Síntesis de nanopartículas lipídicas por flujo turbulento en mezcladores de chorro de impacto confinados

Sai Nikhil Subraveti; Brian K. Wilson; Navid Bizmark; Jason Liu; Robert  K. Prud'homme

doi:10.3791/67047

Artículo de método

Síntesis de nanopartículas lipídicas por flujo turbulento en mezcladores de chorro de impacto confinados

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DOI:

10.3791/67047

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23 de agosto de 2024

Sai Nikhil Subraveti¹ , Brian K. Wilson¹ , Navid Bizmark¹ , Jason Liu¹ , Robert K. Prud'homme¹

¹Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University

En este artículo

Resumen

Se demuestra un protocolo detallado para sintetizar nanopartículas lipídicas (LNPs) utilizando tecnologías de mezcladores de chorro de impacto confinado (CIJ), incluyendo un CIJ de dos chorros y un mezclador de vórtice de entrada múltiple de cuatro chorros (μMIVM). Los mezcladores CIJ generan entornos de micromezcla turbulentos y reproducibles, lo que da como resultado la producción de LNP monodispersos.

Resumen

Las nanopartículas lipídicas (LNP) han demostrado su enorme potencial como vehículos de administración terapéutica, como lo demuestra la aprobación y el uso mundial de dos vacunas de ARN mensajero (ARNm) contra la COVID-19. A pequeña escala, los LNP a menudo se fabrican utilizando microfluídica; Sin embargo, las limitaciones de estos dispositivos impiden su uso a gran escala. Las vacunas contra la COVID-19 se fabrican en grandes cantidades utilizando mezcladores turbulentos de chorro de impacto confinado (CIJ). La tecnología CIJ permite la producción a escala de laboratorio con la confianza de que se puede escalar a volúmenes de producción. Los conceptos clave en la mezcla CIJ son que la longitud de mezcla y la escala de tiempo están determinadas por la intensidad de la turbulencia en la cavidad de mezcla y que la formación de nanopartículas se produce lejos de las paredes, eliminando el problema de la deposición en las superficies y el ensuciamiento. Este trabajo demuestra el proceso de fabricación de LNPs utilizando la tecnología de mezcladores de chorro de impacto confinado con dos geometrías: el CIJ de dos chorros y el mezclador de vórtice de entrada múltiple (MIVM) de cuatro chorros. Se discuten las ventajas y desventajas de cada geometría de mezcla. En estas geometrías, los LNP se forman por la mezcla rápida de una corriente de disolvente orgánico (generalmente etanol que contiene los lípidos ionizables, co-lípidos y lípidos PEG estabilizadores) con una corriente acuosa de anti-solvente (tampón acuoso que contiene ARN o ADN). Se presentan los parámetros de funcionamiento de los mezcladores CIJ y MIVM para preparar LNPs reproducibles con tamaño, potencial zeta, estabilidad y efectividad de transfección controlados. También se presentan las diferencias entre los LNP elaborados con una mala mezcla (soluciones de pipeteo) en comparación con la mezcla CIJ.

Introducción

Las terapias basadas en ARNm tienen un gran potencial para el tratamiento y la prevención de una amplia gama de enfermedades, incluidas las enfermedades^infecciosas, los trastornos genéticos y los cánceres. A diferencia de las terapias de moléculas pequeñas, que pueden difundirse pasivamente a través de la membrana celular, los ácidos nucleicos deben encapsularse para su administración intracelular². La encapsulación proporciona estructura y estabilidad al ARNm, facilitando su entrega intracelular a través de vías endocíticas, así como evitando la degradación de componentes intra y extracelulares como las nucleasas³. Se han desarrollado una gran cantidad de materiales y nanoportadores para la encapsulación y administración de ARNm, incluidas nanopartículas inorgánicas, polímeros, lípidos y materiales similares a los lípidos¹. Entre ellas, las LNP se han convertido en la plataforma de administración más destacada para las terapias basadas en^{ARNm 4}.

Las LNP están compuestas por cuatro componentes lipídicos: lípidos ionizables, colesterol, lípidos zwitteriónicos y estabilizador de lípidos PEG⁵. Los lípidos ionizables adecuados para la administración de ARNm exhiben un cuidadoso equilibrio entre la hidrofobicidad lipídica y la constante de disociación (pKa) de un grupo amina^{ternario 6}. El pKa lipídico ionizable suele tener un pH entre 6,0 y 6,7, como KC-2 (DLin-KC2-DMA), MC-3 (DLin-MC3-DMA) y ALC-0315⁷. Esta restricción de pKa en el lípido ionizable permite tanto la encapsulación de polímeros de ácidos nucleicos como sales lipídicas hidrofóbicas como la administración intracelular a través de un proceso de "escape de endosomas". Las LNP ingresan a una célula diana a través de (varias) vías de endocitosis que implican la acidificación del endosoma desde un pH de 7,4 hasta un pH ~^5,8. El pKa lipídico ionizable asegura que las LNP tengan superficies casi neutras en condiciones fisiológicas, pero se conviertan en catiónicas en un endosoma acidificante⁹. Esta respuesta al pH permite la disrupción selectiva de solo la membrana endosómica, la liberación del polímero de ácido nucleico encapsulado y preserva la viabilidad celular, a diferencia de los lípidos catiónicos permanentes utilizados en sistemas de transfección como Lipofectamine. El colesterol es una molécula hidrofóbica e intersticial en la estructura de LNP que mejora la fluidez de los lípidos. El lípido zwitteriónico desempeña un papel estructural y forma una bicapa en la superficie del LNP. El poli(etilenglicol)-lípido (PEG-lípido) es un estabilizador coloidal que mejora la estabilidad del LNP al impartir un estabilizador estérico polimérico sobre la superficie del LNP, que resiste la agregación de LNP. Esto estabiliza el LNP, particularmente durante los cambios en el pH que regeneran la forma de base libre del lípido ionizable que se comporta como un aceite hidrofóbico. La receta de Onpattro (patisiran) (en adelante, denominada formulación LNP) se utiliza a menudo como punto de partida para la formulación de LNP con lípidos ionizables MC3, colesterol, distearoilfosfatidilcolina (DSPC) y PEG2000-DMG disueltos en etanol mezclados contra una solución acuosa de ARN¹⁰.

Se pueden utilizar varias técnicas para fabricar LNPs que encapsulan polímeros de ácidos nucleicos, y la mayoría de ellas se basan en un tema común de mezclar rápidamente una corriente de etanol que contiene lípidos con una corriente acuosa que incorpora el ácido nucleico de interés (siRNA, mRNA o ADN)9,11,12,13,14 . En este sentido, los procesos de mezcla a granel, como la mezcla con pipeta y la mezcla en vórtice, ofrecen una estrategia sencilla para formar LNP que elimina la necesidad de utilizar instrumentos sofisticados¹². Sin embargo, la mezcla a granel no proporciona una distribución homogénea de los componentes, lo que conduce a una distribución del tamaño de LNP subóptima junto con una variabilidad significativa de un lote a otro¹⁵.

Los laboratorios utilizan rutinariamente técnicas de mezcla microfluídica para obtener LNPs reproducibles al lograr un control más preciso sobre las condiciones de mezcla 12,13,16. Sin embargo, las condiciones de flujo laminar en los dispositivos microfluídicos, que son inherentes debido a las escalas de pequeña longitud y las bajas velocidades en una cámara de microfluídica, dan como resultado una mezcla de solvente/antisolvente comparativamente lenta¹⁷. Las pequeñas dimensiones de la cámara limitan severamente el rendimiento y la escalabilidad necesarios para la producción de GLP de LNP, pero los investigadores han paralelizado cámaras microfluídicas para intentar escalar los volúmenes de producción^. Una geometría de microfluídica paralelizada no elimina el problema de la adsorción de lípidos a las superficies durante el procesamiento de grandes volúmenes, un problema comúnmente conocido como "ensuciamiento" del dispositivo de mezcla, y existen problemas con la uniformidad y estabilidad de los flujos que hacen que el escalado de la microfluídica sea un desafío para la producción a escala industrial^18,19. No es de extrañar que las empresas farmacéuticas utilizaran mezcladores de chorro de impacto turbulento para fabricar ARNm-LNP de la vacunación contra la COVID-19²⁰.

