Metodología para el estudio de las interacciones de los receptores de membrana de vitamina A y la proteína opsina con sus ligandos en la generación de la proteína retinilideno

Resumen

Aquí, describimos dos métodos cuantitativos para estudiar las interacciones proteína-ligando de los receptores de membrana de vitamina A y la opsina fotorreceptora con sus respectivos ligandos fisiológicos.

Resumen

La distribución de la vitamina A en la dieta/retinol todo-trans (ROL) en todo el cuerpo es fundamental para mantener la función de los retinoides en los tejidos periféricos y generar la proteína retinilideno para la función visual. RBP4-ROL es el complejo de ROL con la proteína 4 de unión al retinol (RBP4), que está presente en la sangre. Dos receptores de membrana, el receptor 2 de la proteína de unión al retinol 4 (RBPR2) en el hígado y el receptor STimulado por el ácido retinoico 6 retinol (STRA6) en el ojo, se unen a la RBP4 circulatoria y este mecanismo es fundamental para internalizar el ROL en las células. El establecimiento de métodos para investigar la cinética receptor-ligando es esencial para comprender la función fisiológica de los receptores de vitamina A para la homeostasis de los retinoides. Mediante ensayos de resonancia de plasmón de superficie (SPR), podemos analizar las afinidades de unión y los parámetros cinéticos de los receptores de membrana de la vitamina A con su ligando fisiológico RBP4.

Estas metodologías pueden revelar nueva información estructural y bioquímica de los motivos de unión a RBP4 en RBPR2 y STRA6, que son críticos para comprender los estados patológicos de la deficiencia de vitamina A. En el ojo, el ROL internalizado se metaboliza a 11-cis retinal, el cromóforo visual que se une a la opsina en los fotorreceptores para formar la proteína retinilideno, rodopsina. La absorbancia de la luz provoca la isomerización cis-trans del retinal 11-cis, induciendo cambios conformacionales en la rodopsina y la posterior activación de la cascada de fototransducción. La disminución de las concentraciones séricas y el ROL ocular pueden afectar la formación de la proteína retinilideno, que a su vez puede causar una mala localización de la rodopsina, acumulación de opsina de apoproteína, ceguera nocturna y degeneración del segmento externo de los fotorreceptores, lo que conduce a la retinosis pigmentaria o amaurosis congénita de Leber.

Por lo tanto, las metodologías espectrofotométricas para cuantificar el complejo retiniano opsina-11-cis del receptor acoplado a proteína G en la retina son críticas para comprender los mecanismos de degeneración de las células de la retina en los estados patológicos mencionados anteriormente. Con estas metodologías integrales, los investigadores podrán evaluar mejor el suministro de vitamina A en la dieta para mantener la homeostasis sistémica y ocular de los retinoides, que es fundamental para generar y mantener las concentraciones de proteína retinilideno en los fotorreceptores, que es fundamental para mantener la función visual en los seres humanos.

Introducción

La vitamina A / retinol todo-trans / ROL es un componente importante que desempeña un papel en la función visual ^1,2. El cromóforo 11-cis retinal, un metabolito de la vitamina A de la dieta, se une a la opsina del receptor acoplado a la proteína G (GPCR) para generar la proteína retinilideno, rodopsina, en los fotorreceptores. Cuando la luz incide sobre el ojo, la configuración de la rodopsina sufre un cambio fundamental a través de la conversión de su componente 11-cis-retinal en el todo-trans-retinal. Este cambio de configuración desencadena una cascada de fototransducción dentro de los fotorreceptores de los bastones, convirtiendo la luz en una señal eléctrica, que se transmite a la corteza visual en el cerebro a través del nervio óptico 3,4,5,6,7,8,9,10 . La disminución de las concentraciones séricas y el ROL ocular pueden afectar la formación de la proteína retinilideno, lo que a su vez causa la mala localización de la opsina, la acumulación de apoproteínas opsinas, la ceguera nocturna y la degeneración del sistema operativo de los fotorreceptores, lo que conduce a la retinosis pigmentaria o amaurosis congénita de Leber, que puede causar ceguera ^3,10.

El retinol totalmente trans es la forma de transporte fundamental de la vitamina A en la dieta y es la fuente de la que se derivan todos los retinoides funcionales y los metabolitos de la vitamina A en la dieta. El hígado es el órgano principal para el almacenamiento de vitamina A en la dieta. El retinol hepático se transporta a través del suero en forma de complejo con la proteína 4 de unión al retinol (RBP4). La RBP4, expresada principalmente en el hígado, forma un holocomplejo con el sustrato de retinol y la transtiretina (TTR), que entra en la circulación 11,12,13,14,15,16,17. El informe de un receptor de superficie celular para RBP4 en la década de 1970 condujo a la hipótesis de que las proteínas transportadoras de membrana ayudaban al transporte de retinoides dentro y fuera de las células. El receptor de la superficie celular para el retinol unido a RBP4 (RBP4-ROL) se identificó como estimulado por el ácido retinoico 6 retinol (STRA6) en el epitelio pigmentario de la retina (EPR) del ojo. STRA6 se une al complejo holo-RBP4 circulatorio y transporta el retinol unido a RBP4 a través del EPR para ser utilizado por los fotorreceptores^18,19. Las mutaciones en STRA6 pueden conducir a una miríada de enfermedades y fenotipos asociados con concentraciones reducidas de ROL ocular. Las mutaciones en STRA6 durante el desarrollo pueden provocar anoftalmia, microftalmia y otros síntomas no oculares que se superponen con los fenotipos asociados con el síndrome de Matthew-Wood 20,21,22,23,24,25,26,27. La STRA6 se expresa en diferentes órganos y tejidos, como el EPR del ojo, pero no en todos los tejidos^26,27. Aunque el sitio principal de almacenamiento de retinoides es el hígado, STRA6 no se expresa en el hígado.

