en el icono de la caja de herramientas en la barra superior y seleccionando el rotor SK eT en la sección de accesorios (Figura 3A,B).
   3. Seleccione la velocidad de agitación de las barras agitadoras haciendo clic en la sección del agitador y escribiendo 20% (Figura 4A).
      NOTA: La velocidad de agitación se puede seleccionar de 0% a 100%.
   4. Haga clic en el sector de la cerradura de la puerta y configúrelo para que se active a temperaturas superiores a 80 °C (Figura 4B).
      NOTA: Este ajuste garantiza el cierre automático de la puerta de la cámara cuando la temperatura interna supera los 80 °C.
   5. Haga clic en el icono de la tabla en la barra superior (Figura 5A) y ajuste el gradiente de temperatura (T1) a una duración de extracción de 10 min, la potencia de microondas a 1800 W y la temperatura a 120 °C.
   6. Active el agitador haciendo clic en el botón del agitador hasta que aparezca la luz verde.
   7. Ajuste la velocidad del ventilador al nivel 3 (máximo) (Figura 5B).
   8. Para mantener el tiempo de extracción, seleccione la temperatura de extracción deseada (T2) ajustando la duración de la extracción a 15 min, la potencia de microondas a 1800 W y la temperatura a 120 °C.
   9. Ajuste la velocidad del agitador y del ventilador como se indica en las secciones 2.2.6 y 2.2.7 (Figura 5A,B).
      NOTA: La temperatura máxima y la potencia de microondas son de 260 °C y 1800 W.
   10. Establezca el tiempo de enfriamiento haciendo clic en el botón de enfriamiento en la esquina inferior izquierda de la pantalla y seleccionando la duración de 10 min (Figura 6).
   11. Guarde el método haciendo clic en el icono de guardar en la esquina superior derecha de la pantalla (Figura 7A).
   12. Asegúrese de que después de guardar las condiciones del método, el gráfico de condiciones de extracción se mostrará en la pantalla con el botón de reproducción en la esquina inferior derecha (Figura 7B).
   13. Inicie el proceso de extracción eligiendo el número de recipientes utilizados (Figura 7C).
       NOTA: Se pueden usar hasta 15 recipientes en una extracción, y si se utiliza el número deseado de recipientes, asegúrese de la ubicación equilibrada de los recipientes en la cámara.
   14. Después de la extracción, centrifugar los extractos a 4 °C, 9072 x g, durante 15 min, utilizando una máquina centrífuga refrigerada.
   15. Recoja el sobrenadante con una pipeta de vidrio de 10 ml (figura 8) y guárdelo a -20 °C en el congelador para su posterior estudio.
       NOTA: Dependiendo del tamaño de partícula y la densidad del residuo vegetal, los extractos requerirán tiempos de centrifugación más largos (20-30 min).