El proceso de producción de LNP cargadas de ARN implica la mezcla de un flujo tampón acuoso que contiene la carga útil de ARN con un flujo de etanol que contiene los cuatro componentes lipídicos distintos. Estas formulaciones utilizan un tampón ácido con un pH de 4.0 o menos, que carga el lípido ionizable a medida que se mezclan las corrientes acuosa y etanólica. Los lípidos ionizables cargados positivamente interactúan electrostáticamente con los ARN cargados negativamente, formando una sal hidrofóbica ARN-lipídica. Las especies lipídicas hidrofóbicas, incluida la sal lipídica de ARN, precipitan en los disolventes mezclados y forman núcleos hidrofóbicos. Estos núcleos crecen a través de la precipitación de lípidos zwitteriónicos y colesterol hasta alcanzar un punto crítico en el que se adsorbe suficiente lípido pegilado en la superficie de las LNPs, deteniendo el crecimiento posterior del mecanismo de nucleación y crecimiento 21,22,23. La adición de tampón acuoso a la solución lipídica, en la medida en que los lípidos precipitan y se forman LNP, depende de dos escalas de tiempo distintas: el período de mezcla solvente-antisolvente, τ_mezcla, y el período de crecimiento de los núcleos, τ_agg. El número adimensional de Damköhler, definido como Da = τ_mix/τ_agg, capta la interacción entre estas escalas de tiempo²⁴. En los casos de mezcla lenta (Da > 1), el tamaño final de los LNP está controlado por el transporte y varía con el tiempo de mezcla. Por el contrario, durante la mezcla rápida (Da < 1), el fluido se fragmenta en estrías o capas de longitud de Kolmogrov, por lo que la formación de LNP se rige únicamente por la difusión molecular de cada constituyente, lo que da como resultado una cinética homogénea de formación de LNP. Lograr este último escenario exige que la concentración de lípidos supere un umbral crítico, estableciendo un estado de sobresaturación propicio para una nucleación homogénea uniforme.

Se estima que τ_agg oscila entre unas pocas decenas y unos pocos cientos de milisegundos²⁵. En su configuración más básica, las dos corrientes, una que contiene etanol con lípidos y la otra que contiene un tampón acuoso con carga de ARN, se inyectan en una cámara conocida como mezclador de "chorro de impacto confinado" (CIJ). Los vórtices turbulentos producen escalas de longitud de estría de solvente/antisolvente de 1 μm dentro de 1,5 ms cuando se operan a velocidades adecuadas. Las velocidades de la corriente y la geometría de la mezcla determinan la conversión del momento lineal en vórtices turbulentos que mezclan las corrientes. Esto está parametrizado por el número adimensional, el número de Reynolds (Re), que es linealmente proporcional a las velocidades de flujo. Re se calcula a partir de Re = Σ (V_iD_i/v_i), donde V_i es la velocidad del flujo en cada vapor, v_i es la viscosidad cinemática de cada corriente y D_i es el diámetro de entrada de la corriente en dispositivos CIJ de 2 chorros²⁶ o el diámetro de la cámara en MIVM de 4 chorros²⁷. Nota: Algunas referencias para el CIJ utilizan un solo diámetro de chorro y velocidad para definir Re²⁸. Re está en el rango de 1-100 en un dispositivo de microfluídica, mientras que en los dispositivos CIJ, se puede lograr Re de 125.000. En un mezclador CIJ, las corrientes con el mismo momento chocan, disipando su impulso al impactar como una mezcla turbulenta, lo que conduce a una micromezcla eficiente debido a las pequeñas microescalas de Kolmogorov y al pequeño número de Damköhler. Otro tipo de mezclador es el "mezclador de vórtice de entrada múltiple" (MIVM), donde cuatro corrientes se dirigen a una cámara central. En esta configuración, los flujos continuos hacia la cámara de mezcla confinada garantizan una escala de tiempo de mezcla bien definida. Todos los elementos fluidos pasan a través de la zona de mezcla de alta energía en ambos tipos de mezcladores. Por el contrario, los dispositivos de mezcla simples, como las uniones en T, no contienen una cámara que proporcione una zona de mezcla, lo que resulta en una menor mezcla de las dos corrientes debido a que el momento de la corriente entrante se desvía en gran medida hacia la dirección de salida en lugar de hacia la generación de vórtices turbulentos. Tanto los mezcladores CIJ como los MIVM pueden funcionar en modo por lotes o continuo, lo que ofrece flexibilidad para la producción de LNP a varias escalas.

Este protocolo describe cómo se obtienen las formulaciones óptimas de LNP mediante el empleo de dos tecnologías de chorro de impacto confinado: CIJ de 2 chorros y los mezcladores MIVM de 4 chorros. El funcionamiento de los mezcladores CIJ y MIVM ha sido demostrado previamente para la preparación de NPs con materiales de núcleo hidrófobos²⁹. Ese artículo y video deben ser consultados como un recurso adicional sobre la formación de NPs con estos mezcladores. Esta actualización se centra en la formación de NP a base de lípidos. Se demuestra la capacidad de ajustar el tamaño de los LNP variando las condiciones de micromezcla. Además, se muestra la utilidad de las tecnologías CIJ en la formación de LNPs estables y monodispersas con una mayor eficiencia de transfección in vitro en células HeLa en comparación con las LNP fabricadas con una mezcla deficiente de pipetas. Además, se discuten las ventajas y desventajas de cada geometría de mezcla CIJ, junto con las condiciones apropiadas necesarias para el escalado de estos mezcladores.

Protocolo

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de tampones, flujos de disolventes y antidisolventes

Disuelva todos los componentes lipídicos en etanol a concentraciones másicas dadas, como se muestra en la Tabla 1, para hacer una formulación de patisiran LNP¹⁰. Antes de su uso, calentar las soluciones a 37 °C con una suave sonicación para volver a disolver los sólidos precipitados.
NOTA: Se pueden preparar y almacenar a 4 °C soluciones madre más grandes de varios mililitros.
Prepare una solución tampón de acetato a una concentración de 100 mM, pH 4, combinando 186 mg de acetato de sodio y 464 mg de ácido acético en 80 ml de agua libre de nucleasas. Ajuste el pH con HCl o NaOH concentrado según sea necesario y aumente el volumen final a 100 mL.
Preparar una solución tampón HEPES a una concentración de 1 M, pH 7,5, disolviendo 23,82 g de sal HEPES en 80 mL de agua libre de nucleasas. Ajuste el pH con HCl o NaOH concentrado según sea necesario y aumente el volumen final a 100 mL.
Diluir el polímero de ácido nucleico de interés y el tampón de acetato de 100 mM con agua libre de nucleasas para producir una solución de 300 μg/mL de ARN en tampón de acetato de 30 mM. Prepare un volumen adecuado de solución de trabajo para los experimentos diseñados, y este protocolo requiere 1500 μL en total para los mezcladores CIJ y MIVM.
NOTA: El ARN obtenido del proveedor ya estará en un tampón adecuado, normalmente a una concentración de 10 mg/mL (ARN de levadura) o 1 mg/mL (ARNm que codifica con luciferasa, LucRNA, o ARNm que codifica con GFP, GFP-ARN). El ARN de levadura se puede utilizar como un modelo de ARN de bajo costo para las precipitaciones.

2. Formulación de LNPs utilizando un mezclador CIJ de dos chorros

Preparación y limpieza de equipos
1. Limpie los mezcladores CIJ inmediatamente antes de usarlos enjuagando el mezclador con etanol. Llene dos jeringas de 5 ml con etanol y bloquee cada una en un puerto de entrada de la CIJ. Deprima rápidamente las jeringas y recoja el efluente del mezclador como residuo.
  NOTA: Los mezcladores CIJ pueden construirse y operarse como se describió anteriormente²⁹. Se pueden usar varios soportes de soporte para sujetar el mezclador CIJ, incluido un soporte de anillo, un soporte de tubo de centrífuga o un matraz Erlenmeyer. Los proveedores de CIJ se enumeran en la Tabla de Materiales y en el Archivo Complementario 1.
2. Retire las jeringas de descarga de etanol de la CIJ. Estas jeringas pueden almacenarse y reutilizarse para enjuagues de etanol adicionales de la CIJ.
3. Seque los canales internos de CIJ soplando un chorro de nitrógeno seco a través de los adaptadores de entrada. Use solo aire seco y filtrado que no esté contaminado con neblina de aceite de la bomba o aerosoles si no hay nitrógeno disponible.
Preparación de corrientes de disolventes y antidisolventes
1. Mezcle las soluciones madre lipídicas y diluya con etanol adicional para producir 500 μL de la solución lipídica de 6 mg/mL enumerada en la Tabla 1 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  NOTA: Esta formulación es la composición de Onpattro comúnmente utilizada que contiene 50 mol % MC3, 10 mol % DSPC, 38,5 mole % colesterol y 1,5 mol % DMG-PEG2000.
2. Diluir el material tampón de acetato de pH 4 de 100 mM a 10 mM en un volumen total de 4 mL como baño de enfriamiento de efluentes del mezclador CIJ.
  NOTA: También se puede agregar una barra agitadora magnética al baño de enfriamiento.
3. Extraiga 500 μL de solución de ARN preparada en el paso 1.4 en una jeringa de 1 mL. Invierta la jeringa y expulse el aire de esta corriente acuosa de antisolvente que contiene un polímero de ácido nucleico.
4. Extraer 500 μL de la solución lipídica preparada en el paso 2.2.1 en una jeringa de 1 mL. Invierta la jeringa y expulse el aire de esta corriente de disolvente etanólico que contiene lípidos.
Producción de LNP en un mezclador CIJ
1. Coloque el mezclador CIJ limpio sobre el vial del baño de enfriamiento.
  NOTA: Una abrazadera de soporte de anillo o un soporte de tubo es un soporte conveniente para el mezclador CIJ. Consulte la Figura 1A para ver una configuración típica de CIJ.
2. Acople las dos jeringas llenas en los pasos 2.2.3 y 2.2.4 a los puertos de entrada del mezclador CIJ.
3. Presione ambas jeringas rápidamente para mezclar las corrientes de solvente y antisolvente y recolectar las NP lipídicas en el baño de enfriamiento.
  NOTA: las jeringas deben avanzarse rápidamente (en menos de 1 s) pero de manera suave y uniforme. El flujo asimétrico o el flujo lento producirán LNP polidispersos y grandes.
4. Retire el mezclador CIJ de sobre el baño de enfriamiento con las jeringas aún conectadas.
  NOTA: No retire las jeringas ni permita que el volumen de retención fluya hacia el baño de enfriamiento, ya que este material está mal mezclado y afectará negativamente las propiedades de dispersión de la producción si se mezcla con el baño de enfriamiento.
5. Sostenga el CIJ sobre un contenedor de residuos y retire las jeringas, permitiendo que el volumen residual de retención fluya hacia el contenedor de residuos. Deseche estas jeringas y repita el proceso de limpieza como se describe en la sección 2.1.
6. Analice los LNP producidos con el CIJ como se describe en la sección 5 a continuación.

