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Artículo de método

Miniscopio que registra señales de calcio en el hipocampo de ratones que navegan por una columna de olor

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DOI:

10.3791/67039

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20 de septiembre de 2024

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1Department of Cell and Developmental Biology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Neurotechnology Center, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Bioengineering, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 4Civil, Environmental & Architectural Engineering, University of Colorado, 5Neuroscience Graduate Program, University of Colorado Anschutz Medical Campus

En este artículo

Resumen

Este protocolo investiga la relación cerebro-comportamiento en el hipocampo CA1 en ratones que navegan por una columna de olor. Proporcionamos un protocolo paso a paso, que incluye cirugía para acceder a imágenes del hipocampo, entrenamiento conductual, registro y procesamiento del cerebro con miniscopio GCaMP6f, y datos de comportamiento para decodificar la posición del ratón a partir de la actividad neuronal ROI.

Resumen

Los ratones navegan por una columna de olor con una compleja estructura espacio-temporal en la oscuridad para encontrar la fuente de los odorantes. Este artículo describe un protocolo para monitorear el comportamiento y registrar transitorios de Ca2+ en neuronas piramidales del estrato CA1 dorsal en el hipocampo (dCA1) en ratones que navegan por una columna de olor en una arena de olor de 50 cm x 50 cm x 25 cm. Un miniscopio de epifluorescencia enfocado a través de una lente de índice de gradiente (GRIN) obtuvo imágenes de transitorios de Ca2+ en neuronas dCA1 que expresan el sensor de calcio GCaMP6f en ratones Thy1-GCaMP6f. El artículo describe el protocolo de comportamiento para entrenar a los ratones para realizar esta tarea de navegación de la pluma de olor en un campo de olor automatizado. Los métodos incluyen un procedimiento paso a paso para la cirugía para la implantación de lentes GRIN y la colocación de la placa base para la obtención de imágenes GCaMP6f en CA1. El artículo proporciona información sobre el seguimiento en tiempo real de la posición del ratón para automatizar el inicio de las pruebas y la entrega de una recompensa de agua. Además, el protocolo incluye información sobre el uso de una placa de interfaz para sincronizar metadatos que describen la automatización de la tarea de navegación de olores y los tiempos de fotogramas para el miniscopio y una cámara digital que rastrea la posición del ratón. Además, los métodos delinean la tubería utilizada para procesar las películas de fluorescencia GCaMP6f mediante corrección de movimiento utilizando el algoritmo NorMCorre seguido de la identificación de regiones de interés con EXTRACT. Finalmente, el artículo describe un enfoque de red neuronal artificial para decodificar rutas espaciales de la actividad del conjunto neuronal CA1 para predecir la navegación del ratón por la columna de olor.

Introducción

Aunque se han logrado avances significativos en la comprensión de los circuitos neuronales involucrados en la navegación olfativa en ratones con cabeza fija 1,2,3 y las estrategias de navegación en ratones que se mueven libremente 4,5,6,7,8, aún se desconoce el papel de los circuitos neuronales en la navegación etológicamente relevante de las columnas de olor turbulentas. Este artículo describe el monitoreo de la actividad neuronal mediante la obtención de imágenes de transitorios de Ca2+ en células que expresan el sensor de calcio codificado genéticamente GCaMP6f en ratones Thy1-GCaMP6f9 para estudiar si la dinámica neuronal secuencial de las neuronas piramidales del estrato CA1 dorsal en el hipocampo (dCA1) desempeña un papel en la navegación de la pluma odorífera. Los métodos proporcionan información sobre la fluorescencia GCaMP6f obtenida a través de un microscopio de epifluorescencia en miniatura enfocado a través de una lente GRIN en dCA1 10,11,12. Los métodos explican cómo monitorear simultáneamente la navegación espacial y los transitorios de calcio de la neurona dCA1 GCaMP6f en ratones que realizaban una tarea de navegación de penacho de olor en la que recibían una recompensa de agua cuando llegaban al pico entregando un odorante en una arena de olor con un flujo de aire laminar de fondo13,14. En este artículo se describen los métodos necesarios para lograr esta tarea (Figura 1), incluyendo la cirugía estereotáxica para la implantación de lentes de índice de gradiente (GRIN), la colocación de una placa base para asegurar el miniscopio al cráneo en un ratón que se mueve libremente, la obtención de imágenes con el microscopio en miniatura y el seguimiento del movimiento del ratón con una cámara digital de alta velocidad, el preprocesamiento de datos para la eliminación de artefactos de movimiento y la búsqueda de las regiones de interés (ROI), y la preparación de conjuntos de datos y el entrenamiento y la predicción de redes neuronales artificiales para decodificar las posiciones X e Y del ratón en el ámbito de los olores a partir de los cambios en la fluorescencia en los ROI de dCA17.

