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Artículo de método

Monitorización a largo plazo de las tasas de consumo de oxígeno en cultivos epiteliales de pigmento retiniano altamente diferenciados y polarizados

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DOI:

10.3791/67038

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16 de agosto de 2024

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1Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, 2School of Optometry and Vision Science, University of New South Wales, 3Lucid Scientific, 4Schepens Eye Research Institute of Mass. Eye and Ear, Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, 5Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Presentamos un novedoso dispositivo para medir las tasas de consumo de oxígeno (OCR) en cultivos epiteliales de pigmento de retina (EPR). El dispositivo puede medir el OCR durante semanas seguidas en RPE cultivado en placas de cultivo celular estándar con medios estándar mientras las placas están en una incubadora de cultivo celular estándar.

Resumen

El metabolismo mitocondrial es fundamental para el funcionamiento normal del epitelio pigmentario de la retina (EPR), una monocapa de células de la retina importante para la supervivencia de los fotorreceptores. La disfunción mitocondrial del EPR es una característica distintiva de la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la principal causa de ceguera irreversible en el mundo desarrollado, y de la vitreorretinopatía proliferativa (RVP), una complicación cegadora de los desprendimientos de retina. Las condiciones degenerativas del EPR han sido bien modeladas por sistemas de cultivo de EPR que están altamente diferenciados y polarizados para imitar el EPR in vivo . Sin embargo, el monitoreo de las tasas de consumo de oxígeno (OCR), un indicador de la función mitocondrial, ha sido difícil en dichos sistemas de cultivo porque las condiciones que promueven la polarización y diferenciación ideal del RPE no permiten mediciones fáciles de OCR.

Aquí, presentamos un sistema novedoso, Resipher, para monitorear OCR durante semanas a la vez en cultivos de EPR bien diferenciados mientras se mantiene el EPR en sustratos de crecimiento óptimos y medios de cultivo fisiológicos en una incubadora de cultivo celular estándar. Este sistema calcula el OCR midiendo el gradiente de concentración de oxígeno presente en los medios por encima de las células. Discutimos las ventajas de este sistema sobre otros métodos para detectar OCR y cómo configurar el sistema para medir OCR en cultivos de RPE. Cubrimos consejos y trucos clave para usar el sistema, precaución sobre la interpretación de los datos y pautas para solucionar problemas de resultados inesperados.

También proporcionamos una calculadora en línea para extrapolar el nivel de hipoxia, normoxia o hiperoxia que experimentan los cultivos de RPE en función del gradiente de oxígeno en los medios por encima de las células detectadas por el sistema. Finalmente, revisamos dos aplicaciones del sistema, midiendo el estado metabólico de las células EPR en un modelo de PVR y entendiendo cómo el EPR se adapta metabólicamente a la hipoxia. Anticipamos que el uso de este sistema en cultivos de EPR altamente polarizados y diferenciados mejorará nuestra comprensión del metabolismo mitocondrial del EPR, tanto en estados fisiológicos como de enfermedad.

Introducción

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa de células epiteliales funcionalmente postmitóticas altamente polarizadas que forman una barrera entre los fotorreceptores sensibles a la luz en la retina y su circulación sanguínea, un lecho capilar denominado coriocapilar. Al igual que el papel de las neuronas de soporte de la glía, el EPR lleva a cabo innumerables funciones para apoyar a los fotorreceptores, incluida la fagocitosis de los segmentos externos de los fotorreceptores, el transporte de nutrientes y el apoyo metabólico de los fotorreceptores, y la secreción de factores de crecimiento esenciales, todos críticos para mantener la función visual.

La degeneración del EPR subyace a varios trastornos degenerativos comunes de la visión. En la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), una de las causas más comunes de pérdida de visión incurable en el mundo, el EPR muere y, por lo tanto, los fotorreceptores suprayacentes sufren una degeneración secundaria. En la vitreorretinopatía proliferativa (PVR), el EPR, en cambio, sale de su estado postmitótico normalmente inactivo, proliferando y desdiferenciándose en un estado mesenquimal (la llamada transición epitelial a mesenquimal [EMT]) con alteraciones en su metabolismo. La desdiferenciación del EPR provoca una pérdida del apoyo del EPR a los fotorreceptores, al tiempo que desencadena un estado más fibrótico. Esto da lugar tanto a la degeneración de los fotorreceptores como a la cicatrización inducida por el EPR, que desencadenan la pérdida de la visión 1,2.

