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Caracterización de plaquetas procoagulantes mediante la medición de la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas de plaquetas humanas purificadas

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DOI:

10.3791/67042

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29 de noviembre de 2024

 ,  , 
1French Reference Centre for Inherited Platelet Disorders, University Hospital of Bordeaux, 2Department of Haematology, University Hospital of Bordeaux, 3Inserm U1034, Biology of Cardiovascular Disease

En este artículo

Resumen

La formación de plaquetas procoagulantes se ha correlacionado con un mayor riesgo de trombosis. Aquí se presenta un protocolo preciso para aislar plaquetas lavadas de la sangre humana, destinado a cuantificar la exposición a la fosfatidilserina y la liberación de microvesículas, que son características distintivas de las plaquetas procoagulantes.

Resumen

Las plaquetas activadas promueven la coagulación principalmente al exponer el fosfolípido procoagulante fosfatidilserina (PS) en las superficies de sus membranas externas y liberar microvesículas que expresan PS que conservan la arquitectura de membrana original y los componentes citoplasmáticos de sus células de origen. La accesibilidad de la fosfatidilserina facilita la unión de los principales factores de coagulación, amplificando significativamente la eficiencia catalítica de las enzimas de coagulación, mientras que la liberación de microvesículas actúa como un mediador fundamental de la señalización intercelular. Las plaquetas procoagulantes desempeñan un papel crucial en la estabilización del coágulo durante la hemostasia, y su mayor proporción en el torrente sanguíneo se correlaciona con un mayor riesgo de trombosis. También se ha demostrado que las microvesículas plaquetarias son ricas en factores de crecimiento que promueven la cicatrización de heridas y la modulación inflamatoria. El análisis de la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas mediante citometría de flujo plantea desafíos significativos debido a su pequeño tamaño y al número limitado de eventos positivos para los marcadores de interés. A pesar de los considerables avances logrados en la última década, los métodos para evaluar la exposición a la fosfatidilserina y la liberación de microvesículas siguen siendo un trabajo en progreso. Desafortunadamente, no existe un único protocolo universalmente aplicable, y se deben evaluar varios factores para determinar la metodología más apropiada para cada aplicación específica. En este artículo, describimos un protocolo detallado para aislar las plaquetas lavadas de la sangre humana, seguido de la activación del colágeno y/o la trombina, para medir la exposición a la fosfatidilserina y la liberación de microvesículas que caracterizan a las plaquetas procoagulantes. Este protocolo está diseñado para facilitar la preparación inicial del plasma rico en plaquetas y el aislamiento de las plaquetas lavadas. Por último, la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas se cuantifican mediante citometría de flujo, lo que permite la identificación de plaquetas procoagulantes.

Introducción

La formación de procoagulantes plaquetarios es crucial para mantener la hemostasia 1,2,3. Este proceso implica la expresión de fosfolípidos inducidos por agonistas en la membrana plaquetaria, que es esencial para el ensamblaje de los complejos tenasa y protrombinasa 1,3,4. Después de la activación plaquetaria, las microvesículas plaquetarias también se liberan continuamente 5,6. Las microvesículas (de 50 nm a más de 1 μm de diámetro) encapsulan tanto la estructura de la membrana como los constituyentes citoplasmáticos de las células de origen 7,8. Las microvesículas son importantes mediadores de la señalización intercelular 9,10 y también repositorios de factores de crecimiento que promueven la cicatrización de heridas y la modulación inflamatoria11,12. También se ha sugerido que las microvesículas son de 50 a 100 veces más procoagulantes que las plaquetas activadas13. En particular, la evidencia reciente sugiere que las plaquetas almacenadas se activan, lo que lleva a la producción de microvesículas, lo que tiene ramificaciones potenciales para la práctica de la terapia de transfusión de plaquetas. La duración prolongada del almacenamiento de las microvesículas y su mayor actividad procoagulante las convierten en un sustituto prometedor de las plaquetas en aplicaciones transfusionales14.

Se han realizado innovaciones metodológicas para, directa e indirectamente, evaluar la formación de procoagulantes plaquetarios tanto en condiciones de salud como de enfermedad 4,14,15. Las evaluaciones de la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas utilizando plaquetas purificadas han proporcionado nuevos datos sobre cómo se perturban las respuestas procoagulantes plaquetarias en diversas enfermedades humanas 1,4. Este creciente campo de investigación también abre vías para las intervenciones terapéuticas 1,4. Sin embargo, el aislamiento y el análisis de las plaquetas purificadas de la sangre requieren mucho tiempo, requieren equipos de laboratorio especializados y, por lo tanto, actualmente no son adaptables para el diagnóstico clínico de rutina16,17. El análisis de la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas también es un desafío debido a su pequeño tamaño y al número de eventos positivos para los marcadores de interés18,19.

