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Imágenes de radiosíntesis, control de calidad y tomografía por emisión de positrones en animales pequeños de 68nanomoléculas marcadas con Ga

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DOI:

10.3791/67048

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4 de octubre de 2024

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1Department of Nuclear Medicine, University Hospital RWTH Aachen, 2Department of Radiology and Nuclear Medicine, Maastricht University Medical Center, 3School of Nutrition and Translational Research in Metabolism (NUTRIM), Maastricht University, 4School for Cardiovascular Diseases (CARIM), Maastricht University

En este artículo

Resumen

Este artículo describe la radiosíntesis, la formulación y el control de calidad de una nueva sonda radiomarcada (es decir, NANOBODY NM-02 marcada con 68Ga) y su uso para la obtención de imágenes PET/CT de animales pequeños en un modelo de xenoinjerto.

Resumen

Las técnicas de imagen de tomografía por emisión de positrones (PET) y tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) para animales pequeños son cruciales en la investigación preclínica del cáncer, lo que requiere una atención meticulosa a la síntesis de radiotrazadores, el aseguramiento de la calidad y los protocolos de inyección in vivo . Este estudio presenta un flujo de trabajo integral diseñado para mejorar la robustez y la reproducibilidad de los experimentos de PET con animales pequeños. Se detalla el proceso de síntesis en el laboratorio de radioquímica utilizando 68Ga, destacando los estrictos protocolos de control de calidad y garantía para cada producción de radiotrazadores. Parámetros como la concentración, la actividad molar, el pH y la pureza se controlan rigurosamente, alineándose con los estándares aplicables a los estudios en humanos. Esta metodología introduce una preparación simplificada de la jeringa y una cánula de 30G diseñada a medida para inyecciones intravenosas precisas en ratones. El control de la salud de los animales durante la exploración, incluida la temperatura y la frecuencia cardíaca, garantiza su bienestar durante todo el procedimiento. Las dosis para las exploraciones PET y SPECT están predeterminadas para equilibrar la adquisición de datos con la minimización de la exposición a la radiación para los animales y los investigadores. De manera similar, las tomografías computarizadas emplean configuraciones preprogramadas para limitar la exposición a la radiación, especialmente pertinente en estudios a largo plazo que evalúan los efectos del tratamiento. Al optimizar estos pasos, el flujo de trabajo tiene como objetivo estandarizar los procedimientos, reducir la variabilidad y mejorar la calidad de las imágenes PET/SPECT/CT de animales pequeños. Este recurso proporciona información valiosa para los investigadores que buscan mejorar la precisión y la fiabilidad de las investigaciones preclínicas en imágenes moleculares y, en última instancia, hacer avanzar el campo.

Introducción

Un tema de suma relevancia es la investigación en el campo del cáncer de mama. Elcáncer de mama sigue siendo un cáncer frecuente, que representa aproximadamente 1/3 de todos los cánceres en las mujeres. El tratamiento se adapta a las características biológicas e histológicas del tumor y al estadio de la enfermedad. La probabilidad de supervivencia es generalmente buena, a menos que el tumor ya haya hecho metástasis, en cuyo caso la supervivencia a 5 años es solo de alrededor del 30%1. Otros cánceres ginecológicos sufren un destino similar, por ejemplo, el cáncer de ovario muestra > 95% de supervivencia a 5 años para los tumores en etapa 1, pero solo 15% para los tumores con metástasis en etapa 4 2,3.

Las imágenes no invasivas, en particular la tomografía por emisión de positrones (PET), han transformado la investigación del cáncer, ya que ofrecen información sin precedentes sobre los aspectos moleculares del tumor, como el metabolismo, la expresión de los receptores y la respuesta terapéutica 4,5,6. Permite tanto la visualización como la cuantificación de áreas metabólicas específicas, lo que permite no solo diagnosticar con precisión, sino también monitorear el efecto de (nuevas) terapias en puntos de tiempo muy cortos. De hecho, la PET permite evaluar la respuesta frente a la falta de respuesta después de 1-3 ciclos de terapia y lo hace mejor y más rápido en comparación con los cambios morfológicos observados por las imágenes clásicas de tomografía computarizada (TC)7. La naturaleza no invasiva de la PET también permite estudios longitudinales.

Cualquier modelo animal requiere la máxima estandarización para evaluar a fondo la capacidad terapéutica de los nuevos productos farmacéuticos (radiactivos), por lo que hay que hacer hincapié en ello, tanto en la generación del modelo tumoral como en el análisis de datos e imágenes PET de animales pequeños. Se podría debatir sobre el mejor modelo tumoral en animales (inoculación subcutánea o implante ortotópico, tumores en ratones, humanos o singénicos, acompañados o no de cuidados clínicos rutinarios), pero eso estaría más allá del objetivo de esta publicación. Utilizamos varios modelos para los estudios del cáncer, y el que se describe aquí es un modelo subcutáneo relativamente simple.

El control de calidad en radioquímica es primordial para la seguridad de los animales y la eficacia del tratamiento. Esto no solo afecta al radiofármaco en sí, sino también a la formulación del producto. Existe una amplia legislación sobre la producción de radiofármacos para aplicaciones clínicas 8,9 (véase 10 para una amplia visión general de la legislación y las directrices actuales), y varias directrices sobre las propiedades de los radiofármacos para la investigación preclínica (véase 11 para una visión más amplia). Producimos radiofármacos tanto para aplicaciones clínicas como preclínicas, simplificando la traslación del control de calidad de alta gama que se encuentra en las síntesis para aplicaciones clínicas a las aplicaciones preclínicas.

Nuestra investigación se centra en los teranósticos dirigidos, especialmente en los cánceres positivos para el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2). Por lo tanto, desarrollamos nuevos radiofármacos para diagnosticar y monitorear el cáncer durante el tratamiento. Los radiofármacos de diagnóstico exitosos también se evalúan como compuestos terapéuticos utilizando diferentes radioisótopos. La evaluación de estos radiofármacos se realiza inicialmente en modelos animales, esforzándose por la traslación clínica tras resultados preclínicos prometedores. En este artículo, presentaremos los protocolos utilizados, ejemplificados con un radiofármaco, para garantizar el control y la garantía de calidad, así como la práctica estándar para la inyección intravenosa en ratón y la exploración PET/CT, con el fin de mejorar la precisión y fiabilidad de las investigaciones preclínicas en imagen molecular. El protocolo se divide en tres secciones diferentes: radioquímica (síntesis de trazadores y control de calidad), generación de modelos animales (modelo de tumor subcutáneo) e imagenología.