Una parte importante del apoyo del EPR a los fotorreceptores es metabólica, y la desregulación metabólica es un factor crítico en numerosas enfermedades de la retina, incluidas la DMAE y la RVP. El EPR sirve como barrera reguladora entre los fotorreceptores y su fuente de oxígeno y nutrientes, la coriocapilar. Por lo tanto, lo que el EPR elige metabolizar frente a lo que el EPR elige pasar de la coriocapilar a los fotorreceptores gobierna en gran medida el metabolismo y la supervivencia de los fotorreceptores. Numerosos estudios han demostrado que el EPR depende en gran medida del metabolismo mitocondrial para su salud normal, y que los fotorreceptores dependen en gran medida de la glucólisis3. Esto ha introducido el concepto de estados metabólicos complementarios y entrelazados entre los fotorreceptores y el EPR. Específicamente, el EPR reduce su metabolismo de los sustratos metabólicos fotorreceptores preferidos y, en su lugar, utiliza los subproductos del metabolismo de los fotorreceptores combinados con los metabolitos que los fotorreceptores no consumen. En enfermedades como la RVP y la DMAE, la evidencia sugiere fuertemente que el EPR se vuelve más glucolítico y menos dependiente del metabolismo mitocondrial; este cambio hacia la glucólisis RPE puede privar a los fotorreceptores de los metabolitos que necesitan, desencadenando la degeneración 4,5,6. Dado lo interdependientes que son el metabolismo del EPR y los fotorreceptores y el grado de alteración del metabolismo que subyace a la enfermedad de la retina, existe un gran interés en modelar y manipular el metabolismo del EPR con fines terapéuticos.

Si bien el estudio del metabolismo mitocondrial del EPR in vivo es ideal, muchos aspectos del metabolismo mitocondrial del EPR solo se pueden investigar prácticamente en un sistema de cultivo in vitro. En las últimas décadas se han realizado avances significativos hacia los cultivos de EPR de alta fidelidad, hasta el punto de que los cultivos de EPR más cuidadosamente preparados se utilizan ahora para la terapia de reemplazo celular en ensayos clínicos en humanos7. Para mantener estos cultivos de alta fidelidad, el EPR debe cultivarse en sustratos particulares en medios particulares durante meses antes de la experimentación. Con estas condiciones, los cultivos de EPR se diferencian y polarizan al máximo, aproximándose al EPR in vivo. Desafortunadamente, actualmente no hay ningún equipo disponible que pueda medir el metabolismo mitocondrial específicamente a partir del RPE in vivo. Si bien la monitorización del oxígeno de la red capilar de la retina se ha logrado in vivo utilizando oximetría de resonancia paramagnética electrónica (EPR)8, esto no es posible para el análisis de RPE. Las diferencias entre el metabolismo del EPR in vivo e in vitro no están bien descritas, pero se ha demostrado que los cultivos de EPR tienen una alta actividad mitocondrial, similar al EPR in vivo 3,9, lo que sugiere que se puede obtener información significativa sobre el metabolismo mitocondrial del EPR utilizando cultivos de EPR de alta fidelidad.

Dado que todo metabolismo mitocondrial conduce al consumo de oxígeno, la medición de las tasas de consumo de oxígeno (OCR) del EPR es un indicador fiel del metabolismo mitocondrial. La medición del OCR en cultivos de EPR ha sido difícil, ya que las condiciones que promueven la máxima polarización y diferenciación del EPR a menudo impiden mediciones precisas de OCR a largo plazo con las técnicas disponibles actualmente, como el analizador de caballitos de mar. En este documento de métodos, se presenta un dispositivo novedoso, denominado Resipher (en lo sucesivo denominado "el sistema"), que permite la medición continua de OCR durante semanas en RPE cultivado en condiciones que promueven al máximo la polarización y la diferenciación. La facilidad con la que este sistema puede medir el OCR en condiciones de cultivo de RPE que promueven al máximo la diferenciación y polarización del RPE es única entre los dispositivos de medición de OCR existentes.