El registro en miniscopio de las señales de calcio en la región CA1 del hipocampo de los ratones que navegan por una columna de olor es relevante para comprender el cálculo de los circuitos neuronales involucrados con el olfato y la información espacial en la compleja tarea de comportamiento de la navegación de la pluma de olor 2,14,15,16. La región CA1 del hipocampo desempeña un papel en la navegación espacial y es crucial para crear un mapa cognitivo del entorno para una navegación eficiente17,18. El registro de señales de calcio con un miniscopio es una forma valiosa de investigar las neuronas CA1 que codifican la información espacial durante la navegación de la pluma de olor.

Esta técnica combina las ventajas de la tecnología de miniscopio para registrar las señales de calcio GCaMP con el papel bien establecido del hipocampo CA1 en la navegación espacial para comprender mejor cómo los circuitos neuronales impulsan comportamientoscomplejos. Alternativamente, los enfoques que utilizan microscopía de 2 fotones pueden registrar las neuronas CA1 9,20, lo que requiere un ratón con la cabeza fija y restringe la posibilidad de moverse libremente para navegar por una columna de olor21. Los registros electrofisiológicos de campo local de las neuronas CA1 permiten la investigación de ratones que se mueven libremente navegando por las columnas de olor22. Aun así, las señales eléctricas de campo local imponen limitaciones para estimar el disparo intracelular mediante el aislamiento de señales de una sola unidad mediante técnicas de clasificación de picos. Las señales de miniscopio permiten identificar las ROIs asociadas directamente con las señales de calcio intracelular de forma fiable10,11 para investigar con precisión los cálculos neuronales a resolución de una sola célula. La tecnología de miniscopio ofrece una oportunidad única para comprender mejor cómo la región CA1 codifica la información espacial en función de las señales de olor.

Además, esta técnica investiga cómo poblaciones neuronales específicas procesan la información de olor para la navegación y la relación entre los patrones de actividad neuronal y la toma de decisiones durante el seguimiento de la pluma de olor. Este método puede contribuir a una mejor comprensión de cómo el cerebro procesa el olor y la información espacial. Si bien los miniscopios ofrecen una resolución de una sola celda para registrar el cerebro de un ratón que se mueve libremente, requieren cirugía especializada y experiencia en análisis de datos. En este artículo, proporcionamos un protocolo integral para ayudar a los investigadores a realizar cada paso para investigar los mecanismos neuronales de la navegación entre el olor y la pluma.

La tarea de navegación por olores es un marco prometedor para estudiar la codificación neuronal y la memoria espacial de señales de olores en ratones. Los hallazgos del artículo indican que es posible decodificar la trayectoria del ratón navegando por una columna de olor a partir de las señales de calcio del conjunto neuronal en dCA1. Comprender el papel de las señales de calcio dCA1 en la navegación de la pluma de olor es un paso crucial para descifrar la base del circuito neuronal para la navegación guiada por olores en entornos realistas13,14.

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Protocolo

Los estudios se llevaron a cabo en ratones transgénicos machos y hembras de 3-6 meses de edad Thy1-GCaMP6f23. Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Campus Médico Anschutz de la Universidad de Colorado de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud. Los procedimientos quirúrgicos para el implante de lentes GRIN (Sección 1) y la colocación de la placa base (Sección 2) se adaptaron de trabajos previos 9,24,25,26,27,28,29.