3. Formulación de LNPs utilizando un mezclador MIVM de cuatro chorros

Ensamblaje de un mezclador MIVM, denominado MIVM de tamaño micro (μMIVM) para distinguirlo de los modelos más grandes utilizados para la producción a escala
1. Reúna todos los componentes individuales necesarios para ensamblar un mezclador MIVM: el receptor inferior, el disco de geometría de mezcla, el disco superior, la junta tórica y la llave inglesa.
  NOTA: La construcción, el montaje y la operación de MIVM se han demostrado previamente para la encapsulación de especies hidrofóbicas, y los proveedores se enumeran en el Archivo Suplementario 1 y la Tabla de Materiales²⁹. Consulte la Figura 2 para obtener un esquema de los componentes y la terminología del soporte del mezclador.
2. Coloque la junta tórica en la ranura del disco de mezcla.
3. Alinee los orificios del disco mezclador con las clavijas del disco superior y empújelos sin que la junta tórica se desprenda.
4. Atornille el disco mezclador acoplado, la junta tórica y el conjunto del disco superior en el receptor inferior sin apretar.
  NOTA: Retire el tubo de salida del receptor inferior antes de este paso.
5. Apriete el disco superior en el receptor inferior con la llave inglesa.
  NOTA: Se puede aplicar un compuesto antiadherente de grado alimenticio o farmacéutico a las roscas superiores del disco si se observa un excoriado de la rosca.
6. Inserte y apriete el accesorio del tubo de salida en el receptor inferior para completar el MIVM.
7. Monte el MIVM ensamblado en el soporte del mezclador de modo que el tubo de salida salga a través de la placa de soporte.
  NOTA: El procedimiento para ajustar el soporte del mezclador MIVM debe realizarse periódicamente para asegurarse de que los topes mecánicos del soporte del mezclador estén configurados correctamente²⁹.
Preparación de corrientes de disolventes y antidisolventes
1. Mezcle las dos soluciones de corriente de disolvente lipídico etanólico en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, como se indica en la Tabla 2, diluyendo las soluciones madre lipídicas y añadiendo etanol adicional según sea necesario para alcanzar una concentración final de lípidos de 6 mg/mL.
  NOTA: Se trata de la misma composición de la solución lipídica que en el punto 2.2.1 pero con un volumen total de 1000 μL.
2. Diluir el material tampón de acetato de pH 4 de 100 mM a 10 mM en un volumen total de 8 mL como baño de enfriamiento del efluente MIVM.
  NOTA: También se puede agregar una barra agitadora magnética al baño de enfriamiento.
Formulación de LNPs utilizando un mezclador MIVM
1. Coloque el baño de enfriamiento de 8 ml debajo del soporte del mezclador para que el tubo de salida se vacíe en el baño de enfriamiento.
2. Extraiga los chorros de disolvente y antidisolvente en jeringas herméticas al gas de 1 ml con una aguja de punta roma. Retire todas las burbujas de aire y deseche la aguja. Prepare cada jeringa invirtiendo y expulsando el aire de la jeringa.
3. Ensamble las cuatro jeringas en la batidora en el sentido de las agujas del reloj (Jeringas 1-4, Tabla 2) con los mismos chorros en los lados opuestos. Consulte la Figura 1B para ver el esquema de apariencia final.
4. Sujete la carcasa del rodamiento a ambos lados de la placa móvil. Evite colocar los dedos en la cara inferior de la carcasa, ya que esto representa un peligro de pellizco debido a los topes mecánicos. Baje con cuidado la placa móvil hasta que descanse uniformemente sobre las jeringas.
  NOTA: Los émbolos de la jeringa deben estar todos a la misma altura antes de la operación.
5. Presione la placa de manera constante y suave, con el objetivo de completar la operación en aproximadamente 0,5 s a 1 s para estos volúmenes de flujo.
6. Tape el baño de enfriamiento, que contiene la dispersión de LNP.
7. Realice la limpieza de la MIVM después de su uso, siguiendo las instrucciones del paso 3.5 a continuación.
Formulación de LNPs utilizando un mezclador MIVM accionado por una bomba de jeringa
1. Ensamble el MIVM como se describe en el paso 3.1.
2. Prepare las soluciones de disolvente y antidisolvente en la composición deseada y en un volumen suficiente para el tamaño de formulación requerido (Tabla 3).
  NOTA: Estas son las mismas composiciones que las corrientes de antisolvente acuoso (paso 1.4) y solvente etanólico (paso 3.2.1), pero se amplían para su uso con los volúmenes de jeringa más grandes de la Tabla 3.
3. Cargue las soluciones en jeringas herméticas al gas con volúmenes de 20 ml y conecte el tubo de PTFE con un adaptador luer instalado en el extremo. Prepare las jeringas y el tubo invirtiendo la jeringa y el tubo y luego expulsando el aire.
4. Monte las jeringas en una bomba de jeringa y conecte las jeringas a las entradas del mezclador en el MIVM, como se muestra en la Figura 3A.
  NOTA: El CIJ también puede funcionar a través de bombas de la misma manera, pero con una sola jeringa de flujo de solvente y antisolvente.
5. Diluir el material tampón de acetato de pH 4 de 100 mM a 10 mM en un volumen total de 320 mL como baño de enfriamiento de efluentes MIVM.
6. Coloque el baño de enfriamiento debajo de la salida MIVM.
7. Ajuste el caudal volumétrico de la bomba de jeringa a 20 mL/min.
  NOTA: Los caudales volumétricos pueden variar de 2 mL/min a 40 mL/min ajustando manualmente los valores de la bomba de jeringa para formar LNP con diferentes condiciones de micromezcla.
8. Encienda la bomba de jeringa, pero deje que los primeros 10 s de efluente fluyan hacia un vaso de precipitados. Recoja el efluente MIVM en el baño de enfriamiento después de este período de flujo de arranque de 10 s.
9. Retire y tape el baño de enfriamiento que contiene la dispersión de LNP hecho a la tasa de flujo volumétrico seleccionada (20 mL/min).
  NOTA: Este procedimiento se puede repetir para sintetizar LNP a diferentes caudales seleccionando los volúmenes apropiados del baño de enfriamiento.
10. Limpie el MIVM entre cada experimento (cuando cambie el caudal) enjuagando al menos el doble del volumen de la tubería de salida para evitar la acumulación de LNP en la condición de caudal anterior antes de comenzar la siguiente síntesis de LNP.
Limpieza del equipo después de su uso
1. Separe la batidora del soporte mientras mantiene las jeringas conectadas y sosténgala sobre un contenedor de desechos. Retire las jeringas, dejando que el volumen de retención se drene en el recipiente. Luego, sostenga el conjunto de la batidora boca abajo y use la llave inglesa para desmontar la batidora.
2. Enjuague el tubo de salida con solvente (por ejemplo, etanol) y séquelo con aire o nitrógeno.
3. Enjuague la geometría de mezcla con un solvente adecuado, como agua desionizada o etanol, seguido de un enjuague con etanol. Seque los componentes con un chorro de aire o nitrógeno.
4. Enjuague la junta tórica con agua desionizada y séquela.
  NOTA: Si la junta tórica se ve estirada o deformada, déjela secar al aire durante la noche antes de usarla. Mantener un gran stock de juntas tóricas ya que son piezas consumibles. Si la forma no se recupera al día siguiente, deseche la junta tórica.
5. Enjuague bien el disco superior con disolvente, utilizando un chorro de aire o nitrógeno para secar la superficie y los accesorios de la jeringa.
6. Enjuague cada jeringa con un solvente bueno (por ejemplo, agua desionizada o etanol). Aplique un enjuague final con etanol y seque al aire antes del próximo uso.

