Artículo de método

Fotobiomodulación bajo controles electroencefalográficos del sueño para la estimulación de la eliminación linfática de toxinas del cerebro de ratón

DOI:

10.3791/67035

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28 de junio de 2024

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1Department of Biology, Saratov State University, 2Institute of Physics, Department of Optics and Biophotonics, Saratov State University, 3Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Saratov Scientific Centre of the Russian Academy of Sciences

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio presenta la tecnología no invasiva y portátil de fotobiomodulación transcraneal bajo control electroencefalográfico para la estimulación de la eliminación linfática de toxinas (por ejemplo, beta amiloide soluble) del cerebro de ratones machos BALB/c envejecidos y no anestesiados durante el sueño profundo natural.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los vasos linfáticos meníngeos (MLV, por sus siglas en inglés) desempeñan un papel importante en la eliminación de toxinas del cerebro. El desarrollo de tecnologías innovadoras para la estimulación de las funciones de MLV es una dirección prometedora en el progreso del tratamiento de diversas enfermedades cerebrales asociadas con anomalías de MLV, incluidas las enfermedades de Alzheimer y Parkinson, tumores cerebrales, lesiones cerebrales traumáticas y hemorragias intracraneales. El sueño es un estado natural en el que los procesos de drenaje del cerebro están más activos. Por lo tanto, la estimulación del drenaje cerebral y los MLV durante el sueño pueden tener los efectos terapéuticos más pronunciados. Sin embargo, en la actualidad no existen estas tecnologías comerciales.

Este estudio presenta una nueva tecnología portátil de fotobiomodulación transcraneal (tPBM) bajo control electroencefalográfico (EEG) del sueño, diseñada para fotoestimular la eliminación de toxinas (por ejemplo, beta amiloide soluble (Aβ)) del cerebro de ratones BALB/c envejecidos con la capacidad de comparar la eficacia terapéutica de diferentes recursos ópticos. La tecnología se puede utilizar en las condiciones naturales de una jaula doméstica sin anestesia, manteniendo la actividad motora de los ratones. Estos datos abren nuevas perspectivas para el desarrollo de fototecnologías no invasivas y clínicamente prometedoras para la corrección de los cambios relacionados con la edad en las funciones del MLV y los procesos de drenaje del cerebro, y para la limpieza eficaz de los tejidos cerebrales de metabolitos y toxinas. Esta tecnología está pensada tanto para estudios preclínicos de las funciones del cerebro dormido como para el desarrollo de tratamientos clínicamente relevantes para las enfermedades cerebrales relacionadas con el sueño.

Introducción

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Los vasos linfáticos meníngeos (MLV) desempeñan un papel importante en la eliminación de toxinas y metabolitos de los tejidos cerebrales 1,2,3. El daño de los MLV en diversas enfermedades cerebrales, incluyendo tumores, lesiones cerebrales traumáticas, hemorragias y procesos neurodegenerativos, se acompaña de una disminución de las funciones de los MLV que conduce a la progresión de estas patologías 1,2,3,4,5,6 . Por lo tanto, el desarrollo de métodos para la estimulación de MLVs abre nuevos horizontes en la aparición de tecnologías efectivas para el tratamiento de enfermedades cerebrales. Recientemente, se ha propuesto una tecnología no invasiva para la fotobiomodulación transcraneal efectiva (tPBM) para estimular los MLV y eliminar toxinas como la sangre y el Aβ del cerebro 5,7,8,9,10,11,12. Es interesante notar que el sueño profundo es un factor natural para la activación de los procesos de drenaje linfático en el cerebro 13,14. Con base en este hecho, es lógico suponer que el tPBM de los MLV durante el sueño puede tener efectos terapéuticos más efectivos que durante la vigilia 9,11,12,15. Sin embargo, actualmente no existen tecnologías comerciales para el tPBM durante el sueño16. Además, se realizan experimentos con animales para estudiar los efectos terapéuticos del tPBM bajo anestesia, que es necesaria para suministrar luz con precisión al cerebro. Sin embargo, la anestesia afecta significativamente el drenaje del cerebro, lo que reduce la calidad de los resultados de la investigación17.

Aβ es un producto metabólico de la actividad neuronal normal18. Como se estableció en neuronas corticales de rata cultivadas, Aβ se libera de ellas a altas tasas en el espacio extracelular (2-4 moléculas/neurona/s para Aβ)19. Existen evidencias de que la forma disuelta de Aβ, localizada en los espacios extracelular y perivascular, es la más tóxica para las neuronas y las sinapsis20. El Aβ soluble se elimina rápidamente del cerebro humano durante 1-2,5 h21. Los MLV son los túneles para la eliminación del Aβ soluble del cerebro 1,7 que disminuye con la edad, lo que lleva a la acumulación de Aβ en el cerebro envejecido 1,22. Existen evidencias de que las anormalidades extracelulares de los niveles de Aβ en el cerebro se correlacionan con el rendimiento cognitivo en el envejecimiento y están asociadas al desarrollo de la enfermedad de Alzheimer (EA)23,24. Por lo tanto, los roedores viejos y envejecidos se consideran alternativas a los modelos transgénicos para el estudio de la amiloidosis, incluyendo el AD25,26.