Alapatt y sus colegas descubrieron que el receptor 2 de la proteína de unión al retinol 4 (RBPR2) se unió a RBP4 con alta afinidad y fue responsable de la absorción de retinol unido a RBP4 en el hígado, similar a STRA6 en el RPE²⁸. Se ha reportado que RBPR2 comparte homología estructural con STRA6 29,30,31. Se propone que RBP4 se une a los residuos S294, Y295 y L296 en RBPR2, un dominio de unión a aminoácidos parcialmente conservado entre RBPR2 y STRA6 29,30,31. A partir de estos estudios, se propone que los receptores de membrana de la vitamina A, como STRA6 y RBPR2, que contienen uno o más residuos/dominios de unión extracelular, interactúan con el RBP4-ROL circulatorio. Los receptores de membrana, por lo tanto, desempeñan un papel importante en la unión del receptor a RBP4 circulatorio para la internalización de ROL en tejidos diana, como el hígado y el ojo.

En la primera parte de este estudio, utilizamos la Resonancia de Plasmón de Superficie (SPR) para investigar la interacción de dos receptores de membrana de vitamina A (RBPR2 y STRA6) con su ligando fisiológico RBP4³¹. Las afinidades de unión y la cinética de asociación/disociación de la proteína a los complejos de ligandos se pueden medir en tiempo real mediante el uso de SPR. Esta metodología tuvo como objetivo proporcionar información cinética, estructural y bioquímica crítica sobre los motivos de unión a RBP4 en RBPR2 y STRA6, que son críticos para comprender los estados patológicos de la deficiencia de vitamina A^31,32. Como se mencionó anteriormente, el ROL circulatorio se internaliza en el EPR a través de STRA6 para generar el cromóforo 11-cis retinal, que se une a la opsina para generar la proteína retinilideno, rodopsina, en los fotorreceptores³³. Utilizamos metodologías de espectrofotometría para cuantificar la GPCR-opsina y su ligando 11-cis retinal complex en lisados de retina murinos, lo cual es crítico para comprender los mecanismos de la proteína retinilideno reducida, rodopsina, en los estados patológicos oculares de Retinitis Pigmentosa o Amaurosis Congénita de Leber³⁴. En general, estos protocolos se pueden aplicar para estudiar in vitro las consecuencias fisiológicas de los mutantes RBP4, STRA6 o RBPR2 en la influencia de la homeostasis sistémica y ocular de la vitamina A sistémica y ocular o el impacto de las proteínas mutantes de la rodopsina o del ciclo de los retinoides en la función visual^35,36.