4. Posprocesamiento de LNPs

Intercambio de tampones y eliminación de etanol
1. Diálisar la dispersión de LNP contra un tampón HEPES de 10 mM a pH 7,4 utilizando un casete de diálisis de tamaño adecuado con un cartucho de diálisis de corte de peso molecular de 20 kDa.
  NOTA: Este paso elimina el etanol residual al 10% y aumenta el pH de dispersión al reemplazar el tampón de acetato con HEPES.
2. Diluir el tampón HEPES de 1 M a 10 mM en un volumen total de 1 L.
3. Cargue la dispersión de LNP en un casete de diálisis de 12 ml con una jeringa y una aguja.
4. Sumerja el cartucho de diálisis en 1 L de tampón HEPES y agite magnéticamente el tampón externo. Cambie el tampón externo HEPES después de 3 h y retire el cartucho de diálisis después de 3 h adicionales para un tiempo total de diálisis de 6 h.
5. Extraiga la dispersión de LNP dializada del cartucho de diálisis y deseche el cartucho gastado.
Concentración de suspensión de LNP mediante ultracentrifugación
1. Pipetee la suspensión en un filtro centrífugo de tamaño adecuado con un MWCO de 100kDa³⁰.
  NOTA: Los filtros centrífugos están disponibles en una variedad de tamaños, comúnmente de 0.5 mL a 12 mL.
2. Centrifugar la dispersión a 2000 x g durante 10-20 min (a temperatura ambiente) para aumentar la concentración en un factor de aproximadamente 5-20x.
  NOTA: Durante la centrifugación, revise la muestra cada 5 minutos para asegurarse de que quede una cantidad adecuada de líquido.

5. Caracterización de las LNPs

Mediciones de diámetro hidrodinámico con dispersión dinámica de la luz (DLS)
1. Dispensar 750 μL o 900 μL de la dispersión de LNP preparada (sin diluciones) en una cubeta de plástico micro o cuadrada, respectivamente.
  NOTA: También se pueden utilizar volúmenes más pequeños en cubetas adecuadas.
2. Establezca la viscosidad adecuada para el disolvente en el que se dispersan los LNP (es decir, 1,26 cP para una mezcla de etanol al 10% vol).
3. Recoge la luz retrodispersada en un ángulo de 173° a 25 °C, seguida de la determinación del tamaño de LNP utilizando el modelo de Stokes-Einstein y el primer acumulador de la expansión de la serie de la función de correlación de dispersión de luz tal como se define en el documento de la norma ISO 13321:1996 E.
4. Repita las mediciones al menos tres veces.
Mediciones de potencial zeta
1. Agregue ~ 800 μL de dispersión de LNP preparada en celdas zeta-sizer capilares plegadas.
  NOTA: Para evitar el atrapamiento de burbujas dentro del canal capilar, la mitad del líquido se dispensa en las células, se mantiene boca abajo y luego se gira.
2. Repita las mediciones al menos tres veces.
  NOTA: La conductividad del tampón debe estar entre 0,2 y 2 miliSiemens/cm para obtener los mejores resultados.
Mediciones de la eficiencia de encapsulación (EE) mediante un kit de cuantificación de ARN disponible en el mercado
1. Diluya la cantidad adecuada del tampón Tris-EDTA (TE) 20x a pH 7,5 proporcionado en el kit de ensayo a una concentración 1x utilizando agua sin nucleasas.
2. Prepare una solución de Triton X-100 al 2 % en peso.
3. Diluya la cantidad adecuada de dispersiones de LNP en el tampón TE 1x para producir una concentración de masa total de aproximadamente 0,6 μg/mL para el ARN, con un contenido de etanol inferior al 0,2 % en volumen.
4. Prepare muestras similares a las del paso anterior pero que contengan 0,5% en peso de Triton X-100, que disuelve eficazmente las LNPs, facilitando la diferenciación entre las concentraciones de ARN "libre" y total en ausencia y presencia de Triton X-100, respectivamente.
5. Prepare cantidades adecuadas de soluciones de ARN de control en las concentraciones de 0 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,4 μg/mL, 0,6 μg/mL, 0,8 μg/mL y 1,0 μg/mL en el tampón TE 1x.
  NOTA: Es posible que inicialmente sea necesario diluir el kit de ARN.
6. Repita el paso anterior pero al 0,5% en peso de Triton X-100.
7. Diluya el tinte Ribogreen (incluido en el kit) 200 veces en el tampón 1x TE.
8. Agregue volúmenes apropiados del colorante Ribogreen diluido a todas las soluciones de ARN y muestras de control preparadas, ya sea con o sin Triton X-100. El colorante debe diluirse por igual tanto en el ARN de control como en las soluciones de muestra en un factor de dos. En consecuencia, la dilución total del colorante es 400 veces mayor que su concentración original en el kit de ensayo.
9. Mezcla en vórtice los contenedores.
10. Prepare una placa opaca de 96 pocillos, sin tratar, de fondo plano para su análisis en un lector de placas.
11. Dispense volúmenes de 100 μL de muestras y controles de ARN en celdas separadas de la placa.
  NOTA: Esté atento a la formación de burbujas en soluciones que contengan Triton X-100. Se realizan al menos tres réplicas para cada muestra, lo que requiere al menos 350 μL de muestras.
12. Registre la intensidad de fluorescencia utilizando el lector de placas a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 528 nm, con una duración de iluminación de aproximadamente 10 s por lectura. No es necesario agitar.
  NOTA: El EE se determina a partir de , donde I_{con Triton} e I_{sin Triton} representan la intensidad de fluorescencia promediada de tres réplicas de muestras con y sin Triton X-100, respectivamente, y a_{con Triton} y a_{sin Triton} denotan la pendiente de los ajustes lineales a las dos curvas de calibración promediadas con y sin Triton X-100, respectivamente³¹.

Resultados

El cribado de formulaciones óptimas de LNP puede lograrse rápidamente con cantidades relativamente pequeñas de material utilizando mezcladores turbulentos CIJ de dos flujos, siempre que funcionen a velocidades adecuadas. Se utiliza un mezclador μMIVM accionado por una bomba de jeringa programable, como se muestra en la Figura 3A, para resaltar la importancia de lograr una micromezcla suficiente, por encima de un número crítico de Reynolds, para formar LNP pequeños y monodispersos. La Tabla 3 contiene el resumen de las formulaciones utilizadas para producir LNP, y la configuración del mezclador sigue el protocolo descrito en el paso 3.4. Los tamaños de los LNP se caracterizaron por la dispersión dinámica de la luz (DLS) en función del número de Reynolds. Como se muestra en la Figura 3B, más allá de un Re crítico de 5000, se observan LNP pequeñas y monodispersas. Además, se puede acceder a los números altos de Reynolds (~10^4-10 ⁵) cuando las jeringas se presionan uniformemente mediante la operación manual o mediante el uso del soporte de mezcla (punto de datos más a la derecha en la Figura 3B). El soporte de mezcla, que se muestra en la Figura 2A, presiona uniformemente todas las jeringas simultáneamente²⁷. Como resultado, estos LNP también tienen tamaños óptimos. Con una mezcla inadecuada (es decir, un Re demasiado pequeño), se forman LNP más grandes. En la Figura 3B se muestran fotos representativas de las LNPs formadas a baja (Foto 1) y alta Re (Foto 2). Las muestras tomadas a bajo Re son turbias, lo que indica la presencia de grandes estructuras coloidales de dispersión de luz (efecto Tyndall), pero las LNP formadas a alto Re parecen claras debido a una dispersión más débil y desplazada hacia el azul de los coloides más pequeños.

Los lípidos ionizables tienen diferentes propiedades físico-químicas, que afectan a las propiedades fisicoquímicas de los LNP producidos con formulaciones lipídicas idénticas. Se utiliza un mezclador CIJ (Figura 1A) para probar esto. En la Tabla 4 se enumeran las formulaciones elaboradas con dos lípidos ionizables aprobados por la FDA: ALC-0315 y MC3. La Figura 4A muestra que los LNP producidos a pH 5 a partir de ALC-0315 son de ~80 nm, mientras que los LNP fabricados con MC3 son de ~60 nm. Además, a pH 5, los MC3-LNPs tienen un potencial zeta positivo (~28 mV), mientras que los ALC-LNPs tienen un potencial zeta neutro (<10 mV). Esta distinción en la carga superficial, así como en el tamaño total de las LNP, surge del pKa de los dos lípidos. MC3 tiene un pKa más alto (6,44) en comparación con ALC0315 (6,09)³²; por lo tanto, una fracción mayor de lípidos MC3 se cargan a pH 5. Ambas formulaciones tienen 1,5 mol% de estabilizador de lípidos PEG; sin embargo, los MC3-LNP se estabilizan en un tamaño más pequeño debido a mayores repulsiones electrostáticas durante el ensamblaje de LNP durante la agregación limitada por difusión, lo que detiene el crecimiento en el tamaño más pequeño. Ambas formulaciones muestran altas eficiencias de encapsulación (>90%), como se muestra en la Figura 4B. La química de los lípidos es crucial para determinar las propiedades generales, así como el rendimiento de los LNP y, por lo tanto, deben elegirse cuidadosamente en función de la aplicación objetivo.