La citometría de flujo, aprovechando la unión fluorescente a la anexina-V, ha sido una piedra angular en la evaluación de la expresión de PS en plaquetas y microvesículas desde su inicio hace dos décadas20. Ha ganado una amplia aceptación en el examen de plaquetas y microvesículas procoagulantes21,22. Por lo tanto, se presenta un protocolo optimizado que puede ser utilizado para el aislamiento de plaquetas purificadas a partir de muestras de sangre utilizando la técnica desarrollada por el grupo23 de Cazenave, y la posterior caracterización de la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas por citometría de flujo después de la activación plaquetaria24. Este protocolo facilitará el estudio posterior y la caracterización en profundidad de las plaquetas procoagulantes en poblaciones clínicas de interés.

Protocolo

El protocolo sigue las directrices y fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Humana del Hospital Universitario de Burdeos. Se obtuvieron muestras de sangre de voluntarios sanos que dieron su consentimiento informado, y estas muestras se procesaron de acuerdo con los protocolos institucionales. Se excluyó a los donantes que habían tomado cualquier sustancia que pudiera afectar la función plaquetaria si dichas sustancias se habían tomado dentro de los 10 días anteriores a los experimentos. Se obtuvo el consentimiento informado de voluntarios sanos para recolectar su sangre y publicar sus datos. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Extracción de sangre y preparación de plaquetas lavadas

  1. Recoja la sangre venosa periférica en tubos de recolección que contengan el anticoagulante activo Citrato trisódico con ácido cítrico y dextrosa (ACD) después de desechar los primeros 3 mL.
  2. Después de la recolección, invierta suavemente el tubo para mezclar la sangre con ACD y deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de la centrifugación.
  3. Cuente las plaquetas utilizando un contador de células automatizado antes de la centrifugación para determinar la velocidad correcta de centrifugación (Tabla 1). Prepare plasma rico en plaquetas (PRP) por centrifugación a 250 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT) sin aplicar el freno para optimizar la recuperación de plaquetas.
    NOTA: Este paso producirá tres capas en la muestra: la capa superior que contiene plasma, plaquetas y una pequeña fracción de glóbulos blancos; una capa intermedia enriquecida con glóbulos blancos; y una capa inferior formada por glóbulos rojos. Transfiera con cuidado el PRP de la capa superior a un nuevo tubo cónico de 50 ml para evitar la contaminación con glóbulos rojos y blancos.
  4. Al PRP, añadir 1 mL de ACD-A (ver Tabla 2) y 6,25 μL de apirasa por 9 mL.
    NOTA: La apirasa, a una concentración de 0,02 U/mL, degrada las trazas de ATP o ADP secretadas por las plaquetas, impidiendo así la desensibilización de los receptores plaquetarios de ADP y manteniendo la forma plaquetaria25. También se puede incluir un inhibidor de la prostilina PGI2 (0,5 μM) con la apirasa para prevenir la activación plaquetaria.
  5. Prepare el pellet de plaquetas por centrifugación a RT a 1100 x g durante 10 min. Aspire el sobrenadante que contiene plasma pobre en plaquetas (PPP) utilizando un método suave, como una pipeta Pasteur, y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de tampón de lavado (ver Tabla 3 y Tabla 4). Homogeneizar suavemente con una pipeta, luego agregue 3-4 mL adicionales de tampón de lavado.
    NOTA: El nivel de calcio se reduce para evitar la coagulación con factores de coágulo presentes en el plasma. En esta etapa, el plasma pobre en plaquetas se ha eliminado por completo, lo que evita la formación de coágulos y la activación de plaquetas por la producción de trombina.
  6. Vuelva a centrifugar a RT a 1100 x g durante 10 min. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 1 mL de tampón de lavado. Transfiera 150 μL de la suspensión de plaquetas a un tubo de 1,5 mL para el recuento de células utilizando un contador de células automatizado. A continuación, vuelva a suspender el pellet con 3-4 mL de tampón de lavado.
  7. Realice una centrifugación final a 1100 x g durante 10 min (a RT). Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet de plaquetas en un volumen de tampón de reacción (ver Tabla 5 y Tabla 6) para lograr una concentración final de 5 x 1011 plaquetas/L.
  8. Deje reposar las plaquetas lavadas durante al menos 30 minutos antes de los experimentos para permitir que los inhibidores residuales desaparezcan y que las plaquetas se aclimaten al tampón.