Protocolo

1. Metodología de resonancia de plasmón de superficie (SPR)

1. Preparación y purificación de la proteína RBP4 de ratón
   1. Diseñe cebadores para generar ADNc de ratón RBP4 (msRBP4) de longitud completa (Secuencia de referencia del NCBI: NM_001159487.1). Clone el ADNc msRBP4 en un vector de expresión resistente a la kanamicina pET28a His-tag y expréselo en células BL-21 DE3 (Tabla de materiales).
   2. Transformar las células competentes BL-21 DE3 (según el protocolo del fabricante) con el vector msRBP4-pET28a ligado y, a continuación, colocar la placa en placas de agar de caldo Luria-Bertani (LB) que contienen kanamicina 50 μg/mL^30,37. Incubar las placas durante la noche a 37 °C en una incubadora y detectar colonias positivas al día siguiente.
   3. Elija una sola colonia e incube durante la noche a 37 °C en 5 mL de caldo LB que contenga Kanamicina 50 μg/mL.
   4. Para el cultivo secundario en 500 mL de caldo LB que contenga 50 μg/mL de kanamicina, utilizar un volumen de cultivo primario al 1% (a partir del paso 1.1.3.) e incubar a 37 °C durante 3-4 h; Compruebe la densidad óptica con un espectrofotómetro. Lo ideal es proceder si el valor de OD está entre 0,6 y 1 para inducir la expresión de proteínas con 0,5 mM de IPTG a 24 °C durante la noche.
   5. Utilice múltiples concentraciones de IPTG de 0,1-1 mM y un rango de temperatura de 16-30 °C para optimizar laexpresión y la estabilidad de MS RBP4.
   6. Centrifugar el cultivo (desde el paso 1.1.5.) a 16.000 × g durante 10 min, desechar el sobrenadante y mantener el pellet en hielo.
   7. Homogeneizar el pellet con tampón de lisis (50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 0,1% (v/v) de Triton X-100, 10% de glicerol, 0,5 mM de PMSF e inhibidores de la proteasa [pH 8,0]). Sonicar el lisado durante un ciclo de 15 s ON y 30 s OFF utilizando un homogeneizador con una potencia de salida de 250 vatios y una frecuencia de salida del 40-50% a 20 kHz. Repita 5 veces.
   8. Eliminar los restos celulares y las células no lisadas mediante centrifugación a 16.000 × g durante 20 min. Pase el sobrenadante del lisado a través de una columna NTA de níquel equilibrado por tampón.
   9. Lave la columna con tampón de lisis (del paso 1.1.8) que contenga 30 mM de imidazol.
   10. En fracciones, eluir la proteína msRBP4 unida utilizando un tampón que contenga 250 mM de imidazol. Ejecute las fracciones eluidas y controle visualmente la cantidad de proteína con un gel de poliacrilamida SDS al 12%, teñido con Coomassie Brilliant Blue R-250 en solución de metanol:agua:ácido acético (45:45:10) y elimine las manchas con solución sin tinción de Coomassie metanol:agua:ácido acético (45:45:10).
   11. Agrupe las fracciones no utilizadas y dialice las fracciones agrupadas con un casete de diálisis de 10K de 10 kDa MWCO.
   12. Evaluar la calidad de la fracción dializada en un gel SDS-PAGE al 12% y cuantificar la concentración de proteína.
       NOTA: Se utilizó la proteína Apo-RBP4 en el análisis SPR. Para la generación de holo-RBP4 (RBP4-retinol), consulte los protocolos detallados publicados en otros lugares^36,37.
2. Validación inicial de los péptidos RBPR2 y STRA6 con RBP4 para su estructura e interacción mediante ensayo de fluorescencia de triptófano y espectroscopía de dicroísmo circular (CD)
   1. Ensayo de fluorescencia de triptófano
      1. Utilice la herramienta de análisis de composición de proteínas en línea (https://web.expasy.org/protparam/) y pegue la secuencia de aminoácidos en un código de una letra para evaluar la composición estructural de la proteína RBP4 recombinante y los péptidos individuales de RBPR2 y STRA6 para determinar los residuos de aminoácidos de triptófano en los péptidos y proteínas individuales (Tabla de materiales).
      2. Haga clic en el botón de cálculo de parámetros y evalúe la composición de aminoácidos para los residuos de triptófano (Trp).
         NOTA: Los residuos de triptófano deben estar presentes en los péptidos o proteínas individuales que se están analizando.
      3. Diluir los péptidos RBPR2 y STRA6 individuales en varias concentraciones micromolares e incubar individualmente con 3 μg ms deRBP4 en una placa de 96 pocillos a temperatura ambiente durante 5 min. Excite la mezcla a 290 nm y escanee la emisión de 300 nm a 400 nm de longitud de onda.
      4. Normalice los datos con la condición de control en blanco (solo tampón, sin péptido y sin proteína) y péptido (sin proteína) y gráfica.
         NOTA: El incremento de la fluorescencia del triptófano tras la exposición a una concentración de péptidos de baja a alta sugiere una interacción positiva entre los dos péptidos individuales y la proteína RBP4.
   2. Espectroscopía de dicroísmo circular (CD)
      1. Diluya los péptidos individuales y la proteína RBP4 recombinante en 1x tampón PBS, pH 7.0. Utilice varias concentraciones de péptidos RBPR2 y STRA6 y proteína RBP4 de 0,1 a 10 μg/ml para un control de calidad, como se describe a continuación.
      2. Añada péptidos diluidos individuales y proteínas en una cubeta de 0,1 cm de longitud de paso y mida la absorbancia/elipticidad de la CD utilizando un espectrofotómetro de CD (195-250 nm). Utilice la siguiente fórmula para calcular la elipticidad media del residuo (θ).
         [v] = (S × mRw)/(10cl)
         S representa la señal CD en mθ; mRw representa la masa media del residuo; c representa la concentración de la proteína en mg/mL; y l representa la longitud del camino en cm.
      3. Calcule el cambio porcentual en la estructura de la molécula utilizando el análisis de estructura secundaria de BeStSel para la predicción del pliegue de proteínas mediante espectroscopia CD (https://bestsel.elte.hu).
         NOTA: La estructura secundaria indica el plegamiento adecuado y las confirmaciones conservadas cruciales para el estudio de la interacción y el resultado de las interacciones. Inspeccione la estructura predicha del dominio y continúe con el estudio de interacción.

2. Análisis SPR para determinar las afinidades de unión y los parámetros cinéticos de los receptores de membrana de la vitamina A (RBPR2 y STRA6) con su ligando fisiológico RBP4