Los LNP fabricados utilizando las dos geometrías del mezclador turbulento (paso 2.3 y paso 3.3) tienen propiedades fisicoquímicas similares. Esta comparación se extiende aún más a los LNP elaborados a partir de técnicas de mezcla deficientes, como la mezcla con pipetas a granel, para ilustrar aún más la distinción entre los mezcladores turbulentos y las técnicas de mezcla no uniformes (Figura 1C). En la Tabla 5 se presenta un resumen de las formulaciones utilizadas para la elaboración de LNPs, como se muestra en la Figura 5. En el caso de la técnica de mezcla con pipeta, se mezclan rápidamente volúmenes iguales de etanol y corrientes acuosas pipeteando hacia arriba y hacia abajo durante 15-20 s, seguido de pipeteo de la mezcla en un baño tampón de acetato a pH 4. La Figura 5A muestra que los tamaños de los LNP en el baño tampón de acetato de 10 mM de enfriamiento (pH 4, etanol al 10 % en volumen) son sorprendentemente similares y pequeños (~50 nm) independientemente de la geometría del mezclador utilizada (CIJ o MIVM). Sin embargo, los LNP fabricados con mezcla de pipetas son el doble de grandes que los LNP fabricados con mezcladores turbulentos. Esto demuestra que los LNP fabricados a partir de diferentes geometrías CIJ exhiben propiedades similares cuando se fabrican a velocidades suficientemente altas (régimen turbulento por encima del número crítico de Reynolds), mientras que una mezcla deficiente da como resultado LNP polidispersos más grandes.

A continuación, los LNP se dializan contra un tampón HEPES de 10 mM, pH 7,4 (100x volumen), para eliminar el etanol y cambiar el pH a 7,4. Durante este proceso, se produce cierta fusión y crecimiento de LNP hasta alcanzar un tamaño ligeramente mayor, como se muestra en la Figura 5A, lo que está en línea con el mecanismo de fusión bien estudiado en la literatura³³. En general, los LNP fabricados con mezcladores CIJ y MIVM son de menos de 100 nm, mientras que los LNP fabricados con mezcla de pipetas son de alrededor de 140 nm. Como se muestra en la Figura 5B, los potenciales zeta para estas formulaciones son inferiores a 10 mV, lo que indica que todas son neutras a pH 7,4. Además, todos muestran altas eficiencias de encapsulación de >95% (Figura 5C). Por lo tanto, los LNP con propiedades fisicoquímicas óptimas se pueden fabricar fácilmente utilizando tecnologías de mezcladores turbulentos. El rendimiento de estas LNPs se evalúa mediante la realización de transfección in vitro en células HeLa.

El protocolo de ensayo de transfección in vitro basado en luciferasa se adopta de una publicación anterior³⁴. La Figura 6A traza la luminiscencia (RLU) por 1000 celdas para las tres formulaciones resumidas en la Tabla 5. Lipofectamine 3000 se utiliza como control positivo. Es importante tener en cuenta que lipofectamine 3000 se usa generalmente para formulaciones de ADN; sin embargo, funcionó como un control adecuado en estos experimentos. Los LNP fabricados con mezcladores CIJ de 2 chorros y MIVM de 4 chorros transfieren mucho mejor que los LNP fabricados con mezcla de pipetas. A pesar de que se espera que las partículas más grandes transfecten mejor que las partículas pequeñas debido a la mayor carga útil por LNP, las LNP fabricadas con la mezcla de pipetas aquí transfectan de manera menos efectiva. Esto implica claramente que existe una diferencia significativa en las estructuras de los LNP fabricados con tecnologías CIJ en comparación con los LNP fabricados con mezcla de pipetas. Las eficiencias de transfección de los LNP fabricados con mezcladores CIJ y MIVM son esencialmente idénticas. Lipofectamine 3000 muestra la eficiencia de transfección más baja. En la Figura 6B se evalúa la toxicidad de LNP in vitro en células HeLa utilizando un ensayo de viabilidad celular basado en sal de resazurina sódica³⁵. Todas las formulaciones muestran una baja citotoxicidad, exhibida por altos niveles de viabilidad celular cuando se trazan como un porcentaje de células vivas frente al control que no tiene ningún tratamiento con nanopartículas.

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Figura 1: Métodos de mezcla para la producción de LNPs. (A) El mezclador de chorro de impacto confinado (CIJ) de dos chorros, que muestra una fotografía de un mezclador transparente y una configuración de mezclador Delrin ensamblada que se usa regularmente en el laboratorio. (B) El mezclador de vórtice de entrada múltiple de cuatro chorros (μMIVM) que muestra una fotografía de un mezclador transparente y una configuración de mezclador de acero inoxidable y Delrin ensamblada. Los flujos de entrada para el mezclador transparente se han movido a los lados del mezclador para una mejor visualización de la geometría de la mezcla, mientras que en el mezclador práctico, los flujos de entrada entran desde la parte superior. Tanto el CIJ como el μMIVM funcionan con suficiente velocidad de líquido para que los flujos estén en el régimen turbulento, y la mezcla produce microescalas de Kolmogorov menores que 1 μm, lo que permite alcanzar la supersaturación en ~1,5 ms. (C) La configuración de mezcla de pipeta ampliamente utilizada para preparar pequeños volúmenes de dispersiones de LNP mediante la mezcla de soluciones acuosas y etanólicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Vista ampliada del μMIVM y su soporte de mezcla. (A) μMIVM ensamblado, con jeringas de vidrio, debajo del soporte mezclador que facilita la depresión uniforme y rápida de las jeringas. Esta figura se reproduce de Markwalter et ^al.29. (B) μMIVM desmontado que muestra los componentes interiores. Esta geometría de mezcla es idéntica a la del mezclador transparente de la Figura 1B, excepto que los flujos de entrada entran a través del disco superior y no a través de la superficie cilíndrica lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: El aumento del número de Reynolds en un mezclador turbulento disminuye el diámetro hidrodinámico del LNP hasta un número de Reynolds crítico de meseta. (A) Representación esquemática de la bomba de jeringa y la configuración de μMIVM utilizada para controlar el número de Reynolds en el mezclador turbulento mediante el ajuste de los caudales volumétricos de la corriente. (B) Diámetro hidrodinámico del LNP frente al número de Reynolds en el MIVM. El aumento del número de Reynolds y la disipación de energía turbulenta mejora la mezcla y conduce a una mezcla más homogénea, sobresaturación y crecimiento de partículas. Por encima del número crítico de Reynolds, los tamaños de LNP permanecen constantes con caudales crecientes debido a la condición Da<<1, es decir, el tiempo de difusión del solvente/antisolvente es más corto que el tiempo de ensamblaje del NP. Los caudales indicados son los caudales totales de las cuatro corrientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Propiedades coloidales de las LNPs producidas con diferentes lípidos ionizables. (A) Diámetros hidrodinámicos y potenciales zeta de LNPs producidos con dos lípidos ionizables diferentes: ALC-0315 y MC3. Las mediciones se realizan a pH 5 en el baño de enfriamiento después de la formación de LNP. Las diferencias en el pKa aparente de los lípidos ionizables afectan a las propiedades coloidales de los LNPs. (B) Mediciones de la eficiencia de encapsulación de ambos LNPs (n = 3, las barras de error representan una desviación estándar). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Propiedades coloidales de las LNPs producidas con diferentes mezcladores que encapsulan el ARNm de la luciferasa utilizando el lípido ionizable MC3. (A) Diámetros hidrodinámicos de LNP producidos con mezcladores de 2 chorros, 4 chorros y pipetas. Las mediciones se realizan tanto en las condiciones ácidas del baño de enfriamiento después de la formación de LNP (lado izquierdo) como después de la diálisis en un tampón HEPES neutro (lado derecho). El tamaño de LNP crece durante la neutralización del pH debido a la desionización del lípido ionizable, lo que conduce a la fusión y el crecimiento de LNP. El estabilizador de lípidos-PEG detiene este crecimiento de coalescencia de partículas antes de la formación de precipitados de tamaño micrométrico. (B) Mediciones de carga superficial (como potencial ζ) en LNP dializados en la condición HEPES de 10 mM, pH 7,4. Todos los LNP están dentro de los 2 mV de 0 mV, lo que indica que estas superficies de partículas son neutras y tienen solo una cantidad casi indetectable de carga catiónica. (C) Mediciones de la eficiencia de encapsulación después de la diálisis de LNP (n = 3, las barras de error representan una desviación estándar). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Transfección de células HeLa con LNPs preparadas. (A) Luminiscencia de la enzima luciferasa expresada después del tratamiento con luciferina. (B) Viabilidad de las células HeLa después de la incubación con LNPs. Las células no muestran cambios estadísticamente significativos en la viabilidad, como lo indica un ensayo metabólico de resazurina (n = 4, las barras de error representan una desviación estándar). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Corriente(s) / Baño de enfriamiento	Componente	Formulación	Acción	Volumen
Jeringa 1 - Flujo de etanol (6 mg/mL de lípidos totales)	Lípido ionizable (MC3)	50 mol%	50 mg/mL	0,5 ml
	Lípido de Zwitterion (DSPC)	10 mol%	5 mg/mL
	Colesterol	38.5 mol%	5 mg/mL
	Lípidos pegilados (DMG-PEG2000)	1,5 mol%	4 mg/mL
Jeringa 2 - Corriente acuosa (0,3 mg/mL de ARN)	ARN de levadura	N/P 6	10 mg/mL	0,5 ml
Jeringa 2 - Corriente acuosa (0,3 mg/mL de ARN)	Tampón de acetato	20 mM, pH 4	100 mM, pH 4	0,5 ml
Baño de enfriamiento	Tampón de acetato	10 mM, pH 4	100 mM, pH 4	4 mL