Protocolo

El protocolo de investigación se adhiere a los más altos estándares de bienestar animal y está en estricta conformidad con las Directrices de Cuidado Animal del Hospital Universitario RWTH de Aquisgrán. Estamos comprometidos a garantizar el trato ético y humanitario de todos los animales involucrados en los estudios, y los procedimientos son revisados y aprobados por el comité de ética animal local. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por una autoridad competente alemana (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, LANUV) para cumplir con la Ley de Protección Animal, junto con el reglamento para la protección de animales utilizados para experimentación y otros fines científicos.

NOTA: En la Tabla de Materiales se proporciona una lista completa de los equipos, materiales y reactivos utilizados a lo largo de este estudio. Es importante tener en cuenta que la manipulación de 68Ga debe realizarse con pipeta siempre que sea posible y, por supuesto, evitar cualquier metal, ya que el hierro puede reducir enormemente el rendimiento del etiquetado. Esto significa que se deben evitar las agujas hasta que se completen los procedimientos radioquímicos.

1. Radioquímica

  1. Radiomarcaje de NM-02-DOTA-GA con 68Ga
    ATENCIÓN: El protocolo implica el manejo y manipulación de materiales radiactivos. Los investigadores deben seguir la legislación local sobre el manejo de materiales radiactivos, las prácticas ALARA (tan bajas como sea razonablemente posible), trabajar con blindaje de plomo, minimizar el tiempo de contacto directo y mantener la distancia máxima en cada paso de la exposición a la radiación. Los procedimientos experimentales deben ser monitoreados con dispositivos de detección de radiactividad.
    1. Eluir el generador de 68Ge/68Ga de forma manual o automática en 10 mL de HCL de 0,6 M (1,2 GBq/10 mL). Atrape el 68Ga en un cartucho PS-H+ (tamaño M - 0,8 mL) pasando el eluido a través del cartucho. Eluir el cartucho PS-H+ SPE con un total de 1 mL de NaCl 4 M de forma escalonada y lenta en un tubo de microcentrífuga.
    2. Deseche los primeros 0,3 mL del eluido y recoja los 0,7 mL restantes en otro tubo de microcentrífuga.
    3. Tome un nuevo tubo de microcentrífuga y proceda con el radiomarcaje de NM-02-DOTA-GA como se indica en el protocolo del fabricante.
      NOTA: El conjugado nanocuerpo-quelante (NM-02-DOTA-GA) fue previamente preparado de acuerdo con el protocolo del proveedor. El conjugado puede almacenarse en alícuotas a -80 °C durante varios meses.
    4. Ajustar el pH del producto en torno a 7 utilizando hasta 5 μL de 3 M NH4OAc.
  2. Control de calidad
    1. Mida la actividad de la muestra concentrada en el tubo de microcentrífuga utilizando un medidor de actividad en la configuración correcta (68Ga como isótopo; 1 mL de jeringa, 0,1 mL para geometría). El rendimiento radioquímico (corregido por desintegración) debe ser de al menos el 40%.
    2. Determine el pH con una tira reactiva de pH (0-14) detectando una cantidad suficiente en la tira reactiva de pH (10-15 μL).
    3. Cromatografía en capa fina (TLC)
      1. Localice 1 μL de la mezcla de reacción de radiomarcaje en una tira de TLC impregnada de sílice. Deje que la alícuota se seque durante aproximadamente 1 minuto. Ejecute el TLC utilizando ácido cítrico como fase móvil, precargado durante unos 2-3 mm, en una cámara TLC cerrada. Retire la tira de TLC de la cámara cuando el líquido haya alcanzado la parte superior de la tira.
      2. Coloque la tira de TLC en un escáner de radio-TLC y mídala de acuerdo con el protocolo del fabricante. El producto debe aparecer en el origen (Rf < 0,2), mientras que los cationes libres de 68Ga eluirán con el frente del disolvente (Rf > 0,9).
      3. Calcule el rendimiento de radiomarcaje de la reacción utilizando el radiocromatograma, dividiendo el área integrada bajo la curva (AUC) de Rf 0,0-0,2 por el AUC total (Rf 0,0-1,0) y multiplicando por 100.
    4. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
      1. Asegúrese de que la HPLC haya estado funcionando durante al menos 10 minutos utilizando el disolvente correcto para que todas las líneas se inunden y ajuste la configuración de la medición. Utilice el flujo isocrático de una mezcla 50:50 de acetonitrilo (disolvente A) y una mezcla de solución de NaCl al 0,9% (980 mL) combinada con ácido trifluoracético (1 mL) y solución de citrato (20 mL) como disolvente B. Mida la absorbancia UV a 280 nm.
      2. Tomar 5 μL del producto y diluirlo con 15 μL de NaCl al 0,9%. Inyectar 15 μL de la mezcla en la radio-HPLC analítica (5 μm columna SEC-s2000 154 Å; caudal: 2 mL/min).
      3. Utilice el flujo isocrático de una mezcla 50:50 de acetonitrilo (disolvente A) y una mezcla de solución de NaCl al 0,9% (980 mL) combinada con ácido trifluoracético (1 mL) y solución de citrato (20 mL) como disolvente B. Mida la absorbancia UV a 280 nm. Hay un pequeño cambio en los tiempos de retención entre los canales UV y gamma; esto se debe al diseño de la HPLC (la señal gamma se instala en serie después del detector UV).
      4. Determinar la pureza radioquímica integrando los picos en el canal gamma. El producto debe estar en el rango de integración que se determinó previamente midiendo el nanocuerpo no radiomarcado. Además, integre todos los demás picos en el canal gamma y evalúelos como impurezas. La pureza debe ser del >95%.
    5. Endotoxina
      1. Prepare una dilución 1:20 del producto con un volumen total de 150 μL utilizando agua (certificada) libre de endotoxinas para diluir.
      2. Inserte un cartucho de endotoxinas desechable, que está precargado comercialmente con todos los reactivos necesarios, en el lector de pruebas de endotoxinas y cargue 25 μL del producto diluido en cada cámara de cartucho.
      3. Dale al play. El PTS tiene controles internos positivos y negativos y se incluirá en el informe final. La prueba dura unos 15 minutos. El producto se considera libre de endotoxinas si el contenido de endotoxinas es < 8,7 UE/ml a Vmáx = 20 ml.
    6. Esterilidad retrospectiva
      1. Después de la inyección y la recogida de la muestra de calidad, almacene el radiofármaco en un vial estéril en el refrigerador a 4 °C.
      2. Entregue la muestra a un instituto certificado para el análisis de la esterilidad (ya sea interno o de una empresa externa) si no se supera el límite de exención de 10,5 Bq o 10 Bq/g para realizar una prueba de esterilidad de acuerdo con12.
  3. Preparación de jeringas (una por animal)
    1. Mida la actividad del producto utilizando un medidor de actividad en la configuración correcta (68Ga como isótopo; 1 mL de jeringa, 0,1 mL para geometría).
    2. Tome 15 MBq del producto (alrededor de 25 μL) en un tubo de microcentrífuga y llene el volumen con NaCl al 0,9% hasta 75 μL.
    3. Añada 50 μL a la jeringa y mídala con un medidor de actividad en el ajuste correcto (68Ga como isótopo; 1 mL para jeringa, 0,1 mL para geometría). La jeringa debe contener 10 MBq del producto.
      NOTA: Tan pronto como se forma el nanobody NM-02 marcado con 68Ga, ya no son necesarias puntas de pipeta de plástico al manipular el 68Ga. A partir de aquí, siempre que el protocolo mencione la manipulación de un líquido, utilice una jeringa (1 mL) y una aguja (27-30G) adecuadas.