1. Para la inmovilización de RBP4 en la configuración de la superficie del chip CM5, utilizamos el chip sensor SPR, que lleva un enlazador de carboximetildextrano extendido a un tamaño de ~ 100 nm unido covalentemente sobre una superficie de oro. En presencia de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropilo) carbodiimida (EDC), la N-hidroxisuccinimida (NHS) convierte los grupos carboxilo en la superficie del chip en ésteres de N-hidroxisuccinimida, que reaccionan espontáneamente con los grupos amina de aminoácidos y proteínas, obligando al ligando a unirse covalentemente a la superficie del chip (Tabla de materiales).
   1. Inmovilice la proteína msRBP4 purificada en el chip sensor (Figura 1 y Figura 2). En el menú Ejecutar software, elija el Asistente y proceda con la opción de inmovilización . Diluir el ligando (proteína msRBP4 obtenida del paso 1.1) en tampón de inmovilización (tampón de acetato de sodio 10 mM, pH 5,0) a 10 μg/mL (4 μL de ligando + 396 μL de tampón) y alícuota los reactivos de acoplamiento en viales. Abra la ventana del asistente de configuración de inmovilización desde el control de software, seleccione Chip CM5 y opción Inmovilizar celda de flujo 2 y nivel objetivo de 1,200 Unidad de respuesta (RU) para lograr Rmax de 30 RU en el estudio cinético y solución de lavado: Etanolamina. Introduzca el nombre RBP4 y haga clic en Siguiente.
      NOTA: Opcional: El cuadro de diálogo Preparativos del sistema para la opción Centrar antes de la ejecución no es necesario si anteriormente se realizó el cebado con tampón de funcionamiento PBST (solución salina tamponada con fosfato con una solución detergente Tween 20 al 0,05 %).
   2. En el cuadro de diálogo Posición del bastidor , haga clic en Expulsar bastidor. Tome la gradilla y coloque los viales con volúmenes asignados para cada reactivo: 156 μL de msRBP4, 177 μL de etanolamina, 89 μL de EDC, 89 μL de NHS y un vial vacío. Inserte la gradilla con los viales de muestra y haga clic en Aceptar y Siguiente.
   3. En el cuadro de diálogo Preparar protocolo de ejecución , haga clic en Iniciar y guardar.
2. Configuración del ensayo cinético de péptidos RBPR2 y STRA6
   1. Diluir en serie los péptidos RBPR2 de ratón, RBPR2 mutante y STRA6 (sintetizados químicamente anteriormente³¹ y enumerados en la Tabla de materiales) en un tampón en funcionamiento en un rango de 0,8-26,6 μM.
   2. Abra el software de control y seleccione Asistente de cinética/afinidad. Haga clic en Archivo | Abra la plantilla y seleccione Cinética/Afinidad. Introduzca la ruta de flujo 2-1 del cuadro de diálogo de secuencia de inyección (celda de flujo 2 como activa y celda de flujo 1 como referencia), verifique el tipo de chip CM5 y haga clic en Siguiente. En el cuadro de diálogo de configuración , marque Ejecutar ciclos de inicio, introduzca Solución: búfer y ciclos: y haga clic en Siguiente.
   3. En el cuadro de diálogo de parámetros de inyección , introduzca los valores de los parámetros de muestra : tiempo de contacto: 120 s, caudal 30 μL/min, tiempo de disociación 300 s; para los parámetros de regeneración : introduzca el nombre de la solución de regeneración: Glicina-HCl (pH 2,5), tiempo de contacto: 30 s, caudal: 30 μL/min y haga clic en Siguiente.
   4. En el cuadro de diálogo de muestras , introduzca el nombre de los péptidos, el peso molecular y las concentraciones y haga clic en Siguiente. En el cuadro de diálogo Posición de la grada , asigne los péptidos diluidos como muestras individuales de ~120 μL de varias concentraciones de 1 a 100 μM y ~230 μL de tampón, ~120 μL de tampón y ~1.000 μL de glicina, pH 2,5, a las posiciones del Rack. Haga clic en Eject Rack e inserte todos los viales. Haga clic en Siguiente y, en el cuadro de diálogo Preparar protocolo de ejecución , haga clic en Iniciar, escriba un nombre de archivo y Guardar (Figura 2).
   5. En el software, haga clic en el menú Inicio y seleccione Evaluación. Elija abrir el archivo en el software y, en el menú desplegable de selección, elija Fc2-1 para analizar el sensorgrama activo sustraído en blanco de la celda de referencia para las fases de asociación y disociación de los péptidos msRBP4 y mutantes msRBPR2 y msSTRA6.
   6. Haga clic en el botón desplegable Cinética/Afinidad y elija Superficie enlazada; para abrir el cuadro de diálogo Seleccionar curvas , marque Incluir columna en la tabla y haga clic en Siguiente. Seleccione el cuadro de diálogo Datos para mostrar los sensorgramas sustraídos en blanco; haga clic en Cinética y afinidad, mantenga los parámetros predeterminados y haga clic en la opción Ajustar para el ajuste de curvas. Inspeccione la pestaña Informe para ver la constante de disociación de equilibrio K_d y K_a o K_en la tasa de asociación y K_d o K_{en la tasa de} disociación. Guarde el sensorgrama de datos de Kinetics en .txt formato delimitado por tabulaciones y utilice los valores para trazar gráficos (Figura 3).
   7. Para determinar la constante cinética de afinidad K_d (concentración de ligando que se une a la mitad de los receptores en equilibrio), copie y pegue las columnas de datos en el archivo de formato .txt generado a partir de la gráfica de evaluación a XY utilizada en el software. Haga clic en Analizar y regresión no lineal (ajuste de curva), compruebe la columna de datos y haga clic en Aceptar. En el cuadro de diálogo de parámetros , haga clic en Saturación de encuadernación y Modelo de ajuste de encuadernación específico de un sitio con la fórmula de:
      Y= (Bmax * X)/(Kd + X)
      Donde Bmax es el número máximo de sitios de unión (unidad de respuesta), X es la concentración de los péptidos e Y es la unión (unidad de respuesta) (Figura 3).

3. Metodología de espectrofotometría para cuantificar el complejo proteico retiniano GPCR-11-cis (proteína retinilideno rodopsina) en lisados de retina