Tabla 1: Formulación estándar de patisiran LNP producida por un mezclador CIJ. El ARN de levadura se utiliza como ARN modelo para este protocolo. Todas las soluciones se disuelven molecularmente y se mezclan completamente antes de cargarlas en las jeringas.

Corriente(s) / Baño de enfriamiento	Componente	Formulación	Acción	Volumen
Jeringa 1 - Flujo de etanol (6 mg/mL de lípidos totales)	Lípido ionizable (MC3)	50 mol%	50 mg/mL	0,5 ml
	Lípido de Zwitterion (DSPC)	10 mol%	5 mg/mL
	Colesterol	38.5 mol%	5 mg/mL
	Lípidos pegilados (DMG-PEG2000)	1,5 mol%	4 mg/mL
Jeringa 2 - Corriente acuosa (0,3 mg/mL de ARN)	ARN de levadura	N/P 6	10 mg/mL	0,5 ml
Jeringa 2 - Corriente acuosa (0,3 mg/mL de ARN)	Tampón de acetato	20 mM, pH 4	100 mM, pH 4	0,5 ml
Jeringa 3 - Flujo de etanol (6 mg/mL de lípidos totales)	Lípido ionizable (MC3)	50 mol%	50 mg/mL	0,5 ml
	Lípido de Zwitterion (DSPC)	10 mol%	5 mg/mL
	Colesterol	38.5 mol%	5 mg/mL
	Lípidos pegilados (DMG-PEG2000)	1,5 mol%	4 mg/mL
Jeringa 4 - Corriente acuosa (0,3 mg/mL de ARN)	ARN de levadura	N/P 6	10 mg/mL	0,5 ml
Jeringa 4 - Corriente acuosa (0,3 mg/mL de ARN)	Tampón de acetato	20 mM, pH 4	100 mM, pH 4	0,5 ml
Baño de enfriamiento	Tampón de acetato	10 mM, pH 4	100 mM, pH 4	8 mL

Tabla 2: Formulación estándar de patisiran LNP producida por un mezclador MIVM. Un mezclador MIVM utiliza cuatro flujos: dos solventes y dos antisolventes. Se pueden utilizar corrientes con momentos desiguales; sin embargo, se eligen flujos con momentos iguales para este protocolo.

Corriente(s) / Baño de enfriamiento	Componente	Formulación	Acción	Volumen
Jeringa 1 - Flujo de etanol (6 mg/mL de lípidos totales)	Lípido ionizable (MC3)	50 mol%	50 mg/mL	20 mL
	Lípido de Zwitterion (DSPC)	10 mol%	5 mg/mL
	Colesterol	38.5 mol%	5 mg/mL
	Lípidos pegilados (DMG-PEG2000)	1,5 mol%	4 mg/mL
Jeringa 2 - Corriente acuosa (0,3 mg/mL de ARN)	ARN de levadura	N/P 6	10 mg/mL	20 mL
Jeringa 2 - Corriente acuosa (0,3 mg/mL de ARN)	Tampón de acetato	20 mM, pH 4	100 mM, pH 4	20 mL
Jeringa 3 - Flujo de etanol (6 mg/mL de lípidos totales)	Lípido ionizable (MC3)	50 mol%	50 mg/mL	20 mL
	Lípido de Zwitterion (DSPC)	10 mol%	5 mg/mL
	Colesterol	38.5 mol%	5 mg/mL
	Lípidos pegilados (DMG-PEG2000)	1,5 mol%	4 mg/mL
Jeringa 4 - Corriente acuosa (0,3 mg/mL de ARN)	ARN de levadura	N/P 6	10 mg/mL	20 mL
Jeringa 4 - Corriente acuosa (0,3 mg/mL de ARN)	Tampón de acetato	20 mM, pH 4	100 mM, pH 4	20 mL
Baño de enfriamiento (Tiempo de recogida = 30 s)	Búfer HEPES	10 mM, pH 7,5	1 M, pH 7,5	320 mL

Tabla 3: Formulación de LNP producida por un mezclador MIVM accionado por una bomba de jeringa. DODMA se utiliza como lípido ionizable junto con el ARN de levadura como ARN modelo. Se elige un ejemplo de ejecución con 40 mL/min para este protocolo.

Corriente(s) / Baño de enfriamiento	Componente	Formulación	Acción	Volumen
Jeringa 1 - Flujo de etanol (12 mg/mL de lípidos totales)	Lípido ionizable (MC3 o ALC0315)	50 mol%	50 mg/mL	0,5 ml
	Lípido de Zwitterion (DSPC)	10 mol%	5 mg/mL
	Colesterol	38.5 mol%	5 mg/mL
	Lípidos pegilados (DMG-PEG2000)	1,5 mol%	4 mg/mL
Jeringa 2 - Corriente acuosa (0,6 mg/mL de ARN)	ARN de levadura	N/P 6	10 mg/mL	0,5 ml
Jeringa 2 - Corriente acuosa (0,6 mg/mL de ARN)	Tampón de acetato	20 mM, pH 5	100 mM, pH 5	0,5 ml
Baño de enfriamiento	Tampón de acetato	10 mM, pH 5	100 mM, pH 5	9 mL

Tabla 4: Formulaciones de LNP a partir de dos lípidos ionizables diferentes producidos por un mezclador CIJ. Las formulaciones se elaboran a partir de ALC-0315 o MC3, mientras que todos los demás componentes se mantienen iguales.

Corriente(s) / Baño de enfriamiento	Componente	Formulación	Acción	Volumen
Jeringa 1 - Flujo de etanol (6 mg/mL de lípidos totales)	Lípido ionizable (MC3)	50 mol%	50 mg/mL	0,5 ml
	Lípido de Zwitterion (DSPC)	10 mol%	5 mg/mL
	Colesterol	38.5 mol%	5 mg/mL
	Lípidos pegilados (DMG-PEG2000)	1,5 mol%	4 mg/mL
Jeringa 2 - Corriente acuosa (0,3 mg/mL de ARN)	ARNm FLuc	N/P 6	1 mg/mL	0,5 ml
Jeringa 2 - Corriente acuosa (0,3 mg/mL de ARN)	Tampón de acetato	20 mM, pH 4	100 mM, pH 4	0,5 ml
Baño de enfriamiento	Tampón de acetato	10 mM, pH 4	100 mM, pH 4	4 mL

Tabla 5: Formulación estándar de patisiran LNP producida por un mezclador CIJ. El ARNm de FLuc que expresa una proteína luciferasa se emplea para medir la expresión génica mediante un ensayo de bioluminiscencia.