1. Cirugía estereotáxica para implantar una lente GRIN implante en el hipocampo

  1. Use guantes estériles, una cubierta para la cabeza, una mascarilla quirúrgica y una bata de laboratorio.
  2. Use condiciones estériles durante todas las cirugías de supervivencia. Esterilizar todo el equipo quirúrgico en autoclave.
  3. Coloque paños estériles alrededor del área quirúrgica.
  4. Anestesiar al ratón colocándolo en la cámara de inducción con isoflurano al 3% durante 10 min. Inyectar Buprenorfina Base en Polímero a 0,001 mg/g por vía subcutánea en el momento de la inducción anestésica.
  5. Compruebe si el ratón deja de moverse y está bajo anestesia profunda, confirmada pellizcando la pata trasera para probar el reflejo de la pata trasera.
  6. Cambiar el flujo de isoflurano al cono de la nariz (Ficha Suplementaria 1).
  7. Asegúrese de que el sistema de anestesia de isoflurano de bajo flujo para ratones (Tabla de materiales) tenga la almohadilla de temperatura configurada en configuraciones homeotérmicas y asegúrese de que la fuente de vapor esté configurada para comprimir externamente.
  8. Colocar el ratón anestesiado en el instrumento estereotáxico digital (Tabla de Materiales). Coloque los dientes frontales del ratón en la barra de mordida y coloque el cono de la nariz delante de la nariz para asegurar el flujo de isoflurano y bloquear la cabeza en su lugar. Ajuste el nivel de anestesia entre 2% y 3% según el reflejo de la pata después de pellizcar (Figura 2A).
  9. Coloque las barras de ratón en las orejas y apriételas. Asegúrese de que la cabeza del mouse esté horizontal y no se mueva de lado a lado o de arriba a abajo. Cuando la cabeza esté asegurada, asegúrese de que presionar ligeramente hacia abajo sobre el cráneo no haga que el cráneo se deslice por debajo de las barras de la cabeza.
  10. Coloque la sonda de temperatura en el recto y pegue el cable en la cola del mouse para evitar movimientos. Ajuste la temperatura de la almohadilla para mantener la temperatura rectal a 37 °C.
  11. Agregue ungüento oftálmico a los ojos para evitar que el aire se seque al aire de manera dañina.
  12. Afeitar el pelo cuando la cabeza esté fija y bajo el flujo de isoflurano proporcionado por el cono de la nariz para evitar el movimiento. Afeita el vello por encima de la cabeza con una afeitadora eléctrica, luego limpia los pelos restantes con un removedor de vello y aplicadores estériles de madera con punta de algodón (Figura 2B).
  13. Haga que el campo quirúrgico sea estéril frotando el cuero cabelludo con un aplicador de madera estéril con punta de algodón con etanol y betadine tres veces cada uno.
  14. Inyecte 0,1 mL del anestésico local lidocaína por vía subcutánea (S.Q.) debajo de la piel entre los ojos y los oídos con una aguja de 29 G. Esto hará una burbuja. Espere unos minutos antes de cortar la piel con unas tijeras.
  15. Usando una técnica de solo puntas, jale la piel hacia arriba con cuidado con pinzas y use un par de tijeras pequeñas para quitar una parte circular de la piel. Absorba la sangre con un hisopo de algodón estéril.
  16. Una vez que se detenga el sangrado, limpie el cráneo con peróxido de hidrógeno (5%) con un hisopo de algodón estéril. Asegúrese de que los puntos de referencia óseos, incluida la sutura sagital y la intersección de la sutura bregmática para marcar el bregma, sean fáciles de identificar después de este procedimiento.
  17. Confirme que el cráneo es plano en relación con el aparato estereotáxico asegurándose de que las suturas de bregma y lambda estén exactamente en la misma coordenada Z. Realice esto colocando una aguja en el brazo del manipulador y verificando si la punta de una aguja está en la misma coordenada Z al tocar ambas suturas. De lo contrario, ajuste el ángulo de la cabeza moviendo la barra de mordida en la placa Z y repitiendo el procedimiento hasta que la habilidad esté en una posición plana.
  18. Conecte una pipeta al micromanipulador que sostiene una aguja para aplicar la tinta del tatuaje. Haz una marca en la parte superior del bregma.
  19. Ponga a cero las coordenadas del micromanipulador en el bregma y muévase a la coordenada superior a CA1 en el hipocampo derecho (medio-lateral +1,8 mm desde el bregma, antero-posterior -2,4 mm desde el bregma)2. Esta es la ubicación elegida por Radvansky y Dombeck para estudiar la navegación virtual del gradiente de olor en ratones18,30. Taladre con cuidado una pequeña abolladura permanente de 1 mm de diámetro con un taladro (Tabla de materiales) a 10000 rotaciones para hacer una abolladura permanente en la parte superior de la ubicación objetivo (Figura 2C).
  20. Utilice el taladro dental para abrir una perforación circular de 1,5 mm de diámetro para permitir la implantación de una lente GRIN de 1 mm de diámetro y 4 mm de longitud en el cerebro (Tabla de materiales) (Figura 2D).
  21. Perfore la duramadre y la corteza insertando una aguja de 23 g en el centro del orificio y moviendo la aguja hacia el cerebro lentamente (~0,1 mm/min) hasta que alcance una profundidad de 1,25 mm por debajo de la duramadre. Retire la aguja lentamente del cerebro (~0,1 mm/min). Use hisopos de algodón estériles y solución salina para limpiar la sangre.
  22. Utilice un soporte de lentes GRIN de UCLA hecho a medida construido con dos puntas de micropipeta de 1 ml cortadas para encajar entre sí (soporte de lentes GRIN, Tabla de materiales) (Figura 2E, F).
    1. Conecte el soporte de la lente GRIN al micromanipulador y encienda el aspirador conectado a la pipeta para sujetar la lente GRIN. La presión del aire producida por la succión de aire mantiene la lente GRIN en su lugar.
    2. Utilice una lente GRIN de 4 mm de longitud y 1 mm de diámetro. Implante la lente GRIN lentamente en la corteza hasta que alcance una profundidad de -1,25 mm por debajo de la duramadre.
  23. Coloque una gota de adhesivo de tejido líquido (Tabla de materiales) en la perforación circular del cráneo para sellar el orificio. Espere unos minutos para que se seque.
  24. Preparar cemento adhesivo rápido -resina de metacrilato biocompatible- (Tabla de Materiales) sobre la base de la lente GRIN para sellarla permanentemente en el cráneo. Espera unos minutos y déjalo secar.
  25. Apague el aspirador para soltar y retire lentamente el soporte de la lente GRIN de la parte superior de la lente GRIN que en este punto está permanentemente unido al cráneo.
  26. Coloque la barra de la cabeza en la parte superior del cráneo, centrando el orificio en la lente GRIN (Figura 2G-I) (Archivo Suplementario 2 y Archivo Suplementario 3).
  27. Coloque con cuidado cemento adhesivo de secado rápido (Tabla de Materiales) alrededor de la base de la lente GRIN para sellar la ventana craneal y fijar la barra de la cabeza al cráneo. Coloque cemento adhesivo de secado (Tabla de Materiales) en el centro de la barra de cabeza y en los lados para mantenerlo firmemente sujeto al cráneo. Asegúrate de que esté completamente seco. Asegúrese de que no se coloque cemento adhesivo encima de la lente GRIN; de lo contrario, degradará permanentemente la ruta óptica y bloqueará la imagen.
  28. Coloque una gota de adhesivo de silicona de baja toxicidad (Tabla de materiales) encima de la lente GRIN para protegerla de daños físicos.
  29. Apague el isoflurano
  30. Realizar un seguimiento inmediato de los cuidados postoperatorios hasta que el animal despierte de la anestesia.
    1. Tome cuidados postoperatorios hasta la recuperación completa de la cirugía monitoreando a los ratones para detectar signos de dolor. No devuelva el animal que ha sido sometido a una cirugía en compañía de otros animales.
    2. Observe brevemente el movimiento alrededor de la jaula, comiendo y bebiendo, y las reacciones normales a la manipulación para asegurarse de que no estén bajo dolor o estrés.
    3. Si los animales muestran signos de daño neurológico o tisular grave, eutanasia humanitaria de inmediato.