2. Preparación del ensayo

  1. Prepare todos los agonistas y fluorocromos en el tampón de reacción. Añadir 5 μL de trombina a 45 μL de tampón (dilución 1:10) y 5 μL de ionóforo a 495 μL de tampón (dilución 1:500).
    1. En el caso de los ensayos internos, se comparan las plaquetas no activadas con las tratadas con agonistas simples y dobles. Añadir, en diferentes alícuotas, 100 μL de plaquetas lavadas a 50 x 109 plaquetas/L a: (i) 10 μL de tampón de reacción, (ii) 3 μL de colágeno no diluido (concentración final de 30 μg/mL), (iii) 10 μL de trombina prediluida (0,5 UI/mL), (iv) 3 μL de colágeno no diluido + 10 μL de trombina prediluida, y (v) 10 μL de ionóforo prediluido (concentración final de 2 μM), que se sabe que aumenta directamente los niveles de calcio intracelular como se señaló anteriormente26.
      NOTA: El tratamiento con un ionóforo de calcio, como A23187 o ionomicina, es fundamental, ya que induce una amplia alteración de la membrana de fosfolípidos y una mayor externalización de PS.
    2. Agite suavemente cada alícuota con la mano e incube a 37 °C durante 5 min.
      NOTA: La incubación agonista más prolongada (30 min) puede permitir una mejor diferenciación entre las poblaciones de plaquetas durante el proceso de análisis por citometría de flujo.
  2. Añadir 5 μL de Anexina-V FITC no diluida a cada microtubo e incubar a temperatura ambiente durante 10 min en la oscuridad.
    NOTA: También se podría incluir un anticuerpo monoclonal contra uno de los receptores específicos de plaquetas, GPIX (CD42b) o integrina αIIb (CD41, GPIIb), para identificar mejor las células plaquetarias.
  3. Añada 500 μL de tampón de reacción para detener el proceso y proceda al análisis de la muestra con un citómetro de flujo.

3. Caracterización de plaquetas y microvesículas procoagulantes por Citometría de Flujo (FC)

NOTA: Para un análisis confiable de la función plaquetaria, utilice un instrumento de citometría de flujo (FC) configurado de acuerdo con los estándares establecidos27. El instrumento debe ser capaz de detectar dispersión directa (FSC) y al menos una señal de fluorescencia. Ajuste los detectores de dispersión de luz y fluorescencia a ganancia logarítmica. Diluya las muestras de forma adecuada para la FC para asegurarse de que solo se cuentan las plaquetas individuales a una velocidad de adquisición de datos reducida.

  1. Ajuste el citómetro de flujo a un caudal "lento" con un umbral de al menos 10.000 eventos plaquetarios. Monitoree la emisión de fluorescencia utilizando un filtro de paso para FITC.
  2. Controlar la población de plaquetas mediante dispersión directa (FSC). Examine las plaquetas y las microvesículas liberadas de acuerdo con sus tamaños. Utilice gráficos de densidad para identificar las plaquetas y las microvesículas liberadas tanto para las plaquetas en reposo como para las estimuladas; Analice cada población cerrada de forma independiente.
  3. Distinguir las plaquetas procoagulantes según el eje FL1. Coloque el punto de corte negativo en el extremo derecho de la población de plaquetas en estado de reposo (es decir, en presencia de tampón de reacción). Después de la activación plaquetaria, clasifique todos los eventos localizados a la derecha de este punto de corte como plaquetas que exponen fosfatidilserina.
  4. Diferenciar las microvesículas, al ser más pequeñas que las plaquetas, por sus características únicas de dispersión de la luz. Establezca el punto de corte en el valor más bajo de FSC observado en la población de plaquetas en reposo. Después de la activación, clasifique cualquier evento positivo para fosfatidilserina que caiga por debajo de este umbral como microvesículas.
    NOTA: Tenga en cuenta la variación individual en el tamaño de las plaquetas ajustando el corte si es necesario. Asegúrese de que menos del 1% de las microvesículas estén presentes en el estado de reposo.