2. Generación de modelos animales

  1. Alojamiento de animales
    1. Utilice ratones hembra inmunodeficientes Rj: ATHYM-Foxn1nu/nu a las 6-8 semanas de edad (de un proveedor comercial) para desarrollar tumores subcutáneos. A su llegada, aloje a todos los ratones directamente en la habitación de los animales y déle al menos 1 semana después del transporte para la aclimatación.
    2. Aloje a los animales en un ciclo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad y proporcione acceso libre a comida y agua. Mantenga la temperatura ambiente y la humedad relativa entre 20-25 °C y 45%-65%, respectivamente.
  2. Preparación de las células para la implantación
    1. Iniciar el cultivo celular con 1 x 106 células SKOV-3 y añadir 25 mL de medio DMEM/F12 precalentado enriquecido con 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina en un matraz de cultivo celular T175.
    2. Cultive las células en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2 y reemplace el medio completo al menos 2 veces por semana.
    3. A la semana o, a más tardar, 1 día antes de la implantación de la célula, tomar 20 μL de medio del matraz de cultivo celular para analizar el micoplasma13. Utilice únicamente células negativas para micoplasma para la inyección de células.
    4. El día de la inyección de células, aspire el medio completo y pipetee 5 ml de PBS en el frasco. Gira la botella de un lado a otro varias veces para lavar el medio restante.
    5. Añadir 3 mL de tripsina al matraz e incubar durante 4 min en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2 para disociar las células. Compruebe bajo el microscopio con un aumento de 40x si las células se desprendieron del matraz de cultivo celular.
    6. Agregue 7 mL de medio para neutralizar la actividad de la tripsina y transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 50 mL.
    7. Centrifugar las celdas a 150 x g durante 5 min (a temperatura ambiente) para obtener un pellet de celda. Retirar el sobrenadante y añadir 1 mL de medio para resuspender las células.
    8. Tome 12 μL de la suspensión celular en un tubo de microcentrífuga y agregue una cantidad igual de azul de tripano. Cargue la cámara del hemocitómetro con 10 μL de la suspensión celular cuidadosamente mezclada.
    9. Cuente las células viables no teñidas dentro del área definida y calcule el número de células. Ajuste la concentración celular a un medio de 5 x 107 células/mL y mezcle cuidadosamente la suspensión celular con 1 mL de matriz de membrana basal.
    10. Tome 5 x 106 células en 0,2 mL de medio celular con una matriz de membrana basal al 50% en una jeringa de insulina de 1 mL para cada ratón. Mantenga la jeringa en hielo hasta la inyección para evitar la solidificación de la matriz de la membrana basal.
      NOTA: Si un ratón pesa menos de 20 g, inyecte solo 150 μL (para 15-20 g) o 100 μL (para 10-15 g) de la mezcla. Para aplicaciones subcutáneas, se debe procurar que no se supere el volumen máximo de 10 mL/kg de peso corporal recomendado por el GV-SOLAS14.
  3. Inoculación y seguimiento
    1. Inyecte la suspensión celular por vía subcutánea en el flanco del animal despierto fijando el cuello y la cola con una mano. Por lo general, preferimos las inyecciones en el flanco izquierdo.
    2. Espere 10-15 s para que la matriz de la membrana basal se endurezca, luego retire la aguja.
    3. Controle el crecimiento del tumor diariamente después de la implantación utilizando un calibrador digital para medir dos ejes tumorales perpendiculares.
    4. Con esas mediciones, evalúe el crecimiento tumoral usando el volumen tumoral calculado por la fórmula:
      VT = L × B2 × π / 6
      donde VT es el volumen del tumor en mm3, L es la longitud del tumor en mm (es decir, el mayor de dos ejes perpendiculares) y B es el ancho del tumor en mm (es decir, el menor de dos ejes perpendiculares15). Esta técnica tiende a sobreestimar el volumen del tumor, ya que también incluye la piel.
    5. La masa tumoral influye en el peso del ratón cuando se mide en la báscula electrónica. Para calcular el peso del animal corregido por la masa tumoral, use la siguiente fórmula:
      mratón-T = mratón - 0.82 × VT
      donde mmouse-T es el peso del ratón excluyendo la masa tumoral en g, mmouse es el peso del ratón según la escala electrónica en g y VT es el volumen tumoral calculado en mm3. El número 0,82 g/mm3 resulta del valor medio de una serie de tumores aislados de experimentos previos con animales, pesados y cuyo volumen determinado utilizando la fórmula dada. Representa una densidad tumoral media.
    6. Además, determine qué tan grande es el tumor en comparación con el ratón y controle la carga tumoral con la siguiente fórmula:
      Carga tumoral [%] = (0,82 × VT) / mratón × 100
      donde la carga tumoral se expresa en porcentaje, 0,82 × VT corresponde a la masa tumoral en g (es decir, VT, el volumen tumoral calculado enmm 3, multiplicado por la densidad tumoral media), y mratón es el peso del ratón según la escala en g.
    7. Cuando los animales alcancen un volumen tumoral de más de 200mm3, prográmelos para una PET/CT no invasiva o SPECT/CT, según el experimento.