2. Colocación de la placa base para el miniscopio

NOTA: Los procedimientos para fijar la cabeza del ratón comienzan 2 semanas después de que el animal se recupera completamente de la cirugía. El procedimiento para obtener imágenes de dCA1 comienza 3 semanas después de la cirugía, una vez que el animal se recupera por completo y la señal de GCaMP6f se vuelve muy visible. Se fija una placa base en la parte superior de la lente GRIN para el acceso óptico de la fluorescencia dCA1 GCaMP6f a través de la lente GRIN mediante un miniscopio. Este protocolo utilizó el miniscopio versión 4 -V4 (Miniscope V4; Tabla de Materiales).

  1. Comience a fijar la cabeza del mouse durante 10 minutos asegurando la barra de la cabeza con pinzas de pellizco para aclimatar el mouse a la fijación de la cabeza 2 semanas después de la cirugía.
  2. Fije la cabeza del ratón 3 semanas después de la cirugía para la colocación de la placa base.
  3. Conecte un miniscopio a un soporte impreso en 3D conectado a un micromanipulador (Tabla de materiales) conectado a un micromanipulador (Figura 3A, B).
  4. Retire con cuidado el adhesivo de silicona (Tabla de materiales) de la parte superior de la lente con pinzas finas y limpie la superficie de la lente GRIN con una toallita para lentes.
  5. Asegure la placa base conectada al miniscopio apretando el tornillo de fijación en el costado de la placa base (Tabla de materiales) (Figura 3C, D).
  6. Mueva el extremo del miniscopio hasta alcanzar 100 μm por encima de la lente GRIN.
  7. Utilice los controles deslizantes para configurar los ajustes del miniscopio en el software del miniscopio (Tabla de materiales) siguiendo los pasos 2.8 a 2.10.
  8. Haga clic en el control deslizante de energía en el software para controlar la potencia y mantenerla alrededor del 10%.
  9. Haga clic en el control deslizante Tasa de adquisición y manténgalo alrededor de 10 Hz.
  10. El miniscopio v4 tiene una lente electrohumectante que se puede utilizar para un enfoque fino. Haga clic en el control deslizante de enfoque para establecerlo al 50% para mantener la lente electrohumectante en el medio del rango focal.
  11. Utilice el software para ver la parte superior de la lente GRIN. Es posible ver la forma circular de la lente GRIN en la pantalla.
  12. Acerque el miniscopio a la lente GRIN ajustando la posición axial con el micromanipulador y controle la imagen con el ordenador.
    1. Una vez que la parte superior de la lente GRIN sea visible, use el enfoque fino hacia arriba y hacia abajo en el micromanipulador para alcanzar el mejor plano focal para visualizar los destellos celulares. Utilice la configuración pseudo δF/F0 en el software para verificar la calidad de los parpadeos de celdas.
    2. Ajuste el enfoque para permitir el número máximo de células en el campo de visión con la mayor intensidad de fluorescencia posible. En este punto, asegúrese de que los vasos sanguíneos estén enfocados.
  13. Puede suceder que un ratón no tenga señales transitorias de calcio -destellos. En este caso, evite los siguientes pasos (14-16) y vuelva a verificar el ratón en las próximas semanas para comprobar si se producen las señales transitorias de calcio.
    NOTA: Se puede tomar la decisión de sacrificar al ratón si las señales transitorias de calcio nunca ocurren 2 meses después de la cirugía.
  14. Una vez que se optimice el enfoque, construya con cuidado una pared de cemento adhesivo rápido entre el cráneo y la parte inferior de la placa base. Tenga cuidado de no cementar el miniscopio en la placa base y tenga mucho cuidado de que no caiga cemento en la parte superior de la lente GRIN.
  15. Una vez que el cemento esté seco, retire el tornillo de fijación y retire con cuidado el miniscopio de la placa base con el micromanipulador.
  16. Utilice la cubierta de la placa base para proteger la lente GRIN.