Este documento proporciona consejos y trucos para usar el sistema con cultivos RPE, seguido de una demostración de dos aplicaciones particulares. En primer lugar, la EMT RPE, que imita la PVR, se desencadena por la exposición al factor de crecimiento transformante beta (TGFβ)1,10,11,12. El sistema se utiliza para monitorizar cómo evoluciona el metabolismo del RPE durante el proceso de EMT. En segundo lugar, se explora el papel de la hipoxia en el metabolismo del EPR utilizando este sistema. La hipoxia es un contribuyente importante a la patogénesis de la DMAE, ya que la coriocapilar se adelgaza con la edad13,14. La combinación de este sistema con cámaras de hipoxia permite modelar el metabolismo mitocondrial alterado del EPR con la sutil hipoxia que acompaña al envejecimiento. Por último, se presenta una calculadora en línea que utiliza datos de Resipher para permitir determinar si los cultivos de EPR se encuentran en condiciones hipóxicas, normóxicas o hiperóxicas. Esta información es fundamental para sacar conclusiones sobre el metabolismo del EPR a partir de estudios de cultivo in vitro de EPR.

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Protocolo

Para conocer los protocolos para establecer cultivos primarios humanos o iPSC-RPE, consulte las siguientes referencias 15,16,17,18. La adquisición y el uso de tejido humano para estos protocolos fueron revisados y autorizados por la Junta de Revisión Institucional (HUM00105486) de la Universidad de Michigan.