3. Imágenes

  1. Preparación de jeringas (sistema a medida)
    NOTA: La cola del ratón es pequeña; por lo tanto, se requiere el uso de una cánula de 27G o menor (los números más grandes corresponden a agujas más pequeñas). En el caso de los ratones hembra, las únicas venas accesibles para las inyecciones en bolo son las tres venas de la cola. Anatómicamente, la vena dorsal de la cola está más cerca de la columna vertebral en comparación con las dos venas laterales; No inyecte en esta vena para evitar el rascado óseo iatrogénico. Según la experiencia, el uso de una cánula de 30G proporciona los mejores resultados, ya que también se puede acceder a venas más pequeñas. Dado que los catéteres de 30G no están disponibles para su compra, este tipo debe ser fabricado con cuidado por el investigador.
    1. Prepare la jeringa con el marcador radiactivo en función de la vía de administración prevista. En el caso de las inyecciones intravenosas, asegúrese de administrar un volumen máximo de 5 ml/kg de peso corporal para un ratón de 25 g; esto significa un volumen máximo inyectado de 125 μL.
    2. Para preparar un catéter de 30G, en primer lugar, utilice cualquier aguja de 30G y retire el eje metálico de la aguja, ya sea con unas tijeras metálicas o doblándolo para separarlo del plástico.
    3. Inserte manualmente un tubo PE10 de 0,3 mm de diámetro en la parte del eje que se retiró del cubo. Se debe tener cuidado para evitar perforar el tubo.
      NOTA: También se pueden utilizar otros tipos de plástico; sin embargo, PE10 ofrece el mejor equilibrio entre rigidez y flexibilidad de la pared.
  2. Inyección intravenosa
    NOTA: Las inyecciones intravenosas también se pueden realizar en animales despiertos; Sin embargo, si esto no es necesario, los animales deben ser inyectados bajo sedación con isoflurano para reducir la carga en el animal de investigación.
    1. Llene el catéter de 30G con un tampón de NaCl al 0,9% o cualquier otro tampón deseado.
    2. Coloque el ratón en una cámara de inducción y llénela continuamente con una mezcla de oxígeno (o aire presurizado de grado médico) e isoflurano gaseoso hasta que el animal pierda el reflejo de enderezamiento. Para la inducción, utilice isoflurano al 3,5%-5% con un caudal de oxígeno o aire de 0,8 L/min.
    3. Coloque inmediatamente el ratón sedado en una posición ventral inicial sobre una estera calefactora (37-38 °C) mientras se mantiene la sedación con isoflurano a través de un cono nasal. Revise los ratones con frecuencia para detectar signos de sobrecalentamiento (por ejemplo, estiramiento excesivo, respiración rápida, enrojecimiento de la piel). Para el mantenimiento de la anestesia, utilice isoflurano al 1,8%-2,5% con un caudal de oxígeno o aire de 0,8 L/min.
    4. Aplicar una pomada oftálmica en los ojos del animal para evitar que se seque durante la sedación. Inspeccione ambas venas laterales de la cola y seleccione la mejor para la inyección. Se debe tener en cuenta la visibilidad y el diámetro de la veta. Para obtener los mejores resultados, gire ligeramente la cola para que la vena seleccionada entre en contacto con la estera calefactora y deje que la vena se dilate durante 1 minuto.
    5. Gire todo el ratón en la posición lateral para que la vena seleccionada salga hacia arriba. Fija la punta y la base de la cola con cinta adhesiva.
    6. Tome el catéter 30G con la mano dominante y coloque suavemente el dedo índice de la mano no dominante en la vena seleccionada para crear una copia de seguridad de sangre en el interior. En el sitio de la copia de seguridad, la vena se dilatará, formando una pequeña joroba.
    7. Con la mano dominante, coloque el catéter 30G paralelo a la cola mirando hacia la joroba en la vena. Mueve la mano dominante hacia adelante. La mayoría de las veces, esta técnica asegura una venopunción directa.
    8. Una vez dentro de la vena, el reflujo sanguíneo se hace visible en el tubo de plástico. Fije el tubo de plástico para asegurarse de que la aguja no se mueva dentro de la vena durante la inyección. En el extremo libre del tubo, inserte la jeringa trazadora conectada a una aguja de 30 G.
      NOTA: Cuando es necesario evaluar una distribución dinámica del trazador, se deben realizar los siguientes puntos después de que el animal se coloca en la cama del escáner PET y se inicia la PET.
    9. Inyecte lentamente el contenido de la jeringa trazadora durante al menos 10 s. Mientras mantiene la aguja 30G aún conectada al sistema de catéter 30G, retire solo la jeringa trazadora y conecte una jeringa con tampón de NaCl al 0,9% (o cualquier otro tampón deseado) para enjuagar el catéter. Controle la respiración continuamente durante el procedimiento de inyección y ajuste la concentración de isoflurano para mantener aproximadamente 1 respiración por segundo.
    10. Retire el catéter de 30 G de la vena de la cola y use una compresa de algodón estéril para detener el sangrado.
    11. Para medir la actividad sobrante, mida el catéter de 30 G, la jeringa tampón, la jeringa trazadora vacía y la compresa de algodón, ya que todas contienen pequeñas cantidades de trazador que no llegaron al animal.
  3. Adquisición de PET/CT
    NOTA: Para el nanobody NM-02 marcado con 68Ga, todos los animales se visualizan con un sistema PET/CT para animales pequeños.
    1. Adquisición de PET
      1. Coloque el ratón sedado en posición ventral en la cama del animal y conéctelo al escáner PET. Cambie el flujo de isoflurano al cono de la nariz en la PET y manténgalo en 1,5%-2,5% de isoflurano en el aire medicinal a 0,8 L/min para que la frecuencia respiratoria del animal durante la exploración esté entre 75 y 50 respiraciones por minuto.
      2. Fije el ratón detrás de su cuello a la cama del animal con cinta médica. Si es necesario, aplique una pomada oftálmica una vez más en los ojos del ratón para evitar que se seque durante la sedación.
      3. Encienda la almohadilla térmica en la cama del animal a aproximadamente el 80% de potencia, lo que equivale a aproximadamente 30 ° C.
      4. Establezca el tiempo de adquisición en 45 minutos y seleccione la región de interés que se escaneará. Seleccione 68Ga como isótopo de estudio e inicie la exploración. Introduzca la cantidad de actividad inyectada, el tiempo de inyección y el tiempo de medición de la jeringa vacía. Una posición de la cama PET es de 160 mm, que es lo suficientemente larga para un escaneo de ratón de cuerpo completo.
      5. Cuando sea necesario evaluar una distribución dinámica del trazador, primero se debe iniciar la exploración PET, esperar 30 s para la adquisición y solo entonces continuar con los pasos 3.2.9-3.2.10. Deje el catéter en el ratón con la jeringa tampón conectada para evitar una mayor pérdida de sangre. El catéter se puede desconectar al final de la PET, antes de la adquisición de la TC para evitar artefactos.
    2. Adquisición de TC
      1. Desconecte la cama del animal del escáner PET y conéctelo inmediatamente al escáner CT. Si es necesario, también separe la cánula de la vena de la cola. Después de al menos 30 minutos después de la venopunción, el sitio de la inyección ya está coagulado, por lo que no se producirá más sangrado.
      2. Cambie el flujo de isoflurano al cono de la nariz en el escáner de tomografía computarizada.
      3. Seleccione la misma región de interés que se va a escanear para la toma de imágenes PET. Seleccione el protocolo de adquisición estándar: 440 μA, 50 kVp, tiempo de exposición de 32 ms y rotación de 1080° en modo espiral con 960 exposiciones/360°; la duración de la tomografía computarizada es de aproximadamente 7 minutos para una exploración de cuerpo completo con ratón.
      4. Controle la frecuencia respiratoria y encienda la almohadilla térmica en la cama del animal. Controle la respiración de forma continua durante las exploraciones y ajuste la concentración de isoflurano para mantener una frecuencia respiratoria entre 75 y 50 respiraciones por minuto.