3. Construcción de la arena de olores

NOTA: Este método delinea un campo de olores automatizado basado en el diseño de Connor et al.13 y Gumaste et al.14. El montaje completo se puede encontrar en el enlace proporcionado en la Tabla de Materiales (Archivo Complementario 4).

  1. Construya una cámara con dimensiones de 50 cm (largo) x 50 cm (ancho) x 25 cm (alto) con 2 paredes acrílicas, un techo acrílico, un piso de cloruro de polivinilo expandido (PVC) blanco y 2 paredes únicas en la parte delantera y trasera que faciliten el flujo de aire (Figura 4A).
  2. Instale un extremo de succión de aire en la parte trasera de la arena con un diseño cónico y un ventilador de computadora conectado para extraer el aire de la cámara. Use una perilla física para configurar la modulación de ancho de pulso (PWM) del ventilador para regular la tasa de flujo de aire.
    NOTA: Una estructura de panal impresa en 3D comprende paredes para la parte delantera y trasera de la arena de olor para facilitar el flujo laminar de aire mientras se retiene un mouse dentro de10. La pared de nido de abeja en la parte delantera de la arena tiene un destello externo para recibir grandes volúmenes de aire de manera no disruptiva.
  3. Configure un sistema de suministro de agua para entregar agua de recompensa a través de artilugios simples que tengan un motor paso a paso Nema 17 acoplado a una jeringa. Un controlador de micropasos A4988 permite un control preciso del volumen dispensado (https://github.com/dougollerenshaw/syringe_pump, Figura 4B).
  4. Configure el extremo de entrada de aire con 4 conjuntos de fuentes de olor emparejadas con boquillas de suministro de agua, con cada conjunto colocado a 10 cm de distancia a lo largo del eje x para definir los "carriles" a lo largo de los cuales navegará un animal para obtener una recompensa de agua (Figura 4C, D).
  5. Instale un sistema de suministro de olores administrado por válvulas solenoides conectadas a tubos y botellas de odorante (Figura 4D).
    NOTA: Las válvulas se alimentan mediante un tablero de relés en una disposición que garantiza que el aire limpio o el aire odorizado fluyan en todo momento, y que un solo carril o cero carriles puedan recibir aire odorizado en un momento dado. Un conjunto de cinco electroválvulas de 12 V se gestiona mediante una placa de relés que contiene 4 relés. Cuando los 4 relés están en 'apagado', la válvula de aire limpio está abierta de forma predeterminada. Cuando se abre una sola válvula de olor, la válvula de aire limpio se cierra automáticamente. El estado de la placa de relés se gestiona mediante salidas digitales del controlador arduino primario. Una bomba de aire para acuarios de consumo suministra aire que está restringido a 20 mL/min mediante un regulador de flujo de aire manual. Utilizando una serie de tubos y divisores de diámetro interno de 1/16 de pulgada, la línea de suministro suministra aire limpio a cada una de las válvulas solenoides. Las válvulas de retención antes y después del odorante garantizan la dirección del flujo de aire. La línea de aire limpio se fusiona con las líneas de odorantes antes de ingresar a la arena para garantizar que el aire odorizado se purgue cuando las líneas de olor están cerradas.
  6. Instale una cámara digital rápida sobre la arena para monitorear el comportamiento de los animales (Tabla de Materiales).
    NOTA: El comportamiento de los animales se monitorea a 60 Hz utilizando una sola cámara digital rápida montada sobre la arena (Tabla de Materiales). Se montó un objetivo de la serie C de 3,5 mm de longitud focal fija a través de un adaptador de montura C/CS, capaz de capturar todo el campo (objetivo focal, tabla de materiales).
  7. Utilice un código python personalizado para administrar el hardware de la arena de olor (Tabla de materiales). El software integra la cámara y todo el hardware necesario para la configuración de los parámetros experimentales y la adquisición de datos experimentales (Tabla de Materiales).
  8. Configure una PC conectada a una placa de desarrollo Teensy 4.0 para proporcionar los medios para la entrega de olor y agua mediada por computadora (Odor Arena Hardware and Software, Table of Materials).
  9. Configure la cámara digital para exportar una señal de reloj al grabar fotogramas de vídeo. La señal se utiliza para la sincronización post-hoc con el miniscopio mediante una placa de interfaz USB (Tabla de Materiales), que registra las señales de sincronización de ambos sistemas.
    NOTA: Durante un experimento, el software de adquisición personalizado también crea un archivo de eventos que contiene los eventos experimentales importantes y el fotograma de la cámara en el que se produjo el evento. También se crea un archivo de marcas de tiempo para identificar cualquier fotograma caído, un evento raro (Odor Arena Software, Tabla de Materiales).