3. Determinación de compuestos fenólicos

1. Determinación del contenido fenólico total
   1. Determinar el contenido fenólico total de los extractos de CS haciendo referencia al protocolo con algunas modificaciones¹⁷.
   2. Prepare una dilución de 10 veces de las muestras diluyéndolas con agua destilada.
   3. Mezclar 10 μL de la muestra diluida con 20 μL de reactivo de Folin-Ciocalteu sin diluir y dejar que reaccionen durante 3 min.
   4. A continuación, añada 100 μL de solución de Na_{2CO 3} al 7,5% a la mezcla en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
   5. Prepare diferentes concentraciones para el rango de concentración estándar de ácido gálico (consulte la Tabla 1 y la Tabla 2) diluyendo con agua destilada.
   6. Mezclarlos con 20 μL del reactivo de Folin-Ciocalteu y dejar que actúen durante 3 min.
   7. A continuación, añada 100 μL de solución de Na_{2CO 3} al 7,5% a la mezcla en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
   8. Incubar la reacción durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
   9. Mida la absorbancia de la solución de reacción a 765 nm utilizando un lector de microplacas (Figura 9A).
   10. Traza la curva de calibración del patrón utilizando las concentraciones del patrón y la absorbancia a 765 nm (Figura 10A).
   11. Exprese los resultados en mg de equivalente de ácido gálico (GAE) por g de la muestra y calcule utilizando la siguiente ecuación¹⁸:
       NOTA: mg de equivalente de ácido gálico (GAE) por g de muestra = [((A₇₆₅ - c) / m)) en μg de equivalente de ácido gálico × Volumen total en el pocillo de reacción (mL) x Dilución × peso de la muestra seca (1 g) x Volumen resultante del extracto (mL)] / [(Volumen de muestra añadida en cada pocillo (mL) x Peso real de la muestra seca (g) × factor de conversión de μg a mg (1000)]
       donde, c = intersección con el eje y, m = pendiente
2. Determinación del contenido total de flavonoides
   1. Determinar el contenido total de flavonoides del extracto de CS de acuerdo con el protocolo con algunas modificaciones¹⁷.
   2. Prepare una dilución de 5 veces de las muestras diluyéndolas con agua destilada.
   3. Añadir 50 μL de la muestra diluida a 15 μL de NaNO₂ al 5% e incubar en la oscuridad durante 5 min.
   4. Mezclar 15 μL de solución de AlCl₃ al 10% con la reacción y mantener a temperatura ambiente durante 6 min.
   5. A continuación, añada 100 μL de solución de NaOH 1 M a la reacción e incube durante 10 minutos más.
   6. Mida la absorbancia de la mezcla a 510 nm (Figura 9B).
   7. Prepare diferentes concentraciones de quercetina en el rango estándar (consulte la Tabla 3 y 4) añadiéndolas a 15 μL de NaNO₂ al 5% e incubando en la oscuridad durante 5 minutos.
   8. Mezclar 15 μL de solución de AlCl₃ al 10% con la reacción y mantener a temperatura ambiente durante 6 min.
   9. Añada 100 μL de solución de NaOH 1 M a la reacción e incube durante 10 min.
   10. Determine la absorbancia del patrón a 510 nm (Figura 9B).
   11. Traza la curva de calibración del patrón utilizando las concentraciones del patrón y la absorbancia a 510 nm (Figura 10B).
   12. Exprese los resultados en mg de equivalente de quercetina (QE) por g de la muestra, calculados mediante la ecuación¹⁹ de la siguiente manera:
       NOTA: mg de equivalente de quercetina (QE) por g de muestra = [((A₅₁₀ - c) / m)) en μg de equivalente de quercetina × Volumen total en el pocillo de reacción (mL) x Dilución × peso de la muestra seca (1 g) x Volumen resultante del extracto (mL)] / [(Volumen de la muestra añadida en cada pocillo (mL) x Peso real de la muestra seca (g) × factor de conversión de μg a mg (1000)]
       donde, c = intersección con el eje y, m = pendiente