Resultados

La cuantificación de plaquetas y microvesículas procoagulantes se logra mediante la tinción con anexina-V, con al menos 50.000 eventos registrados por muestra. Como se indicó en el paso 2.2, las mediciones de plaquetas de referencia se tomaron de muestras incubadas con tampón de reacción, como se muestra en la Figura 1A. El tamaño de las plaquetas se midió utilizando el valor de la mediana de dispersión directa (FSC). Si bien el FSC está influenciado por varios factores, sigue siendo un indicador común para la estimación del tamaño de las células, incluido el de las plaquetas. Se utilizaron gráficos de densidad de área (Figura 1A) para identificar y controlar las plaquetas en reposo y las microvesículas liberadas.

En el caso de las plaquetas no activadas, menos del 2,9% presentó fosfatidilserina (PS) según lo determinado por la tinción con anexina V. Tras la activación de las plaquetas lavadas con colágeno solo o junto con trombina o ionóforo de calcio, se observó un aumento en la exposición a PS. El colágeno por sí solo provocó un aumento del 26,7% en las plaquetas PS positivas. La trombina tuvo efectos mínimos sobre la exposición a PS (9,1%), pero cuando se asoció con el colágeno, aumentó el porcentaje de plaquetas expuestas a PS al 36,2%. Como referencia, el tratamiento con ionóforo de 2 μM dio como resultado que el 49,6% de las plaquetas se convirtieran en procoagulantes.

La Figura 1 ilustra que la proporción basal de microvesículas de plaquetas lavadas en un individuo sano fue mínima (0,3%). Si bien la trombina y el colágeno aumentaron mínimamente la formación de microvesículas, solo con la combinación de colágeno y trombina la formación de microvesículas aumentó significativamente (Figura 1D; 11,4%). La adición de 2 μM de ionóforo dio como resultado que el 44,0% de las microvesículas formadas por las plaquetas de control estuvieran expuestas a PS.

La Figura 2 proporciona información sobre la variación, repetibilidad y reproducibilidad que se espera de este proceso.

figure-results-1
Figura 1: Exposición a PS y formación de microvesículas en plaquetas de control en reposo y activadas. Las plaquetas fueron activadas o inactivadas (en reposo) (A), con 30 μg/mL de colágeno (B), con 0,5 U/mL de trombina (C), con combinaciones de colágeno y trombina (D) con ionóforo de 2 μM. Los diagramas de puntos representativos muestran el tamaño de las plaquetas (dispersión directa (registro FSC)) frente a la unión de la anexina-V. Las líneas horizontales y verticales (E) delinean la población de plaquetas negativas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Repetibilidad y reproducibilidad de la exposición a PS y la formación de microvesículas después de la incubación con ionóforo. Análisis de la exposición a PS y la formación de microvesículas después de la incubación con ionóforo de 2 μM o 5 μM en plaquetas lavadas, tratadas o no con citrato (un quelante de calcio): (A) de 4 controles sanos diferentes; (B) de un control sano repetido 5 veces; y (C) de dos controles sanos preparados por dos técnicos diferentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Recuento de plaquetas en sangre total (10:9 por ml)Fuerzas centrífugas relativas (g)
<3070
30-50100
51-100130
101-150200
151-300250
301-600290
>600340

Tabla 1: Fuerzas centrífugas relativas para la preparación de plasma rico en plaquetas en relación con el recuento de plaquetas en sangre total.

ReactivoImporte
Ácido cítrico monohidratado (C6H8O7. H2O, 38 mM)8 g
Citrato trisódico dihidratado (Na, 3, C,6, H5O,7,2 H, 2O, 61 mM)180 g
Glucosa (C6h12o6, 136 mM)24,6 g
El pH de la solución no debe ajustarse. Mantenga la solución a 4 °C.

Tabla 2: Preparación de una solución acuosa de 1 L de ácido-citrato-dextrosa (ACD).

ReactivoImporte
Ácido cítrico monohidratado (C6, H,8, O, 7. H2O, 36 mM)7,56 g
NaCl (103 mM)6 g
NaOH4 g
MgCl2.6H 2O (1 mM)0,203 g
Ajusta el pH a 6,5. Mantenga la solución a 4 °C.

Tabla 3: Preparación de la solución madre del tampón de lavado.

ReactivoImporte
30% albúmina sérica bovina (BSA)583 μL
CaCl2, 0,25 m400 μL
Glucosa40 mg
Apirasa31,5 μL

Tabla 4: Preparación de una solución extemporánea de 50 mL de tampón de lavado a partir de la solución madre.

ReactivoImporte
NaCl (137 mM)8 g
KCl (2.7 mM)0,2 g
MgCl2.6H 2O (1 mM)0,203 g
HEPES (5 mM)1,19 g
NaHCO3 (12 mM)1 g
NaH2PO4.2H 2O; 0,3 mM0,05 g
Ajusta el pH a 7,4. Mantenga la solución a 4 °C.