4. Cuidado de los animales después de la obtención de imágenes

  1. Al final de las exploraciones, el animal necesita al menos 15 minutos para despertarse. Para evitar la agresión de los compañeros de camada, enjaula al animal solo durante unos 15 minutos o hasta que sea capaz de caminar por sí solo hasta que lo vuelva a colocar en su jaula de alojamiento original. Durante este tiempo, use luz infrarroja para evitar la hipotermia.
  2. Inicialmente, coloque al animal sobre su lado izquierdo (posición segura) para evitar un choque hemodinámico. Deja que la pomada oftálmica permanezca, ya que será retirada por el propio animal una vez que esté despierto.

5. Reconstrucción PET/CT

  1. Realice la reconstrucción PET utilizando una maximización de expectativas de subconjuntos ordenados en 3 dimensiones (es decir, OSEM-3D con 30 iteraciones) con una ventana de energía de ± 15% desde un pico de 511 keV hasta un tamaño de vóxel isométrico de 0,4 mm en una matriz de 192 × 192 × 384. Aplique correcciones basadas en TC (es decir, corrección de atenuación, corrección de dispersión, tiempo muerto y eventos aleatorios) a la reconstrucción PET.
  2. En caso de que sea necesario evaluar una distribución dinámica del trazador, aplique una reconstrucción de varios fotogramas. Por ejemplo, se pueden utilizar los siguientes fotogramas para un análisis de 45 minutos: 4 x 30 s, 3 x 1 min, 5 x 2 min, 2 x 5 min y 2 x 10 min.
  3. Reconstruya los protocolos de adquisición estándar de TC utilizando un proceso de reconstrucción de algoritmo de reconstrucción iterativo (es decir, ISRA) a un tamaño de vóxel isométrico de 0,2 mm en una matriz de 200 × 200 × 425. Usando el software del proveedor, convierta los valores de CT en unidades de Hounsfield (HU) usando la fórmula:
    figure-protocol-1
    dondeμ w es el coeficiente de atenuación lineal del agua, μa es el coeficiente de atenuación lineal del aire y μt es el coeficiente de atenuación lineal del tejido.
  4. Las imágenes de PET y CT se alinearon automáticamente después de la reconstrucción utilizando la matriz generada a partir de una gammagrafía capilar. Archive todos los datos reconstruidos y transfiéralos a un servidor de base de datos utilizando software de análisis de imágenes según sea necesario.

6. Procesamiento y análisis de imágenes

NOTA: Las imágenes PET/CT corregistradas se utilizan además para la cuantificación dentro del servidor de base de datos de un software de análisis de imágenes, donde cada escaneo híbrido se guarda como un sujeto.

  1. Identifique el tumor en función de la tomografía computarizada y selecciónelo como la región de interés. Enmascarar manualmente la base tumoral en la TC.
  2. Para lograr una segmentación independiente del usuario, se debe ajustar el umbral de la máscara tumoral recién formada en PET o SPECT. Para PET, use un umbral mínimo de 1.0 valor de absorción estandarizado (SUV). Para la SPECT, use un umbral mínimo más alto que la absorción media de la reserva de sangre medida en el corazón o la aorta abdominal terminal.
  3. Registre la media, el máximo, el promedio de los 10 vóxeles más calientes (es decir, el promedio caliente de 10) y la absorción total de los volúmenes de interés recién generados.
  4. Utilice esos valores para generar valores de SUV y de destino a fondo (TBR), que se utilizarán posteriormente para el análisis estadístico.

Resultados

Uno de los aspectos más importantes del control de calidad de un radiofármaco es mediante HPLC, ya que muestra no solo la pureza química y radioquímica (98,2% en este caso) sino que también permite demostrar la identidad del radiofármaco comparando el tiempo de elución y la forma del pico con el de un compuesto de referencia no radiactivo. Este compuesto de referencia es, en este caso, un nanocuerpo no marcado, que se ha demostrado que es el compuesto correcto mediante técnicas clásicas como la espectrometría de masas o la resonancia magnética nuclear. Estas técnicas no se pueden aplicar directamente al compuesto radiactivo (no hay suficiente masa para generar una señal), pero al comparar el compuesto radiactivo con su referencia, se reúnen suficientes pruebas de que el compuesto correcto fue efectivamente marcado y no alterado durante la síntesis. Obsérvese la pequeña diferencia en el tiempo de retención entre el producto radiactivo y la referencia de la Figura 1, correspondiente a la medición en serie del flujo de HPLC (primero se mide la radiación UV; el caudal tarda aproximadamente 0,2 minutos en llegar al detector de radiactividad en una configuración típica).

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Figura 1: Cromatograma analítico típico de HPLC para el control de calidad de 68nanocuerpos marcados con Ga NM-02 (GLNM-02). La absorbancia UV del compuesto frío (es decir, el panel superior) se mide a 280 nm y muestra un pico a los 4,18 min, con un desplazamiento de 0,22 min. El pico del producto marcado con 68Ga se puede ver en el detector gamma (es decir, en el panel inferior). El rendimiento radioquímico es del 98,2%. mAU = mili unidades de absorbancia, NM-02 = nuestro producto, UV = canal de luz ultravioleta, nm = nanómetro, min = minuto, CPS = recuentos por segundo, GLMN-02 = 68nanocuerpo marcado con Ga NM-02, 68Ga-DOTA-GA = [68Ga]Ga-DOTA-GA, γ ChA = canal gamma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En ausencia de HPLC o además de ella, TLC se puede utilizar para determinar el rendimiento del etiquetado y la pureza del producto final (pero no la identidad, y no es tan detallada como la HPLC). Debido a su baja complejidad, TLC es ideal cuando la vía de radiosíntesis aún se está optimizando. La Figura 2 muestra el cromatograma TLC de 68nanocuerpos NM-02 marcados con Ga (pureza radioquímica aparente del 99,9%).