1. Aplicación general del sistema a la cultura RPE

  1. Placa de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) derivadas de RPE o células RPE humanas primarias en placas de 96 pocillos compatibles con el sistema.
    1. Suponiendo que ya existen cultivos maduros cultivados en placas de cultivo celular de 24 pocillos, lave las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) una vez y luego agregue 500 μL de tripsina-EDTA al 0,25% (Tabla de materiales). Incubar durante 10-40 min en una incubadora de cultivo celular, revisando cada 5-10 min hasta que las celdas estén redondeadas y casi listas para desprenderse.
    2. Pipetear suavemente los medios sobre las células para separarlas del plástico del cultivo celular, seguido de una transferencia a 3 veces el volumen de los medios de cultivo celular (1.500 μL por 24 pocillos), girando en una centrífuga a 250 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
      NOTA: La receta para los medios de cultivo celular RPE se detalla en la Tabla 1 y está disponibleen las referencias publicadas anteriormente 9,15,16,17,18.
    3. Resuspender las células en medios de cultivo celular EPR con un 15% de suero fetal bovino (FBS) y contar las células con un hemocitómetro.
    4. Siembre 74.000 células por cada pocillo de una placa de 96 pocillos (generalmente 225-300 × 105 células/cm2), después de recubrir con sustratos de recubrimiento de matriz extracelular altamente especializados (Tabla de Materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Celdas de siembra solo en una placa compatible con Resipher (Tabla de Materiales) y solo en pocillos correspondientes a la matriz de sondas en la tapa de detección (columnas 3, 4, 9 y 10 para la tapa de 32 canales; ver Tabla de Materiales). La tapa de detección del sistema está disponible con sensores de 4, 32 o 96 canales (consulte las ubicaciones de los sensores en la Figura 1A-D), y una gama de placas de cultivo celular estándar son compatibles.
    5. Dado que los pozos de borde son propensos a la evaporación, lo que afecta drásticamente la disponibilidad de oxígeno y, por lo tanto, las lecturas de OCR, evite sembrar celdas en todos los pozos de borde (filas A y H de una placa de 96 pocillos). Además, agregue 200 μL de agua estéril en cada uno de los pocillos vacíos de la placa de 96 pocillos para reducir los efectos de evaporación.
    6. Mantenga el plato sobre una superficie de mesa estable durante 10 minutos para permitir que las células se asienten; luego devuélvalo a la incubadora. Cambie el medio después de 24-72 h, reemplazándolo por un medio de cultivo RPE estándar con 5% de FBS. Cultivo durante al menos 4 semanas, cambiando de medio 2 veces por semana.
      NOTA: Las células están listas para la experimentación cuando están pigmentadas, empedradas y muy compactas (Figura 1E).
  2. Configuración y adquisición de datos con el sistema
    1. Coloque la tapa de detección en una placa receptora vacía de 96 pocillos y luego vuelva a colocarla en la incubadora de cultivos celulares. Alinee y monte el dispositivo en la tapa de detección y conéctelo al Hub a través del cable USB provisto. Esto crea un "sándwich" Resipher (Figura 2A).
    2. Ve a la aplicación del sitio web de Lucid lab (https://lab.lucidsci.com/) y haz clic en el botón Nuevo experimento en la esquina superior derecha para crear un nuevo experimento.
    3. Nombra el título del experimento e ingresa cualquier nota experimental relevante para el estudio en particular (por ejemplo, el número de pasaje de la iPSC-RPE que se está utilizando).
    4. Crear condiciones de pozo y grupos de tratamiento. Por ejemplo, si prueba los efectos de diferentes concentraciones séricas en los medios en OCR, seleccione Suero en el nombre del grupo y, a continuación, introduzca las concentraciones séricas de los medios que se utilizarán, agregando más valores de porcentaje sérico haciendo clic en el botón + . Asigne qué pocillos recibirán un porcentaje de suero en particular y seleccione un patrón de color para esos pocillos. Agregue más grupos (por ejemplo, una variable experimental diferente para probar) según sea necesario haciendo clic en el botón Agregar grupo .
    5. Defina la configuración de la placa y seleccione el dispositivo y el estilo de placa correspondientes. Haga clic en el botón Agregar placa y elija Dispositivo; Seleccione el tipo de placa. Seleccione el tratamiento y haga clic en el pozo correspondiente.
    6. Haga clic en el botón Iniciar ahora para iniciar el experimento. Compruebe que el indicador del sitio web y el LED del Hub estén en verde fijo.
    7. Deje que el sistema funcione durante 15-60 minutos para garantizar que cada sensor esté correctamente calibrado y detecte con precisión el oxígeno atmosférico, que debe estar en una concentración de ~ 200 μM en una incubadora de cultivo celular completamente humidificada con 5% de CO2 (Figura 2Bi).