4. Determinación de las actividades antioxidantes

1. Ensayo de eliminación de radicales 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH)
   1. Determinar la actividad de eliminación de radicales DPPH del extracto de CS de acuerdo con el protocolo con algunas modificaciones¹⁷.
   2. Prepare una dilución de 10 veces de las muestras diluyéndolas con agua destilada.
   3. Mezclar 20 μL de las muestras diluidas con 135 μL de solución de DPPH 0,1 mM.
   4. Prepare diferentes concentraciones del rango de concentración estándar de Trolox (consulte la tabla 5 y 6) mezclando con 135 μL de solución de DPPH de 0,1 mM.
   5. Incuba la mezcla en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min.
   6. Mida la absorbancia de la resultante a 517 nm (Figura 9C).
   7. Traza la curva de calibración del patrón utilizando las concentraciones del patrón y el porcentaje de inhibición (Figura 10C).
   8. Calcule el porcentaje de inhibición del ensayo DPPH de la siguiente manera:
      % Inhibición = [(absorbancia de control − absorbancia de la muestra)/ absorbancia de control] × 100
   9. Expresa los resultados en mg de la capacidad antioxidante equivalente de Trolox por g de la muestra, calculada mediante la siguiente ecuación²⁰:
      NOTA: mg de equivalente de Trolox (TE) por g de muestra = [((% de inhibición-c) / m) en μg de equivalente de Trolox × Volumen total en el pocillo de reacción (mL) x Dilución × peso de la muestra seca (1 g) x Volumen resultante del extracto (mL)] / [(Volumen de la muestra añadida en cada pocillo (mL) x Peso real de la muestra seca (g) × factor de conversión de μg a mg (1000)]
      donde, c = intersección con el eje y, m = pendiente
2. Ensayo de eliminación de radicales del ácido 2,2′-Azino-Bis-3-Etilbenztiazolina-6-sulfónico (ABTS)
   1. Determine la actividad de barrido de radicales ABTS del extracto de CS utilizando el protocolo de la referencia con algunas modificaciones¹⁷.
   2. Preparar la solución madre ABTS·+ mezclando 7 mM de ABTS y 2,45 mM de persulfato de potasio (1:2) e incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 16 h.
   3. Prepare la solución de trabajo mezclando 5 mL de solución madre ABTS·+ con 100 mL de agua desionizada.
   4. Mezclar 160 μL de solución de trabajo ABTS·+ con 10 μL de la muestra diluida 10 veces o patrón de Trolox a diferentes concentraciones (véanse los cuadros 7 y 8).
   5. Incubar la reacción en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min.
   6. Determine la absorbancia de la mezcla a 734 nm (Figura 9D).
   7. Traza la curva de calibración estándar utilizando las concentraciones del patrón y el porcentaje de inhibición (Figura 10D).
   8. Calcule el porcentaje de inhibición del ensayo ABTS utilizando la siguiente fórmula:
      % Inhibición = [(absorbancia de control - absorbancia de la muestra) / absorbancia de control] × 100.
      1. Exprese los resultados en mg de la capacidad antioxidante equivalente de Trolox por g de la muestra, calculada utilizando la siguiente ecuación²¹:
         NOTA: mg de equivalente de trolox (TE) por g de muestra = [((% de inhibición - c) / m)) en μg equivalente de trolox × Volumen total en el pocillo de reacción (mL) x Dilución × peso de la muestra seca (1 g) x Volumen resultante del extracto (mL)] / [(Volumen de muestra añadida en cada pocillo (mL) x Peso real de la muestra seca (g) × factor de conversión de μg a mg (1000)]
         donde, c = intersección con el eje y, m = pendiente
3. Ensayo de poder antioxidante reductor férrico (FRAP)
   1. Determinar la actividad antioxidante reductora férrica del extracto de CS de acuerdo con el protocolo con algunas modificaciones¹⁷.
   2. Prepare el reactivo FRAP utilizando un tampón de acetato de 30 mM a pH 3,6, que es una mezcla de 10 mM de solución de TPTZ en 40 mM de HCl y 20 mM de solución de FeCl_{3,6H 2}O en una proporción de 10:1:1.
   3. Coloque el reactivo FRAP en un frasco ámbar hasta que lo necesite.
      NOTA: Asegúrese de que el reactivo FRAP esté marrón. Si está contaminado por iones metálicos u otros compuestos reactivos, el reactivo se volverá púrpura y debe desecharse. Utilice únicamente reactivos recién preparados.
   4. Prepare una dilución 5 veces mayor de las muestras diluyéndolas con agua destilada.
   5. Añadir 10 μL de la muestra diluida o 20 μL de FeSO_{4.7H 2}O a diferentes concentraciones patrón (Tabla 9 y Tabla 10) a 180 μL de la solución FRAP.
   6. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 4 min.
   7. Evalúe la absorbancia de la mezcla a 593 nm (Figura 9E).
   8. Traza la curva de calibración del patrón utilizando las concentraciones del patrón y la absorbancia a 593 nm (Figura 10E).
   9. Expresa los resultados en mg de FeSO₄ por g de la muestra, calculados utilizando la siguiente ecuación²¹:
      NOTA: mg de FeSO₄ equivalente (Fe (II) E) por g de muestra = [((A₅₉₃ - c) / m)) en μg FeSO₄ equivalente × Volumen total en el pocillo de reacción (mL) x Dilución × peso de la muestra seca (1 g) x Volumen resultante del extracto (mL)] / [(Volumen de muestra añadida en cada pocillo (mL) x Peso real de la muestra seca (g) × factor de conversión de μg a mg (1000)]
      donde, c = intersección con el eje y, m = pendiente
4. Realice todos los ensayos (TPC, TFC, DPPH, ABTS y FRAP) de cada muestra por triplicado. En este estudio, se utilizó agua como blanco para la mayoría de los ensayos, excepto el DPPH, donde el etanol sirvió como blanco para abordar la absorbancia de fondo.

5. Análisis estadístico

1. Utilice el software SPSS para realizar un análisis estadístico de los datos experimentales.
2. Realice la prueba de normalidad utilizando la prueba de Shapiro-Wilk.
3. Compare las sustancias bioactivas y las actividades antioxidantes del extracto de MAE CS a base de polioles y los extractos de MAE CS convencionales a base de solventes utilizando ANOVA de un factor con las pruebas de rango múltiple de Duncan.
4. Exprese todos los datos como media ± SD (n = 3) y defina el nivel de significación en p < 0,05.

