Artículo de método

Estudios sobre el efecto antiinflamatorio de las píldoras Xiaoyao en el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica en ratones

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DOI:

10.3791/67051

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23 de agosto de 2024

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1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Geriatric Orthopedics, Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, 3Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

En este artículo

Resumen

La osteoporosis posmenopáusica se ha convertido en un problema de salud pública mundial. El objetivo de este estudio es explorar los efectos terapéuticos y los mecanismos relacionados de las píldoras de medicina tradicional china Xiaoyao sobre esta afección.

Resumen

La osteoporosis es una enfermedad metabólica común de las mujeres ancianas y posmenopáusicas, sin síntomas evidentes durante sus primeras etapas. En las últimas etapas de esta afección, los pacientes son propensos a sufrir fracturas, lo que puede afectar seriamente su salud y calidad de vida. El aumento de la esperanza de vida en todo el mundo ha convertido a la osteoporosis en una preocupación mundial. Las píldoras Xiaoyao fueron anteriormente
Se utiliza en el tratamiento de la depresión. Además, el fármaco parecía tener una actividad similar a la del estrógeno, lo que afectó a la expresión de ALP, un marcador temprano específico del osteoblasto, y COL-1, un componente importante de la matriz extracelular ósea. Las píldoras de Xiaoyao se evaluaron por sus efectos sobre la osteoporosis posmenopáusica (PMOM) en ratones. Se accedió a la información objetivo de cada componente herbal de las píldoras Xiaoyao a través de la base de datos de Farmacología de los Sistemas de Medicina Tradicional China (TCMSP). La información de GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD, DrugBank y otros sitios web se utilizó para construir la red reguladora del complejo herbal a través de Cytoscape y la red String para evaluar las interacciones de las proteínas. Los ratones fueron ovariectomizados y tratados con dosis altas y bajas de píldoras Xiaoyao y estos se compararon con los controles. Sus síntomas se evaluaron mediante inmunocitoquímica de los tejidos óseos. Los resultados sugirieron que las píldoras de Xiaoyao tenían la capacidad de aliviar los síntomas de PMOM en ratones ovariectomizados a través de la vía de señalización IL-17. Este fármaco tiene el potencial de convertirse en un nuevo agente terapéutico para el tratamiento de la osteoporosis.

Introducción

La Organización Mundial de la Salud (OMS) define la osteoporosis (OP) como una enfermedad caracterizada por una disminución de la masa ósea y un deterioro de la microarquitectura del tejido óseo, lo que conduce a un aumento de la fragilidad ósea y, por lo tanto, a un mayor riesgo de fractura1. La importancia clínica de la osteoporosis es que puede conducir a fracturas, las cuales se asocian con alta mortalidad, morbilidad y costos económicos2. La osteoporosis posmenopáusica (PMOP) es causada por una disminución de los niveles de estrógeno en las mujeres después de la menopausia, lo que conduce a un aumento de la actividad de los osteoclastos, lo que resulta en pérdida ósea y destrucción de la microestructura ósea. Esto a menudo causa osteoporosis con un grave impacto en la salud3. Las terapias actuales para la PMOP incluyen terapia de reemplazo de estrógenos, bifosfonatos y hormona paratiroidea, pero pueden tener diversos grados de efectos adversos, un cumplimiento insuficiente a largo plazo y altos costos4. Por lo tanto, la medicina herbal asequible es una alternativa viable para una gran proporción de la población.

Las píldoras Xiaoyao están incluidas en la FarmacopeaChina 5 y contienen ocho componentes herbales, que incluyen Chai Hu, Angelica sinensis, Paeonia lactiflora blanca, Atractylodes macrocephala, Poria cocos, Menthae Herba, regaliz y jengibre fresco. Se sabe que todas estas hierbas son efectivas para desintoxicar el hígado y fortalecer el bazo, nutrir la sangre y regular el ciclo menstrual, y la mezcla también se ha utilizado para tratarla depresión. Sin embargo, el papel de las píldoras Xiaoyao en la osteoporosis no está claro.

Los primeros estudios han sugerido que la inflamación puede conducir a la pérdida ósea7, y que la disminución de la densidad ósea asociada con este proceso puede acelerarse con la menopausia. Además, existe una fuerte relación entre el desarrollo de osteoporosis y la inflamación. El factor inflamatorio, interleucina-17 (IL-17), es un factor proinflamatorio secretado por las células Th17, un subconjunto de linfocitos T CD4+. Estas células se asocian con varias afecciones inflamatorias crónicas y desempeñan un papel importante en el desarrollo de la destrucción ósea en la artritis reumatoide8. Además, la IL-17 estimula el activador del receptor del ligando del factor nuclear κ B (RANKL), que regula la osteoclastogénesis, lo que conduce a una mayor resorción ósea que la formación ósea9. La IL-17 estimula la expresión de otras citocinas osteoclastogénicas como TNFα, IL-1, IL-6 e IL-8. Tiene la capacidad de sinergizar con otros factores inflamatorios, lo que lo convierte en un importante efector inflamatorio10.

Los estudios también han demostrado un vínculo entre las píldoras Xiaoyao y la inflamación. Shi et al.11 y Fang et al.12 han confirmado recientemente que las píldoras de Xiaoyao pueden reducir los niveles de IL-6 y TNF-α, respectivamente. En otro estudio sobre la esteatohepatitis asociada al metabolismo, se informó que las píldoras de Xiaoyao podrían regular al alza la expresión de ácido propiónico, que a su vez inhibe la expresión de TNF-α y ejerce un efecto antiinflamatorio13. Sin embargo, en la actualidad, no se sabe si las píldoras de Xiaoyao pueden regular el desarrollo de PMOM mediando una respuesta inflamatoria a través de la IL-17, que fue el objetivo de este estudio.

Este estudio predijo la intersección de los objetivos de las píldoras Xiaoyao y los genes relacionados con la osteoporosis a través de la farmacología de redes y el análisis bioinformático y analizó los genes que se cruzan para las interacciones de proteínas, GO y KEGG. Con base en los resultados previstos, se puede observar la expresión de Act1 e IL-6, que son proteínas clave en la vía de señalización de IL-17,14,15, así como los marcadores de recambio óseo fosfatasa alcalina (ALP) y colágeno tipo I (COL-1), para observar la eficacia terapéutica de las píldoras de Xiaoyao en el modelo de ratones PMOM.

Protocolo

El Comité de Ética de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de Youjiang para las Nacionalidades aprobó el protocolo del estudio (número de aprobación: 2022101502). Los ratones hembra C57BL/6, de 10 a 12 semanas de edad, clase SPF y pesos corporales (22 ± 2) g, se alojaron en el Centro de Experimentación Animal de Clase SPF de la Universidad Médica de Youjiang para las Nacionalidades. Los animales de experimentación se mantuvieron a una temperatura de 24-26 °C y una humedad relativa de 55% a 60%.

1. Base de datos y plataforma de análisis de farmacología de los sistemas de medicina tradicional china

NOTA: La Base de Datos y Análisis de Farmacología de los Sistemas de Medicina Tradicional China (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) son plataformas de farmacología de la medicina china que contienen información sobre los ingredientes de la medicina tradicional china, las propiedades relacionadas con el ADME, los objetivos y las enfermedades16,17.

  1. Acceda a la interfaz web de TCMSP. Busque el nombre de Herb, ingrese el nombre de la medicina china y haga clic en Buscar. Haga clic en Nombre latino en los resultados de búsqueda. Realizar un cribado de los resultados de los ingredientes con los parámetros OB ≥ 30% y DL ≥ 0,18.
  2. Copie todos los resultados y guárdelos en formato TXT, llamado Medicina China Name_ingredients.txt.
  3. En Información de destinos, en la pestaña Destinos relacionados, filtre por Mol ID (es decir, el resultado del paso 1.2).
  4. Copie los resultados filtrados y guárdelos en formato TXT llamado Medicina China Name_targets.txt.
    NOTA: A través de los pasos anteriores, se obtuvieron todos los ingredientes activos elegibles y la información objetivo correspondiente de la medicina tradicional china (MTC).
  5. Coloque todos los archivos ingredients.txt y targets.txt anteriores en la misma carpeta y coloque los scripts Perl (Archivo de codificación suplementario 1) en esa carpeta.
  6. Abra CMD, escriba la ruta de la carpeta cd, ingrésela y ejecute el script Perl. Obtener un nuevo archivo de texto (allTargets.txt). Este nuevo archivo de texto (allTargets.txt) contiene el nombre de la hierba, el nombre del ingrediente, el ID del ingrediente y el objetivo.

2. Base de datos UniProt

NOTA: La base de datos UniProt (https://www.uniprot.org/) contiene secuencias de proteínas humanas anotadas con información funcional, y se utiliza para normalizar los nombres de los objetivos a sus nombres oficiales18.