4. Medición de la velocidad del aire de la pluma con un detector de fotoionización (PID) (Figura 5)

NOTA: Este método detecta el curso temporal de la columna de olor a través de un PID que expone el odorante gaseoso a una luz ultravioleta de alta intensidad que ioniza las moléculas odorizantes. La salida del dispositivo detecta moléculas odoríferas en la pluma de olor. Esta técnica permite la estimación de la velocidad del aire en el campo de olores comparando el retardo para detectar la presencia de odorantes que viajan a través de dos lugares utilizando el PID.

  1. Coloque un PID en miniatura de respuesta rápida a dos distancias diferentes. Un lugar está cerca y otro lejos -10 cm- de la fuente del olor.
  2. Cambie el interruptor GAIN en el panel frontal del controlador PID a la posición x5.
  3. Cambie el interruptor PUMP en el panel frontal del controlador PID a la posición Alta.
  4. Verifique la luz de estado del diodo emisor de luz (LED) que muestra la salida del sensor (voltaje) en el panel frontal del controlador en ausencia de odorantes.
  5. Cambie el potenciómetro OFFSET para poner a cero la salida de voltaje en ausencia de odorantes.
  6. Abra la válvula de olor en la arena de olores.
  7. Mida el retraso en la detección de la columna de olor con el PID en cada ubicación después de abrir la válvula. Este procedimiento se puede realizar fuera de línea registrando simultáneamente la salida del PID y la salida de la válvula registrada por la arena de olor (odor on) con una placa de interfaz (Tabla de materiales).
  8. Divida la diferencia en los retrasos en cada ubicación por la diferencia en la distancia entre los dos PID para calcular la velocidad del aire de la pluma.

5. Ratón de entrenamiento conductual en el campo del olfato (Figura 6)

NOTA: Esta sección describe una tarea conductual adaptada de Findley et al.4. Al ratón se le restringe el agua el día anterior para motivarlo a buscar una recompensa de agua. El ratón navega la columna de olor (Figura 6B) hacia una boquilla de agua ubicada en la fuente de liberación de olor para obtener un refuerzo de agua (3 gotas de 10 μL administradas a 1 Hz). Durante el período de entrenamiento, el ratón se mantiene bajo la restricción de agua al tener acceso a hasta 2 ml al día. El peso corporal del ratón se controla durante el período de restricción de agua y no debe ser inferior al 85% del peso corporal original. El ratón recibe aproximadamente 1 mL de agua por día durante el entrenamiento en la arena de olores y se complementa con 1 mL adicional de agua por día en la jaula después del entrenamiento. El ratón permanece bajo restricción de agua durante un periodo máximo de 72 h. El software personalizado (Table of Materials) detecta la ubicación del ratón en tiempo real (60 Hz) utilizando una sencilla técnica de sustracción de fondo y localización de blobs. El usuario establece manualmente los límites de los carriles, el límite de inicio (la ubicación de inicio del ratón en la parte trasera de la arena) y el límite del objetivo (cerca de la fuente de olor en la parte delantera). Además, el usuario puede decidir cómo el software utiliza estos límites. Por ejemplo, el usuario puede emitir olores solo cuando el mouse está detrás del límite de la casa. Para que el ratón reciba una recompensa, el usuario puede requerir que permanezca dentro del carril odorizado mientras navega hacia el objetivo (la fuente de olor). Una vez que el ratón cruza el límite objetivo, puede recibir una recompensa. Sin embargo, durante el entrenamiento, cualquiera de estos requisitos se ajusta simplemente editando un archivo 'yaml' diseñado para que se explique por sí mismo y sea fácil de usar.

  1. Primero, entrene al ratón para comenzar las pruebas moviéndose a la parte trasera de la arena (definida como la parte de la arena que está a 40 cm del lado donde el aire fluye hacia la cámara). Espere hasta que el mouse vaya a la parte trasera de la arena y luego entregue manualmente el olor y el agua en un carril aleatorio. Deja que el ratón encuentre la fuente y beba el agua.
    1. Repita el procedimiento muchas veces para crear la asociación entre el olor y el agua (Figura 6A, B). Una vez que el ratón aprenda a iniciar las pruebas, utilice el software automatizado para emitir olores.
  2. Entrene al mouse para realizar la tarea de navegación de olores de dos carriles utilizando el software personalizado automatizado. En esta tarea, elija aleatoriamente uno de los dos puertos de olor para entregar olor y refuerce el mouse con agua cuando llegue a la boquilla de agua donde se entrega el odorante. Este protocolo utilizaba el odorante acetato de isoamilo diluido al 1% en aceite mineral.
    NOTA: El ratón completa una sesión de unas 20 pruebas de navegación de la pluma de olor en unos 40 minutos. El ratón realiza una sesión al día. El ratón entrenado logra un porcentaje de navegación correcta por encima de la opción aleatoria al final de la sesión (> un 65% de opciones correctas). El mouse debe alcanzar el criterio de > 65% de opciones correctas en la tarea de navegación de olores de dos carriles después de 3 a 5 sesiones de entrenamiento.