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Figura 2: Cromatograma analítico TLC típico para el control de calidad de 68nanocuerpos marcados con Ga NM-02 (GLNM-02). Los recuentos de área se trazan en función de la distancia recorrida por el solvente (citrato) en la placa TLC. El Rf es 0,2 y la pureza radioquímica es del 99,9%. C = Recuentos, mm = milímetro, GLNM-02 = 68nanocuerpo marcado con Ga NM-02, TLC = cromatografía en capa fina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En el proceso de preparación de los datos de imágenes para su publicación, es una práctica estándar mostrar al menos una imagen de TC y PET independiente. Este enfoque permite una evaluación exhaustiva de la biodistribución de los trazadores. El escalado estándar de la TC está entre -1000 HU y 1000 HU, lo que permite la visualización de todos los tejidos blandos dentro de una sola ventana. Como se muestra en la Figura 3A, este método permite una demarcación clara de los riñones de ratón y, al mismo tiempo, permite la evaluación ósea.

Para la báscula PET, establezca el umbral inferior en un SUV de 0.0 mientras mantiene un umbral superior mínimo de 1.0 (Figura 3B), preferiblemente utilizando la normalización del peso corporal durante el cálculo del SUV (es decir, SUVbw). Además, para la cuantificación, se prefiere la media de SUVh en comparación con la SUVmax; si se usa el SUVmax, entonces use el promedio de los 10 vóxeles más calientes en lugar del valor del vóxel individual más caliente en el cálculo de SUVbw . Prepare fusiones de características de imágenes PET/CT fusionando los cortes de TC y PET (Figura 3C).

Para permitir a los lectores evaluar de forma independiente la biodistribución del trazador de cuerpo completo, la proyección de intensidad máxima de la misma exploración PET se puede presentar utilizando la misma escala que el corte de PET (Figura 3D).

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Figura 3: Imágenes PET/CT in vivo de un ratón subcutáneo portador de tumores SKOV-3. La imagen se obtuvo 3 h después de la inyección intravenosa de 5 MBq 68Nanobody NM-02 marcado con Ga (GLNM-02). (A) La imagen CT se escala entre -1000 HU y 1000 HU, mientras que (B) la imagen PET está entre un SUV de 0.0 y 5.0. (C) La fusión PET/CT utiliza la misma escala. (D) La imagen PET de proyección de máxima intensidad (MIP) también se escala utilizando un SUV de 0.0 y 5.0. Todas las imágenes PET muestran una buena captación tumoral de GLNM-02 y el aclaramiento renal es claramente visible. TC = tomografía computarizada, PET = tomografía por emisión de positrones, MIP = proyección de intensidad máxima, HU = unidad de Hounsfield, SUV = valor de captación estandarizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En el caso específico del nanobody NM-02 marcado con 68Ga, se puede observar una notable absorción tumoral en el flanco izquierdo del ratón. Además, también es evidente el aclaramiento renal del trazador. Al presentar la proyección de intensidad máxima del PET, la actividad de la vejiga urinaria también se hace visible, reforzando el aclaramiento renal del trazador. En este caso específico, vale la pena mencionar que el riñón, el tumor y la vejiga no se pueden mostrar en el mismo corte 2D. Al incluir la proyección de máxima intensidad en las publicaciones, toda la biodistribución del trazador se presenta en una misma imagen.

Discusión

Radiosíntesis
La radiosíntesis descrita aquí es típica de un nuevo compuesto marcado con 68Ga: tiempo de síntesis corto, con énfasis en el pH adecuado y evitando los metales siempre que sea posible. Para ello, es importante seguir estrictamente el orden en el que se añaden los componentes. En cualquier caso, el valor de pH de la solución de 68Ga debe ajustarse primero a pH 4 con 3 M de NH4OAc; de lo contrario, el nanocuerpo puede degradarse si el pH es demasiado ácido. Los conceptos generales de la síntesis de Ga 68han sido descritos anteriormente16, por lo que no entraremos en detalles aquí. El módulo de síntesis automatizado requiere una mayor optimización en lo que respecta a la reducción de la dosis de radiación. Esto requiere un esfuerzo significativo que está más allá del alcance de la investigación exploratoria en un experimento preclínico típico, como se describe aquí. Además, es poco probable que una síntesis automatizada produzca los pequeños volúmenes que podemos producir con el método actual (< 1 mL), lo que permite concentraciones más altas de 68Ga y una mayor actividad específica.

El control de calidad aún debe realizarse y registrarse con gran detalle. Una excepción a este detalle es el pH: mientras que las mediciones de pH para las síntesis clínicas se realizan con frecuencia con muy precisión utilizando medidores de pH, aquí es suficiente medir el pH con una simple tira de pH, ya que los requisitos para las inyecciones intravenosas lo permiten (cualquier pH entre 6 y 8 está permitido14). Esta sencilla técnica reduce el coste y la posibilidad de contaminar los equipos con material radiactivo.

Formulaciones para modelos animales
La formulación final del trazador es un aspecto crucial del mismo, un aspecto que a menudo se describe mal en la investigación preclínica. Si bien existe una legislación clara para la formulación de productos farmacéuticos para ensayos en humanos, incluidos los radiofármacos, en el ámbito preclínico, solo existen directrices17,18 que no abordan específicamente los solventes o las formulaciones. Estas directrices se utilizan a menudo cuando se redactan o evalúan los protocolos legalmente requeridos para su aprobación por parte de los comités de ética (animal) (en Alemania: LANUV19), pero estos documentos no enfatizan suficientemente la importancia de la formulación. Es probable que las malas formulaciones puedan conducir a resultados falsos (negativos), pero tal afirmación es difícil de verificar considerando el persistente sesgo de publicación que aún existe, también en el campo de la oncología20.