  1. Vaya a la interfaz web de UniProt. Haga clic en la pestaña Buscar , seleccione UniProtKB y haga clic en Buscar.
  2. Filtre en la barra lateral izquierda, seleccione Revisado (Swiss-Prot) para Estado y Humano para Organismos populares. Haga clic en Descargar, seleccione Descargar todo, seleccione TSV para Formato y haga clic en Descargar para descargar el archivo de anotación.
  3. Descomprima el archivo descargado en la carpeta actual, abra el archivo descomprimido y cópielo y péguelo en un archivo de texto llamado ann.txt.

3. Conversión de ID de diana de fármaco

  1. Coloque todos los archivos de diana de drogas allTargets.txt obtenidos en la sección 1 y el archivo de anotación UniProt ann.txt obtuvo en la sección 2 en una carpeta y coloque los scripts de Perl (Supplementary Coding File 2) en ella.
  2. Abra CMD, escriba cd + espacio + ruta de la carpeta, ingréselo y ejecute el script Perl para obtener un nuevo archivo de texto (allTargets.symbol.txt). Este nuevo archivo de texto (allTargets.symbol.txt) contiene el nombre de la hierba, la identificación del ingrediente, el nombre del ingrediente y la identificación del gen.

4. Búsqueda en la base de datos

  1. GeneCards: Base de datos de genes humanos (GeneCards)
    NOTA: La base de datos GeneCards (https://www.genecards.org/) proporciona información de predicción y anotación para genes humanos. Se utiliza para acceder a los objetivos de la enfermedad19,20.
    1. Vaya a la interfaz web de GeneCards. Escriba osteoporosis en el cuadro de búsqueda y haga clic en Buscar.
    2. Haga clic en Exportar y seleccione Exportar a Excel.
    3. Abra el archivo descargado, copie los genes con una puntuación de relevancia ≥ 1, péguelos y guárdelos en un archivo llamado GeneCards.txt.
  2. Base de datos OMIM
    NOTA: La base de datos OMIM (https://omim.org) contiene genes humanos, enfermedades genéticas y rasgos21.
    1. Vaya a la interfaz web de OMIM. Haga clic en GENE Map, escriba osteoporosis en el cuadro de búsqueda y haga clic en Buscar.
    2. Haga clic en Descargar como y seleccione Archivo de Excel.
    3. Abra el archivo descargado, copie el nombre del gen en la columna Símbolo aprobado, péguelo y guárdelo en un archivo llamado OMIM.txt.
  3. Base de datos PharmGkb
    NOTA: PharmGkb (https://www.pharmgkb.org), la base de conocimientos de farmacogenómica, contiene anotaciones en las etiquetas de los medicamentos, vías centradas en los medicamentos, resúmenes farmacogenéticos y relaciones entre genes, medicamentos y enfermedades22.
    1. Vaya a la interfaz del sitio web de PharmGkb. Ingrese osteoporosis en el cuadro de búsqueda, haga clic en Buscar y marque Gen en la barra lateral izquierda.
    2. Ingrese todos los resultados manualmente y guárdelos en un archivo llamado PharmGkb.txt.
  4. TTD: Base de datos de dianas terapéuticas (TTD)
    NOTA: La base de datos TTD (https://idrblab.org/ttd/) proporciona información sobre las dianas de proteínas y ácidos nucleicos, las enfermedades objetivo, la información sobre las vías y los fármacos correspondientes para cada diana23.
    1. Vaya a la interfaz web de TTD. Escriba osteoporosis en el cuadro de búsqueda y haga clic en Buscar.
    2. Haga clic en Información de destino en ID de destino en el resultado, copie el nombre de destino, péguelo y guárdelo en un archivo llamado TTD.txt. Se obtuvieron un total de 33 resultados. Guarde cada resultado de la misma manera.
  5. Base de datos en línea de DrugBank (DrugBank)
    NOTA: La base de datos de DrugBank (https://go.drugbank.com) contiene información sobre fármacos y dianas farmacológicas, interacciones farmacológicas, mecanismos farmacológicos y metabolismo farmacológico24.
    1. Vaya a la interfaz del sitio web de DrugBank. Seleccione Indicaciones en la pestaña de búsqueda, escriba osteoporosis en el cuadro de búsqueda y haga clic en Buscar.
    2. Haga clic en la entrada Osteoporosis en los resultados para obtener más información, haga clic en la pestaña FÁRMACOS Y DIANAS y haga clic en el enlace apropiado en la columna TARGET de la tabla.
    3. Haga clic en Detalles en Proteína, copie el nombre del gen, péguelo y guárdelo en un archivo llamado DrugBank.txt. Guarde cada resultado de la misma manera.

5. Diagrama de Venn

  1. Fusión de genes asociados a enfermedades y mapeo de Venn
    1. Coloque los archivos txt guardados, así como el script, en la misma carpeta.
    2. Abra el código R (Merge Disease-Related Genes), copie y pegue la ruta donde se almacena el archivo txt anterior en la línea donde se encuentra el setwd en el código R.
    3. Abra el software R, ejecute el código R modificado y guarde. Establezca el gen, asigne un nombre al archivo Disease.txt.
    4. Abre el sitio web de Draw Venn Diagram; en la sección de entrada, copie y pegue el contenido de texto guardado en las secciones 4 a 8 uno por uno en la lista, asígnele un nombre con la base de datos respectiva y haga clic en Enviar.
    5. Haga clic en Guardar imagen como PNG debajo de la imagen y guarde el resultado del texto en la misma carpeta.
  2. Intersección de dianas farmacológicas y genes asociados a enfermedades
    1. Coloque el archivo allTargets.symbol.txt obtenido en la sección 3 y el archivo Disease.txt obtenido en el paso 5.1.3 en la misma carpeta.
    2. Abra el código R (el objetivo del fármaco y el gen relacionado con la enfermedad se interseccionan), copie y pegue la ruta donde se almacena el archivo txt anterior en la línea donde se encuentra el setwd en el código R.
    3. Abra el software R, ejecute el código R modificado y guarde. Establezca el gen, nombre del archivo Drug_Disease.txt.
    4. Abre el sitio web de Draw Venn Diagram. En la sección de entrada, copie y pegue allTargets.symbol.txt y Disease.txt en la lista y asígneles el nombre de sus archivos respectivos.
    5. Haga clic en Guardar imagen como PNG debajo de la imagen y guarde los resultados del texto en la misma carpeta.

6. Construcción de la red reguladora de la composición TCM

  1. Coloque el archivo allTargets.symbol.txt obtenido en la sección 3 en la misma carpeta que el archivo Disease.txt y el script Perl correspondiente (Archivo de codificación suplementario 3).
  2. Abra CMD, escriba la ruta del archivo cd, presione Enter y ejecute el script Perl. Obtén cuatro nuevos archivos txt: net.geneLists.txt, net.molLists.txt, net.network.txt y net.type.txt. El archivo network.txt contiene el ID del ingrediente de la MTC, el gen objetivo, la relación entre el objetivo y el nombre del ingrediente. net.type.txt contiene el nombre del nodo, los atributos y la afiliación. net.geneLists.txt es la lista de genes, y net.molLists.txt es la lista de ingredientes.
  3. Copie los archivos de texto recién obtenidos en la misma carpeta nueva.
  4. Abra el software Cytoscape 3.9.1, haga clic en Archivo, haga clic en Importar y seleccione Archivo de formulario de red. Seleccione net.network.txt, coloque la primera columna de Component ID como Nodo de origen, la segunda columna de Genes como Nodo de destino y la tercera columna de Relación de segmentación como Tipo de interacción y haga clic en Aceptar.
  5. Importe net.type.txt desde la ventana Tabla de nodos. Haga clic en la pestaña Seleccionar, seleccione Nodos, seleccione Del archivo de lista de ID, seleccione net.geneLists.txt y haga clic en Abrir.
  6. Haga clic en la pestaña Diseño, seleccione Diseño de círculo ordenado por grados y seleccione Solo nodos seleccionados. Ajuste la altura y la anchura de los nodos a 70.
  7. Haga clic en el segundo cuadro de Altura, seleccione degree.layout en Columna, seleccione Mapeo continuo en Tipo de mapeo y haga doble clic en la Ventana de ajuste de altura en el lado derecho de Mapeo actual para ajustar los límites superior e inferior de la altura a un rango adecuado.
  8. Repita la operación con la opción Anchura.
  9. Vuelva a hacer clic en la pestaña Diseño y haga clic en Herramientas de diseño > Ajustar la escala para que los nodos no se superpongan.
  10. Haga clic en la ventana superior derecha del software para desmarcar la red de nodos, haga clic en la pestaña Seleccionar , seleccione Nodos, seleccione Del archivo de lista de ID, seleccione net.molLists.txt y haga clic en Abrir.
  11. Haga clic en la pestaña Diseño, seleccione Diseño de atributos de grupo, seleccione Solo nodos seleccionados y haga clic en Tipo.
  12. Haga clic en Tamaño de fuente de etiqueta en la columna de la izquierda y establezca Valor predeterminado en 12. Haga clic en Valor predeterminado en Imagen/Gráfico 1 en la columna de la izquierda.
  13. Seleccione Gráficos en la ventana emergente, haga clic en Gráfico circular y seleccione los elementos de la columna Columnas disponibles, excepto el grado. Diseño en la columna de columnas seleccionadas y haga clic en Aplicar.
  14. Haga clic en Pintura de borde en la columna de la izquierda y establezca el Valor predeterminado en #003EF8. Haga clic en la pestaña Borde en la parte inferior de la barra lateral izquierda y establezca Ancho en 0.8.
  15. Haga clic en Archivo en la barra de herramientas superior, seleccione Exportar y, a continuación, seleccione Red a imagen.
  16. En la ventana emergente, seleccione Formato PNG para Formato, seleccione el directorio de guardado y asigne un nombre a la red de imágenes, ajuste el tamaño de la imagen al máximo del 500%, seleccione Fondo transparente y haga clic en Aceptar para terminar de guardar la imagen.