Este estudio presenta una tecnología original y portátil de tPBM bajo control electroencefalográfico (EEG) del sueño profundo o de movimientos oculares no rápidos (NREM) en ratones machos BALB/c no anestesiados de diferentes edades para estimular el aclaramiento linfático de Aβ desde el cerebro hacia el sistema linfático periférico (los ganglios linfáticos cervicales profundos, dcLNs).

Protocolo

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Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio", Directiva 2010/63/UE sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos, y las directrices del Ministerio de Ciencia y Educación Superior de la Federación Rusa (Nº 742 de 13.11.1984), que han sido aprobadas por la Comisión de Bioética de la Universidad Estatal de Saratov (Protocolo No. 7, 22.09.2022).

1. Montaje de herrajes

  1. Corta un trozo de textolito de aluminio de 1,5 mm de grosor con unas dimensiones de 1,5 mm x 2 mm. Esta parte se denominará placa de circuito impreso (PCB) de diodo emisor de luz (LED) (Figura 1C).
  2. Suelde un LED a una PCB, como se muestra en la Figura 1.
  3. Suelde dos cables de cobre trenzados a las clavijas de un LED y luego cúbralos con una funda.
  4. Imprima el modelo 3D del marco (Figura 1A); coloque un LED (Figura 1B) e imanes (Figura 1D) en el marco; coloque una arandela (Figura 1E) en la cabeza del ratón.
  5. Para ensamblar el circuito (Figura 2), siga estos pasos.
    1. Primero, conecte la resistencia (Figura 2; R1) entre un ánodo LED y un puerto de 5 V en el Arduino.
    2. A continuación, conecte un cátodo LED al transistor de efecto de campo (MOSFET) de semiconductor de óxido metálico (Figura 2; Q1) desagüe. A continuación, conecte la fuente MOSFET a tierra.
    3. Conecte la resistencia pull-down (Figura 2; R2) entre la puerta del MOSFET y el suelo. Finalmente, conecte la puerta MOSFET al pin 3 en el Arduino.
  6. Conecte un protector de teclado con pantalla de cristal líquido (LCD) al Arduino.
  7. Imprime los modelos 3D de la carcasa, la placa de cubierta y los botones. Inserte la placa Arduino con el blindaje del teclado LCD, el MOSFET y el conector LED en la caja, como se muestra en la Figura 3.

2. Guía de software (Figura 4)

  1. Descargue el boceto de Arduino (archivo .ino) y ábralo a través del entorno de desarrollo integrado (IDE) de Arduino (Archivo de codificación suplementario 1).
  2. Seleccione el puerto de comunicación (COM) correcto y actualice el firmware.
  3. La interfaz incluye dos columnas. Utilice los botones Izquierda y Derecha para navegar entre estas columnas. El indicador de selección se encuentra a la izquierda de la columna.
  4. La columna de la izquierda de la pantalla es el campo de selección del ciclo de trabajo de modulación de ancho de pulso (PWM). Utilice los botones Arriba y Abajo para ajustar el ciclo de trabajo. Logre la dosis de 10/20/30 Dj/cm2 de PBM con un ciclo de trabajo PWM correspondiente del 2%/4%/6% en una sesión de 17 minutos.
  5. La columna de la derecha de la pantalla es el campo RUN/Off . Para seleccionar esta columna, presione el botón derecho en el teclado y, a continuación, presione Seleccionar. Cuando el proceso se esté ejecutando, el indicador de actividad parpadeará y el texto del botón EJECUTAR cambiará a APAGADO.
    NOTA. Los ratones se preparan para los experimentos durante un período de 10 días, incluida la implantación de electrodos de EEG, la implantación de un catéter crónico en el ventrículo lateral derecho para la inyección de Aβ fluorescente y la colocación de una placa para PBM.