Fichero complementario 1: Proveedores de mezcladores CIJ y MIVM. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Se ha presentado la síntesis de LNPs que contienen polímeros de ácidos nucleicos utilizando dos mezcladores turbulentos de chorro de impacto confinado. Cuando se llevan a cabo a velocidades adecuadas, los mezcladores turbulentos CIJ garantizan que la escala de tiempo de mezcla sea más corta que el tiempo de ensamblaje del LNP, lo que produce condiciones de supersaturación homogéneas para formar LNP pequeños con distribuciones de tamaño estrechas²¹. En consecuencia, los LNP fabricados con la misma química utilizando diferentes geometrías de mezclador turbulento (el CIJ de 2 chorros y el mezclador MIVM de 4 chorros) exhiben propiedades fisicoquímicas similares y muestran buenas eficiencias de transfección (Figura 5 y Figura 6). Por el contrario, los LNP elaborados mediante pipeteo que produce una mezcla más pobre dan como resultado LNP más grandes y polidispersos (Figura 5A) con menores eficiencias de transfección. Desde hace mucho tiempo se sabe que la cinética de mezcla y ensamblaje juega un papel importante en el procesamiento de LNP; Cullis et al. observaron que la mezcla convectiva-difusiva rápida de etanol y tampón conduce a la formación de partículas pequeñas con una distribución de tamaño estrecha, mientras que la mezcla difusiva lenta conduce a partículas más grandes con distribuciones de tamaño amplias⁹. La escala de tiempo de mezcla en los mezcladores turbulentos CIJ disminuye proporcionalmente a los caudales de entrada de las corrientes al mezclador²⁷. Esto se cuantifica mediante el número adimensional de Reynolds (Re), que mide la relación entre las fuerzas inercial y viscosa. La turbulencia dentro de las cámaras de mezcla de la CIJ y la MIVM se produce a un Re suficientemente alto, de modo que el estiramiento del vórtice turbulento da lugar a pequeñas escalas de longitud que producen una rápida mezcla de disolvente/antidisolvente por difusión. La escala de longitud turbulenta depende del Re y no de la geometría específica del dispositivo de mezcla. Esa es la razón por la que el CIJ o el MIVM producen las mismas partículas de LNP, y por qué varios tamaños de mezcladores MIVM producen los mismos tamaños de NP²⁷. A alta Re, correspondiente a altas velocidades de entrada, los LNP se pueden producir de manera reproducible sin variaciones de lote a lote (Figura 3B).

Este protocolo permite la formulación de una variedad de LNPs de ARNm, ADN o ARNip con diferentes propiedades fisicoquímicas utilizando mezcladores CIJ turbulentos. Además de permitir versatilidad en la composición y las concentraciones, esta técnica proporciona un camino claro para seleccionar rápidamente las formulaciones en el banco (unos pocos miligramos) y escalar las formulaciones principales a tamaños de lote industrial más grandes a tasas de producción de 5 L/min³⁶. Esto ha sido un obstáculo importante para varias otras técnicas, como la mezcla a granel y la microfluídica. Por ejemplo, las técnicas de procesamiento a granel no logran fabricar LNP de manera consistente y reproducible, incluso en escalas de unos pocos mililitros. Las técnicas microfluídicas proporcionan una mejora significativa con respecto a las técnicas de mezcla a granel para permitir la producción de LNP uniformes y reproducibles; sin embargo, solo están en el rango de miligramos²⁹. Como se detalla en la introducción, la paralelización de dispositivos microfluídicos proporciona un intento de escalar a escalas de producción, pero no elimina el problema del ensuciamiento, y no se puede escalar con tanto éxito como los mezcladores basados en la tecnología de chorro de impacto confinado.

Aparte de estas ventajas, los mezcladores CIJ serán fundamentales en la fabricación de LNP de próxima generación que exhiban capacidades de orientación o realicen edición de genes. Las formulaciones actuales de LNP tienen lípidos y ácidos nucleicos que tienen difusividades similares y, por lo tanto, se pueden hacer incluso con una mezcla ligeramente pobre a escala de laboratorio. Sin embargo, los enfoques de edición genética pueden requerir la encapsulación de especies de ácidos nucleicos con pesos moleculares muy diferentes, como pequeñas moléculas de ARN guía y grandes transcripciones de ARNm, para codificar una proteína CAS9³⁷. Las muy diferentes escalas de tiempo de difusión de estas diferentes especies hacen que la encapsulación uniforme en proporciones estequiométricas sea un desafío. Este problema de encapsulación uniforme se vuelve más pronunciado a medida que la eficiencia de la mezcla se vuelve más pobre. Del mismo modo, las células no hepáticas dirigidas podrían necesitar la incorporación de estabilizadores de difusión lenta fuertemente unidos (como los copolímeros de bloque de gran peso molecular con ligandos dirigidos). Los ligandos dirigidos de hasta 14 kDa se pueden conjugar para bloquear copolímeros antes del ensamblaje de nanopartículas, lo que permite su incorporación uniforme en NP mediante la mezcla CIJ³⁸. Los mezcladores turbulentos CIJ son herramientas útiles para la fabricación de LNP fabricados con componentes que tienen diferentes difusividades.

Si bien los mezcladores turbulentos CIJ demuestran varias ventajas sobre otros mezcladores para formular LNP, es importante tener en cuenta las limitaciones asociadas con cada geometría. El mezclador CIJ de 2 chorros requiere que ambas corrientes de entrada (etanol y agua) tengan momentos iguales (dentro del 10%-30%) para lograr una micromezcla turbulenta uniforme en la cámara. El hecho de que la corriente de salida comprenda 50:50 solvente/antisolvente limita el nivel de sobresaturación en la cavidad de mezcla donde se produce la precipitación²⁹. Este inconveniente se soluciona con el mezclador MIVM de 4 chorros, ya que puede utilizar cuatro chorros con momentos desiguales para lograr condiciones de alta supersaturación en la cámara de mezcla. Además, ambos mezcladores deben estar en el orden de miligramos de masa total, lo que los convierte en una opción no ideal para el cribado de alto rendimiento de muchas formulaciones diferentes de LNP. En el caso de formulaciones simples de LNP, el cribado puede realizarse mejor con microfluídica o estrategias de pipeteo a escalas de microgramos y luego transferirse a la tecnología de chorro de impacto confinado cuando se hayan identificado algunas formulaciones de plomo. También es crucial tener en cuenta los volúmenes muertos en los mezcladores. En el CIJ, dos mezcladores de chorro, los volúmenes de retención son de 50 a 100 microlitros. Esta cantidad de material debe restarse de la cantidad capturada en el baño de enfriamiento al calcular la recuperación del proceso. Estas pérdidas son insignificantes cuando se opera a gran escala, pero representarían pérdidas del 10% cuando se producen volúmenes totales de 5 mL, como se muestra aquí. Los mezcladores turbulentos de chorro que inciden son una herramienta valiosa para producir LNP a escala GMP, como lo demuestran las dos vacunas COVID-19 aprobadas por la FDA.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Beca NSF a BKW (DGA1148900), apoyo de Tessera Therapeutics Inc., la Fundación Bill y Melinda Gates (BMGF, números de contrato OPP1150755 e INV-041182) y la FDA bajo el laudo 75F40122C00186.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
18:0 PC (DSPC)	Avanti Polar Lipids	850365P	Lípido auxiliar
21 G x 1-1/2 pulg. Aguja BD PrecisionGlide	BD	305167
96 Pozo Pared Negra Placa inferior negra	Fisher Scientific	07-000-135
96 Pocillo Placa inferior blanca/transparente, TC Surface	Thermo Fisher Scientific	165306
Ácido Acético, Glacial	Fisher Scientific	A38-212
ALC-0315	Avanti Polar Lipids	890900	Lípido ionizable
Filtro ultracentrífugo Amicon, 100 kDa MWCO, 15 mL	Millipore Sigma	UFC910024
Filtro ultracentrífugo Amicon, 100 kDa MWCO, 4 mL	Millipore Sigma	UFC810096
Sistema de ensayo de luciferasa Bright-Glo Promega		E2620
Colesterol	Millipore Sigma	C8667
CleanCap FLuc mRNA (5 moU)	Trilink Biotechnologies	L-7202
Mezclador de chorros de impacto confinados	Holland Applied Technologies, Helix Biotech, Diamond Tool and Die (DTD)	N/A	Póngase en contacto con Holland o DTD para pedidos personalizados y el sistema Helix Biotech es Nova BT. Texto de revisión para la validación del nuevo mezclador
D-Lin-MC3-DMA	MedChemExpress	HY-112251	Lípido ionizable
DMEM, glucosa alta, piruvato	Thermo Fisher Scientific	11995065
DMG-PEG 2000	Avanti Lípidos Polares	880151P	Lípidos PEG
DODMA	Avanti Lípidos Polares	890899P	Lípidos ionizables
Etanol 200 Proof	Decon Labs, Inc.	2701
Falcon 15 mL Tubos de Centrífuga Cónicos	Fisher Scientific	14-959-70C
Falcon 50 mL Tubos de Centrífuga Cónicos de Alta Claridad	Fisher Scientific	14-959-49A
Suero Fetal Bovino, certificado, Estados Unidos	Thermo Fisher Scientific	16000044
HeLa	ATCC	CCL-2
HEPES, IBI de ácido libre	Scientific	IB01130
HSW HENKE-JECT de dos partes de 1 mL Luer	Henke Sass Wolf	4010.200V0
HSW HENKE-JECT de dos partes de 5 mL (6 mL) Luer Lock	Henke Sass Wolf	4050.X00V0
Idex 1648 Tubo de ETFE ” Diámetro exterior 0.093" ID	Idex Salud & Ciencia	1648
Idex P-678 y frac14; "-28 a Luer fitting	Idex Health & Férula Science	P-678
Idex P-940 para tubos de ETFE	Idex Health & Science	P-940
Lipofectamine 3000 Reactivo de transfección	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Luer fitting	Idex Health & Science	P-604	Ensamble en la entrada del mezclador CIJ o MIVM con las roscas correspondientes. Las piezas Idex también están disponibles a través de VWR y muchos otros proveedores
Soporte mezclador	Holland Applied Technologies	N/A	Ver Markwalter & Prud'homme for design.²⁶ Póngase en contacto con Holland para comprar
el mezclador de vórtice de entrada múltiple	Holland Applied Technologies y Diamond Tool and Die (DTD)	N/A	Póngase en contacto con Holland o DTD para pedidos personalizados. Revise el texto para la validación del nuevo mezclador
Junta tórica (MIVM)	C.E. Conover	MM1.5 35.50 V75	Pedido a granel - pieza consumible. Garantice la compatibilidad con el disolvente si utiliza una fuente alternativa.
Casquillo de salida - CIJ	Idex Health & Science	P-200	Ensamblar con accesorio de salida (extremo grande al ras con tubo)
Accesorio de salida - CIJ	Idex Health & Ciencia	P-205	Ensamble con férula y tubo en la salida de la cámara CIJ
Accesorio de salida - MIVM	Idex Health & Science	P-942	Combinación con férula
Tubo de salida - CIJ	Idex Health & Ciencia	1517	Use un cortador de tubos para los extremos limpios. Asegúrese de que los tubos adicionales no sobresalgan en la cámara de mezcla
Tubo de salida - MIVM	N/A	N/A	Ajuste a la férula ID.
PBS - Solución salina tamponada con fosfato (10x) pH 7.4, libre de RNasa	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
PHD 2000 Bomba de jeringa programable	Harvard Apparatus N	/A Jeringa
de plástico de dos piezas 1 mL	Thermo Fisher Scientific	S7510-1
Conexión de	tapónIdex Salud & Science	P-309	Ensamble en los lados del mezclador CIJ (sellar el punto de acceso de la perforación)
Quant-it Kit de ensayo de ARN RiboGreen y reactivo de ARN RiboGreen, RediPlate 96 Kit de cuantificación de ARN RiboGreen	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	R11491
Resazurina, sal de sodio	Thermo Fisher Scientific	R12204
RNase AWAY Descontaminante de superficies	Thermo Fisher Scientific	7000TS1
Frasco de centelleo	DWK Lifesciences	74504-20
SGE Jeringas herméticas al gas, Luer Lock, 100 mL	SGE	100MR-LL-GT
SGE Jeringas herméticas al gas, Luer Lock, 50 mL	SGE	50MR-LL-GT
Slide-A-Lyzer Casetes de diálisis, 20 K MWCO	Thermo Fisher Scientific	66012
Acetato de sodio	Millipore Sigma	32319-500G-R
Hidróxido de sodio	Fisher Scientific	S320-500
Sacarosa	Millipore Sigma	S7903-1KG
Filtros de jeringa, estériles	Genesse Scientific	25-243
Triton X-100	Millipore Sigma	9036-19-5
Tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenol	Thermo Fisher Scientific	25200056
Agua, libre de endotoxinas	Calidad Biológico	118-325-131	ARNasa y ARN de levadura libre de ADNasa
(10 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	AM7118