7. Construcciones de redes de interacción proteína-proteína (PPI)

  1. Abra el sitio web de STRING (https://string-db.org/), haga clic en Proteína múltiple, haga clic en Examinar en Cargar un archivo, seleccione el archivo Drug_Disease.txt obtenido en el paso 5.2.3 y seleccione Homo sapiens en organismos. Haga clic en Buscar y haga clic en Continuar.
  2. Haga clic en Configuración, establezca la puntuación de interacción mínima requerida en la confianza más alta (0,900) y marque Ocultar nodos desconectados en la red en las opciones de visualización de la red. Haga clic en Actualizar.
  3. Realice ajustes en los nodos del diagrama de red para que no haya superposición ni oclusión.
  4. Haga clic en Exportaciones y haga clic en Descargar como mapa de bits de alta resolución para obtener el mapa de la red de interfuncionamiento de proteínas en formato PNG. Además, descargue el archivo TSV como una salida de texto tabular corta. Guarde ambos archivos en una carpeta unificada. El archivo TSV contiene el nombre del gen, el ID interno de STRING y las puntuaciones de los diferentes atributos.

8. Construcción del núcleo de la red PPI

  1. Coloque el archivo TSV obtenido en la sección 7 y los scripts Perl necesarios en una nueva carpeta.
  2. Abra el software Cytoscape 3.9.1, haga clic en Archivo, seleccione Importar, haga clic en Red desde archivo, seleccione el archivo TSV anterior, coloque el nodo de la primera columna 1 como Nodo de origen y el segundo nodo de columna 2 como Nodo de destino, y haga clic en Aceptar.
  3. Haga clic en Estilo en la barra lateral izquierda, haga clic en Valor predeterminado en Ancho y establézcalo en 60. Arrastre y suelte los nodos para que no haya superposición ni oclusión en la red.
  4. Haga clic en APLICACIONES en la barra de herramientas superior, haga clic en CytoNCA y haga clic en Abrir.
  5. En la columna de la izquierda, seleccione Sin peso en Intersección, Cercanía, Grado, Vector propio, Método basado en conectividad de promedio local y Red, y haga clic en Analizar.
  6. Cuando se complete el análisis, haga clic en Tabla de nodos en la ventana inferior derecha, haga clic en Exportar, guárdelo en la carpeta y asígnele el nombre puntuación 1.
    NOTA: El complemento CytoNCA debe instalarse en el software Cytoscape. Para ello, haga clic en Aplicaciones en la barra de herramientas superior, haga clic en Administrador de aplicaciones, escriba CytoNCA en el cuadro de búsqueda, marque CytoNCA en la columna central de los resultados devueltos y haga clic en Instalar.
  7. Abra score1, ajuste la columna de nombre a la primera columna, copie la información de la tabla, péguela en un nuevo archivo de texto, asígnele score1.txt nombre y guárdela.
  8. Abra el código R y copie y pegue la ruta donde se encuentra el archivo score1.txt en la línea donde se encuentra el setwd en el código R.
  9. Abra el software R y ejecute el código modificado para obtener dos archivos nuevos, score2.txt y score2.gene.txt. El archivo score2.txt contiene los genes para los cuales todas las puntuaciones del programa fueron mayores que la mediana y las puntuaciones específicas de cada programa. score2.gene.txt contiene los genes que obtuvieron una puntuación superior a la mediana de todos los ítems.
  10. Para continuar en Cytoscape, haga clic en AnalysisPanel 1 en la ventana inferior derecha, haga clic en Cargar desde archivo en el lado izquierdo de la ventana, seleccione la score2.gene.txt, haga clic en Abrir y toque Aceptar en la ventana emergente.
  11. Haga clic en Seleccionar nodos en la parte inferior y haga clic en Aceptar en la ventana emergente.
  12. Haga clic en Archivo en la barra de herramientas superior, seleccione Exportar, haga clic en Red a imagen, ajuste el Zoom (%) en el tamaño de la imagen al máximo 500%, marque Fondo transparente y guarde el archivo en la misma carpeta, asígnele el nombre network1.
  13. Haga clic en Crear subred en la barra lateral derecha de la ventana inferior para crear una subred, analizar la subred, haga clic en APP en la barra de herramientas de la parte superior, haga clic en CytoNCA y haga clic en Abrir.
  14. En la barra lateral izquierda, seleccione Sin peso en Interrupción, Cercanía, Grado, Vector propio, Método basado en conectividad de promedio local y Red, y haga clic en Analizar.
  15. Cuando finalice el análisis, haga clic en Tabla de nodos en la ventana inferior derecha, haga clic en Exportar y guárdelo en una nueva carpeta llamada score2.
  16. Abra score2, ajuste la columna de nombre a la primera columna, copie la información de la tabla, péguela en un nuevo archivo de texto, asígnele score2.txt nombre y guárdela.
  17. Abra el código R y copie y pegue la ruta donde se encuentra el archivo score2.txt en la línea donde se encuentra el setwd en el código R.
  18. Abra el software R y ejecute el código modificado para obtener dos archivos nuevos: score3.txt y score3.gene.txt. El archivo score3.txt contiene los genes que obtuvieron una puntuación superior a la mediana para todos los ítems y las puntuaciones específicas para cada ítem. score3.gene.txt contiene los genes que obtuvieron una puntuación superior a la mediana de todos los ítems.
  19. Para continuar en Cytoscape, haga clic en AnalysisPanel 1 en la ventana inferior derecha, haga clic en Cargar desde archivo en el lado izquierdo de la ventana, seleccione el score3.gene.txt, haga clic en Abrir y toque Aceptar en la ventana emergente.
  20. Haga clic en Seleccionar nodos en la parte inferior y haga clic en Aceptar en la ventana emergente.
  21. Haga clic en Archivo en la barra de herramientas superior, seleccione Exportar, haga clic en Red a imagen, ajuste el Zoom (%) en el tamaño de la imagen al 500%, marque Fondo transparente y guarde el archivo en la misma carpeta que la utilizada en este paso, nombrándolo network2.
  22. Haga clic en Crear subred en la barra lateral derecha de la ventana de abajo para crear una subred.
  23. Haga clic en Archivo en la barra de herramientas en la parte superior, seleccione Exportar, haga clic en Red a imagen, ajuste el Zoom (%) en el tamaño de la imagen al máximo de 500%, marque Fondo transparente y guarde el archivo en la misma carpeta que se usó en este paso y asígnele el nombre network3.

9. Conversión de ID de genes

  1. Coloque el archivo Drug_Disease.txt en la misma carpeta nueva que el archivo de código requerido.
  2. Abra el código R (Archivo de codificación suplementario 4) y copie y pegue la ruta donde se encuentra el archivo Drug_Disease.txt a la línea donde se encuentra el setwd en el código R.
  3. Abra el software R, ejecute el código modificado usando la org. Hs.eg.db paquete para convertir el ID del gen y ejecutarlo después de completar un nuevo archivo id.txt. El id.txt contiene el símbolo del gen y el ID correspondiente.

10. Análisis de enriquecimiento de GO

  1. Coloque el archivo id.txt del paso anterior en la misma carpeta que el código de análisis de enriquecimiento de GO.
  2. Abra el código R (Supplementary Coding File 5) y establezca el directorio de trabajo en id.txt y la ruta donde se almacena el código GO.
  3. Abra el software R, ejecute el código modificado y use clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enriquezca el gráfico, el gráfico ggplot2, los histogramas de análisis de enriquecimiento GO y los diagramas de burbujas. Obtenga tres archivos nuevos, GO.txt, barplot.pdf y bubble.pdf, una vez completada la ejecución.
    NOTA: El GO.txt es el archivo de resultados de enriquecimiento que contiene la clasificación de enriquecimiento (BP, CC, MF), GO ID, nombre GO, proporción de genes, proporción de fondo, valor p de importancia del enriquecimiento, valor p corregido (p.ajuste, valor), ID de gen (nombre) y número de genes enriquecidos en cada GO. barplot.pdf es el histograma, burbuja. PDF es un diagrama de burbujas.