Tabla 5: Preparación de una solución madre de tampón de reacción.

ReactivoImporte
30% albúmina sérica bovina (BSA)167 μL
CaCl2, 0,25 m400 μL
Glucosa50 mg

Tabla 6: Preparación de una solución extemporánea de 50 mL de tampón de reacción a partir de la solución madre.

Discusión

Estudios recientes sobre plaquetas procoagulantes han puesto de manifiesto sus cambios durante varias enfermedades 1,28,29, subrayando la importancia de su análisis detallado y caracterización 30,31,32. Si bien las pruebas clínicas actuales para evaluar la formación de procoagulantes plaquetarios son limitadas, ha habido un aumento significativo en el interés clínico en las últimas dos décadas. Por ejemplo, la scramblase dependiente del calcio TMEM16F (ANO6) está implicada en la exposición a la fosfatidilserina (PS) procoagulante33. Las variantes de TMEM16F se asocian con el síndrome de Scott33,34,35, un trastorno hemorrágico poco frecuente caracterizado por una alteración de la codificación de los fosfolípidos y una reducción de la generación de trombina en las plaquetas activadas36. Además, los niveles elevados de plaquetas procoagulantes están relacionados con accidentes cerebrovasculares trombóticos y enfermedad de las arterias coronarias, lo que despierta interés en terapias para frenar la actividad procoagulante plaquetaria37. De los métodos actualmente disponibles para evaluar la formación de plaquetas procoagulantes, la evaluación de la exposición a PS por unión a anexina-V y liberación de microvesículas es uno de los más utilizados38,39.

El protocolo descrito aquí permite el aislamiento de plaquetas purificadas humanas y la caracterización de plaquetas procoagulantes mediante la medición de la exposición a PS y la liberación de microvesículas mediante citometría de flujo. Es crucial aconsejar a los voluntarios sanos que se abstengan de tomar medicamentos que puedan afectar la función plaquetaria durante al menos 10 días antes de la toma de muestras de sangre. La extracción de sangre requiere cuidados para evitar traumatismos venosos o un flujo excesivamente lento, ya que estos pueden inducir la generación de trombina y la activación de plaquetas. La sangre anticoagulada con citrato de sodio no se recomienda para la preparación de plaquetas lavadas, ya que el calcio residual puede permitir la generación de trombina y la activación de las plaquetas durante la centrifugación17. La sangre anticoagulada con ACD tiene un pH de 6,5 y una mayor concentración de citrato de 22 mmol/L en comparación con el pH de la sangre anticoagulada con citrato de 7,5 y la concentración de citrato de 13 mmol/L17. El pH ácido y la disminución de la concentración de calcio extracelular en la sangre anticoagulada con ACD previenen la agregación plaquetaria24. Minimizar la generación de trombina durante el proceso de recolección es esencial. Se recomienda una venopunción no traumática con una aguja de al menos 21 G para prevenir la estasis venosa o la presión excesiva. Además, se deben desechar los primeros mililitros de sangre para evitar la contaminación con factores tisulares y trazas de trombina17. También es esencial minimizar el tiempo entre la venopunción y el procesamiento de la muestra, ya que el almacenamiento prolongado de sangre puede conducir a la activación de las plaquetas, aumentando así la exposición a PS y la liberación de microvesículas40. Se debe prestar especial atención durante todo el procedimiento de preparación de las plaquetas para prevenir la preactivación espontánea de las plaquetas, que puede ocurrir durante el propio proceso de preparación41,17. Además, el aislamiento de las plaquetas purificadas requiere evitar cuidadosamente la contaminación por otras células sanguíneas17. Esto implica aspirar completamente el sobrenadante después de centrifugar las plaquetas para garantizar una preparación limpia. Dado que el pellet suele ser visible y estar firmemente adherido a la pared del tubo, el sobrenadante puede aspirarse fácilmente con una punta de pipeta.