3. Implantación de un sistema de registro de EEG (Figura 5)

  1. Pesar al ratón y anestesiarlo con una mezcla de Zoletil 100 y Xilanita (100 mg/kg; 10 mg/kg, respectivamente) mediante inyección intramuscular en el muslo.
  2. Cuando cesen los reflejos de retirada del pie trasero y la respuesta de pellizco de la cola, coloque el ratón en un marco estereotáxico sobre una almohadilla térmica (Figura 5A).
  3. Aplique ungüento oftálmico en los párpados para evitar que los globos oculares se sequen durante la cirugía. Repita este procedimiento siempre que sea necesario.
  4. Afeita la cabeza en el área desde los huesos nasales hasta los huesos occipitales con una máquina de afeitar y esteriliza primero la piel expuesta con alcohol.
  5. Con unas tijeras de disección rectas, corte el cuero cabelludo, sujételo con micropinzas, limpie el cráneo de la fascia y séquelo con hisopos de algodón. Si es necesario, utilice los agentes hemostáticos.
  6. Con un taladro con un diámetro de 1,3 mm, haga 2 agujeros en los huesos temporales a cada lado a lo largo de las coordenadas: AP = -1 mm para el primer par de tornillos y AP = -3 mm para el segundo par de tornillos.
  7. Coloque los tornillos de EEG con cables conductores en alcohol durante 5 min. Después, coloque los tornillos de EEG en la solución salina.
  8. Coloque cuatro tornillos plateados con electrodos en los orificios a una profundidad de 1 mm (Figura 5B).
  9. Fije los tornillos en la superficie del cráneo con acrílico dental de modo que los electrodos que se extienden desde ellos se ubiquen hacia la nariz del animal (Figura 5C). Deje que el acrílico dental se endurezca durante 15 minutos.
  10. Coloque un sensor de registro de EEG en la nariz del animal con acrílico dental. Deje que el acrílico dental se endurezca durante 30 minutos (Figura 5D).
  11. Coloque los electrodos EMG en la parte posterior del músculo orbicular de los ojos con pinzas curvas y fíjelos con el acrílico dental. Deje que el acrílico dental se endurezca durante 15 minutos (Figura 5E).
  12. Conecte los electrodos de EEG al hueco plateado del sensor y suéldelos con una estación de soldadura. Después, fije los electrodos de EEG con el acrílico dental (Figura 5F).
  13. Después de la cirugía, coloque el ratón en una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal hasta que el animal se recupere completamente de la anestesia.
  14. Después, coloque al ratón en una jaula doméstica individual con libre acceso a comida y agua con ibuprofeno (40 mg/kg en 200 mL de agua) para la analgesia después de la cirugía durante 10 días.

4. Implantación de una placa para PBM

  1. Pesar el ratón y anestesiarlo con una mezcla de Zoletil 100 y Xilanita (100 mg/kg; 10 mg/kg, respectivamente) mediante inyección intramuscular en el muslo 7 días después de la implantación del sistema de registro de EEG.
  2. Cuando cesen los reflejos de retirada del pie trasero y la respuesta de pellizco de la cola, fije el ratón en un sistema estereotáctico.
  3. Aplique ungüento oftálmico en los párpados para evitar que los globos oculares se sequen durante la cirugía. Repita este procedimiento siempre que sea necesario.
  4. Fije una placa metálica de 5 mm de diámetro en el hueso occipital del cráneo utilizando acrílico dental y pinzas Dumont. Deje que el acrílico dental se endurezca durante 15 minutos (Figura 6).

5. Preparación de un catéter crónico

  1. Marque en la aguja de insulina un segmento a 2 cm del lado del extremo biselado.
  2. Fije la aguja de insulina en el soporte de la aguja desde el lado de la punta biselada hasta el segmento marcado.
  3. Colocar un catéter de polietileno PE-10 de 2 cm en toda la longitud restante de la aguja.
  4. Llene el catéter con una solución salina y cúbralo con una tapa de plástico para sellarlo.

6. Implante de un catéter crónico en el ventrículo lateral derecho

  1. Después de la implantación de la placa para PBM, haga un orificio de trepanación en las coordenadas AP = -0,5 mm y ML = 1,2 mm, con un diámetro de 1,5 mm, utilizando un taladro.
  2. Coloque el catéter de polietileno PE-10 en un soporte estereotáctico e insértelo en el cráneo del ratón (DV = 2 mm). Después, fíjalo con el acrílico dental. Deje que el acrílico dental se endurezca durante 15 minutos (Figura 7).
  3. Después de la cirugía, coloque el ratón en una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal hasta que el animal se recupere completamente de la anestesia.
  4. Después, coloque al ratón en una jaula doméstica individual con libre acceso a comida y agua con ibuprofeno (40 mg/kg en 200 mL de agua) para la analgesia después de la cirugía durante 10 días.

7. tPBM bajo control EEG del sueño NREM

  1. Conecte cualquier sistema de registro de EEG comercial al conector en la cabeza del mouse y establezca el valor requerido del ciclo de trabajo PWM.
  2. Controle la señal del EEG y espere la actividad del ritmo delta. Si se observa sueño NREM, inicie el proceso PBM y deténgalo si el sueño NREM pasa a un sueño de movimientos oculares rápidos (REM) o vigilia. La dosis aumenta con cada interacción hasta alcanzar el valor requerido.
  3. Cuando se obtiene la dosis requerida de PBM, la sesión termina.