11. Análisis de enriquecimiento de KEGG

  1. Coloque el archivo id.txt en la misma carpeta que el código de análisis de enriquecimiento KEGG.
  2. Abra el código R (Supplementary Coding File 6) y establezca el directorio de trabajo en la ruta donde se almacenan id.txt y el código KEGG.
  3. Abra el software R, ejecute el código modificado y use clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichplot, paquete ggplot2 para trazar histogramas de análisis de enriquecimiento GO, diagramas de burbujas y gráficos de ruta. La tirada se completa con la producción de tres nuevos archivos, KEGG.txt, barplot.pdf y bubble.pdf.
    NOTA: El archivo KEGG.txt es un archivo de resultados de enriquecimiento que contiene el ID de la vía, la descripción de la vía, la proporción de genes, la proporción de fondo, el valor p de la importancia del enriquecimiento, el valor p corregido (p.adjust, qvalue), el ID del gen (nombre) y el número de genes enriquecidos en cada vía. barplot.pdf es un gráfico de barras y bubble.pdf es un gráfico de burbujas.
  4. Busque IL-17 en el archivo KEGG.txt; El resultado muestra que solo hay un camino; copie el ID de la ruta.
  5. Abra el código R, pegue el ID de la ruta IL-17 en KEGGID y use el paquete pathview para etiquetar el mapa de ruta. Ejecute el código R modificado y obtenga dos archivos nuevos, hsa04657.pathview.png y hsa04657.png.
    NOTA: El archivo hsa04657.png es el mapa de rutas, hsa04657.pathview.png es el mapa de rutas etiquetado, y los marcados en rojo son los genes presentes en la red de interacciones.

12. Preparación de las píldoras Xiaoyao

NOTA: Para conocer el método de preparación utilizado, consulte la Farmacopea China5.

  1. Tomar 100 g de Chai Hu, 100 g de Angelica sinensis, 100 g de Paeonia lactiflora blanca, 100 g de Atractylodes macrocephala salteados, 100 g de Poria cocos, 80 g de Radix glycyrrhizae preparate y 20 g de Menthae herba.
  2. Usando un molino de piedra o una máquina pulverizadora, triture las hierbas hasta obtener un polvo fino; Varias hierbas se combinan en las proporciones anteriores y se pulverizan hasta obtener un polvo fino para mezclarse de forma natural. Utilice un tamiz de fármaco de 80 mallas con un diámetro interior de 180 μm ± 7,6 μm y tamice el polvo pulverizado. Homogeneizar.
  3. Tome 100 g de jengibre, agregue agua y hiérvalo 2 veces durante 20 minutos cada vez. Colar y reservar.
  4. Tome una placa medicinal, sumerja una escoba pequeña en agua de jengibre, úntela sobre la placa, tome el polvo anterior, espolvoréelo sobre el agua de jengibre y gire la placa para que todo el polvo esté húmedo y se pueda moldear en forma de bola.
    NOTA: La formación de la placa medicinal es un paso esencial durante la preparación de las píldoras de MTC. La mayor parte del bambú moso se dividirá en tiras y se tejerá en un esqueleto. La piel de bambú, o tengpi, se teje en la superficie y se redondea. La superficie de la placa debe recubrirse finamente con aceite de tung y luego cepillarse con una capa de barniz. Este se seca para que se vuelva hermético. Las píldoras hechas de esta manera serán redondas y suaves.
  5. Vuelva a cepillar el agua de jengibre, espolvoree el polvo y gire la placa para que el medicamento se redondee y agrande gradualmente. Coloque en un lugar fresco para que se seque.

13. Establecimiento del modelo animal

  1. Después de 7 días de aclimatación, divida aleatoriamente los ratones experimentales en 4 grupos, a saber, el grupo de operación simulada (Sham, donde solo se eliminó la grasa alrededor de los ovarios) y tres grupos de ratones ovariectomizados que consisten en un grupo modelo (OVX), así como grupos de administración de píldoras Xiaoyao de baja y alta concentración.
  2. Anestesiar a los ratones con pentobarbital sódico al 3% (40 mg/kg) inyectado por vía intraperitoneal. Compruebe que los ratones entran en el estado de anestesia observando la relajación muscular generalizada, la respiración profunda y lenta y la lentitud de los movimientos. Aplique ungüento ocular en los ojos de los ratones antes de la cirugía.
  3. Coloque a los animales en posición prona y afeita la región renal de la espalda con una afeitadora de animales. Realizar la desinfección local con etanol al 75%.
  4. Realice una incisión longitudinal de aproximadamente 1 cm bilateralmente, cerca de la región dorsal del riñón, e incida en la fascia para separar los músculos y el peritoneo.
  5. Localice la parte superior del cuerno uterino y las trompas de Falopio para la ligadura. Inserte pinzas en la incisión para la exploración y localice el ovario, cubierto por tejido adiposo en un patrón de coliflor rojo brillante, con trompas de Falopio dispuestas en espiral debajo del ovario, conectando el ovario con el cuerno uterino25. Extirpar los ovarios con tijeras quirúrgicas y sutura.
  6. Extraer una pequeña cantidad de tejido adiposo cerca del ovario como control en el grupo de operación simulada. Observa a los animales hasta que recuperen la conciencia. Coloque a los animales postoperatorios en jaulas separadas hasta su recuperación completa.
  7. Para prevenir la infección, administre gentamicina a los ratones durante 3 días después de la operación. Después de la operación, asegúrese de tener una dieta normal y un buen entorno de crecimiento de acuerdo con la condición real de los ratones. Si hay alguna anomalía, como infección de la herida o pérdida de apetito, consulte inmediatamente al instructor del Centro de Animales de Laboratorio.

14. Administración de medicamentos

NOTA: De acuerdo con la Metodología Experimental de Farmacología26, la conversión de las dosis humanas y animales utilizadas fue de 9 g de pastillas de Xiaoyao para un adulto de 70 kg, lo que equivale a una dosis (dosis para una sola administración).

  1. Para los grupos de dosis baja y alta, utilizar 0,683 g/kg y 2,73 g/kg, respectivamente, para un grupo de 8 animales. Use la mano izquierda para inmovilizar el ratón de modo que la boca del ratón quede en línea recta con el esófago. Sosteniendo la aguja de sonda nasogástrica en la mano derecha, insértela suavemente en el esófago a lo largo de la pared posterior de la faringe desde la comisura de la boca del ratón.
  2. En este punto, la dirección de la aguja de sonda nasogástrica puede alterarse ligeramente para estimular una acción de deglución inducida. Inyectarse la droga. Realice esto una vez al día durante 12 semanas.
  3. Para los grupos operados simuladamente y modelo, administre solución salina una vez al día durante 12 semanas en una cantidad determinada por el peso del animal.
  4. Sacrificar ratones por dislocación cervical y cortarles las extremidades traseras. Despellejar las extremidades para separar el músculo del fémur. Trate los fémures de los ratones con una solución de descalcificación de EDTA durante 1 mes y reemplácelos con una solución fresca todos los días.

15. Tinción de hematoxilina-eosina (HE)

  1. Desparafinar los tejidos femorales durante 8 min y luego colocarlos en etanol de gradiente durante 3 min; Enjuague con agua corriente durante 1 min.
  2. Agregue la solución de tinción de hematoxilina gota a gota a las secciones para cubrir completamente el tejido, tiña durante 5 minutos y lave con agua del grifo
  3. Agregue la solución de diferenciación de ácido clorhídrico al tejido en el portaobjetos, asegurándose de que cubra completamente el tejido. Deténgase cuando se observe decoloración del tejido. Enjuague con agua del grifo.
  4. Agregue la solución de colorante de eosina gota a gota y deje cubrir el tejido por completo, actuando durante 30 s a 2 min. Enjuaga el exceso de tinte con agua corriente.
  5. Realice la deshidratación de etanol en gradiente con etanol anhidro al 75% durante 5 minutos, seguido de etanol anhidro durante 5 minutos y limpie con solución desparafinadora durante 3 minutos.
  6. Deje caer una cantidad adecuada de goma neutra en el portaobjetos de acuerdo con el tamaño del pañuelo, y baje el cubreobjetos con cuidado, evitando las burbujas de aire.