Durante las etapas de lavado por centrifugación, las plaquetas se resuspenden en un tampón que simula las condiciones fisiológicas. El uso de plaquetas lavadas en un tampón fisiológico las aísla de los anticoagulantes y el plasma, evitando así los artefactos mediados por la trombina. Si bien el plasma rico en plaquetas (PRP) es un método rápido para obtener altas concentraciones de plaquetas, su uso para estudios funcionales está limitado por los cambios de pH inducidos por los anticoagulantes y el contenido extracelular de calcio y proteínas del plasma, que pueden influir en la activación plaquetaria17. Además, los altos niveles de PS generados durante la activación plaquetaria serían suficientes para promover el ensamblaje de complejos de coagulación plasmática, el posterior estallido de trombina y la formación de coágulos en PRP, lo que hace que los resultados experimentales sean ininterpretables. Por el contrario, se recomienda la resuspensión en un tampón que contenga apirasa para mantener la funcionalidad plaquetaria al prevenir la desensibilización de los receptores purinérgicos a través de la degradación de ATP y ADP42,43. Aunque los pasos repetidos de centrifugación y lavado requieren más tiempo, las suspensiones de plaquetas lavadas preparadas por este método ofrecen la ventaja de una mayor estabilidad (5-8 h) en comparación con las preparaciones de PRP citado, que no son estables durante más de 1-3 h23.

Este estudio demuestra la factibilidad y simplicidad de cuantificar microvesículas por citometría de flujo. Sin embargo, la producción de microvesículas puede perderse entre los residuos y el ruido de la máquina. Por lo tanto, es fundamental asegurarse de que el citómetro de flujo se haya sometido a una limpieza exhaustiva y que los tampones utilizados no contengan ninguna partícula contaminante que pueda provocar un fondo alto durante el análisis de citometría de flujo. Alternativamente, se pueden utilizar citómetros de flujo especializados con capacidades de detección de partículas pequeñas para identificar la formación de microvesículas. También se estudió la unión de la anexina-V marcada con fluoresceína en función del contenido de PS en la membrana, lo que pone de manifiesto el papel crítico de concentraciones suficientes de calcio en el tampón para la unión de la anexina-V y la respuesta plaquetaria procoagulante44.

Los datos que respaldan la estabilidad de las muestras de plaquetas a lo largo del tiempo son actualmente escasos. Varios laboratorios han abordado este problema estabilizando las muestras mediante la adición de una solución fijadora, como un tampón que contiene formaldehído. La adición de un fijador a las muestras de plaquetas recién recolectadas tiene la ventaja de preservar las muestras para su posterior análisis. Sin embargo, la fijación de formaldehído puede causar un aumento artefacto de la unión de la anexina-V. Rochat et al. demostraron que la fijación plaquetaria con una solución de formaldehído libre de calcio de baja concentración no altera la proporción de plaquetas positivas para anexina-V45. Sin embargo, los investigadores que requieren fijación deben optimizar su protocolo específico para asegurarse de que no cause resultados alterados artificialmente. De lo contrario, las muestras deben procesarse inmediatamente.

Otra vía que también puede conducir a la exposición a la PS involucra la apoptosis intrínseca, un proceso conocido por regular la vida útil de las plaquetas en la circulación46. La activación de las proteínas proapoptóticas BAK y BAX da lugar a la activación de las caspasas, lo que promueve la externalización de la PS, lo que conduce al aclaramiento in vivo de las plaquetas. Recientemente, se ha sugerido el uso de otro marcador de superficie plaquetaria, la P-selectina/CD62P, además de la Anexina-V, para distinguir los procoagulantes de las plaquetas apoptóticas47. Se espera que las plaquetas procoagulantes sean positivas para los marcadores PS y P-selectina, mientras que las plaquetas apoptóticas son positivas para la anexina-V pero negativas para la P-selectina. Sin embargo, el tiempo también es un factor diferenciador entre las plaquetas procoagulantes y apoptóticas47. La generación de plaquetas procoagulantes in vitro es un proceso rápido, mientras que la apoptosis intrínseca es un proceso más lento, que dura48 horas. En este contexto, no es necesario el uso de marcadores adicionales para evaluar las plaquetas procoagulantes, lo que simplifica el método. Los aumentos sostenidos en la formación intracelular de Ca2+ y plaquetas procoagulantes ocurren en pocos minutos con agonistas muy fuertes, como el ionóforo o la activación combinada con colágeno y trombina, mientras que un inhibidor de BCL-XL (o mimético de BH3) desencadena la formación de plaquetas apoptóticas mediante la activación de BAK y BAX proapoptóticas, causando permeabilización de la membrana externa mitocondrial, liberación de citocromo C, y activación decaspasas 49.