6. Registro de epifluorescencia de un ratón que se mueve libremente en la arena de olor

NOTA: El método describe el registro de la actividad neuronal de las células del estrato piramidal (SP) en la CA1 dorsal mediante la obtención de imágenes del sensor de calcio codificado genéticamente GCaMP6f expresado en ratones Thy19 mediante imágenes de miniscopio de campo amplio durante la tarea de navegación de la pluma de olor de dos picos (Película Suplementaria 1 y Película Suplementaria 2). Una sesión de imagen típica dura 40 minutos, lo que permite al ratón completar aproximadamente 20 pruebas de navegación de olores. Esta técnica graba a un ratón durante varios meses.

  1. Fije el ratón, coloque el miniscopio en la parte superior de la placa base con el micromanipulador y apriete el tornillo de fijación.
  2. Ajuste la lente electrohumectante para encontrar el plano focal óptimo con el mayor número de células con la mayor intensidad de fluorescencia.
  3. Ajuste la potencia del miniscopio para obtener el rango dinámico óptimo con una alta relación señal-ruido sin saturación. Para ello, se obtuvieron imágenes de la CA1 dorsal en ratones Thy1-GCaMP6f con una potencia de miniscopio ajustada en torno al 30% a una tasa de adquisición de 30 Hz.
  4. Suelta el ratón dentro de la arena de olor con el miniscopio conectado a la placa base.
  5. Inicie la adquisición con la placa de interfaz para grabar la salida lógica de transistor-transistor (TTL) de la cámara digital ubicada en la parte superior de la arena y la señal TTL del miniscopio para su posterior sincronización entre fotogramas de video de comportamiento y GCaMP6f. La cámara digital graba a 60 Hz y el miniscopio graba a 30 Hz.
  6. Comience a grabar el miniscopio y las películas de comportamiento y encienda el software automatizado para dos tareas de navegación de olores de la boquilla.

7. Pretratamiento de datos

NOTA: Este método utiliza una canalización de MATLAB para procesar los datos. El código está disponible en GitHub (Software de sincronización, Tabla de materiales). NoRMCorre31 se utiliza para la corrección de movimiento, y EXTRACT32 se utiliza para encontrar los ROI con señales de fluorescencia variables en el tiempo informadas como cambios en la fluorescencia normalizados por fluorescencia entre transitorios de calcio (δF/F0).

  1. Sincronice los metadatos de la arena de olores, los fotogramas de las cámaras digitales y los fotogramas del miniscopio utilizando las señales de sincronización grabadas por la placa de interfaz mediante la ejecución del código de MATLAB Synchronize_Files_JOVE.m, disponible en GitHub.
  2. Realice la corrección de movimiento de los fotogramas sincronizados del miniscopio mediante NoRMCorre (software de corrección de movimiento, tabla de materiales).
  3. Encuentre el retorno de la inversión con señales δF/F0 variables en el tiempo utilizando EXTRACT (software de extracción de ROI, tabla de materiales).
  4. Separar los datos en ensayos (Software de Sincronización, Tabla de Materiales).
  5. Etiquete cada intento como un acierto o un error en función del comportamiento de navegación correcto o incorrecto del mouse, respectivamente.
  6. Utilice Behavior Ensemble and Neural Trajectory Observatory (BENTO)33 para visualizar el comportamiento y el retorno de la inversión de cada ensayo por separado (Figura 7A, B y vídeo complementario 3).

8. Análisis de datos: decodificación de la posición espacial a partir de señales cerebrales

NOTA: Este método utiliza el aprendizaje automático para decodificar las posiciones X e Y del ratón en la arena a partir de los ROI de dCA17. El código de MATLAB está disponible (Decoding Brain Signals Software, Table of Materials) en https://github.com/restrepd/drgMiniscope.

  1. Introduzca el archivo de salida EXTRACT.mat y el archivo de metadatos odor arena en el software drgDecodeOdorArenav2.m. El repositorio de GitHub proporciona estos dos archivos a modo de ejemplo (Software de sincronización, Tabla de materiales):
    dFF_file='20220804_FCM22_withodor_miniscope_sync
    _L1andL4_ncorre_ext.mat';
    arena_file='20220804_FCM22withodor_odorarena_L1
    andL4_sync.mat';
    NOTA: drgDecodeOdorArenav2.m crea un conjunto de datos dividido por datos dentro del ensayo que contienen las señales de ROI y los metadatos (posiciones X e Y del ratón, ubicación de la boquilla de olor, suministro de agua, etc.) para cada ensayo. El código también analiza la decodificación de los datos entre ensayos. El código utiliza fitrnet para entrenar una red neuronal artificial con los datos δF/F0 para todos los ROI de todos los ensayos excepto uno para predecir las posiciones X e Y y predecir la posición del ensayo que se omite mediante un procedimiento de dejar uno fuera.
  2. La red neuronal devuelve las posiciones X e Y como salida. Utilice la red neuronal entrenada para realizar predicciones. La entrada omitió las pruebas que no se utilizaron para entrenar a la red para hacer predicciones de las posiciones X e Y del mouse en la arena a partir de los ROI (Figura 8A, B).