16. Micro-CT e inmunohistoquímica

  1. Eliminar el exceso de músculos y ligamentos alrededor del fémur de diferentes grupos de ratones y fijar los tejidos de la muestra en paraformaldehído al 4% durante 24 h.
  2. Seque los tejidos óseos al aire y realice micro-CT mediante escaneo de tejido óseo para obtener datos tridimensionales de micro-CT.
  3. De los bloques de cera de ratón conservados, córtelos en secciones continuas de 6 μm de grosor y hornee las rodajas a 70 °C -72 °C durante 30-60 min.
  4. Desparafinar durante 8 minutos, seguido de un tratamiento con etanol anhidro al 75% durante 5 minutos, etanol anhidro durante 5 minutos y enjuague con PBS durante 5 minutos durante 3 veces.
  5. Realice la reparación de alta presión con EDTA durante 15 minutos, seguida de un lavado con PBS durante 5 minutos durante 3 veces.
  6. Agregue peróxido de hidrógeno al 3% gota a gota al pañuelo, incube a temperatura ambiente durante 10 minutos y lave con PBS durante 5 minutos durante 3 veces.
  7. Use un bolígrafo de inmunohistoquímica para dibujar un círculo. Lavar con PBS lavar durante 3 min para 3x.
  8. Tinción en el anticuerpo primario (pAb de conejo anti-ALP (1:200), pAb de conejo anti-COL-1 (1:200), pAb de conejo anti-IL-17 (1:275), anti-Act1 (1:500), pAb de conejo anti-IL-6 (1:500)) durante la noche, seguido de enjuague con tampón PBS durante 5 min durante 3 veces.
  9. Añadir gota a gota el anticuerpo secundario (Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L; 1:2000) conjugado con HRP) e incubar a temperatura ambiente durante 60 min. Lavar con tampón PBS durante 3 min para 3x.
  10. Incubar en DAB listo para usar durante 3-5 min, luego enjuagar con PBS.
  11. Vuelva a tingir con hematoxilina durante 3 minutos, seguido de un enjuague con PBS.
  12. Utilice la solución de diferenciación durante unos 10 s, seguida de un enjuague con PBS.
  13. Agregue la solución azul de retorno durante 10 s, seguido de enjuague con PBS.
  14. Realice un tratamiento con etanol anhidro al 75% durante 5 minutos, etanol anhidro durante 5 minutos y transparente durante 3 minutos. Utilice resina neutra para sellar los portaobjetos.

Resultados

Ingredientes activos y objetivos de acción de las píldoras Xiaoyao
Al buscar en la base de datos de TCMSP y realizar el cribado según los criterios de biodisponibilidad oral (OB) ≥ 30% y propiedades similares a los medicamentos (DL) ≥ 0,18, se encontró que existían 125 ingredientes activos en las píldoras de Xiaoyao. Entre ellos, los ingredientes 6, 4, 9, 13, 2, 6, 83 y 2 eran de Paeonia lactiflora blanca, Atractylodes macrocephala, Menthae herba, Chaihu, Angelica sinensis, Poria cocos, regaliz y jengibre, respectivamente. Algunos de los ingredientes activos se muestran en la Tabla 1. Además, se obtuvieron un total de 879 dianas de ingredientes activos eficaces de la base de datos del TCMSP, y quedaron 232 dianas tras la conversión de ID y la eliminación de los valores duplicados.

Análisis de red de MTC - Ingrediente activo - Diana intersectante - Enfermedad
Se realizaron búsquedas en varias bases de datos utilizando la palabra clave osteoporosis para genes asociados con la enfermedad. En la base de datos GeneCards se obtuvieron 1692 genes después de filtrar de acuerdo con la puntuación de relevancia ≥1. Se obtuvieron un total de 35 genes en la base de datos OMIM. Había 3, 33 y 386 genes en las bases de datos PharmGkb, TTD y DrugBank, respectivamente. Posteriormente, se utilizó la intersección de los resultados de estas cinco bases de datos para su posterior análisis (Figura 1A). Uno de los genes que se representó en cuatro bases de datos fue el CALCR. Se obtuvieron un total de 102 genes que se cruzan después de combinar los genes relacionados con la enfermedad y tomar la intersección con el objetivo del fármaco (Figura 1B). Sobre la base de las interacciones entre las dianas de la enfermedad y los ingredientes activos del fármaco, se construyó una red de enfermedades diana que se cruzan con el principio activo de la MTC con el software Cytoscape. Como resultado, se obtuvieron relaciones entre los componentes del fármaco y la regulación polimórfica de las gammagrafías genéticas relacionadas con la enfermedad (Figura 2A).

En la base de datos String, se analizaron las interacciones de las proteínas en la intersección de los genes de la enfermedad y las dianas farmacológicas para obtener sus diagramas de red de interacción (Figura 2B), y luego se examinaron las proteínas más centrales (Figura 2C-D). Los resultados mostraron las interacciones más fuertes entre FOS, ESR1, MAPK3, TP53, MAPK1 y STAT3 entre los genes de la enfermedad y los objetivos farmacológicos (Figura 2E).

Función GO y análisis de enriquecimiento de la vía KEGG
El análisis de enriquecimiento de GO mostró un total de 2177 entradas, incluidas las entradas de 1990 de procesos biológicos (BP), 58 entradas de componentes celulares (CC) y 129 entradas de funciones moleculares (MF). En la BP, los genes se centraron principalmente en la respuesta a los niveles de nutrientes, la respuesta al estrés oxidativo y la respuesta celular al estrés oxidativo. MF se centró en la unión del factor de transcripción de unión al ADN, la unión del factor de transcripción de unión al ADN específico de la ARN polimerasa II, la actividad del receptor nuclear, la actividad del factor de transcripción activado por ligando y la actividad de las citocinas (Figura 3A-B).

En el análisis de enriquecimiento de la vía KEGG, se obtuvieron un total de 168 vías de señalización relacionadas, y las más significativas fueron la vía de señalización AGE-RAGE, la vía de señalización IL-17, la vía de señalización TNF, la vía de señalización HIF-1 y la diferenciación de células Th17 (Figura 3C-D). Se sugiere que las píldoras Xiaoyao pueden ejercer efectos terapéuticos sobre PMOM de múltiples maneras. La inflamación está fuertemente asociada con la osteoporosis y puede acelerarse con la menopausia, y la IL-17 es un factor inflamatorio importante7. Por lo tanto, el próximo plan es explorar si las píldoras Xiaoyao podrían tratar la osteoporosis desde una perspectiva inflamatoria con respecto a la IL-17.

Cambios estructurales en el tejido óseo antes y después de la extracción del tejido ovárico
La tinción HE mostró que en los fémures de los ratones Sham, las trabéculas estaban bien dispuestas, con buena continuidad, pequeños espacios entre las trabéculas, fracturas raras y tamaño normal de la cavidad de la médula ósea. En comparación con el grupo Sham, los fémures del grupo OVX estaban escasamente dispuestos, con fracturas graves de las trabéculas, continuidad interrumpida y una cavidad de la médula ósea marcadamente agrandada, mostrando cambios osteoporóticos típicos (Figura 4A).

Comparación de micro-TC entre los grupos
Los fémures de los ratones del grupo OVX mostraron una malla trabecular incompleta, una cavidad medular parcialmente vacía y un adelgazamiento de la corteza ósea en comparación con los de los ratones del grupo Sham. El grupo de ratones Sham mostró una abundancia de trabéculas, buena continuidad y un estrechamiento de la cavidad medular en sus fémures (Figura 4B).

Efectos conductuales de las píldoras Xiaoyao en ratones
Durante el período de estudio, a excepción del grupo OVX, todos los ratones de los otros grupos tenían mejores hábitos de vida, un color de pelo normal, mucha movilidad y buena salud. La orina y las heces de cada ratón volvieron a la normalidad dentro de 1 semana después del tratamiento con píldoras Xiaoyao. No hubo mordeduras, infecciones de heridas, obstrucción gastrointestinal, desprendimiento de suturas, necrosis cutánea de la incisión ni muerte de ninguno de los ratones. Los ratones del grupo OVX eran propensos a la pérdida de cabello, al oscurecimiento del color del cabello, a la reducción de la movilidad, a los reflejos más largos, al aumento de la excreción y a la disminución de la comida y la bebida.

Tinción de HE de secciones patológicas de ratones después de la intervención farmacológica
En el grupo Sham, el tejido femoral era denso, reticular y regular dispuesto. El tamaño y la continuidad de la cavidad medular eran normales y el espaciamiento entre las trabéculas óseas adyacentes era relativamente pequeño. En comparación con el grupo Sham, la corteza femoral y el hueso esponjoso en el grupo OVX mostraron defectos evidentes, disminución de las trabéculas, aumento de los espacios, continuidad interrumpida, adelgazamiento de la estructura, ensanchamiento de la cavidad medular y adelgazamiento de la corteza ósea. En comparación con el grupo OVX, las trabéculas femorales de los ratones en los grupos tratados con fármacos (dosis bajas y altas) parecían estructuralmente intactas, con un espaciamiento reducido, una mayor conectividad, cavidades de médula ósea más estrechas y estructuras más densas (Figura 5A).