1. Transporta el grupo predeterminado de ratones que consta de ratones WT-C57BL/6J adultos al cuarto oscuro.
2. Adapte los ratones a la oscuridad durante la noche durante 12-16 h, y bajo luz roja, coloque al ratón en una cámara de eutanasia y abra la válvula de gas CO₂ en el regulador a 5 L / min durante ~ 5 min. Asegurar la muerte aplicando presión sobre el cuello y la cola tirada hacia atrás (luxación cervical).
3. Enuclear los globos oculares y homogeneizar los ojos en un tampón helado que contenga 20 mM de bis-tris propano (1,3-bis (tris(hidroximetil)metilamino)propano; BTP) pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA y con inhibidor de proteasa (Tabla de Materiales).
4. Centrifugar el homogeneizado durante 15 min a 16000 x g a 4 °C, desechar el sobrenadante que contiene proteínas citosólicas solubles en agua. Vuelva a suspender y solubilizar la membrana peletizada y las proteínas de la membrana en un tampón que contenga 20 mM de n-dodecil-β-d-maltósido (DDM), 20 mM de bis-tris propano (BTP), pH 7,4, 100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA y con inhibidor de la proteasa durante 1 h a 4 °C en una plataforma giratoria.
5. Centrifugar la fracción de membrana resolubilizada durante 1 h a 16000 x g, 4 °C. Mezclar el sobrenadante con 30 μL de perlas de anticuerpos Rho 1D4 e incubar durante 1 h a 4 °C en una plataforma giratoria.
6. Con un soporte magnético, separe el pulldown con perlas, deseche el sobrenadante y lave las perlas con tampón 20 mM de propano bis-tris (BTP) pH 7.4, 500 mM de NaCl y 2 mM de DDM.
7. Eluir la proteína de rodopsina incubando durante 5-10 min a temperatura ambiente con tampón 20 mM de bis-tris propano (BTP) pH 7,4, 100 mM de NaCl, 2 mM de DDM que contiene 0,2 mg/mL de péptido 1D4 (-TETSQVAPA) (Figura 4 y Figura 5).
8. Analice el eluto para la absorbancia de 200 nm a 800 nm utilizando una cubeta rectangular, submicro, de cuarzo, de 2 mm de apertura, 10 mm de longitud de trayectoria, 50 μL en un ajuste de escaneo rápido con espectrofotómetro.
   NOTA: Utilice únicamente cubetas de cuarzo de alta calidad (Figura 4).
9. Para validar y determinar la calidad, verifique y exponga el eluido a luz brillante durante 1 minuto, luego repita el paso 3.8.
10. Reste la absorbancia en blanco y calcule la relación de los espectros de absorbancia analizados con absorbancia a 500 nm para la opsina unida a la retina 11-cis, 380 nm para la opsina unida a la retina totalmente trans expuesta a la luz y 280 nm para la proteína Apo-Opsina libre de ligando (Figura 6). La opsina libre sin ligando retinal proporciona una absorbancia de referencia a 500 nm.
11. Para cuantificar la concentración de rodopsina, utilice la Ley de Beer-Lambert:
    A=ε· C·l o C=A/ε·l
    Donde A es la absorbancia, ε el coeficiente de extinción molar (rodopsina ε500 = 40.600 M⁻¹ cm⁻¹ para Apo Opsina ε280 libre = 81.200 M⁻¹ cm⁻¹), C es la concentración y l longitud del trayecto.
12. Para cuantificar la opsina ligada en porcentaje, utilice una relación de A280/A500.
13. Traza los espectros de absorbancia sustraídos en blanco y calcula el valor de opsina libre³².
14. Calcule la concentración de rodopsina utilizando el coeficiente de extinción ε₅₀₀ = 40600 M⁻¹ cm⁻¹. La concentración de opsina libre de ligando se calcula con la ley de Beer-Lambert utilizando el coeficiente de extinción ε₂₈₀ = 81.200 M⁻¹ cm⁻¹.

Resultados

Se describen métodos cuantitativos para estudiar las interacciones proteína-ligando de los receptores de membrana de vitamina A y la opsina de los fotorreceptores con sus respectivos ligandos fisiológicos. La RBP4 recombinante de ratón debe expresarse en E. coli y la proteína purificada debe utilizarse como ligando conjugado en un chip SPR. El RBPR2, STRA6 y el mutante S294A RBPR2 "SYL motif RBP4 interacting extracellular site" sintetizados químicamente de un péptido de ~40 aminoácidos se utiliza como analito a varias concentraciones para medir la cinética de unión y saturación de equilibrio K_d de la interacción (Figura 1 y Figura 2).

La proteína RBP4 recombinante, como ligando para RBPR2 y STRA6, mostró una afinidad de unión hacia los sitios que interactúan en estos péptidos, medida en K_d ~ 22.38 μM y ~ 26.73 μM, respectivamente. El motivo aminoácido "SYL" desempeña un papel esencial en la estabilización de estas interacciones tanto en RBPR2 como en STRA6 y, como se predijo, el péptido mutante S294A había aumentado K_d de ~114,9 μM, lo que sugiere un mayor número de copias de los requisitos del péptido RBPR2 mutante para alcanzar la saturación de unión (Figura 3). La absorción de retinol en el ojo a través de STRA6 y la conversión en varios retinoides para la conversión final de 11-cis retinal como cromóforo con unión a la lisina 296 residuo de rodopsina hace un receptor funcional para la detección de fotones y la visión. La unión covalente retinal 11-cis a la proteína Opsina para formar rodopsina exhibe ciertos rasgos característicos de absorbancia. La absorbancia de proteínas se produce a 280 nm y la absorbancia de retinol libre es de ~325 nm. Sin embargo, la holo-Opsina con absorbancia de retina 11-cis o rodopsina se produce a una longitud de onda de 500 nm.

Cualquier defecto en esta formación compleja debido al bajo retinol sistémico o defecto en la absorción de retinol por una mutación en RBPR2 o STRA6 conduce a la acumulación de Opsina libre u opsina apoproteína desprovista de cromóforo 11-cis retinal, cambiando la absorbancia característica que cambia a baja absorbancia a 500 nm. Cuantificando la absorbancia y utilizando la relación de absorbancia de 280 nm y 500 nm de longitud de onda, es posible estimar las Opsinas o Rodopsinas ligadas. A través de una breve exposición a la luz, es posible verificar la fotoisomerización de la absorbancia de Opsina unida a la retina 11-cis a 500 nm con la absorbancia de Opsina unida a todo el contenido trans-retinal (rodopsina Meta II) a 380 nm (Figura 4, Figura 5 y Figura 6). En una configuración experimental, la posibilidad de artefactos y contaminantes es alta; las dos fuentes principales de artefactos encontrados son la exposición involuntaria a la luz de los instrumentos y el lavado con sal de baja concentración sin eliminar las moléculas contaminantes del EPR o la lente (Figura 7).