Resultados

Efecto de los disolventes polioles y los disolventes convencionales sobre el contenido fenólico total, el contenido total de flavonoides, los ensayos antioxidantes DPPH, FRAP y ABTS
La polaridad del disolvente debe ser compatible con la de las moléculas activas objetivo para mejorar la eficiencia de extracción de las sustancias bioactivas de las plantas²². Se realizaron experimentos utilizando varios solventes (agua, etanol, glicerina, propilenglicol, butilenglicol, metilpropanodiol, isopentildiol, pentilenglicol, 1,2-hexanodiol y hexilenglicol) para evaluar su impacto en los compuestos bioactivos y las actividades antioxidantes del extracto de piel de plata de café MAE.

Efecto de los polioles, disolventes y disolventes convencionales sobre el contenido fenólico total
Se analizó el contenido fenólico total de cada extracción con diferentes solventes. El mayor contenido fenólico se obtuvo en las muestras con 1,2-hexanodiol acuoso (52,0 ± 3,0 mg GAE/g de muestra), mientras que el menor TPC se reveló en las muestras con extracción de agua (31,4 ± 4,3 mg GAE/g de muestra), y estos valores fueron significativamente diferentes a los de todas las demás condiciones. Las muestras con pentilenglicol acuoso arrojaron el segundo valor más alto de TPC, seguidas de muestras con butilenglicol acuoso, metilpropanodiol y otros sistemas solventes (Figura 11A). Al comparar muestras con solventes convencionales (agua y sistema acuoso-etanol) y muestras con solventes a base de polioles, se pueden observar diferencias significativas en los valores de TPC (p < 0.05).

Efecto de los polioles, disolventes y disolventes convencionales sobre el contenido total de flavonoides
Se analizó el contenido total de flavonoides de cada extracción con diferentes solventes. El mayor contenido de flavonoides se obtuvo en las muestras con 1,2-hexanodiol acuoso (20,0 ± 1,7 mg QE/g de muestra), demostrando una diferencia significativa con respecto a todos los demás extractos. Las muestras con isopentidiol acuoso revelaron el valor más bajo de TFC (8,8 ± 0,7 mg QE/g de muestra), que no fue significativamente diferente de los extractos acuosos de metilpropanodiol y etanol acuoso. Además, el segundo valor más alto de TFC se encontró en la muestra con pentilenglicol acuoso, seguido de hexilenglicol acuoso, propilenglicol acuoso, butilenglicol acuoso y glicerina acuosa (Figura 11B).

Efecto de los polioles, disolventes y disolventes convencionales en los ensayos antioxidantes
Las actividades antioxidantes de los extractos con polioles y solventes convencionales se evaluaron mediante ensayos DPPH, ABTS y FRAP. El valor más alto para el ensayo DPPH se midió en muestras con hexilenglicol acuoso (13,6 ± 0,3 mg TE/g de muestra) y el más bajo en muestras con etanol acuoso (4,5 ± 0,2 mg de GAE/g de muestra), y estos valores fueron significativamente diferentes de otros extractos (p < 0,05). Los segundos valores más altos de DPPH se observaron en muestras con 1,2-hexanodiol acuoso, seguidas de pentilenglicol acuoso, metilpropanodiol acuoso y otros sistemas solventes (Figura 11C).

El valor más alto de ABTS se midió en muestras con pentilenglicol acuoso (8,2 ± 0,1 mg TE/g de muestra) y el más bajo en muestras con agua (5,6 ± 0,04 mg GAE/g de muestra), y estos valores fueron significativamente diferentes de otros extractos (p < 0,05). Los segundos valores más altos de ABTS se detectaron en el butilenglicol acuoso y el 1,2-hexanodiol acuoso, seguidos de las muestras con glicerina acuosa, metilpropanodiol acuoso y otros sistemas solventes (Figura 11D).

Los valores más altos de FRAP se observaron en muestras con hexilenglicol acuoso (21,1 ± 1,3 mg de Fe (II) E/g y los más bajos en la extracción con agua (11,5 ± 0,2 Fe (II) E/g de muestra), siendo estos valores significativamente diferentes (p < 0,05) para el resto de disolventes. Además, los segundos valores más altos de FRAP se encontraron en muestras con pentilenglicol acuoso, seguidos de butilenglicol acuoso, glicerina acuosa y otros sistemas solventes (Figura 11E).