8. Imagen confocal de la eliminación linfática de Aβ del cerebro de ratón

  1. Conecte un catéter de 10 cm a una aguja de insulina.
  2. Con una jeringa Hamilton con aguja de 29 G, prepare una infusión de beta-amiloide fluorescente (FAβ) en un volumen de 5 μL en el catéter. Deje que el catéter permanezca en una jeringa Hamilton.
  3. Fije la mano del ratón y conecte el catéter a través de una aguja al catéter crónico implantado.
  4. Conecte el catéter a un microinyector. Luego, coloque el mouse en una caja individual;
  5. Seleccione la tasa de inyección de 0,1 μL/min en el menú del microinyector y pulse el botón Inicio.
  6. Inyectar FAβ en el ventrículo lateral derecho.
  7. Después de la administración de FAβ, realice PBM usando un LED durante 61 min siguiendo el algoritmo: 17 min - luz y 5 min - pausa durante 61 min.
  8. Después de la PBM, inyecte por vía intravenosa cualquier marcador para marcar los vasos cerebrales a través de la cola.
  9. Después de la inyección, eutanasiar ratones utilizando la cámara de eutanasia de CO2 .
  10. Con unas tijeras afiladas y rectas, haga una pequeña incisión transversal en la piel a lo largo de la tráquea, sujetando la piel con pinzas rectas no afiladas.
  11. Haz una incisión longitudinal a lo largo de todo el cuello con unas tijeras rectas.
  12. Con pinzas curvas, tome las glándulas salivales y sepárelas cuidadosamente del tejido conectivo. Coloque un retractor de heridas en la sección abierta de la incisión y fíjelo de tal manera que empuje hacia atrás los tejidos circundantes.
  13. Examine el área entre la tráquea y el músculo cleidomastoideo con dos pinzas curvas de ambos lados del cuello.
  14. Cuando se detecte el ganglio linfático cervical profundo (dcLN, por sus siglas en inglés) en cada lado, quítese los dcLN con pinzas rectas con extremos romos y córtelo del tejido conectivo.
  15. Coloque los dcLN en una placa de Petri con una solución salina y cúbralos con un cubreobjetos orientado horizontalmente (25 mm × 50 mm × 0,17 mm).
  16. Utilice cualquier microscopio confocal comercial para obtener imágenes de dcLN completos.

9. Análisis de Aβ en los lisados de tejidos cerebrales

  1. Prepare las muestras para el ensayo.
    1. Eutanasia de ratones utilizando la cámara de eutanasia de CO2 .
    2. Decapita al ratón, quítale la piel de la cabeza y quita los músculos del cráneo.
    3. Haga dos incisiones con tijeras afiladas y rectas desde el agujero occipital grande hasta el conducto auditivo.
    4. Con unas pinzas rectas, separe la parte ventral del cráneo, el hueso occipital y los huesos que forman las cavidades del oído medio.
    5. Con unas pinzas, separe el cerebro de los huesos parietal y frontal.
    6. Con unas tijeras rectas, retire la mandíbula superior y corte los bulbos olfativos.
    7. Coloca el cerebro en la solución fisiológica.
    8. Enjuague el cerebro con solución salina fría tamponada con fosfato para eliminar completamente el exceso de sangre y pesarlo antes de la homogeneización.
    9. Prepare un tampón de lisado pH 7,2 que contenga 1,5 mm de KH2PO4, 8 mm de Na,2HPO4, 3 mm de KCl, 137 mm de NaCl y 0,1% de Tween20, 10 mM de EDTA con una mezcla inhibidora de proteasas recién preparada.
    10. Homogeneizar el cerebro en tampón de lisis fresco (1 mL de tampón de lisis para una muestra de tejido de 200-500 mg) con un homogeneizador de vidrio en hielo.
    11. Sonicar una suspensión resultante con un disruptor celular ultrasónico hasta que la solución se clarifique.
    12. Centrifugar los homogeneizados a 10.000 × g durante 5 min.
    13. Recoja el sobrenadante con una pipeta mecánica de un solo canal (100-1000 μL) y ensaye inmediatamente o alícuotas y almacene a ≤-20 °C.
  2. Prepare los siguientes materiales: lector de microplacas con filtro de 450 nm ± 10 nm; tubos de microcentrífuga; pipetas monocanal o multicanal de alta precisión y puntas desechables; papel absorbente para secar la microplaca; recipiente para solución de lavado; 0,01 mol/L (o 1x) solución salina tamponada con fosfato (PBS); y agua desionizada o destilada.
  3. Prepara los reactivos.
    1. Lleve los componentes del kit y las muestras a temperatura ambiente (RT; 18-25 °C) antes de usar.
    2. Reconstituya el patrón con 1,0 mL de diluyente estándar, manténgalo durante 10 min a RT y agite suavemente (no hasta formar espuma). La solución madre estándar es de 300 pg/mL. Prepare 5 tubos que contengan un volumen de 0,6 mL de diluyente estándar y haga una serie de dilución triple.
    3. Coloque 5 puntos (300 pg/mL, 100 pg/mL, 33.33 pg/mL, 11.11 pg/mL y 3.70 pg/mL) del patrón diluido, y los últimos tubos con un blanco que contenga solo el diluyente estándar (0 pg/mL).
    4. Centrifugar rápidamente las soluciones madre del reactivo de detección A y del reactivo de detección B antes de usarlas. Dilúyalos 100 veces con los diluyentes de ensayo A y B para preparar la concentración de trabajo.
    5. Diluya 20 mL de la solución de lavado concentrada (30x) con 580 mL de agua desionizada o destilada para hacer 600 mL de solución de lavado (1x).
    6. Aspire la dosis necesaria de la solución con puntas esterilizadas y no vuelva a verter la solución residual en el vial.
  4. Realice el ensayo.
    1. Determine los pozos para un patrón diluido, un blanco y una muestra.
    2. Prepare 5 pocillos para los puntos estándar y un pocillo para los blancos.
      1. Agregue 50 μL de diluciones estándar, en blanco y de muestra en los pocillos correspondientes, respectivamente. A continuación, añada inmediatamente 50 μL de reactivo de detección A a cada pocillo.
      2. Agite la placa suavemente (se recomienda un agitador de microplacas) y cúbrala con un sellador de placas. Incubar la placa a 37 °C durante 1 h. El reactivo de detección A puede aparecer turbio. Caliente la solución a RT y mezcle suavemente hasta que parezca uniforme.
    3. Aspire la solución y lave cada pocillo con 350 μL de 1x solución de lavado con la ayuda de una botella rociadora, una pipeta multicanal, un dispensador de colector o una lavadora automática. Deje el plato sin tocar durante 1-2 minutos. Coloque la placa en papel absorbente para eliminar completamente el líquido restante de todos los pocillos. Repita este procedimiento 3 veces.
    4. Después del último lavado, aspire o decante cualquier tampón de lavado restante. Asegúrese de eliminar completamente la solución de lavado invirtiendo la placa y secándola contra el papel absorbente.
    5. Añada 100 μL de solución de trabajo del reactivo de detección B a cada pocillo e incube la placa durante 30 min a 37 °C después de cubrirla con el sellador de placas.
    6. Repita los pasos de aspiración/lavado durante un total de 5 minutos.
    7. Agregue 90 μL de solución de sustrato a cada pocillo y cubra la placa con un nuevo sellador de placas. Incubar durante 10-20 min a 37 °C (No exceder los 30 min) protegido de la luz. Después de agregar la solución de sustrato, el líquido se volverá azul.
    8. Agregue 50 μL de una solución de parada a cada pocillo para terminar la reacción. Agregar la solución de parada hará que el líquido se vuelva amarillo. Golpea el plato de lado para mezclar el líquido. Si el cambio de color es inconsistente, golpee suavemente la placa para asegurar una mezcla completa.
    9. Asegure la eliminación completa del agua y las huellas dactilares en la parte inferior de la placa y la formación de burbujas en la superficie del líquido. Luego, lea la placa en un lector de microplacas a 450 nm inmediatamente.
  5. Calcula los resultados.
    1. Determine el promedio de las lecturas duplicadas para cada patrón, control y muestra. Traza una curva estándar con el logaritmo de la concentración de Aβ 1-42 en el eje y y la absorbancia en el eje x.
    2. Dibuje una curva de mejor ajuste a través de los puntos, que se puede determinar mediante un análisis de regresión.
    3. Si se utilizaron muestras diluidas, multiplique la concentración obtenida de la curva estándar por el factor de dilución.
      NOTA: Para ELISA, en este estudio se utilizó un kit para determinar Aβ 1-42.