En conclusión, el protocolo aquí descrito facilita el aislamiento de las plaquetas purificadas y su posterior caracterización para la actividad procoagulante utilizando equipos estándar de laboratorio y citometría de flujo. Este procedimiento abre el camino para futuras investigaciones sobre plaquetas procoagulantes en muestras de sangre de pacientes, con potenciales aplicaciones en la práctica clínica, como el diagnóstico del raro síndrome de Scott50.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A tubos de extracción de sangreBD Vacutainer366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen560931
Apirasa Grado VIISigma-AldrichA6410
Albúmina sérica bovina 30%Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25MSigma-AldrichC3881
Ácido cítrico monohidratadoMerck5949-29-1
Colágeno Stago86924
Glucosa Sigma-AldrichG8270
Hepes Sigma-AldrichH3375
Ionóforo Calbiochem/VWR100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
Hidrogenocarbonato de sodioMerck6329NaHCO3
Thrombin Hyphen BiomedEZ 006 A
Citrato trisódico dihidratado Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2
Oα Integración IIb (CD41, GPIIb) PC7Beckman Coulter6607115

Referencias

  1. Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750(2021).
  2. Agbani, E. O., Hers, I., Poole, A. W. Platelet procoagulant membrane dynamics: A key distinction between thrombosis and hemostasis. Blood Adv. 7 (8), 1615-1619 (2022).
  3. Veuthey, L., Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Pereira Portela, C., Alberio, L. Mechanisms underlying dichotomous procoagulant COAT platelet generation-A conceptual review summarizing current knowledge. Int J Mol Sci. 23 (5), 2536(2022).
  4. Bourguignon, A., Tasneem, S., Hayward, C. P. M. Update on platelet procoagulant mechanisms in health and in bleeding disorders. Int J Lab Hematol. 44 Suppl 1, 89-100 (2022).
  5. Suades, R., Padró, T., Vilahur, G., Badimon, L. Platelet-released extracellular vesicles: The effects of thrombin activation. Cel lMo lLife Sci. 79 (3), 190(2022).
  6. Dai, Z., et al. Platelets and platelet extracellular vesicles in drug delivery therapy: A review of the current status and future prospects. Front Pharmacol. 13, 1026386(2022).
  7. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science (New York, N.Y.). 367 (6478), eaau6977(2020).
  8. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  9. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: Mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell communsignal. 19 (1), 104(2021).
  10. Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
  11. Eustes, A. S., Dayal, S. The role of platelet-derived extracellular vesicles in immune-mediated thrombosis. Int J Mol Sci. 23 (14), 7837(2022).
  12. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. Shedding light on the cell biology of platelet-derived extracellular vesicles and their biomedical applications. Life. 13 (6), 1403(2023).
  13. Sinauridze, E. I., et al. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost. 97 (3), 425-434 (2007).
  14. Cai, Z., et al. Platelet-derived extracellular vesicles play an important role in platelet transfusion therapy. Platelets. 34 (1), 2242708(2023).
  15. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. An insight into recent advances on platelet function in health and disease. Int J Mol Sci. 23 (11), 6022(2022).
  16. Tyagi, T., et al. A guide to molecular and functional investigations of platelets to bridge basic and clinical sciences. Nat Cardiovasc Res. 1 (3), 223-237 (2022).
  17. Hechler, B., Dupuis, A., Mangin, P. H., Gachet, C. Platelet preparation for function testing in the laboratory and clinic: Historical and practical aspects. Res Pract Thromb Haemost. 3 (4), 615-625 (2019).
  18. Perez, G. I., et al. Phosphatidylserine-exposing Annexin A1-positive extracellular vesicles: Potential cancer biomarkers. Vaccines. 11 (3), 639(2023).
  19. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), e52484(2015).
  20. Dachary-Prigent, J., Freyssinet, J. M., Pasquet, J. M., Carron, J. C., Nurden, A. T. Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: A flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups. Blood. 81 (10), 2554-2565 (1993).
  21. Abaeva, A. A., et al. Procoagulant platelets form an α-granule protein-covered "cap" on their surface that promotes their attachment to aggregates. J Biol Chem. 288 (41), 29621-29632 (2013).
  22. Fager, A. M., Wood, J. P., Bouchard, B. A., Feng, P., Tracy, P. B. Properties of procoagulant platelets: defining and characterizing the subpopulation binding a functional prothrombinase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (12), 2400-2407 (2010).
  23. Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. Platelet aggregation: A tool for clinical investigation and pharmacological study. Methodology. Ann Biol Clin. 41 (3), 167-179 (1983).
