Este protocolo demuestra la ablación celular con láser de neuronas individuales en larvas intactas de Drosophila . El método permite estudiar el efecto de la reducción de la competencia entre neuronas en el sistema nervioso en desarrollo.
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Artículo de método
La ablación celular con láser en larvas intactas de Drosophila revela una competencia sináptica
En este artículo
Resumen
Resumen
El protocolo describe la ablación de una sola neurona con un sistema láser de 2 fotones en el sistema nervioso central (SNC) de larvas intactas de Drosophila melanogaster. Con este método no invasivo, el sistema nervioso en desarrollo puede manipularse de una manera específica para cada célula. La interrupción del desarrollo de las neuronas individuales en una red se puede utilizar para estudiar cómo el sistema nervioso puede compensar la pérdida de información sináptica. Las neuronas individuales fueron ablacionadas específicamente en el sistema de fibras gigantes de Drosophila, con un enfoque en dos neuronas: la fibra gigante presináptica (GF) y la neurona motora tergotrochanteral postsináptica (TTMn). El GF hace sinapsis con el TTMn ipsilateral, que es crucial para la respuesta de escape. La ablación de uno de los GF en el tercer estadio del cerebro, justo después de que el GF comienza el crecimiento axonal, elimina permanentemente la célula durante el desarrollo del SNC. El GF restante reacciona al vecino ausente y forma un terminal sináptico ectópico con el TTMn contralateral. Este terminal atípico, bilateralmente simétrico, inerva ambos TTMns, como se demuestra mediante el acoplamiento de colorantes, e impulsa ambas neuronas motoras, como se demuestra mediante ensayos electrofisiológicos. En resumen, la ablación de una sola interneurona demuestra la competencia sináptica entre un par bilateral de neuronas que puede compensar la pérdida de una neurona y restaurar las respuestas normales al circuito de escape.
Introducción
La ablación láser es una herramienta preferida para diseccionar circuitos neuronales en una amplia variedad de organismos. Desarrollado en sistemas genéticos modelo como gusanos y moscas, se ha aplicado en todo el reino animal para estudiar la estructura, la función y el desarrollo del sistema nervioso 1,2,3. Aquí, la ablación de una sola neurona se empleó para investigar cómo interactúan las neuronas durante el ensamblaje del circuito en Drosophila. El sistema de escape de la mosca es uno de los circuitos favoritos para el análisis porque contiene las neuronas más grandes y las sinapsis más grandes de la mosca adulta, y el circuito ha sido bien caracterizado en lasúltimas décadas. El papel que juegan las interacciones neurona-neurona en el ensamblaje del circuito de fibra gigante es un punto focal de esta investigación.
Un tipo de interacción que ha sido un punto focal en la neurociencia desde el trabajo de Hubel y Wiesel en la década de 1960 es la "competencia sináptica"5,6. En este protocolo, la ablación con láser se utilizó para revisar el papel de la competencia a través de la ablación de una sola célula en el sistema de fibras gigantes (GFS) de Drosophila, donde se podrían descubrir los fundamentos moleculares de los fenómenos.
La ablación de las neuronas en la mosca en desarrollo ha sido difícil por una variedad de razones, incluida la visualización de las neuronas objetivo, la precisión del método de ablación y la supervivencia del espécimen. Para superar estos problemas en el GFS, se utilizó el sistema UAS/Gal47 para etiquetar las neuronas de interés, y se utilizó un microscopio de dos fotones para eliminar la fibra gigante presináptica o la neurona motora de salto postsináptica (TTMn).
En este estudio, para determinar el papel que juegan las neuronas bilaterales vecinas en el ajuste de la conectividad sináptica y la fuerza sináptica en el GFS, se eliminó uno de los pares bilaterales de neuronas (ya sea GF presináptico o neurona motora postsináptica) justo antes del desarrollo de la pupa. En esta etapa del desarrollo, la axonogénesis de GF no se ha completado8. A continuación, se examinó la estructura y la función del circuito sináptico del FG en el adulto, prestando especial atención a la salida del FG restante.
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Protocolo
Todos los animales utilizados para el protocolo fueron de la especie Drosophila melanogaster. No hay problemas éticos en torno al uso de esta especie. No era necesaria la autorización ética para llevar a cabo este trabajo. Los detalles de las especies de Drosophila , los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Cría de Drosophila y selección del estadio larvario correcto
- Elija una línea controladora Gal4 que impulse la expresión en las células que se van a ablacionar y recombínela con una línea reportera UAS-GFP o la cruce con ella. Cría moscas con alimento estándar para moscas a 25 °C.
NOTA: Para la ablación de fibra gigante (GF), R91H05-Gal4 o A307-Gal4 se recombinó con UAS-GFP. Para las ablaciones de TTMn se utilizó ShakB(letal)-GAL4 recombinado con UAS-GFP (ver Tabla de Materiales). - Seleccione las larvas que hayan comenzado a emerger de la comida y trepen por el costado del frasco de comida. Esas larvas se encuentran en la etapa de deambulación, que es la etapa preferida para realizar la ablación de células GF.