Resultados

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En el primer paso, el estudio se ha centrado en establecer la dosis de luz efectiva (un LED de 1050 nm) para la estimulación de la eliminación linfática de Aβ fluorescente del cerebro a dcLN en ratones BALB/c machos adultos despiertos (2-3 meses de edad, 26-29 g). Las dosis de luz se seleccionaron aleatoriamente como 10 J/cm2, 20 J/cm2 y 30 J/cm2 en base a nuestros estudios previos de los efectos del tPBM en la eliminación de diferentes colorantes y glóbulos rojos del cerebro 7,8,9,10,11,12. Los resultados de las imágenes confocales presentados en la Figura 8A-E demuestran claramente los efectos relacionados con la dosis de tPBM en la eliminación linfática de Aβ fluorescente del cerebro a dcLNs. Se determinó que la dosis de luz de 30 J/cm2 era la más efectiva en comparación con las dosis de luz de 10 J/cm2 y 20 J/cm2 debido a una mayor intensidad de una señal fluorescente de Aβ en dcLNs.

En el segundo paso, la investigación se centró en encontrar las longitudes de onda más eficaces para la eliminación linfática del Aβ fluorescente del cerebro de ratones machos BALB/c adultos (2-3 meses de edad, 26-29 g) despiertos utilizando las plataformas fotográficas portátiles con las diferentes longitudes de onda de luz (880 nm, 1050 nm, 1300 nm) y modos (1050 nm en regímenes de continuación y pulso) con una misma dosis (30 J/cm2). La Figura 9A-E muestra los resultados de las imágenes confocales de las dcLN en los grupos probados. Los hallazgos revelaron que la longitud de onda de la luz de 1050 nm en modo de pulso frente a otras longitudes de onda probadas (880 nm y 1300 nm) y la longitud de onda de 1050 nm en régimen continuo causaron una eliminación significativamente mayor de Aβ fluorescente del cerebro a dcLN.