Detección de índices de imagen en ratones tras la intervención farmacológica
En comparación con el grupo Sham, los fémures de los ratones del grupo OVX tenían trabéculas óseas escasas y rotas y corteza ósea adelgazada. En comparación con el grupo OVX, los ratones en el grupo de píldoras Xiaoyao de dosis alta tenían menos trabéculas óseas fracturadas, reticulación restaurada y un grado significativo de reducción parcial de la cavidad de la médula ósea. Sin embargo, los ratones tratados con píldoras Xiaoyao de dosis bajas todavía tenían trabéculas óseas fracturadas, aunque hubo un aumento de las trabéculas óseas y una reducción de la cavidad de la médula ósea. La estructura trabecular de las trabéculas óseas del grupo operado simuladamente mostró más continuidad y completitud (Figura 5B).

Resultados inmunohistoquímicos de los tejidos de los grupos tras la intervención farmacológica
Act1 e IL-6 son proteínas clave en la vía de señalización de IL-17, y ALP y COL-1 son genes osteogénicos. La expresión de las proteínas ALP, COL-1, IL-6, IL-17 y Act1 conduce a la formación de gránulos de color canela o amarillo en el tejido óseo. Los resultados de inmunohistoquímica mostraron que los valores medios de densidad óptica de ALP y COL-1 en el grupo de fármaco fueron superiores a los del grupo OVX después del tratamiento con pastillas de Xiaoyao, y la diferencia fue estadísticamente significativa (p < 0,05). Los valores medios de densidad óptica de IL-17, Act1 e IL-6 en el grupo de fármaco fueron inferiores a los del grupo OVX, y la diferencia fue estadísticamente significativa (p < 0,05; Figura 6). Las píldoras de Xiaoyao revirtieron la disminución de ALP y COL-1 causada por la ovariectomía, al tiempo que disminuyeron la expresión de varias proteínas clave IL-17, IL-6 y Act1 en la vía de señalización de IL-17, lo que sugiere que el fármaco puede ejercer sus efectos terapéuticos a través de esta vía.

figure-results-1
Figura 1: Análisis de red de la intersección de los ingredientes activos de la medicina herbal china y los genes relacionados con la enfermedad. (A) La intersección de genes relacionados con enfermedades, obtenidos de las bases de datos GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD y DrugBank. Estos están representados por colores azul, rojo, verde, amarillo y marrón con 1692, 35, 3, 33 y 386 genes, respectivamente. La intersección son los genes asociados a la enfermedad en las cinco bases de datos, y la parte superpuesta indica el número de genes que se cruzan en cada base de datos. (B) Se muestran las dianas de los fármacos (con el color azul que indica este conjunto de datos, es decir, el conjunto de genes diana que actúan contra los fármacos recogidos en la base de datos de TCMSP después de la transformación de la identificación y la eliminación de duplicados) y los genes relacionados con la enfermedad (con el color rojo que indica este conjunto de datos, que contiene todos los genes de las cinco bases de datos mencionadas anteriormente). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Interacción de los ingredientes activos de la MTC con las redes reguladoras de genes relacionadas con enfermedades y las proteínas centrales. (A) La red reguladora de ingredientes activos y genes relacionados con enfermedades en la medicina tradicional china muestra las relaciones reguladoras de genes correspondientes a cada ingrediente activo en las píldoras Xiaoyao, con cada ingrediente vinculado al gen que regula. (B) Los resultados del análisis de interacción proteína-proteína de genes que se cruzan en STRING (los nodos de la red representan proteínas, los bordes representan asociaciones proteína-proteína y los enlaces múltiples indican interacciones múltiples entre dos proteínas). (C-E) Las interacciones proteicas obtenidas por String se examinaron varias veces. (C) La red de interacción de proteínas se obtuvo después del primer cribado, y la parte resaltada es su parte central. (D) El resultado del segundo cribado y la parte resaltada es la parte central. (E) La red de interacción proteína-proteína más central en la red de interacción proteína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Análisis de enriquecimiento de GO y KEGG. (A-B) Los resultados del análisis de enriquecimiento de GO de genes que se cruzan se dividen en 3 entradas, Proceso Biológico (BP), Componente Celular (CC) y Función Molecular (MF), y cada entrada muestra solo los 10 genes más significativamente enriquecidos. (C-D) Los resultados del análisis de enriquecimiento KEGG de los genes que se cruzan (mostrando los 30 más enriquecidos más significativamente). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Establecimiento y evaluación del modelo de ratones ovariectomizados. (A) Comparación de la morfología ósea metafisaria entre los grupos operados simuladamente y los ovariectomizados (10x). En el grupo OVX, las fracturas trabeculares fueron graves, la continuidad se interrumpió y la cavidad de la médula ósea se agrandó significativamente, mientras que en el grupo simulado, las fracturas trabeculares fueron raras y la cavidad de la médula ósea fue de tamaño normal. (B) Micro-TC del fémur en los grupos operados simuladamente y ovariectomizados. En el grupo OVX, la malla trabecular estaba incompleta y la cavidad de la médula ósea estaba parcialmente vacía. En el grupo Sham, las trabéculas eran abundantes y continuas, y la cavidad de la médula ósea era estrecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Ensayo de HE y micro-CT después del tratamiento con las píldoras Xiaoyao. (A) Tinción de HE (10x) de secciones de fémur de ratones en cada grupo después del tratamiento con píldoras Xiaoyao. En el grupo OVX, las trabéculas óseas estaban reducidas, la continuidad se interrumpía, la estructura era escasa y la cavidad medular estaba agrandada. En el grupo de Sham, las trabéculas óseas tenían buena continuidad, el tejido femoral era estructuralmente denso y la cavidad medular era normal. En comparación con el grupo OVX, las trabéculas óseas en el grupo del fármaco parecían estructuralmente intactas, con una mayor conectividad, una cavidad medular reducida y una estructura más densa que en el grupo modelo. (B) Comparación de micro-CT de fémures de ratones en cada grupo después del tratamiento con píldoras Xiaoyao. Las trabéculas óseas en los fémures de los ratones del grupo ovariectomizado eran escasas y rotas, mientras que el grupo Sham tenía trabéculas más continuas e intactas. En comparación con el grupo ovariectomizado, los ratones en el grupo tratado con dosis altas de fármaco tenían menos trabéculas óseas rotas, estructura reticular restaurada y cavidad de la médula ósea parcialmente reducida, mientras que los animales en el grupo de dosis bajas de fármacos tenían más trabéculas óseas y menos cavidad de la médula ósea, pero las trabéculas óseas rotas permanecieron. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Inmunohistoquímica para detectar el efecto de las píldoras de Xiaoyao en la vía de señalización de IL-17 y la expresión de proteínas génicas marcadoras osteogénicas en ratones osteoporóticos (40x). Las reacciones positivas para la presencia de ALP, COL-1, IL-6, así como de las proteínas IL-17 y Act1 se manifestaron por la aparición de gránulos de color canela o amarillo en el tejido óseo. La expresión de ALP y COL-1 en el grupo de fármaco fue mayor que en el grupo de OVX (p < 0,05). La expresión de IL-17, Act1 e IL-6 en el grupo de fármacos fue menor que en el grupo de OVX (p < 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre de la medicina tradicional chinaIdentificación molecularNombre de la molécula
Paeonia lactiflora blancaMOL001918paeoniflorgenone
Paeonia lactiflora blancaMOL000211Mairín
Atractylodes macrocephalaMOL00002214-acetil-12-senecoil-2E,8Z,10E-atractilentriol
Atractylodes macrocephalaMOL0000493β-acetoxiatractilona
Menthae HerbaMOL000471Aloe-Emodin
Menthae HerbaMOL005190Eriodictyol
Chai HuMOL000354isorhamnetin
Chai HuMOL013187Cubebin
Angélica sinensisMOL000449Estigmasterol
Angélica sinensisMOL000358beta-sitosterol
Poria cocosMOL000282ergosta-7,22E-dien-3beta-ol
Poria cocosMOL000283Peróxido de ergosterol
RegalizMOL002311Glicirol
RegalizMOL0049907,2',4'-trihidroxi - 5-metoxi-3 - arilcoumarina
Jengibre frescoMOL0061296-metilgingediacetato2
Jengibre frescoMOL001771poriferast-5-en-3beta-ol

Tabla 1: Ingredientes activos en medicamentos chinos seleccionados. La primera columna enumera los nombres de las medicinas tradicionales chinas, la segunda columna es la identificación del ingrediente activo de la medicina china y la tercera columna es el nombre del ingrediente activo de la medicina china.