Referencias

Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 6 (12), 1078-1094 (2021).
Dowdy, S. F., Setten, R. L., Cui, X. -S., Jadhav, S. G. Delivery of RNA therapeutics: The great endosomal escape. Nucleic Acid Ther. 32 (5), 361-368 (2022).
Eygeris, Y., Patel, S., Jozic, A., Sahay, G. Deconvoluting lipid nanoparticle structure for messenger RNA delivery. Nano Lett. 20 (6), 4543-4549 (2020).
Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. Lipid nanoparticles─from liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement. ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).
Buck, J., Grossen, P., Cullis, P. R., Huwyler, J., Witzigmann, D. Lipid-based DNA therapeutics: Hallmarks of non-viral gene delivery. ACS Nano. 13 (4), 3754-3782 (2019).
Semple, S. C., et al. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nat Biotechnol. 28 (2), 172-176 (2010).
Lam, K., et al. trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications. Adv Mater. 35 (15), 2209624(2023).
Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).
Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375(2018).
Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Ther. 28 (3), 146-157 (2018).
Jürgens, D. C., et al. Lab-scale siRNA and mRNA LNP manufacturing by various microfluidic mixing techniques - an evaluation of particle properties and efficiency. OpenNano. 12, 100161(2023).
Wang, X., et al. Preparation of selective organ-targeting (sort) lipid nanoparticles (LNPs) using multiple technical methods for tissue-specific mRNA delivery. Nat Protoc. 18 (1), 265-291 (2023).
Yanez Arteta, M., et al. Successful reprogramming of cellular protein production through mRNA delivered by functionalized lipid nanoparticles. Proc Natl Acad Sci. 115 (15), E3351-E3360 (2018).
Eygeris, Y., Gupta, M., Kim, J., Sahay, G. Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery. Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2022).
Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Lett. 21 (13), 5671-5680 (2021).
Leung, A. K. K., Tam, Y. Y. C., Chen, S., Hafez, I. M., Cullis, P. R. Microfluidic mixing: A general method for encapsulating macromolecules in lipid nanoparticle systems. J Phys Chem B. 119 (28), 8698-8706 (2015).
Prakash, G., et al. Microfluidic fabrication of lipid nanoparticles for the delivery of nucleic acids. Adv Drug Deliv Rev. 184, 114197(2022).
Carvalho, B. G., Ceccato, B. T., Michelon, M., Han, S. W., De La Torre, L. G. Advanced microfluidic technologies for lipid nano-microsystems from synthesis to biological application. Pharmaceutics. 14 (1), 141(2022).
Webb, C., et al. Using microfluidics for scalable manufacturing of nanomedicines from bench to GMP: A case study using protein-loaded liposomes. Int J Pharm. 582, 119266(2020).
Warne, N., et al. Delivering 3 billion doses of comirnaty in 2021. Nat Biotechnol. 41 (2), 183-188 (2023).
Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Flash nanoprecipitation of organic actives and block copolymers using a confined impinging jets mixer. Aust J Chem. 56 (10), 1021-1024 (2003).
Hogarth, C., et al. Evaluating the impact of systematic hydrophobic modification of model drugs on the control, stability and loading of lipid-based nanoparticles. J Mater Chem B. 9 (48), 9874-9884 (2021).
Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 1, e37(2012).
D'addio, S. M., Prud'homme, R. K. Controlling drug nanoparticle formation by rapid precipitation. Adv Drug Deliv Rev. 63 (6), 417-426 (2011).
Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Phys Rev Lett. 91 (11), 118302(2003).
Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. J Pharm Sci. 101 (10), 4018-4023 (2012).
Markwalter, C. E., Prud'homme, R. K. Design of a small-scale multi-inlet vortex mixer for scalable nanoparticle production and application to the encapsulation of biologics by inverse flash nanoprecipitation. J Pharm Sci. 107 (9), 2465-2471 (2018).
Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Chemical processing and micromixing in confined impinging jets. AIChE. 49, 2264-2282 (2003).
Markwalter, C. E., Pagels, R. F., Wilson, B. K., Ristroph, K. D., Prud'homme, R. K. Flash nanoprecipitation for the encapsulation of hydrophobic and hydrophilic compounds in polymeric nanoparticles. J Vis Exp. (143), e58757(2019).
Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P., Dugas, J., Zarraga, I. E., Bandekar, A. Formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform. J Vis Exp. (168), e62226(2021).
Bizmark, N., et al. Ribogreen fluorescent assay kinetics to measure ribonucleic acid loading into lipid nanoparticle carriers. Adv Mater Interfaces. 11 (17), 2301083(2024).
Zhang, C., et al. Modification of lipid-based nanoparticles: An efficient delivery system for nucleic acid-based immunotherapy. Molecules. 27 (6), 1943(2022).
Kulkarni, J. A., et al. Fusion-dependent formation of lipid nanoparticles containing macromolecular payloads. Nanoscale. 11 (18), 9023-9031 (2019).
El-Mayta, R., Padilla, M. S., Billingsley, M. M., Han, X., Mitchell, M. J. Testing the in vitro and in vivo efficiency of mRNA-lipid nanoparticles formulated by microfluidic mixing. J Vis Exp. (191), e64810(2023).
Scalzo, S., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated delivery of plasmid DNA in cardiomyocytes. Int J Nanomed. 17, 2865-2881 (2022).
Feng, J., Markwalter, C. E., Tian, C., Armstrong, M., Prud'homme, R. K. Translational formulation of nanoparticle therapeutics from laboratory discovery to clinical scale. J Transl Med. 17 (1), 200(2019).
Kazemian, P., et al. Lipid-nanoparticle-based delivery of CRISPR/cas9 genome-editing components. Mol Pharm. 19 (6), 1669-1686 (2022).
Pinkerton, N. M. Polymeric drug delivery vehicles and imaging agents. Princeton University. , PhD thesis, http://arks.princeton.edu/ark:/88435/dsp01h128nd846 (2014).

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