En el paso final, se estudiaron los efectos de un LED de 1050 nm en modo de pulso sobre el nivel de Aβ soluble en el cerebro de ratones envejecidos antes y después del curso de 10 días de tPBM bajo un control EEG de NREM y vigilia. El análisis de inmunoensayo reveló que el contenido de Aβ soluble en el cerebro era significativamente mayor en los ratones machos BALB/c de edad avanzada (16-18 meses de edad, 30-33 g) en comparación con los ratones BALB/c machos adultos (2-3 meses de edad, 26-29 g). El curso de 10 días de tPBM durante el sueño profundo, pero no mientras estaba despierto, redujo efectivamente el nivel de Aβ soluble en los cerebros de ratones envejecidos al nivel de Aβ soluble en los cerebros de ratones adultos (Figura 10).

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Figura 1: Proceso de ensamblaje de hardware. (A) marco impreso en 3D, (B) LED, (C) placa de circuito impreso LED, (D) imanes, (E) arandela metálica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Circuito de control LED. R1 - resistencia de regulación de corriente, R2 - resistencia desplegable para la puerta del MOSFET, Q1 - MOSFET de canal n. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Vista 3D de la caja. (A) Placa de cubierta impresa en 3D, (B) Botones impresos en 3D, (C) Pantalla de teclado LCD para Arduino, (D) Arduino, (E) Carcasa impresa en 3D, (F) Conector LED, (G) MOSFET de canal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Software. (A) Botón de selección, (B) Botón izquierdo , (C) Botón arriba/abajo , (D) Botón derecho , (E) Indicador de selección, (F) Campo de selección del ciclo de trabajo PWM, (G) Campo RUN/OFF . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Implantación de un sistema de registro de EEG. (A) Preparación del cráneo; (B) Implantación de tornillos; (C) Fijación de tornillos con el acrílico dental; (D) Fijación del sensor de registro de EEG; (E) Implantación y fijación de los electrodos EMG en la parte posterior del músculo orbicular de los ojos; (F) Los electrodos soldados al hueco plateado del sensor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Fijación de una placa para PBM en el hueso occipital del cráneo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Implante de un catéter crónico en el ventrículo lateral derecho. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8: Los efectos de diferentes dosis de LED de 1050 nm en la eliminación linfática de Aβ fluorescente del cerebro a dcLNs. (A-D) Imágenes representativas de dcLNs del grupo de control (A) y del grupo PBM con (B) 10 J/cm2, (C) 20 J/cm2 y (D) 30 J/cm2; (E) Análisis cuantitativo de la acumulación de Aβ fluorescente en dcLNs de los grupos analizados (n = 8, ANOVA de un factor con prueba post hoc de Duncan, **p < 0,01, *p < 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 9: Los efectos de diferentes longitudes de onda LED en la eliminación linfática de Aβ fluorescente del cerebro a dcLNs. (A-D) Imágenes representativas de dcLNs del grupo PBM con modo de impulso 1050 nm (ImpMode_1050, A), 880 nm (ImpMode_880, B), 1300 nm (ImpMode_1300, C) y modo continuo 1050 nm (ContMode_1050 nm, D); (E) Análisis cuantitativo de la acumulación de Aβ fluorescente en dcLNs de los grupos ensayados (n = 8, ANOVA de un factor con prueba post hoc de Duncan, **p < 0,01). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 10: Los efectos de PBM (LED 1050 nm en modo de impulso, 30 J/cm2) durante NREM y en estado de vigilia sobre el nivel de Aβ soluble (pg/mL) en cerebros de ratones adultos y envejecidos. Un ANOVA de un factor con prueba post hoc de Duncan, **p < 0,01, *p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discusión

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Los MLV son un objetivo importante para el desarrollo de tecnologías innovadoras para la modulación del drenaje cerebral y la eliminación de desechos celulares y desechos del cerebro, especialmente en sujetos de edad avanzada cuya función de MLVdisminuye 1,22. En un estado homeostático, el sueño profundo se asocia con la activación natural de la limpieza del tejido cerebral13,14. Por lo tanto, es obvio esperar que la estimulación de los MLV durante el sueño profundo sea más efectiva que durante la vigilia 15,16. Aquí se presenta la nueva tecnología no invasiva y portátil de tPBM bajo control de EEG del sueño para la estimulación de la eliminación linfática de Aβ soluble del cerebro de ratones machos envejecidos.

El pequeño tamaño de la plataforma fotográfica (7 mm x 11 mm) y su ligereza (1 g) permiten montarla de forma firme y segura en las cabezas de los ratones, manteniendo su actividad motora natural. Esto también elimina la necesidad de usar anestesia durante la tPBM. El tPBM durante el sueño profundo se puede realizar utilizando cualquier dispositivo comercial para un control EEG de las etapas del sueño. Así, nuestra tecnología permite realizar el estudio en una jaula casera, preservando las condiciones más naturales para los animales.