Archivo de codificación suplementario 1: Nombre de la hierba, ingrediente y código de combinación de ID de destino. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Fichero de codificación suplementario 2: Conversión de ID de diana de fármaco. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Fichero de codificación suplementario 3: Ficheros para el análisis de redes. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 4: Conversión de símbolo a identificación de genes. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Fichero de codificación suplementario 5: Análisis de enriquecimiento de GO. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 6: Análisis de enriquecimiento de KEGG. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Según las estadísticas, la osteoporosis causa 1,5 millones de fracturas cada año en los Estados Unidos, y la gran mayoría de ellas ocurren en mujeres posmenopáusicas27. Con el aumento del envejecimiento de la población, se prevé que la mayoría de las futuras fracturas de cadera del mundo se producirán en Asia y que en 2050 el número total de ellas en todo el mundo alcanzará los 8,2 millones28. El costo de prevenir las fracturas es casi igual al de tratarlas, y el uso de medicamentos tendrá inevitablemente algunos efectos secundarios29. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de una forma más rentable de abordar este problema en una sociedad responsable.

Las píldoras Xiaoyao constan de ocho ingredientes. Se están realizando estudios sobre los efectos de sus ingredientes en la osteoporosis. Poria cocos inhibe la osteoclastogénesis y la actividad osteolítica en un modelo de ratón ovariectomizado inducido por osteoporosis30. La combinación de dos componentes, regaliz y Shu-di-huang, puede ejercer un efecto antioxidante al inhibir la vía de señalización NF-κB31. El tónico herbal tradicional chino, Danggui buxue tang, puede ser útil en el tratamiento de la osteoporosis por su capacidad para inhibir el recambio óseo y modular la regulación del eje hipotálamo-hipófisis-gonadal (HPG) y, por lo tanto, prevenir la pérdida ósea en ratas ovariectomizadas32. Todos estos resultados sugieren que las píldoras Xiaoyao pueden tener un efecto terapéutico sobre la osteoporosis. Los resultados de este estudio también sugieren que las píldoras Xiaoyao pueden ejercer un efecto antiosteoporosis al modular la actividad de la vía de señalización de IL-17 de manera antiinflamatoria.

En este estudio se obtuvieron un total de 168 vías de señalización relevantes a partir de la red reguladora de dianas farmacológicas y genes relacionados con la osteoporosis construida en este estudio, y este estudio exploró más a fondo la vía de señalización de la IL-17. La familia de las IL-17 consta de seis miembros, incluida la IL-17A-F, de la cual la IL-17A fue la primera y más importante en ser descubierta33. En los primeros estudios, se pensaba que la IL-17 estaba asociada con enfermedades inflamatorias y autoinmunes en humanos. Más tarde, los estudios sugirieron que tenía un papel en el mantenimiento de la integridad de la barrera, y también se descubrió que estaba asociado con el cáncer15. Sin embargo, aunque no desempeña un papel fisiológico en la remodelación ósea, se comporta de manera diferente durante las condiciones óseas anormales. Además, la IL-17 puede actuar como un activador débil y crea sinergia con otras citocinas para elevar la producción de energía. Esto se demuestra por su co-activación con TNFα15,34.

En experimentos invitro se ha demostrado que la IL-17 puede inducir la proliferación y diferenciación de las MSCs osteoblásticas35, y también puede inhibir la diferenciación inducida por BMP-2 de los osteoblastos primarios de rata36. La IL-17 puede estimular a los osteoblastos para que expresen RANKL, lo que, a su vez, promueve la osteoclastogénesis, pero este efecto parece depender de la presencia de osteoblastos37,38. En este estudio, las diferentes concentraciones de las píldoras Xiaoyao produjeron efectos terapéuticos en ratones modelo PMOM, especialmente cuando se usaron en concentraciones más altas. La IL-17, Act1 e IL-6, que se correlacionan con la vía de señalización de la IL-17, disminuyeron significativamente en estos ratones en comparación con los controles. Cuando se evaluaron los resultados del análisis de enriquecimiento, estos sugirieron la participación de la vía de la IL-17 cuando los animales fueron tratados con píldoras de Xiaoyao.

Este estudio también evaluó algunos de los marcadores de conversión ósea. La ALP es una enzima tetrámera unida a la membrana que puede ser secretada por los osteoblastos y desempeña un papel importante en la formación y mineralización de los huesos al degradar el inhibidor de la mineralización, el pirofosfato39. Alrededor del 90% de la fracción orgánica de la matriz extracelular de los tejidos óseos está compuesta por COL-1, y durante la mineralización ósea, el colágeno juega un papel clave en este proceso40. En el resultado de este estudio, los niveles de expresión de las proteínas ALP y COL-1, observados por inmunohistoquímica en ratones en el grupo de fármacos, fueron más altos que los del grupo modelo, lo que sugiere que el efecto de las píldoras de Xiaoyao en la mejora de la osteoporosis podría lograrse aumentando los indicadores de los genes osteogénicos. Algunos estudiosos han demostrado que la expresión y la actividad transcripcional del receptor de estrógeno de los hepatocitos (ERα) pueden ser reguladas al alza por Xiaoyao san41. Se ha demostrado que los extractos de Angelica sinensis, Paeonia lactiflora blanca y regaliz en el Xiaoyao san tienen una actividad similar al estrógeno. Los mismos ingredientes también están presentes en las píldoras Xiaoyao utilizadas en este estudio, que se elaboran a partir de la prescripción de Xiaoyao san mediante métodos modernos de preparación. Por lo tanto, se puede plantear la hipótesis de que las píldoras Xiaoyao también pueden aumentar la expresión de genes osteogénicos como ALP y COL-1 al ejercer efectos similares al estrógeno sobre los osteoblastos para aumentar su actividad y mejorar la calidad ósea.

Este estudio estableció con éxito un modelo de PMOM en ratones mediante la extirpación de ambos ovarios mediante ovariectomía dorsal. El modelo animal es la base de todos los experimentos posteriores de este estudio. Al extirpar quirúrgicamente los ovarios de los ratones, era importante asegurarse de que los ovarios de los ratones de los grupos OVX y fármaco se eliminaran por completo, mientras que en el grupo simulado, solo se eliminó la grasa cerca de los ovarios, y también fue importante evitar infecciones de la herida.

El número de trabéculas óseas y la densidad de conexión de los ratones mejoraron después del tratamiento ovariectomizado con píldoras de Xiaoyao, lo que sugirió que este medicamento tenía un efecto terapéutico sobre la osteoporosis. En este estudio se utilizaron inmunohistoquímica e inmunocitoquímica para evaluar la eficacia del tratamiento; El tiempo de acción de varios reactivos no es absoluto, especialmente en el proceso de desarrollo del color, que requiere observación en tiempo real y reacción oportuna para garantizar los mejores resultados. Durante la incubación de anticuerpos, primero se establece el gradiente de concentración de anticuerpos y, después de la observación y la comparación, se elige la concentración más adecuada para los experimentos posteriores.

Sin embargo, hubo algunas limitaciones en este estudio. Los datos de farmacología web solo tenían una única fuente de datos, y el análisis con respecto a la composición del medicamento provino de una sola base de datos. Además, la eficacia de las píldoras de Xiaoyao no se comparó con los fármacos positivos en este estudio, y no fue posible evaluar las diferencias específicas entre las píldoras de Xiaoyao y las modalidades de tratamiento actuales.

Para la PMOM, la opción de tratamiento de primera línea disponible son los bifosfonatos. Sin embargo, el uso de estos fármacos puede conducir a contraindicaciones gastrointestinales e incluso a fracturas atípicas de fémur y osteonecrosis de los maxilares aún más graves42,43. Las opciones de tratamiento de segunda línea incluyen el uso de denosumab y la terapia hormonal. Se ha demostrado que el denosumab reduce las fracturas de cadera, vertebrales y no vertebrales. Sin embargo, el rebote puede ocurrir una vez que se suspende el fármaco, y cuanto más larga es la duración de la interrupción, mayor es la pérdida de densidad ósea 42,44,45. La terapia hormonal para la menopausia reduce el riesgo de fracturas osteoporóticas de la columna vertebral, pero sus efectos están limitados por la edad y sus riesgos a largo plazo parecen superar los beneficios46. La terapia secuencial es una opción de tratamiento a largo plazo para la PMOM, en la que el uso de medicamentos formadores de hueso seguidos de medicamentos antirresorlentes puede lograr el mayor aumento de la masa ósea. Por lo general, los medicamentos específicos se determinan paciente por paciente42.