      NOTA: Si alguno de los sensores está más de un 20% desviado del promedio de los otros sensores en una configuración estándar de incubadora de cultivo celular, considere excluir ese pozo en el análisis de datos, ya que el sensor está defectuoso (Figura 2Bii).
      NOTA: Si todos los sensores están más de un 20% desviados del promedio de los otros sensores y del O2 atmosférico esperado reportado como 200 μM en una configuración estándar de incubadora de cultivo celular, la tapa de detección se ha utilizado demasiadas veces; reemplácelo con una nueva tapa de detección (Figura 2Biii).
      NOTA: Obtener las lecturas deO2 en el aire antes de comenzar un experimento mejora significativamente la resolución de problemas posteriores. Si un pozo en particular aparece como un valor atípico después de realizar un experimento y ese pozo tenía un sensor que estaba descalibrado, el problema puede estar en el sensor, no en la réplica biológica.
    8. Retire el dispositivo de la tapa de detección (pero no desconecte el cable USB del dispositivo). Coloque el dispositivo boca abajo en la incubadora para permitir que el motor del dispositivo se reinicie. No vuelva a utilizar el dispositivo hasta que todos los sonidos del motor se hayan detenido (aproximadamente 20-30 s).
      NOTA: Es importante mantener el dispositivo conectado al hub a través del cable USB en todo momento durante un experimento, incluso cuando el dispositivo está fuera de la tapa de detección. Esto permite que el dispositivo monitoree e informe continuamente sobre el entorno de la incubadora de cultivos celulares.
    9. Vuelva a colocar la placa con la tapa de detección en la cubierta de cultivo celular, junto con una placa de 96 pocillos que contenga los cultivos de EPR. Cambie los medios de la placa con cultivos de RPE con el mismo medio y el mismo volumen para todos los pocillos para obtener valores de OCR de referencia para cada pocillo. Asegúrese de llenar todos los pozos sin RPE con agua estéril para ayudar a prevenir la evaporación.
      NOTA: En general, recomendamos 60-100 μL de medio de cultivo RPE por 96 pocillos, basándonos en datos que demuestran que los volúmenes de medio más bajos conducen a un rápido agotamiento de nutrientes, pero los volúmenes de medio más altos conducen a hipoxia inadvertida9.
    10. Transfiera la tapa de detección a la placa que contiene cultivos celulares y la tapa estándar (no Resipher) de la placa que contiene cultivos celulares a la placa receptora vacía de 96 pocillos para mantener la esterilidad de la tapa estándar, que será necesaria en varios puntos durante la experimentación.
    11. Vuelva a colocar la placa con cultivos celulares y la tapa de detección en la incubadora de cultivos celulares. Una vez más, alinee y monte el dispositivo en la tapa de detección y conéctelo al Hub a través del cable USB provisto (ensamblando el "sándwich"). Compruebe que los indicadores de la interfaz del sitio web y del Hub estén todos en verde fijo.
      NOTA: Los datos de concentración deO2 aparecerán de inmediato, mientras que los datos de OCR solo aparecerán después de que se hayan recopilado suficientes datos deO2 , aproximadamente 1 h.
    12. Deje que el dispositivo mida el OCR en cada pocillo durante al menos 12-24 h para capturar un OCR de referencia.
      NOTA: El OCR de referencia variará en función de muchos factores, incluido el tipo de medio que se aplique a las células. En la Figura 2C, los medios de cultivo RPE estándar con diferentes cantidades de FBS (0%, 5%, 15%) tienen valores de OCR ligeramente diferentes. Además, los cultivos con más FBS pueden mantener la actividad mitocondrial durante más tiempo después de aplicar medios a las células antes de que el OCR disminuya debido al agotamiento de los metabolitos mitocondriales (lado derecho de la curva).
    13. Una vez que se obtiene un OCR de referencia, repita los pasos 1.2.8-1.2.12, pero cambie el medio en la placa con cultivos de RPE a las condiciones experimentales de cada uno (por lo general, ± un medicamento o una comparación de diferentes condiciones de medio).
      NOTA: Los cambios de medios de rutina también se pueden manejar de la misma manera. Cada vez que se abre la incubadora de cultivo celular, se espera una interrupción significativa en las lecturas de OCR, ya que dependen de la temperatura, la humedad, las concentraciones deCO2 y otros factores que se interrumpen temporalmente con la apertura de la puerta de la incubadora. Durante cualquier extracción del dispositivo de la tapa de detección, no es necesario pausar el experimento en línea. Después de abrir la puerta de la incubadora de cultivo celular o cambiar el medio en la placa que se está sondeando, generalmente tomará de 2 a 4 horas restablecer el gradiente de oxígeno y comenzar a medir un OCR preciso.
    14. Una vez obtenidos los datos, se resta el OCR de referencia para cada pocillo del OCR después de aplicar la condición experimental, para determinar el OCR Delta desencadenado por el tratamiento.