  24. Han, P., Ardlie, N. G. The influence of pH, temperature, and calcium on platelet aggregation: Maintenance of environmental pH and platelet function for in vitro studies in plasma stored at 37 degrees C. Br J Haematol. 26 (3), 373-389 (1974).
  25. Ardlie, N. G., Perry, D. W., Packham, M. A., Mustard, J. F. Influence of apyrase on stability of suspensions of washed rabbit platelets. Proc Soc Exp Biol Med. 136 (4), 1021-1023 (1971).
  26. Kang, J. K., et al. Increased intracellular Ca2+ concentrations prevent membrane localization of PH domains through the formation of Ca2+-phosphoinositides. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (45), 11926-11931 (2017).
  27. Frelinger, A. L., et al. Consensus recommendations on flow cytometry for the assessment of inherited and acquired disorders of platelet number and function: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. J Thromb Haemost. 19 (12), 3193-3202 (2021).
  28. Khattab, M. H., et al. Increased procoagulant platelet levels are predictive of death in COVID-19. GeroScience. 43 (4), 2055-2065 (2021).
  29. Denorme, F., Campbell, R. A. Procoagulant platelets: Novel players in thromboinflammation. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (4), C951-C958 (2022).
  30. Gianazza, E., et al. Platelets in healthy and disease states: From biomarkers discovery to drug targets identification by proteomics. Int J Mol Sci. 21 (12), 4541(2020).
  31. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood. J VisExp. (119), (2017).
  32. Alberca, R. W., et al. Platelet-based biomarkers for diagnosis and prognosis in COVID-19 Patients. Life. 11 (10), 1005(2021).
  33. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  34. Boisseau, P., et al. A new mutation of ANO6 in two familial cases of Scott syndrome. Br J Haematol. 180 (5), 750-752 (2018).
  35. Castoldi, E., Collins, P. W., Williamson, P. L., Bevers, E. M. Compound heterozygosity for 2 novel TMEM16F mutations in a patient with Scott syndrome. Blood. 117 (16), 4399-4400 (2011).
  36. Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Scott syndrome, a bleeding disorder caused by defective scrambling of membrane phospholipids. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1636 (2), 119-128 (2004).
  37. Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: Generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
  38. Reddy, E. C., Rand, M. L. Procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets in vitro and in vivo. Front Cardiovasc Med. 7, 15(2020).
  39. Reddy, E. C., et al. Analysis of procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets by imaging flow cytometry. Res Pract Thromb Haemost. 2 (4), 736-750 (2018).
  40. Magnette, A., Chatelain, M., Chatelain, B., Ten Cate, H., Mullier, F. Pre-analytical issues in the haemostasis laboratory: Guidance for the clinical laboratories. Thromb J. 14, 49(2016).
  41. Schoenfeld, H., Muhm, M., Doepfmer, U., Exadaktylos, A., Radtke, H. Platelet activity in washed platelet concentrates. Anesth Analg. 99 (1), 17-20 (2004).
  42. Koessler, J., et al. Role of purinergic receptor expression and function for reduced responsiveness to adenosine diphosphate in washed human platelets. PLoS ONE. 11 (1), e0147370(2016).
  43. Baurand, A., et al. Desensitization of the platelet aggregation response to ADP: Differential down-regulation of the P2Y1 and P2cyc receptors. Thromb Haemost. 84 (3), 484-491 (2000).
  44. Alberio, L., et al. Delayed-onset of procoagulant signalling revealed by kinetic analysis of COAT platelet formation. Thromb Haemost. 117 (06), 1101-1114 (2017).
  45. van Kruchten, R., et al. Both TMEM16F-dependent and TMEM16F-independent pathways contribute to phosphatidylserine exposure in platelet apoptosis and platelet activation. Blood. 121 (10), 1850-1857 (2013).
  46. Rochat, S., Alberio, L. Formaldehyde-fixation of platelets for flow cytometric measurement of phosphatidylserine exposure is feasible. Cytometry A. 87 (1), 32-36 (2015).
  47. Josefsson, E. C., Ramström, S., Thaler, J., Lordkipanidzé, M. COAGAPO study group Consensus report on markers to distinguish procoagulant platelets from apoptotic platelets: communication from the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (8), 2291-2299 (2023).
  48. Choo, H. J., Kholmukhamedov, A., ChengZing, Z., Shawn, J. Inner mitochondrial membrane disruption links apoptotic and agonist-initiated phosphatidylserine externalization in platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37 (8), 1503-1512 (2017).
  49. Johnson, L., Pearl Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221(2023).
  50. Montague, S. J. Comprehensive functional characterization of a novel ANO6 variant in a new patient with Scott syndrome. J Thromb Haemost. S1538 - 7836 (24), 00127-00132 (2024).

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