Figura 1: Espacio de trabajo de resonancia de plasmón de superficie. Materiales necesarios y descripción general de la instrumentación SPR. (A) Muelle de carga de chips SPR. (A') Chip CM5 con superficie de oro adherida covalentemente a dextrano carboximetilado para inmovilización a través de grupos -NH2, -SH, -CHO, -OH o -COOH. (B) Bastidor de inyector robótico de carga de muestras. (B') tapones de goma tipo 3. (B'') viales de plástico de 7 mm para las alibcuotas de las muestras. (C,D) Depósito intermedio de equilibrio/funcionamiento y depósito de recogida de residuos. (E) Panel de control de software Biacore. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Descripción general esquemática de la resonancia de plasmón de superficie y los pasos de las adquisiciones de sensorgramas. Paso 1: La superficie del chip CM5 se inmovilizó con la proteína RBP4 con un objetivo de 1.200 unidades de respuesta. Paso 2: Varias concentraciones de péptidos RBPR2 se ejecutan como analitos, y esta interacción biomolecular cambia la densidad de carga de electrones en la superficie del chip de oro, lo que lleva al cambio / reducción en la reflexión de la luz en un ángulo específico o un ángulo de resonancia. Paso 3: El lavado revierte el fenómeno del plasmón de la superficie, lo que lleva a la inversión de la intensidad de reflexión y la caída del sensorgrama a la línea de base. La cinética de estas interacciones se utilizó posteriormente para determinar la asociación, las constantes de disociación y la fuerza de las interacciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Estudios de unión por resonancia de plasmón de superficie de péptidos individuales del dominio de unión al receptor de vitamina A con su ligando fisiológico RBP4. (A) El mensaje del software que muestra la inmovilización lograda de RBP4 en la superficie del chip CM5. (B, C, D) Sensibilizogramas de las interacciones péptido-ligando RBPR2-RBP4, STRA6-RBP4 y S294A RBPR2-RBP4 mutante a varias concentraciones. (B',C',D') Cinética de unión y determinación de equilibrio K_d que muestra la diferencia y la cercanía del patrón de unión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Espacio de trabajo de absorbancia retiniana Opsin-11-cis y descripción general de la instrumentación. (A) Centrífuga de sobremesa refrigerada, todos los indicadores LED cubiertos con cinta roja; (B) espectrofotómetro UV-visible, un indicador LED cubierto con cinta roja; (B') Celda ultra-micro rectangular, cubeta de cuarzo y soporte magnético. (C) Escanear el software de la aplicación; (D) la tapa del compartimiento del espectrofotómetro se desliza abierta, el soporte de la cubeta para el análisis y la tapa del compartimiento cerrada. (E) Configuración de luz apagada con monitor apagado para la preparación de muestras bajo una sola fuente de luz roja. (F) Rotador refrigerado para la preparación y solubilización de muestras. (G) Configuración de luz apagada con monitor encendido para la medición de la absorbancia de la muestra. (H) Análisis de absorbancia en XY-Plot. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Resumen del flujo de trabajo de la metodología de absorbancia retiniana Opsin-11-cis. Paso 1: Las retinas de ratones adaptados a la oscuridad bajo una sola fuente de luz roja se aíslan, homogeneizan y solubilizan para obtener fracciones de la membrana de la retina. Pasos 2-4: En una secuencia de centrifugaciones, el pellet se solubiliza en ausencia de detergente y en presencia de tampón detergente DDM. Pasos 5-6: El gránulo solubilizado que contiene fotorreceptores de la retina y otras proteínas de membrana listos para la extracción y purificación de anticuerpos. Paso 7: La opsina eluida con el péptido VAPA 1D4 está lista para el análisis de absorbancia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Espectros de absorbancia de rodopsina. (A) Extracto de retina de ratones adaptados a la oscuridad utilizando rodopsina purificada 1D4 que muestra la absorbancia máxima de 500 nm, y (B) extracto de retina expuesto a la luz utilizando rodopsina purificada 1D4 que muestra la absorbancia máxima de 380 nm. (C) Western blot utilizando el anticuerpo de rodopsina 1D4 que muestra la calidad de la purificación de la rodopsina y la distribución del tamaño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Artefacto de espectros de absorbancia de rodopsina. (A) El artefacto en los espectros de absorbancia del extracto de ojo adaptado a la oscuridad se muestra con el pico de absorbancia a 380 nm; Las exposiciones involuntarias a la luz de los indicadores LED de los instrumentos o la falla del bloqueador de luz de la puerta de la habitación oscura causan el blanqueo de la proteína rodopsina. (B) Los lavados insuficientes con alto tampón de sal causan la acumulación de contaminantes del EPR, lentes u otras fuentes del extracto ocular, lo que lleva a una alta dispersión del espectro de absorbancia y artefactos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Representación esquemática de las interacciones entre los receptores de membrana de vitamina A (RBPR2 y STRA6) y la proteína Opsina con sus respectivos ligandos (RBP4 y 11-cis retinal) críticos para la generación de la proteína retinilideno en los fotorreceptores para la función visual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria S1: Intensidades de fluorescencia intrínseca del triptófano. Evidencia preliminar de interacción y cambio en las orientaciones de los residuos intrínsecos de triptófano de RBP4 al interactuar con varias concentraciones de péptidos RBPR2 y STRA6. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Acoplamiento e interacción proteína-proteína RBPR2 y RBP4. Los residuos de la interfaz se visualizan en PyMOL y la orientación de RBPR2 en la membrana se visualiza mediante el uso de la herramienta de servidor https://opm.phar.umich.edu/. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S3: Tubería para el análisis in silico de la interacción de acoplamiento proteína-proteína y los posibles sitios de contacto. La canalización de análisis muestra la secuencia de ejecución de scripts de Python y el uso de la línea de comandos de PyMOL de los pasos 1 a 6, lo que garantiza la confiabilidad de la adquisición de los sitios de interacciones. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S4: Análisis de la estructura secundaria de la espectroscopia CD que muestra la composición de los péptidos RBP4, RBPR2 y STRA6. El gráfico circular muestra las proporciones de las estructuras secundarias presentes en la molécula. Utilizando la herramienta BeStSel de Estructura Secundaria, se analizó la Predicción de Pliegues de Proteínas por Espectroscopía de Dicroísmo Circular (https://bestsel.elte.hu). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Pasos críticos en el protocolo
Metodología SPR
Modelado in silico y análisis de acoplamiento: La estructura predicha de RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) y STRA6, y la estructura conocida para la base de datos MSRBP 4 PDB (RSCB PDB ID: 2wqa), deben utilizarse para el estudio de acoplamiento^29,31. Además, se deben utilizar métodos in vitro (cultivo celular) para confirmar la interacción de los sitios de unión putativos en los receptores de vitamina A (RBPR2 y STRA6) con su ligando (RBP4)^29,31 (Figura suplementaria S1, Figura suplementaria S2 y Figura suplementaria S3). Determinar la calidad de los péptidos mediante espectroscopía CD. Anteriormente, para el espectro CD de UV lejano, se utilizaba una celda rectangular de 1 mm de 0,1 μg/μL ~200 μL (3-4 μg de proteína RBP4, 32 μM de RBPR2 y 32 μM de péptidos STRA6)³¹ (Figura suplementaria S4). El flujo de gas nitrógeno debe usarse para evitar la formación de ozono nocivo bajo las lámparas de xenón de emisión y reducir la absorbancia de fondo a 200-300 nm. Utilizando el parámetro predeterminado, el espectro se midió de 185 nm a 300 nm. La línea de base debe corregirse restando con el espacio en blanco. El contenido de la hélice alfa y la lámina beta se calcula en función de la propiedad de la absorbancia, como los picos negativos de la hélice alfa a 222 nm.