En este sentido, se puede suponer que las hierbas tradicionales chinas pueden tener un potencial ventajoso en el tratamiento de la osteoporosis. El modo de acción de la medicina herbaria es multivía y multiobjetivo, en lugar de actuar a través de un único mecanismo47. Algunos estudiosos han evaluado la eficacia y la seguridad de algunas hierbas medicinales chinas, y han demostrado que el número de fracturas cuando se utiliza una combinación de medicinas chinas y occidentales en comparación con la administración de sólo medicina china fue menor queel del grupo de medicina occidental sola. En comparación con los medicamentos químicos, los remedios herbales chinos tienen menos efectos secundarios, son relativamente económicos y son adecuados para el uso a largo plazo. Los remedios herbales chinos no solo pueden reparar la microestructura ósea y aumentar el volumen óseo, sino que también pueden reducir o eliminar los síntomas de la debilidad de la columna lumbar y el dolor de espalda49. El estudio actual puede ayudar a proporcionar un posible enfoque para descubrir nuevos medicamentos y tratamientos.

La aplicación de las píldoras Xiaoyao para tratar la PMOM parece ser prometedora. En el presente estudio, las píldoras pueden mejorar la masa ósea y la calidad ósea en un modelo de ratón de PMOM al suprimir la inflamación. Algunos estudiosos incluso han sugerido que una combinación de medicina china y acupuntura puede ser efectiva en el tratamiento de PMOM50. Al mismo tiempo, se ha demostrado que una combinación de medicina china y occidental es efectiva51. Ambos posibles remedios son válidos, aunque cualquier tratamiento recomendado con las píldoras Xiaoyao junto con la acupuntura y la medicina occidental debe ser validado por ensayos clínicos. La importancia clínica de la osteoporosis radica en las fracturas óseas, y las investigaciones futuras también deben centrarse en prevenirlas.

En resumen, este estudio demostró a través de la farmacología de redes y experimentos con animales que los ratones PMOM mostraron una mejora significativa en el metabolismo óseo y un aumento de la masa ósea después del tratamiento con píldoras Xiaoyao. El mecanismo de acción de este fenómeno puede estar relacionado con la inhibición de la vía de señalización de IL-17 y el aumento de la actividad de los factores osteogénicos, ALP y COL-1. Este estudio establece una base teórica y experimental para la aplicación clínica de las píldoras Xiaoyao en el tratamiento de enfermedades asociadas a la osteoporosis.

Divulgaciones

Los autores declaran que no existe conflicto de intereses.

Agradecimientos

El Programa de Investigación Científica y Desarrollo Tecnológico (20224128) de la ciudad de Baise apoyó este trabajo. Los autores agradecen al Dr. Dev Sooranna del Imperial College de Londres y a YMUN por editar el manuscrito. YYX y ZYW contribuyeron por igual a este estudio.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Muestra de 1 mlGuangxi Beilunhe Medical Industrial Group Co.JYQ001Para anestesia en ratones
4%poliformaldehídoBeijing Solarbio Science & Tecnología Co., Ltd.P1110Para la fijación de tejidos
, sutura absorbible 6-0 (aguja en ángulo)Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.HZX-06Para sutura postoperatoria
Bola de algodón absorbenteWinnerMIANQIU-500gPara esterilización y hemostasia
Portaobjetos adhesivosJiangsu Shitai Experimental Equipment Co.188105Para el corte de tejidos
: AmobarbitalSigma Aldrich (Shanghai) Trading Co.A-020-1MLPara anestesia en ratones
Solución de azulado BeijingSolarbio Science & Tecnología Co., Ltd.G1866Coloración azul de los núcleos de las células después de la acción de la solución de diferenciación de hematoxilina
C57BL/6 ratonesBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.(SCXK 2033-0063)Para uso en experimentos con animales, cuchillas quirúrgicas
de acero al carbono,Premier Medical Equipment, Co.SP239Para cirugía de ratón
CIKS/TRAF3IP2 Conejo pAbBIOSS ANTICUERPOSbs-6202RSe une a Act1 en los tejidos
Solución de hematoxilina de Cole (para tinción convencional)Beijing Solarbio Ciencia & Tecnología Co., Ltd.G1140Para la tinción de secciones de parafina
Anticuerpo policlonal de colágeno tipo Iproteintech14695-1-APSe une a COL-1 en tejidos
DAB Kit de sustrato,20xBeijing Solarbio Science & Tecnología Co., Ltd.DA1010Para el desarrollo del color del tejido
, hoja quirúrgica desechable, 50 * 60 CMNanchang, Xuhui Medical Equipment Co.SP4529777Para cirugía de ratón
Solución de descalcificación EDTA (pH 7.2)Beijing Solarbio Science & Tecnología Co., Ltd.E1171-500mlPara la descalcificación de tejidos
Tampón de Bloching de peroxidasa endógena mejoradaBeyotime BiotechnologyP0100BSecuestro de peroxidasas endógenas celulares o tisulares
Líquido transparente desparafinado respetuoso con el medio ambienteServicebioG1128-1LPara desparafinar secciones de parafina
Alcohol etílicoCHRON CHEMICALS64-17-5 (CAS)Para la deshidratación de secciones de parafina
diluyente de anticuerpos de uso generalEpizyme BiotechPS119Lde anticuerpos
Solución de diferenciación de hematoxilinaServicebioG1039-500MLPara la diferenciación después de la tinción con hematoxilina y la eliminación de colorantes excesivamente unidos y no específicamente adsorbidos de los tejidos
Kit de tinción de hematoxilina eosina (HE)Beijing Solarbio Science & Tecnología Co., Ltd.G1120-3 * 100mlPara tinción de tejidos
Mango de cuchillo quirúrgico de acero inoxidable de alta calidadPremier Medical Equipment Co.SP0088Para cirugía con ratón
Affinipure conjugado con HRP Cabra Anti-Conejo IgG(H+L)proteintechSA00001-2Se une al anticuerpo primario y amplifica la señal
IL-17A Anticuerpo policlonalproteintech13082-1-APSe une a la IL-17 en los tejidos
IL-6 Anticuerpo policlonalproteintech21865-1-APSe une a la IL-6 en los tejidos Pluma de
inmunohistoquímicaPekín Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.ZLI-9305 (YA0310)Para dibujar círculos en inmunohistoquímica
Sutura quirúrgica médica No absorbente (bola) 5-0 3.5mYangzhou Yuanlikang Medical Equipment Co.FHX-5-2Para sutura postoperatoria,
agujas de sutura médica, agujas de ángulo, 4 * 10 3/8Chaohu Binxiong Medical Equipment Co.FHZ612-4Para sutura postoperatoria
Bálsamo neutroBeijing Solarbio Science & Tecnología Co., Ltd.G8590Como sellador de rebanadas
PBS(1X)Shenzhen Mohong Technology Co.,LtdB0015Tampón para el lavado de portaobjetos y dilución parcial
de solución Tampón de bloqueo rápido sin proteínas (1X)Epizyme BiotechPS108PEvitar la unión inespecífica de proteínas
Conejo Anticuerpo de fosfatasa alcalina antióseaANTICUERPOS BIOSSBS-6292RSe une a la fosfatasa alcalina en los tejidos
a solución salinaUniversidad Médica de Youjiang Para nacionalidadesLHN500Para animales por sonda nasogástrica
Maquinillas de afeitar/eléctricasHANGZHOU HUAYUAN PET PRODUCTS CO., LTD.DTJ-002Para ratones de afeitado
Portaagujas médicas de acero inoxidable Aguja gruesa de 14 cmPremier Medical Equipment Co.SP784Para cirugía de ratones
Pinzas oftálmicas de acero inoxidable de 10,5 cm curvadas (sin gancho)ZhuoyouyueYKNWW-10.5Para cirugía de ratones
Tijeras oftálmicas de acero inoxidable / Tijeras quirúrgicas 10 cm Punta recta Premier MedicalEquipment Co.ZYJD-10-ZJPara cirugía de ratón
Aguja gástrica con punta de acero inoxidable Calibre 12 CodoGWJ-12-55WPara uso en ratones por sonda nasogástrica
Líquido de reparación de antígenos Tris-EDTA (50x)proteintechPR30002Para la reparación de antígenos de secciones de parafina
Tablero de disección de madera 25 * 16 cmJP16 * 24Para cirugía
de ratones Píldoras Xiaoyao JiuzhitangCo., Ltd.YPG-041Para la administración de medicamentos en animales
Others
R 4.3.1Procesamiento de datos
Cytoscape3.9.1Recurso Nacional para la Biología de RedesConstrucción de una red reguladora para la medicina tradicional china
ImageJ 1.54fInstitutos Nacionales de SaludProcesamiento de imágenes para resultados de inmunohistoquímica
Adobe Photoshop 24.0.0AdobePara la combinación de imágenes
GraphpadPrism 9.5SoftwareGraphPad Análisis estadístico de
datos DimensionOLYMPUSPara cortar y fotografiar
OLYMPUS BX53OLYMPUSPara tinción HE y fotografía de sección inmunohistoquímica
, Para dilución Hospital afiliado de 55 mm

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