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Resultados

El uso de este procedimiento permite visualizar y registrar los transitorios de fluorescencia de dCA1 GCaMP6f en ratones que navegan por el campo de olores para encontrar la fuente de los odorantes (Figura 6A,B, Película complementaria 1 y Película complementaria 2). Las imágenes de fluorescencia se corrigen por movimiento con NoRMCorre y se utiliza EXTRACT para extraer los ROI. Además, la grabación con una placa de interfaz permite la sincr...

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Discusión

Este protocolo describe meticulosamente los pasos para registrar las células de lugar y las células que responden a los olores en el área dCA1 del hipocampo de los ratones que navegan por una columna de olor. Los pasos críticos del protocolo incluyen la cirugía estereotáxica, la colocación de la placa base del miniscopio, la construcción del área de olor, la comprobación del penacho en la arena de olor, el entrenamiento conductual, la grabación con miniscopio del ratón que se mueve libre...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (NIH UF1 NS116241 y NIH R01 DC000566), y la Fundación Nacional de Ciencias (NSF BCS-1926676). Los autores agradecen a Andrew Scallon por ayudar a establecer la cámara de Odor Arena.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Arduino MicroArduinoMicro
Resina de Metacrilato BiocompatibleParkellS380C& B-Metabond Adhesivo Luting Cemento
Decodificación Señales Cerebrales SoftwareCU Anschutzhttps://github.com/restrepd/drgMiniscope
Taladro dentalOsadaLHP-6AZ210015
Caja de taladros dentalesOsadaXL-23030000 rotaciones por minuto
Instrumento estereotáxico digitalStoelting51730DInstrumento estereotáxico de ratón, #51904 Brazo manipulador digital, 3 ejes, complemento, IZQUIERDA 
BrocaFST Fine Science Tools19007-05Diámetro de la punta 0,5 mm
Cámara digital rápidaEdmund OpticsBFS-U3-63S4CFLIR Blackfly S
Lente focalEdmund OpticsC-Series3.5 mm
GRINInscopix1050-0045951 mm de diámetro y 4 mm de longitud
Soporte para lente GRINUCLAhttp://miniscope.org/index.php/Surgery_Protocol
Adhesivo de tejido líquido3M1469CVetbond Adhesivo de tejido
de anestesia de bajo flujo para ratonesKent Scientific CorporationSomnoSuitehttps://www.kentscientific.com/products/somnosuite/
Adhesivo de silicona de baja toxicidadWPI – World Precision InstrumentsKwik-sil
miniPID ControllerASI – Aurora Científica Inc.Modelo 200BDetector de fotoionización en miniatura de respuesta rápida Soporte para
miniscopio V4UCLANA
https://github.com/Aharoni-Lab/Miniscope-v4/tree/master/Miniscope-v4-Holder Miniscopio V4LabmakerNAhttps://www.labmaker.org/products/miniscope-v4
Placa base para miniscopio V2LabmakerNAhttps://www.labmaker.org/products/miniscope-v4-base-plates-variant-2-pack-of-10
Miniscope DAQ-QT softwareUCLA
https://github.com/Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software/wiki Motion Correction SoftwareCU Anschutzhttps://github.com/restrepd/drgMiniscope
Odor Arena HardwareModelo3D hecho a medidahttps://www.dropbox.com/scl/fo/lwtpqysnpzis32mhrx3cd/ADomsxyhxu42sqDmTBl2O6k?rlkey=b3l4809eradundt5l3iz0gq74&
dl=0
Odor Arena SoftwareCUAnschutzhttps://github.com/wryanw/odorarena
Odorante Acetato de isoamiloAldrich Chemical Co06422AXDiluido al 1% en aceite mineral inodoro
RHD Placa de interfaz USBIntan TechnologiesC3100Producto descatalogado. Alternativamente, use otra placa equivalente.
Software de extracción de ROICU Anschutzhttps://github.com/restrepd/drgMiniscope
Sutter Micromanipulador SutterInstrument CompanyMP-285
Software de sincronizaciónCU Anschutzhttps://github.com/fsimoesdesouza/Synchronization
ratones Thy1-GCaMP6fJackson Laboratory IMSR_JAX 028281C57BL/6J-Tg (Thy1-GCaMP6f)GP5.12Dkim/J)
lente Sistema

Referencias

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