Analice las proteínas RBPR2 y STRA6 y los datos de dominios topológicos en la base de datos (https://www.uniprot.org), confirme los posibles sitios de interacción previamente conocidos de las regiones extracelulares y utilice la secuencia ~ 40-50 aminoácidos para sintetizar químicamente los péptidos. El estudio requiere proteína RBP4 recombinante de ratón purificada (msRBP4) y péptidos RBPR2 y STRA6 sintetizados químicamente que abarquen los residuos de unión RBP4 propuestos para estudiar las interacciones receptor-ligando 18,19,29,31. Antes de preseleccionar los péptidos, se debe determinar la secuencia peptídica extracelular de las proteínas receptoras de vitamina A que interactúan mediante análisis in silico (acoplamiento proteína-ligando basado en ordenador)³¹. El ensayo SPR se realiza para comprender la cinética de las interacciones receptor-ligando. Es crucial conocer los sitios previstos de las interacciones mediante ensayos in-silico basados en ordenador o a partir de análisis in vitro. En este estudio, el péptido diseñado hace referencia a la región extracelular de las proteínas de membrana RBPR2 y STRA6, que se sabe que interactúan con RBP4. Para garantizar resultados precisos y evitar posibles artefactos y sensorgramas SPR negativos, es crucial estandarizar los tampones, las concentraciones de péptidos y la solubilidad. Para los estudios de absorbancia de rodopsina, el aislamiento del lisado de retina requiere condiciones oscuras estrictas y pasos de lavado para evitar artefactos y picos de absorbancia no deseados (Figura 7).

Para comprender la importancia del motivo SYL en los transportadores de vitamina A en la unión de RBP4, RBPR2, STRA6 y un mutante S294A-RBPR2, se sintetizaron químicamente³¹ mediante una reacción de condensación de los grupos carboxilo y amino entre dos aminoácidos. El protocolo siguió la adición precisa y escalonada de aminoácidos secuenciales a la resina de anclaje. El proceso de síntesis de aminoácidos se somete a modificaciones químicas de protección y desprotección de la unidad de aminoácidos N-terminal, lo que permite la síntesis y formación de polímeros peptídicos. Una vez completado, el péptido se recupera de la resina y se purifica. La validación inicial de las interacciones entre la proteína RBP4 y los péptidos del receptor de vitamina A debe confirmarse mediante un ensayo interno de fluorescencia de triptófano y comprobarse con un espectrómetro CD (figura suplementaria S1). La calidad de la interacción inicial de la proteína RBP4 recombinante con STRA6 de ratón (msSTRA6), RBPR2 de ratón (msRBPR2) y péptidos de control debe confirmarse mediante un ensayo de fluorescencia de triptófano intrínseco (Figura suplementaria S1). El ensayo de fluorescencia de triptófano intrínseco es un procedimiento experimental crítico para evaluar el enfriamiento o la mejora de los residuos de aminoácidos de triptófano en las proteínas para la fluorescencia al unirse al receptor y al ligando. La fluorescencia medida es una indicación directa del cambio en el entorno local como resultado de la interacción.

Modificaciones y solución de problemas de los métodos
Optimice el SPR con tampones en ejecución: 1x solución salina tamponada con fosfato (Tween 20) o 1x HEPES (P20). Para evitar precipitados, los péptidos diluidos deben centrifugarse y filtrarse antes de su uso. Estandarizar la absorbancia de la rodopsina con varios tampones con alto contenido de sal (300-500 mM de NaCl). Para confirmar los picos de absorbancia de rodopsina en la oscuridad a 500 nm, exponga las muestras a la luz durante 30 s y repita la medición para garantizar la calidad a través del cambio del pico de absorbancia a 380 nm y la eficacia de la reducción.