Además de las directrices ARRIVE, optamos por seguir la legislación diseñada para aplicaciones humanas en la medida de lo posible, asumiendo que las formulaciones adecuadas para humanos generalmente también son adecuadas para roedores. La principal diferencia es el tamaño del sujeto y, por lo tanto, la cantidad de volumen que se puede inyectar de manera segura. Para ello, se optó por purificar el compuesto siempre que fuera posible utilizando filtros de corte de peso molecular (MWCO), ya que se ha demostrado su eficacia para purificar compuestos grandes21. Permiten que un trazador típico marcado con 68Ga se disuelva finalmente en una solución de elección y en un pequeño volumen adecuado para ratones (inyección intravenosa máxima típica de 100 a 150 μL).

En Alemania, la GV-SOLAS (Gesellschaft für Versuchstierkunde, en español: Asociación de animales de laboratorio) sirve como intermediario entre la protección animal y la investigación, beneficiando tanto a los seres humanos como a los animales. Por lo tanto, esta asociación ha establecido recomendaciones para múltiples aspectos de la investigación con animales, especialmente en los campos de la oncología y la anestesia, para estandarizar el cuidado de los animales a nivel nacional14. A partir de ahora, la mayoría de las autoridades competentes y los comités nacionales de ética hacen cumplir los protocolos con animales a esas recomendaciones. GV-SOLAS tiene recomendaciones para los volúmenes máximos de la mayoría de las rutas de aplicación. Para la inyección intravenosa, se recomienda un máximo de 5 mL/kg de peso corporal; para un ratón de 25 g, esto equivale a 150 μL. Por esta razón, todas las producciones de trazadores radiactivos se establecen para un volumen máximo de inyección de 150 μL por animal. Exceder este umbral cuando se inyecta por vía intravenosa aumenta el riesgo de insuficiencia cardíaca aguda causada por hipervolemia. Las inyecciones intravenosas repetidas que superan este umbral conducen a un mayor riesgo de fibrosis pulmonar, ya que cada inyección, dependiendo de la velocidad del flujo, causa edema pulmonar menor. Un equivalente humano del ratón IV presentado en este trabajo sería inyectar por vía intravenosa en bolo (dentro de los 10 s) un volumen total de 375 mL para un humano de 75 kg. En la atención clínica estándar, se administran 500 ml de solución de NaCl al 0,9% durante 1 h; esto significa que se administrarían 375 mL durante 45 min para evitar cualquier complicación.

GV-SOLAS recomienda que la carga tumoral no alcance más del 5%; En caso de que el animal esté bajo tratamiento, la carga puede extenderse hasta el 10%22. Esta diferencia entre los grupos tratados y no tratados tiene el potencial de crear un sesgo en la investigación, especialmente en el caso de la supervivencia, ya que los ratones con tumores tratados pueden lograr una mayor carga tumoral que el grupo de control aferente. Para evitar estos casos, también se debe fijar la carga tumoral del 5% para los animales de tratamiento; Sin embargo, esto puede conducir a dilemas éticos para matar animales de investigación antes de alcanzar el llamado punto final humanitario, o (preferiblemente) argumentar que el aumento al 10% en el caso de los grupos de control aferentes tiene una base ética para evitar sesgos.

Dado que la carga tumoral debe calcularse todos los días de forma no invasiva, aplicamos un factor de corrección (es decir, 0,82) para convertir el volumen tumoral calculado diariamente en un peso tumoral. Calculamos este factor midiendo los diámetros de los tumores con un calibrador digital antes de que los animales fueran sacrificados según el protocolo y posteriormente el peso real del tumor utilizando una báscula. Este factor de corrección es diferente de la densidad del tejido tumoral, ya que el volumen tumoral medido también incluye la piel. Por lo tanto, es probable que este factor sea < 1,0, ya que el volumen tumoral medido es mayor que el volumen tumoral real. Como los tumores que pesamos eran relativamente grandes, debido a que la evaluación se realizó el último día del experimento, este factor sobreestima el peso de los tumores pequeños. Solo debe utilizarse en la evaluación de la carga tumoral.

Otro aspecto de las recomendaciones de GV-SOLAS es que, para los ratones, se establece un diámetro tumoral fijo de 15 mm como criterio de valoración humanitario17. Con frecuencia, el tumor tiende a crecer rápidamente a lo largo del canal de la aguja formado por la inyección subcutánea si no se inyecta aire o tapón después de la solución que contiene células tumorales. Por lo tanto, los 15 mm se alcanzan más rápido a ciertas vías de aplicación. Dado que, según la experiencia, algunos tumores crecen en forma elíptica, adaptamos y utilizamos la fórmula de volumen tumoral mencionada anteriormente para hacer comparaciones imparciales entre las diferentes vías de aplicación.

Los modelos animales que utilizamos están diseñados siguiendo las directrices ARRIVE17 y PREPARE18 , lo que permite una fácil reproducción experimental. El modelo está sujeto a un cierto grado de variación, ya que la tasa de crecimiento tumoral varía entre diferentes ratones, lo que dificulta el manejo de la estandarización y la interpretación. Sin embargo, estas variaciones reflejan la heterogeneidad intra e intertumoral presente en los pacientes oncológicos23.

Este protocolo no está exento de limitaciones. Los animales deben estar sedados durante la inyección, especialmente durante la PET/CT. La sedación, particularmente con isoflurano, afecta el flujo sanguíneo y los animales pueden sufrir hipotermia, lo que requiere el uso de una estera térmica y el control de la profundidad de la sedación. Este problema se puede evitar escaneando animales despiertos; Sin embargo, esto requiere software interno especializado y experiencia, que a menudo no están disponibles.

Otra limitación es la dosis de radiación. Aunque la dosis recibida por los animales es insignificante para una sola exploración, la realización de múltiples exploraciones (es decir, especialmente si hay más de 10) puede resultar en una dosis acumulativa significativa, lo que podría afectar el crecimiento del tumor. Cuando el crecimiento tumoral es un parámetro de lectura, es esencial que todos los animales reciban el mismo número de exploraciones y dosis para garantizar grupos comparables, lo que aumenta la carga de trabajo de todo el proyecto. El uso de un sistema PET/MRI en lugar de un sistema PET/CT podría reducir la exposición a la radiación. Sin embargo, este enfoque implica tiempos de escaneo más largos, costos adicionales y un método diferente de obtener información anatómica.

Al adherirnos a las recomendaciones de organizaciones de bienestar como GV-SOLAS en Alemania y seguir las pautas establecidas como ARRIVE y PREPARE, nos esforzamos por estandarizar los modelos animales y minimizar la variabilidad en los protocolos experimentales. Estos esfuerzos son cruciales para garantizar la fiabilidad y la reproducibilidad de los estudios preclínicos, lo que en última instancia facilita la traslación de radiofármacos prometedores del laboratorio a la cabecera del paciente.