    15. Una vez finalizado el experimento, esterilice y reutilice la tapa de detección (que se puede reutilizar de 3 a 5 veces, aunque el rendimiento se degrada con el uso repetido). Para esterilizar la tapa de detección, sumerja toda la tapa en etanol al 70% durante 10 minutos en una campana de cultivo celular, luego retírela de la inmersión y descanse en el gabinete con la sonda hacia arriba (evite tocar las delicadas puntas de la sonda), y deje que el etanol y el agua se evaporen por completo antes de colocar la tapa de detección en una nueva placa receptora de 96 pocillos.
  3. Tome imágenes de campo claro para normalizar los valores de OCR al número de celda.
    NOTA: La acumulación de melanina en el EPR facilita la normalización del OCR basado en un simple recuento del número de células en cultivos vivos utilizando un microscopio de campo claro.
    1. Retire el dispositivo y colóquelo boca abajo, como en el paso 1.2.8. En la cubierta de cultivo celular, cambie la tapa de detección de la placa de cultivo RPE por una tapa estándar de 96 pocillos.
    2. Usando un microscopio invertido estándar, tome imágenes de campo claro de cada pocillo.
      NOTA: Mantenga las imágenes del área uno consistentes entre los pocillos (ubicación relativa en el pozo y aumento del objetivo).
    3. En la cubierta de cultivo celular, reemplace la tapa estándar de 96 pocillos en la placa de cultivo RPE con la tapa de detección y vuelva a colocarla en la incubadora para un monitoreo adicional.
    4. Cuente el número de celda en cada pocillo con ImageJ u otro software.
    5. Normalizar el OCR al número de células en los diferentes grupos experimentales. El sistema informa el OCR en unidades de fmol∙(mm2)-1∙s-1-el consumo por unidad de área de sección transversal. Por lo tanto, para normalizar el OCR por celda, divida el OCR por el recuento de células pormm 2 (en lugar del recuento de células por pocillo). De manera equivalente, multiplique el OCR reportado por el sistema por el área de la sección transversal del pozo (alrededor de 31mm2 para una placa estándar de 96 pocillos) para obtener OCR en unidades de fmol∙s-1∙pozo-1.
  4. Controles para la determinación de los parámetros bioenergéticos del EPR.
    NOTA: Para garantizar que el sistema y los cultivos de RPE respondan a las manipulaciones mitocondriales de manera predecible, se pueden probar ciertas moléculas pequeñas bien establecidas para dirigirse a pasos particulares de la fosforilación oxidativa mitocondrial. Estas pruebas son análogas a los pasos realizados en una prueba de esfuerzo mitocondrial utilizando el Seahorse Analyzer10 y proporcionan un perfil bioenergético para cultivos de EPR.
    1. Cultive células de EPR en 65 μL de medio de cultivo de EPR estándar con 5% de FBS y mida el OCR durante 24 h para establecer una línea de base.
    2. Aspire el medio de cultivo y agregue 65 μL de medio de cultivo RPE estándar con 5% de FBS y con desacoplantes mitocondriales (3 μM de cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidrazona [FCCP] o 500 nM Bam15, Tabla de Materiales). Incubar durante la noche.
      NOTA: Los desacopladores mitocondriales deberían aumentar significativamente el OCR. Asegúrese de que el OCR aumentado no esté en o cerca del OCR máximo teórico limitado por difusión de aproximadamente 275 fmol∙(mm2)-1∙s-1 para 65 μL de medio en condiciones de cultivo estándar. El OCR máximo para los diferentes volúmenes de medios de uso común está disponible en la sección Discusión.
    3. Después de la incubación durante la noche, aspire el medio con desacopladores mitocondriales y reemplácelo con 65 μL de medio de cultivo RPE estándar con FBS al 5%. Observe la placa durante otras 24 h para determinar la recuperación de RPE OCR después de la retirada de los fármacos.
    4. Calcular los efectos de los desacopladores sobre el OCR restando el OCR obtenido después del tratamiento del OCR obtenido antes del tratamiento (Figura 3).
      NOTA: El aumento de la OCR con la adición de desacopladores mitocondriales significa la reserva de capacidad respiratoria mitocondrial de la célula19.
    5. Para medir otros parámetros mitocondriales típicamente capturados durante la prueba de esfuerzo mitocondrial con un analizador de caballitos de mar, realice los mismos pasos anteriores con los siguientes compuestos (Figura 4).
      1. Utilice oligomicina a 1 μM para evaluar la respiración ligada a ATP.
      2. Use antimicina A y rotenona a 1 μM para evaluar cualquier respiración no mitocondrial.
        NOTA: El FCCP, la oligomicina, la antimicina A y la rotenona pueden ser tóxicos para el EPR. Si inducen una muerte celular significativa, entonces las mediciones de OCR no serán precisas. Por lo tanto, las mediciones de OCR deben obtenerse solo en un momento en el que no haya una muerte celular evidente, generalmente dentro de las primeras horas después de la adición de los fármacos (Figura 4).