Al comparar las actividades antioxidantes de las muestras con los solventes convencionales (agua y etanol acuoso), aquellas que contenían polioles exhibieron actividades antioxidantes significativamente más altas en todos los ensayos de antioxidantes (DPPH, ABTS y FRAP) (p < 0.05).

Figura 1: Reacción en recipientes experimentales y en la cámara MAE. (A) La muestra y el solvente se agregan al recipiente blanco entre capas de un recipiente de teflón antes de la extracción. (B) Cada recipiente se coloca dentro de la cámara de microondas antes de comenzar la extracción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Herramientas especiales para el cierre de los recipientes de reacción. Después de agregar la muestra y el solvente al recipiente de teflón, las tapas se colocan en la parte superior del recipiente, se colocan en el soporte del recipiente y se sujetan firmemente con las herramientas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Método de extracción. (A) Método de extracción, creado ingresando a la sección de método. (B) El accesorio SK eT se aplica para el proceso MAE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Velocidad de agitación y configuración de la función de bloqueo de la puerta. (A) Las barras agitadoras magnéticas dentro de cada recipiente se pueden activar eligiendo la velocidad de agitación. (B) La función de bloqueo de la puerta limita la temperatura, lo que permite abrir la cámara después de la extracción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Configuración de las condiciones de extracción. (A) Ingresando el icono de la mesa y configurando las condiciones de extracción, como el tiempo, la temperatura y la potencia de microondas. (B) Abrir el botón del agitador y elegir la velocidad del soplador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Ajuste del tiempo de enfriamiento. Aplicar el tiempo de enfriamiento para reducir la temperatura interior en la cámara MAE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Inicio del proceso de extracción. (A) Guardado del método creado para la extracción. (B) Haciendo clic en el icono de reproducción para iniciar el proceso de extracción. (C) Elegir el número de recipientes para iniciar la extracción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Imagen del extracto final después de la extracción con MAE. Obtención del sobrenadante después de la centrifugación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Las 96 placas de pocillos para determinar la actividad de barrido de TPC, TFC, DPPH, la actividad de barrido de ABTS y el ensayo FRAP de los extractos. (A) Determinación del TPC para la placa patrón de ácido gálico a partir de una concentración de 2,5-75 μg/mL y extractos de muestra. (B) Determinación de la TFC para la placa estándar de quercetina a partir de concentraciones de 2,5-50 μg / mL y ensayo de TFC para medir extractos de muestras. (C) Determinación de la actividad de barrido del DPPH para la placa estándar Trolox a partir de concentraciones de 0,25-12,5 μg/mL y la placa de detección de la actividad de barrido del DPPH de extractos de muestras. (D) Determinación de la actividad de barrido de ABTS para la placa estándar Trolox a partir de concentraciones de 0,25-5 μg/mL y la placa de detección de actividad de barrido ABTS de extractos de muestras. (E) Determinación del ensayo FRAP para la placa estándar FeSO₄ a partir de concentraciones de 0,25-10 μg/mL y la placa de detección del ensayo FRAP de extractos de muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Las curvas de calibración estándar para el TPC, el TFC, la actividad de barrido DPPH, la actividad de barrido ABTS y el ensayo FRAP. (A) La curva estándar para determinar el TPC, trazada por las concentraciones del patrón de ácido gálico y la absorbancia en A₇₆₅. (B) La curva estándar para determinar TFC, trazada por las concentraciones del estándar de quercetina y la absorbancia en A₅₁₀. (C) La curva estándar para determinar la actividad de eliminación de DPPH, trazada por las concentraciones del patrón Trolox y el porcentaje de inhibición. (D) La curva estándar para determinar la actividad de barrido de ABTS, trazada por las concentraciones del patrón Trolox y el porcentaje de inhibición. (E) La curva estándar para medir el ensayo FRAP, trazada por las concentraciones del patrón de sulfato ferroso y la absorbancia en A₅₉₃. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: El efecto de los tipos de solventes en la actividad de barrido de TPC, TFC, DPPH, Abts y FRAP en el MAE de la piel plateada del café. (A) El efecto de los tipos de solventes en el contenido fenólico total. (B) El efecto de los tipos de solventes sobre el contenido total de flavonoides. (C) El efecto de los tipos de solventes en la actividad de eliminación de DPPH. (D) El efecto de los tipos de solventes en la actividad de barrido de ABTS. (E) El efecto de los tipos de solventes en el ensayo FRAP. Los valores se indican como Media ± DE (n = 3). Los valores con diferentes letras en superíndice expresan una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Preparación de la curva patrón de ácido gálico. Preparación del rango de concentración estándar de 2,5-75 μg/mL en la placa de 96 pocillos. B = en blanco, 1-7 = número de pocillos en la placa de 96 pocillos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Cálculo de la concentración final de los patrones de ácido gálico. Preparación del rango de concentración estándar de 2,5-75 μg/mL. Las concentraciones finales (μg/mL) de ácido gálico se calculan en consecuencia. Concentración final (μg/mL) = (Concentración inicial (mg/mL) × Volumen inicial (μL) / volumen final (μL)) × (1000 μg/1 mg). Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Preparación de la curva estándar de quercetina. Preparación del rango de concentración estándar de 2,5-50 μg/mL en la placa de 96 pocillos. B = en blanco, 1-7 = número de pocillos en la placa de 96 pocillos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4: Tabla de cálculo de la concentración final para los patrones de quercetina. Preparación del rango de concentración estándar de 2,5-50 μg/mL. Las concentraciones finales (μg/mL) de quercetina se calculan en consecuencia. Concentración final (μg/mL) = (Concentración inicial (mg/mL) × Volumen inicial (μL) / volumen final (μL)) × (1000 μg/1 mg). Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 5: Preparación de la curva estándar de Trolox en el rango de concentración de 0,25-12,5 μg/mL. Preparación del rango de concentración estándar de 0,25-12,5 μg/mL en la placa de 96 pocillos. B = blanco, C = control, 1-7 = número de pocillos en la placa de 96 pocillos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 6: Cálculo de la concentración final de los patrones de Trolox para el ensayo DPPH. Preparación del rango de concentración estándar de 0,25-12,5 μg/mL, incluidas las concentraciones finales (μg/mL) de Trolox. Concentración final (μg/mL) = (Concentración inicial (mg/mL) × Volumen inicial (μL) / volumen final (μL)) × (1000 μg/1 mg). Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 7: Preparación de la curva estándar de Trolox en el rango de concentración de 0,25-5 μg/mL. Preparación del rango de concentración estándar de 0,25-5 μg/mL en la placa de 96 pocillos. B = blanco, C = control, 1-7 = número de pocillos en la placa de 96 pocillos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 8: Cálculo de la concentración final de los patrones Trolox para el ensayo ABTS. Preparación del rango de concentración estándar de 0,25-5 μg/mL, incluidas las concentraciones finales (μg/mL) de Trolox. Concentración final (μg/mL) = (Concentración inicial (mg/mL) × Volumen inicial (μL) / volumen final (μL)) × (1000 μg/1 mg). Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 9: Tabla de cálculo de concentración final para los estándares FeSO₄ . Preparación de la preparación de un rango de concentración estándar de 2,5-100 μg/mL, incluidas las concentraciones finales (μg/mL) de FeSO₄. Concentración final (μg/mL) = (Concentración inicial (mg/mL) × Volumen inicial (μL) / volumen final (μL)) × (1000 μg/1 mg). Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 10: Preparación de la curva estándar FeSO₄ . Preparación del rango de concentración estándar de 0,25-10 μg/mL en la placa de 96 pocillos. B = en blanco. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