Limitaciones de los métodos
SPR puede proporcionar información específica sobre la interacción de dos proteínas; Sin embargo, si la interacción requiere un tercer componente desconocido, los datos pueden volverse complejos de comprender. El cambio en la conformación de la molécula permanecerá sin identificar en la interacción. Dado que la proteína RBP4 se prepara en ausencia de retinol (apo-RBP4), lo que se mide es la unión de la apo-RBP4 a sus receptores. Por lo tanto, el RBP4 cargado de retinol (holo-RBP4) puede tener una afinidad alterada por los receptores RBPR2 y STRA6 en comparación con el apo-RBP4^35,36. Curiosamente, las afinidades por apo- y holo-RBP4 para STRA6 se mostraron previamente en ambos rangos micromolares, y no se observó diferencia estadística entre las uniones de apo- y holo-RBP4 al receptor STRA6³⁵. La metodología de absorbancia de rodopsina puede identificar la presencia de opsina no ligada (opsina de apoproteína) en el ojo, pero no puede identificar los mecanismos causantes.

Espectros de absorbancia de rodopsina
PUNTO DE CONTROL CRÍTICO: La fotoisomerización de retina 11-cis a retinal all-trans es altamente sensible e instantánea³². La cuantificación de la rodopsina (holo-opsina) debe realizarse en condiciones de oscuridad estrictas para medir el contenido adecuado de opsina y retina de 11-cis en la oscuridad (500 nm) o en condiciones adaptadas a la luz como la rodopsina Meta II (380 nm)³². Por lo tanto, los ratones deben adaptarse a la oscuridad en una habitación oscura durante 12-16 h para medir la rodopsina³² sin blanquear. Para ello, la habitación oscura debe estar completamente a oscuras, con la puerta de entrada cubierta con tela opaca y las fuentes de luz LED externas en todos los equipos cubiertas con cinta roja. Cubra la pantalla de la computadora portátil con una lámina de plástico roja y manténgala cerrada hasta que la necesite. También se requiere una fuente de luz roja en el techo.

PASO CRÍTICO: Estandarizar los pasos de lavado a varias concentraciones altas de sales para eliminar las proteínas del cristalino o del RPE o los contaminantes de moléculas que tienen una absorbancia de longitud de onda de 300-500 nm y que podrían interferir con la medición de la absorbancia de opsina.

Importancia de los métodos con respecto a los métodos existentes/alternativos
No existe un enfoque factible para estudiar la utilización sistémica de retinoides, las contribuciones de múltiples tejidos y el impacto de las mutaciones en los receptores de proteínas de unión al retinol para los mecanismos de distribución del retinol. Este protocolo utiliza dos técnicas esenciales para comprender y completar las conexiones faltantes en la depleción de retinol en los fotorreceptores con Apo-Opsina y la utilización del almacenamiento de retinoides hepáticos a través de las interacciones receptor-ligando RBPR2-RBP4 (Figura 3, Figura 6 y Figura 8).

Importancia y posibles aplicaciones del método en áreas de investigación específicas
Los ensayos de espectroscopia de rodopsina basados en SPR y absorbancia proporcionan una estrategia significativa para estudiar los mecanismos sistémicos y oculares de homeostasis de la vitamina A para la generación de la proteína retinilideno (rodopsina). En resumen, estas técnicas y enfoques experimentales pueden dilucidar la cinética del transporte dependiente del receptor de membrana de los retinoides dietéticos a través del hígado y hacia el ojo, lo que facilita la generación de rodopsina (Figura 8). También ayudan a comprender los mecanismos y las consecuencias oculares de las mutaciones en los receptores de vitamina A y las proteínas opsina, en particular en la unión a sus respectivos ligandos. Estas interacciones pueden influir en la generación de la proteína retinilideno, que es crucial para la función visual.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit cuantitativo 2-D	Cytiva	80648356
Kit de acoplamiento de aminas	Cytiva	BR100050
Biacore software de evaluación Biacore	S200	Versión 1.1
Biacore Chip sensor CM5	Cytiva	BR100530
Bis tris propano	Sigma	B6755-25G	20 mM
BL21 DE3 celdas competentes	Thermo Espectrofotómetro	científico EC0114
CD	Jasco	J-815 Espectropolarímetro
Glicina HCL	Fisher Bioreactivos	BP381-1
Prisma GraphPad			Adaptación del modelo, análisis de datos
Caldo LB	Fisher Bioreagents	BP1426-500
n-dodecil-β-d-maltósido (DDM)	EMD Millipore	324355-1GM	2-20 mM
pET28a His-tag Vector de expresión resistente a la kanamicina	Addgene	69864-3
Kit de purificación de plásmidos	Qiagen	27106
Rho1D4 MagBeads	CubeBiotech	33299
Slide-A_Lyzer 10K casete de diálisis	Thermo Scientific	66810
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500	0.05%
UV vis Espectrofotómetro	Agilent	Cary 60 UV-Vis
Nombre del péptido	Secuencia de péptidos	HPLC-pureza	>Mass Spec
Mouse Rbpr2 (42)	HVRDKLDMEDKLESYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	92.14%	Conforms
Mouse Stra6 (40)	SVVPTVQKVRAGINTDVSYL LAGFGIVLSEDRQEVVELVK	90.84	%Conforma
Ratón Rbpr2 mutante S294A (42)	HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	0.92%	Conforme