2. Medición de los cambios en el metabolismo mitocondrial en EPR sometidos a EMT

  1. Siga el mismo protocolo que se describe en la sección 1.2.
  2. Para inducir EMT después de obtener mediciones de OCR de referencia, agregue TGF-β2 (10 ng/mL) a los cultivos de RPE y controle el OCR durante 3 semanas. Refresque los medios con TGFβ2 nuevo cada 2-3 días (Figura 5).
  3. Al menos 2 veces por semana, obtenga imágenes de campo claro como en la sección 1.3 para asegurarse de que el recuento de células no cambie. Si el recuento cambia, normalice los valores de OCR al número de celda de cada pocillo.
    NOTA: El mismo protocolo se puede utilizar para otros inductores de EMT para monitorear los cambios de OCR a largo plazo durante todo el período de cultivo mientras las células están en la incubadora.

3. Medición de los cambios en el metabolismo mitocondrial en el EPR hipóxico

NOTA: La aplicación del sistema en condiciones hipóxicas, normóxicas o hiperóxicas es la misma que en la sección 1.2, excepto por mantener el "sándwich" en una cámara de hipoxia (Tabla de Materiales) colocada en una incubadora de cultivo celular estándar.

  1. Taladre un orificio en la tapa de la cámara de hipoxia para montar el cable USB tipo c y séllelo con silicona o masilla (Figura 6A).
  2. Ensamble la tapa de detección con la placa de cultivo celular en la campana y transfiéralas a la cámara de hipoxia.
  3. Coloque el "sándwich" (placa, tapa de detección, dispositivo) en la cámara de hipoxia. También coloque en la cámara de hipoxia una placa de Petri con agua estéril para ayudar a mantener la humedad. Por último, coloque un sensor portátil deO2 en la cámara de hipoxia (Tabla de Materiales). La configuración se muestra en la Figura 6A.
  4. Selle la cámara y conéctela a un cilindro de gas con una concentración hipóxica deO2 y una concentración estándar de cultivo celular de CO2 (por ejemplo, 1% deO2 y 5% de CO2).
  5. Intercambie lentamente el aire en la cámara de hipoxia con el aire 1% O2/5% CO2 en el cilindro hasta que el sensor de oxígeno muestre la concentración deO2 deseada, generalmente entre 1% y 10%.
    NOTA: El sensor portátil deO2 requiere tiempo para equilibrarse, por lo que el gas del cilindro debe agregarse lentamente a la cámara de hipoxia.
  6. Cierre las válvulas de entrada y salida de la cámara de hipoxia y transfiera toda la cámara a la incubadora.
  7. Configure e inicie el experimento como se indica en la sección 1.2.
    NOTA: El preequilibrio de los medios en la cámara de hipoxia antes de agregarlos a las células puede disminuir el tiempo que tarda la monocapa celular en experimentar una verdadera hipoxia (Figura 6B).

4. Cálculo de la concentración deO2 en la monocapa de RPE para determinar si las células están en condiciones hipóxicas, normóxicas o hiperóxicas

NOTA: El sistema mide la concentración deO2 entre aproximadamente 1 a 1,5 mm por encima del fondo del pocillo de forma predeterminada, suponiendo que se utiliza una placa estándar con la tapa de detección recomendada correspondiente para el cultivo monocapa (consulte https://lucidsci.com/docs/LucidScientific_Sensing_Lid_Selection_Guide.pdf). Si bien la concentración de O2 en la monocapa celular no se mide directamente, los datos del sistema se pueden utilizar para estimar la concentración de O2 a nivel del EPR. Específicamente, sabiendo que existe un gradiente de oxígeno entre la parte superior de la columna de medios, donde O2 está disponible, y la parte inferior de la columna de medios, donde se consumeO2 , las Leyes de Difusión de Fick se pueden combinar con la tasa de OCR medida para extrapolar los niveles de O2 en la monocapa celular. Una calculadora para esta estimación se proporciona en línea: https://lucidsci.com/notes?entry=oxygen_diffusion (y en forma de un cuaderno interactivo de código abierto en https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture, el código fuente de esta calculadora se puede encontrar en https://github.com/lucidsci/oxygen-diffusion-calculator).

  1. Una vez que haya accedido a la calculadora, ingrese el volumen del medio en microlitros (por ejemplo, 100 μL).
  2. Introduzca la concentración de oxígeno saturado en la interfaz aire-líquido (la parte superior de la columna de medios por encima de las células). Este valor es de ~185 μM a presión atmosférica estándar con 5% deO2 y 95% de humedad.
    NOTA: Esto también se puede determinar a partir de mediciones de O2 mediante sondas del sistema en pozos de solo medios (sin celdas en el fondo del pozo).
  3. En la entrada Flux, introduzca el Flux/OCR informado por el sistema.
  4. Sobre la base de estos valores, se calcula la concentración de oxígeno en estado estacionario a cada altura en la columna de medios y se muestra en el gráfico (Figura 7). El eje x de la parcela es la altura en mm sobre el fondo del pozo. El eje Y es la concentración de O2 calculada a esa altura (en μM).
  5. La concentración de O2 en el fondo del pocillo (donde están las celdas) se informa en la línea debajo de la parcela.
    NOTA: En general, se estima que el RPE in vivo tiene una concentración deO2 del 4-9%. Cada 10 μM deO2 en condiciones atmosféricas normales corresponde aproximadamente a un 1% deO2. Por lo tanto, la normoxia a nivel de las células es de aproximadamente 40-90 μM deO2. Cuanto más alta sea la columna de medios, menor será el O2 al nivel de la monocapa RPE9. Por lo tanto, si las células parecen estar en condiciones hipóxicas, se puede reducir el volumen del medio. Si las células parecen estar en condiciones hiperóxicas, se puede aumentar el volumen del medio.