NOTA: La ablación se puede realizar en cualquier etapa larvaria. La última etapa larvaria fue importante para la manipulación del desarrollo del GFS porque los cuerpos de las células GF se pueden identificar fácilmente en el cerebro, pero los axones GF no han hecho conexiones con sus objetivos en esta etapa.
2. Preparación de la larva del3er estadio
NOTA: Las larvas fueron anestesiadas utilizando un método similar al de Burra et al.9. Para que los tiempos de procedimiento sean cortos, prepare solo una larva a la vez. La exposición corta al anestésico mejorará la supervivencia de los animales de experimentación10.
- Prepare un plato de vidrio con una tapa hermética. Coloque una bola de algodón en el plato y, debajo de una campana extractora, agregue aproximadamente 3-5 ml de éter etílico (líquido peligroso e inflamable, bata de laboratorio, guantes, gafas). Cubre el plato con la tapa.
- Recoja larvas individuales de3er estadio de viales de moscas. En la3ª etapa larvaria, las larvas abandonan el medio alimenticio y se arrastran por el costado del vial alimenticio11.
- Asegúrese de que las larvas aún se estén moviendo y no hayan comenzado la formación de pupario. Las larvas que son estacionarias y muestran un acortamiento del cuerpo están comenzando la pupación y no son aptas para la ablación. Recoge las larvas con un pincel pequeño.
NOTA: La3ª etapa larvaria comienza después de la segunda muda a las 72 h de desarrollo (después de la puesta de huevos), y dura hasta la formación del pupario a las 120 h para las moscas criadas a 25 °C.
- Asegúrese de que las larvas aún se estén moviendo y no hayan comenzado la formación de pupario. Las larvas que son estacionarias y muestran un acortamiento del cuerpo están comenzando la pupación y no son aptas para la ablación. Recoge las larvas con un pincel pequeño.
- Transfiera una larva a un recipiente pequeño y abierto. Coloque el recipiente en el plato de vidrio con éter etílico y cierre bien el plato. Al abrir el plato de vidrio, colóquelo debajo de un tubo o en una campana extractora para evitar que los vapores se escapen.
- En intervalos de 30 s, retire la tapa con la larva del plato y verifique la movilidad de la larva bajo un microscopio de disección. Por lo general, la larva se inmovilizará en 1 minuto. Una vez que los ganchos bucales dejan de temblar, la larva está lista para montar. Deseche cualquier larva que no esté completamente inmovilizada después de 3 min.
NOTA: La parte superior de una tapa invertida de un tubo de microcentrífuga (tapa extraída del tubo) se puede utilizar como recipiente.
- En intervalos de 30 s, retire la tapa con la larva del plato y verifique la movilidad de la larva bajo un microscopio de disección. Por lo general, la larva se inmovilizará en 1 minuto. Una vez que los ganchos bucales dejan de temblar, la larva está lista para montar. Deseche cualquier larva que no esté completamente inmovilizada después de 3 min.
3. Montaje de larvas en portaobjetos para la ablación
- Coloque la larva anestesiada en un portaobjetos de vidrio para microscopio. Sumerge la larva en una gota de solución salina de insecto; Esto eliminará algunos de los restos de comida que podrían adherirse a la larva.
- Bajo el microscopio de disección, retire la mayor parte de la solución salina con un pañuelo de papel. Coloque la larva con el lado dorsal hacia arriba para la ablación GF o el lado ventral hacia arriba para la ablación con TTMn. Baje lentamente un cubreobjetos de vidrio sobre la larva. Agregue solución salina al costado del cubreobjetos para llenar el espacio entre el portaobjetos de vidrio y el cubreobjetos.
- Para la ablación GF, verifique la posición del cerebro bajo un gran aumento en el microscopio de disección. Asegúrese de que el cerebro esté nivelado y sea visible a través de la cutícula. A menudo, el cerebro estará cubierto de tejido graso, lo que hace imposible la visualización y la ablación de las células.
- Para desplazar cualquier tejido graso que cubra el cerebro, aplique una ligera presión al cubreobjetos con pinzas y mueva el cubreobjetos de un lado a otro. Si el tejido graso no se puede mover del cerebro de esta manera, usa una larva diferente en su lugar.
4. Localización de las células objetivo
NOTA: El sistema multifotónico utilizado para este estudio se montó en un microscopio vertical. Se utilizó un software específico del sistema para controlar la adquisición y los ajustes de estimulación láser. El sistema estaba equipado con una fuente de luz de epifluorescencia para localizar las muestras. La lente del objetivo era una lente de inmersión en agua con un aumento de 25x, una larga distancia de trabajo de 2 mm y una NA de 1,10.