Divulgaciones

FMM es asesor médico de NanoMab Technology Ltd. y Advanced Accelerator Applications (AAA) GmbH. Recientemente ha recibido subvenciones institucionales de NanoMab Technology Ltd., Siemens y GE Precision Healthcare LLC. Además, tiene un contrato de investigación intervencionista con CURIUM.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Susanne Allekotte su apoyo técnico.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Equipment
Activity meter ISOMED 2010Nuviatech Healthcare -
Centrífuga MIKRO 185Andreas Hettich GmbH & Co. KG1203
Pruebas de endotoxinas Endosafe nexgen-PTSCharlesRiver-Bloque
calefactor NANOCOLOR VARIO C2Macherey-Nagel919350
Sistema de HPLC, incluido el detector de radioKnauer & Raytest-Softwarede análisis de
imágenes Pmod 4.4 PMOD TechnologiesLLC-Sistema
animales pequeños β-CUBE y X-CUBEMolecubes NV-TLC
MiniGITA*Elysia-Raytest-
Materials
0.3 mm de diámetro diámetro PE10 tubo fisherscientific22-204008
aguja 30GB|Braun4656300
Filtro centrífugo; MWCO de 10 kDa, tiraMilliporeUFC501008
Cartucho deSGI0001Agilent Technologies
, sensibilidad de 0,05 UE/ml Charles RiverPTS-2005
Columna de HPLC Biosep SEC-s2000Phenomenex-Tubode
microcentrífuga (1,5 mL)Eppendorf0030125150
Tira de pH 0,0 - 6,0Merck KGaA109531
Tira de pH 0-14Merck KGaA109535
PS-H+ Cartucho SPEMacherey Nagel GmbH &; Co. KG731861
Frasco estéril 10 mLALK Life Science SolutionsSEV100
Reagents
68Ge/68Ga-GeneratorNRF-iThembaLABS-Ammoniumacetate
Merck KGaA101116
Ácido cítricoMerck KGaA
Ácido clorhídricoMerck KGaA320331
NaClMerck KGaAS9888
Nanobody NM-02Radiopharm Theranostics-P-SCN-Bz-DOTA-GA
CheMatechC115
Ácido trifluoracéticoMerck KGaAT6508
Agua ultrapuraMerck KGaA
PET/CT para de papel de cromatografía Millipore de 0,5 mL endotoxinas de 100241101262

Referencias

  1. American Cancer Society. Cancer facts & figures 2024. , https://www.cancer.org/research/cancer-facts-statistics/all-cancer-facts-figures/2024-cancer-facts-figures.html (2024).
  2. Cancer Research UK. Ovarian cancer survival. , https://www.cancerresearchuk.org/about-cancer/ovarian-cancer/survival (2021).
  3. Siegel, R. L., Giaquinto, A. N., Jemal, A. Cancer statistics, 2024. CA Cancer J Clin. 74 (1), 12-49 (2024).
  4. Altunay, B., et al. Her2-directed antibodies, affibodies and nanobodies as drug-delivery vehicles in breast cancer with a specific focus on radioimmunotherapy and radioimmunoimaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 48 (5), 1371-1389 (2021).
  5. Altunay, B., Morgenroth, A., Mottaghy, F. M. Use of radionuclide-based imaging methods in breast cancer. Semin Nucl Med. 52 (5), 561-573 (2022).
  6. Mcgale, J., et al. Pet/ct and spect/ct imaging of her2-positive breast cancer. J Clin Med. 12 (15), 4882(2023).
  7. Zhang-Yin, J. State of the art in 2022 pet/ct in breast cancer: A review. J Clin Med. 12 (3), 968(2023).
  8. USFD Administration. Pet drug products - current good manufacturing practice (cgmp). , https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/pet-drug-products-current-good-manufacturing-practice-cgmp (2018).
  9. Official Journal of the European Union, L238. 60, https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=OJ:L:2017:238:TOC (2017).
  10. Korde, A., et al. Position paper to facilitate patient access to radiopharmaceuticals: Considerations for a suitable pharmaceutical regulatory framework. EJNMMI Radiopharm Chem. 9 (1), 2(2024).
  11. Korde, A., et al. Practical considerations for navigating the regulatory landscape of non-clinical studies for clinical translation of radiopharmaceuticals. EJNMMI Radiopharm Chem. 7 (1), 18(2022).
  12. European Pharmacopeia. , (2023).
  13. Volokhov, D. V., Graham, L. J., Brorson, K. A., Chizhikov, V. E. Mycoplasma testing of cell substrates and biologics: Review of alternative non-microbiological techniques. Mol Cell Probes. 25 (2-3), 69-77 (2011).
  14. Dülsner, A., et al. Technical information from the Committee for Animal Welfare Officers (GV-SOLAS) and Working Group 4 in the TVT Recommendation on substance administration to laboratory animals. GV-SOLAS. , (2017).
  15. derived xenograft (pdx) protocols at the jackson laboratory. , Available from: https://tumor.informatics.jax.org/mtbwi/live/www/html/SOCHelp.html (2020).
  16. Velikyan, I. 68ga-based radiopharmaceuticals: Production and application relationship. Molecules. 20 (7), 12913-12943 (2015).
  17. Percie Du Sert, N., et al. Reporting animal research: Explanation and elaboration for the arrive guidelines 2.0. PLoS Biol. 18 (7), e3000411(2020).
  18. Smith, A. J., Clutton, R. E., Lilley, E., Hansen, K. E. A., Brattelid, T. Prepare: Guidelines for planning animal research and testing. Lab Anim. 52 (2), 135-141 (2018).
  19. Landesamt Für Natur UUVN. Tierversuche. , https://www.lanuv.nrw.de/verbraucherschutz/tierversuche (2024).
  20. Herrmann, D., et al. Statistical controversies in clinical research: Publication bias evaluations are not routinely conducted in clinical oncology systematic reviews. Ann Oncol. 28 (5), 931-937 (2017).
  21. Johnsen, E., et al. A critical evaluation of amicon ultra centrifugal filters for separating proteins, drugs and nanoparticles in biosamples. J Pharm Biomed Anal. 120, 106-111 (2016).
  22. TVT-Veröffentlichungen zum Download. , Society for Laboratory Animal Science (GV-SOLAS). Available from: https://www.tierschutz-tvt.de/alle-merkblaetter-und-stellungnahmen/ (2024).
  23. Bedard, P. L., Hansen, A. R., Ratain, M. J., Siu, L. L. Tumour heterogeneity in the clinic. Nature. 501 (7467), 355-364 (2013).

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