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Resultados

La configuración del "sándwich" para el experimento Resipher se muestra en la Figura 2A. Las tapas de detección con 32 sondas correspondientes a las columnas 3, 4, 9 y 10 de la placa de 96 pocillos se encuentran entre la placa de la celda y el dispositivo. Después de conectarse al Hub, el dispositivo activa los motores para mover la tapa de detección hacia arriba y hacia abajo, midiendo la concentración de O2 en la columna de medios a un rango de alturas por encima de la monocapa ...

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Discusión

El metabolismo mitocondrial del EPR desempeña un papel fundamental en la patogénesis de las enfermedades comunes de la retina que causan ceguera, como la DMAE y la RVP. El modelado del metabolismo mitocondrial del EPR in vitro permite aislar su estado metabólico del de los tejidos circundantes, además de someter al tejido a diferentes agresiones que simulan la enfermedad de forma controlada. Este modelado in vitro del metabolismo mitocondrial del EPR se ha visto facilitado por el advenimiento de cultivo...

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Divulgaciones

Richard A. Bryan y Kin Lo son empleados de Lucid Scientific, que fabrica el sistema Resipher.

Agradecimientos

Agradecemos a los Dres. Daniel Hass y Jim Hurley por la idea de probar la solubilidad delO2 en medios nuevos frente a medios condicionados como control. Agradecemos a la Dra. Magali Saint-Geniez por su aporte editorial sobre el manuscrito. Agradecemos a Scott Szalay de Instrument and Electronic Services Core, Kellogg Eye Center, por adaptar la cámara de hipoxia con el cable USB Resipher. No se utilizaron fondos federales para la investigación de HFT. El Núcleo de Servicios Electrónicos cuenta con el apoyo de la EY007003 P30 del Instituto Nacional del Ojo. Este trabajo cuenta con el apoyo de una subvención departamental sin restricciones de Investigación para Prevenir la Ceguera (RPB). J.M.L.M. cuenta con el apoyo de la Iniciativa James Grosfeld para la Degeneración Macular Relacionada con la Edad Seca, la Fundación E. Matilda Ziegler para Ciegos, una subvención del banco de ojos Eversight, una subvención K08EY033420 del Instituto Nacional del Ojo y el apoyo de Dee y Dickson Brown, así como de la Fundación David y Lisa Drews Discovering Hope. D.Y.S. cuenta con el apoyo del Programa Scientia de la UNSW. L.A.K. cuenta con el apoyo del Premio Iraty, Monte J. Wallace, Michel Plantevin, una beca R01EY027739 del Instituto Nacional del Ojo y el VR220059 de Actividad de Adquisición de Investigación Médica del Ejército del Departamento de Defensa.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.25% Tripsina-EDTAGibco#25-200-056
3,3',5-triyodo-L-tironina sal sódicaSigmaT5516
32 canales Tapa ResipherLucid ScientificNS32-101A para Falcon
Antimicina A de streptomyces sp.SigmaA8674-25MGInhibidor del Complejo III de la cadena de transporte de electrones
BAM15SigmaSML1760-5MGAgente de desacoplamiento para aumentar la respiración mitocondrial
DMSO, grado de cultivo celularSigma-aldrichD4540-100MLVehículo para la reconstitución de fármacos mitocondriales
Sustratos de recubrimiento de matriz extracelular:
Synthemax II-SC		Corning#3535Matriz extracelular para hfRPE
Sustratos de recubrimiento de matriz extracelular: VitronectinaGibcoA14700Matriz extracelular para iPSC-RPE
FCCPSigmaC2920-10MGAgente de desacoplamiento para aumentar la respiración mitocondrial
Suero fetal bovino (Bio-Techne S11550H)Bio-TechneS11550H
Hidrocortisona-CiclodextrinaSigmaH0396
Cámara de hipoxiaEmbrient Inc.MIC-101
N1 Suplemento de mediosSigmaN6530
Solución de aminoácidos no esencialesGibco11140050
sensor de O2Tecnología Sensit o Detectores forensesP100 o FD-90A-O2
Penicilina-estreptomicinaGibco15140-122
TGF humano recombinante y beta; 2Peprotech100-35BFactor de crecimiento transformante beta-2 para inducir la transición epitelio-mesenquimal
RotenonaSigmaR8875-1GInhibidor del complejo I de la cadena de transporte de electrones
Placa compatibleCorning#353072
TaurinaSigmaT8691
α MEM (Modificación Alfa de los Medios de Eagle)Corning15-012-CV
con el sistema

Referencias

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