En el primer paso, se seleccionó aleatoriamente una longitud de onda LED de 1050 nm para el estudio de la dosis efectiva de fotoefectos en la eliminación linfática de Aβ fluorescente del cerebro a dcLN en ratones adultos despiertos (2-3 meses de edad). La elección de esta longitud de onda está relacionada con los datos previos sobre la estimulación efectiva de MLVs con un láser de 1267 nm 8,10,27,28,29,30,31,32,33,34. Esta longitud de onda promueve la generación directa de oxígeno singlete en pequeñas cantidades en el tejido cerebral y en sus meninges, que es uno de los mecanismos subyacentes al PBM de los MLVs 8,28,34. Sin embargo, los efectos biológicos tanto de un láser de 1267 nm como de un LED de 1050 nm están relacionados con la generación de excitación de oxígeno singlete35. De hecho, las bandas de un láser de 1267 nm ± 20 nm y un LED de 1065 nm ± 15 nm están relacionadas con la formación del oxígeno singlete a partir del estado fundamental de una molécula de oxígeno. Una banda de un láser de 1267 nm bombea una molécula de oxígeno directamente al primer estado singlete excitado, mientras que una banda de LED de 1065 nm corresponde a una energía vibratoria adicional, que decae muy rápidamente, liberando calor al medio ambiente. Además, la absorción de agua en la longitud de onda de 1065 nm es diez veces menor que en la longitud de onda de 1267 nm, lo que la hace más favorable para la investigación biológica35. Además, un LED de 1050 nm está disponible comercialmente en el mercado y es mucho más barato en comparación con el raro y caro láser de 1267 nm. Tenga en cuenta que la banda de emisión de un LED de 1050 nm usado en este estudio fue de 40 nm de ancho, y solo se superpone parcialmente con una banda de oxígeno singlete. Sin embargo, demostramos el efecto significativo de la tPBM en la eliminación linfática de Aβ fluorescente del cerebro a las dcLNs utilizando un LED de 1050 nm (30 J/cm2). Se determinó que la dosis de luz de 30 J/cm2 era la más efectiva en comparación con las dosis de luz de 10 J/cm2 y 20 J/cm2 en función de la mayor intensidad de una señal fluorescente de Aβ en dcLNs. Por lo tanto, un LED de 1050 nm puede ser muy útil para la aplicación de la técnica de tPBM a los humanos, lo que es consistente con la tendencia común de usar LED en lugar de láseres para PBM36,37.

En el segundo paso, la investigación tenía como objetivo responder a la pregunta de qué longitudes de onda de luz son más efectivas para la eliminación linfática de Aβ fluorescente del cerebro de ratones adultos despiertos. Esta etapa del estudio se realizó utilizando una plataforma fotográfica portátil con diferentes longitudes de onda de luz (880 nm, 1050 nm, 1300 nm) y modos (1050 nm en regímenes continuo y de pulso) con la misma dosis (30 J/cm2). Estas longitudes de onda se eligieron debido al uso generalizado en la práctica clínica de tPBM (880 nm) y los nuevos y costosos LED (1300 nm), que podrían ser clínicamente significativos. Además, se compararon los modos pulsado y continuo solo para el LED de 1050 nm como recurso lumínico. Estos datos demuestran claramente que solo un LED de 1050 nm en modo de pulso frente a otras longitudes de onda y el de 1050 nm en modo continuo provoca una eliminación linfática significativa de Aβ del cerebro a las dcLN. Estos resultados son consistentes con los hallazgos de otros investigadores, quienes también indican la ventaja de utilizar un PBM pulsado para lograr efectivamente efectos biológicos 38,39,40.

En el paso final, cuando se seleccionaron la longitud de onda efectiva, la dosis y el modo, se llevó a cabo el estudio de los efectos de un LED de 1050 nm en modo de pulso sobre el nivel de Aβ soluble en el cerebro de ratones envejecidos antes y después del curso de 10 días de tPBM bajo un control EEG de NREM y vigilia. El análisis del inmunoensayo reveló que el contenido de Aβ soluble en el cerebro era significativamente mayor en los ratones envejecidos (16-18 meses de edad) en comparación con los ratones adultos (2-3 meses de edad). Es interesante notar que el curso de 10 días de tPBM durante el sueño profundo, pero no durante la vigilia, redujo efectivamente el nivel de Aβ soluble en los cerebros de ratones envejecidos al nivel de Aβ soluble en los cerebros de ratones adultos. En otros estudios también se ha observado un aumento en el contenido de Aβ en el tejido cerebral de ratones y ratas sanos con la edad25,26, lo que puede estar asociado con una disminución relacionada con la edad en las funciones de MLV que conduce a una limpieza ineficaz del tejido cerebral de esta proteína tóxica 1,22. La mayor eficacia del tPBM en la eliminación de Aβ soluble del tejido cerebral en ratones dormidos en comparación con los despiertos puede explicarse por la activación natural del drenaje del tejido cerebral durante el sueño. La morfología del MLV cambia significativamente con la edad, lo que lleva a una reducción de la eliminación linfática de metabolitos del cerebro envejecido22. Sin embargo, el tPBM durante el sueño ayuda a restaurar la eliminación linfática del Aβ soluble del tejido cerebral de ratones envejecidos al nivel de los animales adultos.