Varios factores juegan un papel crucial en la implementación exitosa de MAE, como el contenido fitoquímico de los componentes de la planta, la duración de la extracción, la temperatura, la potencia de microondas, la relación sólido-líquido y la concentración de solvente¹³. Por lo general, las plantas exhiben diferentes perfiles de fitoquímicos; De ahí que la selección de plantas naturales ricas en antioxidantes y compuestos fenólicos sea fundamental²³. Además, los distintos constituyentes bioactivos muestran una variedad de polaridades según el disolvente utilizado. Del mismo modo, los solventes exhiben diferentes polaridades. Dado que la polaridad de los disolventes desempeña un papel crucial en la determinación de la eficacia de la extracción de compuestos bioactivos de las materias primas, es imperativo que la polaridad del disolvente se alinee con la de las moléculas bioactivas objetivo²⁴.

En este estudio, se utilizaron varios polioles para extraer polifenoles y antioxidantes de la piel de plata del café utilizando MAE. Los polifenoles son predominantemente polares, y los disolventes con alta polaridad suelen mejorar el rendimiento de los compuestos fenólicos²⁵. En comparación con las muestras con agua y etanol, las que emplearon diferentes polioles demostraron una mayor eficiencia en todas las respuestas medidas, incluidos TPC, TFC y ensayos de antioxidantes como DPPH, ABTS y FRAP. Estudios previos respaldan los hallazgos de que las mezclas acuosas-polioles pueden mejorar el rendimiento de extracción de compuestos bioactivos en comparación con las mezclas acuosas-etanol ^9,10,11. Al comparar diferentes polioles, las muestras con un sistema acuoso de polioles específico no lograron obtener el valor más alto. Sin embargo, es interesante notar que las muestras con 1,2-hexanodiol acuoso arrojaron los valores más altos en los ensayos TPC y TFC. Mientras tanto, aquellos con hexilenglicol acuoso produjeron los valores más altos en los ensayos DPPH y FRAP, y el extracto acuoso de pentilenglicol exhibió los valores más altos en el ensayo ABTS. La variación en los valores obtenidos de diferentes ensayos como TPC, TFC, DPPH, ABTS y FRAP dentro de sistemas de polioles acuosos puede atribuirse a varios factores, incluidas las características distintivas de los polioles empleados. Los polioles presentan diferencias en viscosidad, polaridad y puntos de ebullición, lo que influye directamente en su eficacia en la extracción de compuestos bioactivos de materiales vegetales²⁶. Una posible explicación puede atribuirse al principio de "Lo semejante disuelve lo semejante", en el que el sistema de disolvente concreto es el más adecuado para facilitar la transferencia de masa de determinados compuestos bioactivos²⁷. Esto subraya la importancia de seleccionar un disolvente con una polaridad que coincida con la del compuesto bioactivo objetivo.

Otra posible razón podría ser el hecho de que la diferencia en el número de grupos hidroxilo (-OH) presentes en el solvente impacta significativamente el rendimiento de los compuestos fenólicos²⁸. Entre estos polioles, solo la glicerina contiene tres grupos -OH, mientras que los polioles restantes en este estudio contienen dos grupos -OH. Los disolventes con un mayor número de grupos -OH tienden a exhibir una viscosidad más alta en comparación con aquellos con menos²⁹. La viscosidad elevada puede impedir la transferencia eficiente de compuestos activos durante el proceso de extracción, reduciendo así el rendimiento general. Además, la constante dieléctrica de un disolvente, estrechamente ligada a su polaridad, desempeña un papel crucial en la determinación de su capacidad para disolver solutos polares o no polares. Los disolventes con constantes dieléctricas más altas son más hábiles para disolver solutos polares, y los que tienen menos fluidas son más adecuados para solutos no polares³⁰. Entre los polioles, la glicerina exhibe una constante dieléctrica comparativamente alta de 41.14, mientras que el hexilenglicol, el pentilenglicol y el 1,2-hexanodiol muestran constantes dieléctricas más bajas de 25.86, 17.31 y 15.45, respectivamente^31,32. Los hallazgos de este estudio sugieren que los compuestos bioactivos dentro de la muestra pueden abarcar constituyentes de baja polaridad.

La eficiencia de la extracción puede mejorarse optimizando la selección y la composición de los disolventes, y puede ser necesaria una mayor experimentación para identificar el sistema de disolventes más adecuado. Aunque la investigación exhibe potencial, está limitada por su enfoque exclusivo en la extracción asistida por microondas con polioles y su evaluación restringida de otras variables, incluida la duración de la extracción, la temperatura, la concentración de solvente, la relación sólido-líquido y la potencia de extracción. Además, es necesario un estudio mecanicista para comprender cómo funcionan los polioles debido a sus variadas constantes dieléctricas, que afectan directamente su solubilidad de solutos polares o no polares. Las diferencias en las constantes dieléctricas entre los polioles resaltan la importancia de investigar sus mecanismos específicos en la extracción de compuestos bioactivos. Dicha investigación ofrecería información valiosa sobre las interacciones entre solventes y solutos, lo que ayudaría a la optimización y selección de sistemas de solventes para procesos de extracción eficientes.