Teniendo en cuenta la dispersión de la energía luminosa al pasar a través del cráneo, el tPBM limita sus efectos solo en los MLV sin penetrar profundamente en los tejidos cerebrales. Sin embargo, a pesar de que los vasos linfáticos aún no se han encontrado directamente en los tejidos cerebrales de humanos y animales, cada vez surgen más evidencias que indican la presencia del sistema linfático cerebral 41,42,43,44. Esto explica los resultados que muestran la remoción de toxinas (sangre y Aβ) de las estructuras profundas del cerebro (el sistema ventricular, el hipocampo) hacia los MLV y más allá de la periferia (dcLNs)5,7. A lo largo de un siglo, el conocimiento se ha acumulado, lo que indica una estrecha conexión entre el drenaje del cerebro y el sistema linfático periférico45. Incluso en ausencia de una red linfática generalmente reconocida en el sistema nervioso central, existen hechos que indican la eliminación linfática de macromoléculas desde las partes profundas del cerebro hasta la periferia 1,2,3,4,5,6,7 Esto también explica por qué la tPBM, que actúa solo sobre los MLV, estimula la eliminación de sangre y Aβ del cerebro 5, 7.

En resumen, este estudio presenta una tecnología portátil de tPBM bajo control EEG del sueño diseñada para fotoestimular la eliminación de toxinas utilizando el ejemplo de Aβ soluble del cerebro de ratones envejecidos con la capacidad de comparar la efectividad terapéutica de diferentes recursos ópticos. La tecnología se puede utilizar en las condiciones naturales de una jaula doméstica sin anestesia, manteniendo la actividad motora natural de los ratones. Estos datos abren nuevas perspectivas para el desarrollo de fototecnologías no invasivas y clínicamente prometedoras para corregir los cambios relacionados con la edad en las funciones del MLV y los procesos de drenaje del cerebro, y para la limpieza eficaz de los tejidos cerebrales de metabolitos y toxinas. La tecnología propuesta para la fotoestimulación del drenaje cerebral y la eliminación linfática de toxinas del cerebro tiene efectos limitados sobre los MLV debido a la dispersión de la energía luminosa al pasar a través del cráneo. Por lo tanto, la tecnología se puede utilizar para desarrollar nuevos métodos para tratar las enfermedades cerebrales asociadas con la disfunción del MLV. Los fotoefectos estimulantes más pronunciados sobre los MLV se observan en el sueño profundo (NREM), que requiere el uso de PBM bajo control EEG. Esto crea ciertas dificultades (técnicas, de programación) para el control simultáneo del inicio del sueño profundo y el suministro de exposición a la luz.

Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Esta investigación fue apoyada por una beca de la Fundación Rusa para la Ciencia (No. 23-75-30001).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.1% Tween20Helicón,  RusiaSB-G2009-100ML
CatéterScientific Commodities Inc., EE. UU.PE-10, 0,28 mm ID y veces; 0,61 mm OD
2cámara Aglutinante, AlemaniaCB-S 170
Microscopo confocalNikon, JapónA1R MP
Acrílico dentalZermack, Polonia-RusiaVillacryl S, V130V4Z05
TaladroForedom, RusiaSR W-0016
Pinza DumontStoelting, EE. UU52100-07
Evans Tinte azulSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU206334
HamiltonHamilton Bonaduz AG, SuizaAguja
IbuprofenoSintez OJSC, RusiaN/A  Medicamento analgésico
Aguja de insulinaINSUPEN, Italia31 G, 0,25 mm x 6 mm
Ungüento antibacteriano LevomekolNizhpharmD06C Para uso externo a una dosis de 40 mg/g, 1 vez al día
Micro pinzasStoelting, EE. UU.52102-02P
MicrocentrífugaGyrozen, Corea del SurGZ-1312
MicroinyectorStoelting, EE. UU.53311
Pinza no afiladaStoelting, EE. UU.52108-83P
Sistema PINNACLEPinnacle Technology, EE. UU.8400-K3-SLSistema para el registro de EEG (2 canales) y EMG (1 canal) de ratones
AfeitadoraBraunSeries 3310s
Pipetas monocanal y multicanalEppendorf, AustriaEpp 3120 000.020, Epp 3122 000.019
Cloruro de sodioKraspharma, RusiaN/A
Estación de soldaduraAOYUE, ChinaN/A
Marco estereotáxicoStoelting, EE. UU51500
Tijeras de disección rectasStoelting, EE. UU.52132-10P
TetraciclinaJSC Tatkhimfarmpreparaty, RusiaN/APomada para los ojos
PinzaStoelting, EE.UU.52100-03
Disruptor celular ultrasónicoBiobase, ChinaUSD-500
Retractor de heridasStoelting, EE.UU52125
XylanitNita-Farm, RusiaN/ARelajante muscular
Zoletil 100Virbac Sante Animale, FranciaN/AAnestesia general
CO. . 29 G. .

Referencias

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