Con respecto al proceso MAE, existen algunas limitaciones. Si bien el MAE puede proporcionar un calentamiento rápido, el control preciso de la temperatura puede ser un desafío, lo que puede provocar un sobrecalentamiento y la degradación de compuestos térmicamente sensibles³³. Sin embargo, la configuración de potencia de microondas para el gradiente y la temperatura de extracción se puede establecer en la misma potencia de microondas para evitar la frustración de la temperatura durante la extracción. Además, MAE tiene limitaciones sobre los componentes de la planta sensibles al calor. Sin embargo, la tecnología avanzada Ethos X MAE puede minimizar el riesgo de deterioro al respaldar un calentamiento efectivo a una duración más corta utilizando calentamiento dieléctrico³⁴. Cada recipiente de la cámara MAE tiene su propia capacidad máxima limitada de sólidos y líquidos. La relación sólido-líquido por encima de esta limitación también puede influir en gran medida en la concentración de los extractos¹¹. La disolución entre el solvente y el soluto se puede promover utilizando barras agitadoras, lo que puede conducir a una extracción efectiva y un mayor rendimiento³⁵. Además, los compuestos fenólicos y flavonoides extraídos dentro de los extractos pueden verificarse a través de análisis adicionales, como la cromatografía líquida de espectrometría de masas de triple cuadrupolo (LC-QQQ) y la espectrometría de masas de tiempo de vuelo cuadrupolar de cromatografía líquida (LC-QTOF), para establecer la presencia de compuestos bioactivos específicos y sus respectivas cantidades³⁶.

La extracción de polifenoles y antioxidantes de la piel de plata del café utilizando polioles acuosos a través de MAE demostró una mayor eficiencia en comparación con los extractos acuosos de agua y etanol. Sobre la base de los resultados derivados de la MAE basada en polioles de los extractos de CS, se ha observado que el empleo de los sistemas acuoso de hexilenglicol, acuoso de 1,2-hexanodiol y acuoso de pentilenglicol dio lugar a rendimientos de extracción significativamente mayores de compuestos bioactivos y capacidades antioxidantes. Además, estos hallazgos subrayan el potencial de utilizar dichos compuestos extraídos para análisis de investigación posteriores. La utilización de polioles como disolventes verdes para la extracción de compuestos bioactivos de materiales vegetales a través de MAE promete beneficios medioambientales y un mayor rendimiento de compuestos bioactivos, ofreciendo un enfoque sostenible con potencial de uso en aplicaciones cosméticas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1,2-Hexanodiol	Chanjao Longevidad Co., Ltd.
2,2 -Azino-bis 3 etilbenzotiazolina-6-sulfónico sal diamónica de ácido (ABTS)	Sigma	A1888
2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH)	Sigma	D9132
2,4,6-Tri(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)	Sigma	93285
2-Balanza digital	Ohaus		Pioneer
4-Balanza digital	Denver	SI-234
Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8 tetrametilcromán -2-carboxílico (Trolox)	Sigma	238813
placa de 96 pocillos	SPL Life Science
Etanol absoluto	RCI Labscan	64175
Ácido acético	RCI Labscan	64197
Cloruro de aluminio	Loba Chemie	898
Automático pipeta	Labnet		Biopett
Butylene glycol	Chanjao Longevity Co., Ltd.
Extracción avanzada por microondas Ethos X	Milestone Srl, Sorisole, Italia
Sulfato ferroso	Ajex Reactivo de Finechem	3850
Folin-Ciocalteu	Congelador Loba Chemie	3870
SF	Sanyo	C697(GYN)
Ácido gálico	Sigma	398225
Molinillo	Ou Hardware Products Co., Ltd
Hexilenglicol	Chanjao Longevity Co., Ltd.
Ácido clorhídrico (37%)	RCI Labscan	AR1107
Cloruro de hierro (III)	Loba Chemie	3820
Isopentyldiol	Chanjao Longevity Co., Ltd.
Metanol	RCI Labscan	67561
Metilpropanodiol	Chanjao Longevidad Co., Ltd.
Pentilenglicol	Chanjao Longevidad Co., Ltd.
Persulfato de potasio	Loba Chemie	5420
Propilenglicol	Chanjao Longevity Co., Ltd.
Quercetina	Sigma	Q4951
Centrífuga refrigerada	Hettich
Acetato de sodio	Loba Chemie	5758
Carbonato de sodio	Loba Chemie	5810
Hidróxido de sodio	RCI Labscan	AR1325
Nitrito de sodio	Loba Chemie	5954
Lector de microplacas SPECTROstar Nano	BMG- LABTECH
SPSS software	IBM SPSS Statistics 20
Secador de bandejas	France Etuves	XUE343