- Coloque la muestra en la platina del microscopio multifotónico y utilice el filtro GFP para localizar la muestra en modo de epifluorescencia. Para la ablación con GF, los cuerpos celulares se pueden identificar en el cerebro, como se ve en la Figura 1A, C, D. Para la ablación de TTMn, se puede identificar un grupo de cuatro células desde el lado ventral en el cordón nervioso ventral (VNC), como se muestra en la Figura 1A,B. Cuando termine de enfocar, centre las celdas en el campo de visión y cambie al modo de 2 fotones.
5. Configuración de los parámetros de ablación
- Ajuste la configuración del láser y la ganancia del detector para ver las células que expresan GFP con el escáner Galvano. Una longitud de onda de 870 nm funciona mejor para visualizar la señal GFP. Centra la celda en el campo de visión.
- Utilice una región circular de interés (ROI) para definir el área de ablación. Asegúrese de que el ROI cubra la mayor parte de la superficie de la celda (Figura 1E,G).
- Configure el protocolo de ablación en el software. Establezca un marco de adquisición, luego estimulación, seguido de otro marco de adquisición.
- Inicie el ajuste de la potencia del láser de estimulación en un valor más bajo (10%-20 %) y ejecute el protocolo de estimulación. Una ablación exitosa se puede reconocer por un círculo claro en el centro del soma celular en la ubicación de la ROI y un aumento en la fluorescencia que rodea la ROI (Figura 1F).
- Si la ablación no tuvo éxito y simplemente blanqueó la célula (Figura 1H), aumente la potencia del láser en incrementos del 5% o el número de bucles de uno en uno y vuelva a ejecutar el protocolo. La potencia del láser aplicada estuvo entre el 10% y el 40% para el sistema utilizado en el protocolo.
NOTA: Los ajustes de la potencia del láser para la ablación dependen en gran medida de la profundidad a la que se encuentren las células en el tejido y de otros factores, como el plegamiento de la cutícula. Si las células son brillantes y claramente visibles, la potencia del láser estará en el extremo inferior del rango. La potencia del láser será diferente para cada sistema en función del modelo de láser y de la antigüedad del láser.
- Si la ablación no tuvo éxito y simplemente blanqueó la célula (Figura 1H), aumente la potencia del láser en incrementos del 5% o el número de bucles de uno en uno y vuelva a ejecutar el protocolo. La potencia del láser aplicada estuvo entre el 10% y el 40% para el sistema utilizado en el protocolo.
Figura 1: Identificación de neuronas para la ablación con láser en larvas intactas de Drosophila L3. (A) Esquema de la ubicación del soma de fibra gigante (GF) en el cerebro y el grupo de neuronas motoras que contienen la motorna tergotrochanteral (TTMn) en el cordón nervioso ventral (VNC). (B) Proyección de intensidad máxima de la expresión de GFP que impulsa la expresión de GFP en las larvas de VNC. La línea media se indica mediante la línea de puntos. El círculo indica el grupo de neuronas que contienen el TTMn y que son objetivo para la ablación con láser. Barra de escala: 50 μm. (C) Vista de proyección parcial del cerebro de las larvas que expresa GFP bajo el control de A307-Gal4. El círculo indica el soma GF dirigido para la ablación con láser. Barra de escala: 50 μm. (D) Proyección de intensidad máxima del cerebro con R91H05-Gal4 impulsando UAS-GFP. Ambos GF (círculos) son identificables por su ubicación, forma y tamaño. Barra de escala: 50 μm. (E) Vista ampliada del soma GF antes de la ablación con láser. El círculo magenta indica la región objetivo para la ablación con láser. Barra de escala: 10 μm. (F) Vista ampliada del soma GF después de la administración de la potencia láser localizada y la ablación exitosa. Barra de escala: 10 μm. (G) Vista ampliada del soma GF antes de la ablación con láser. El círculo magenta indica la región objetivo para la ablación con láser. Barra de escala: 10 μm. (H) Vista ampliada del soma GF después de la administración de potencia láser localizada y la ablación (blanqueo) fallida. Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
6. Recuperación de las larvas
- Después de ablacionar con éxito la célula, retire el cubreobjetos y recoja suavemente las larvas del portaobjetos con un pincel. Coloque las larvas en un frasco de comida. Las larvas comenzarán a arrastrarse nuevamente dentro de los 30 minutos.
NOTA: Mantener el tiempo del procedimiento corto mejora las tasas de supervivencia de los animales. Con la experiencia, el experimento se puede realizar en poco menos de 10 minutos. - Continúe criando larvas en condiciones estándar hasta que se cierren de la cubierta de la pupa.
7. Probar la funcionalidad del GFS en moscas adultas
NOTA: Los siguientes pasos se explican en detalle en Allan y Godenschwege12, y Augustin et al.13.
- Pruebe las moscas adultas a la edad de 2 a 5 días después de la eclosión. Anestesia las moscas con CO2 y móntalas sobre cera dental empujando las patas dentro de la cera. Extienda las alas en un ángulo de 90° y fíjelas en su lugar con la cera. Asegure la cabeza empujando la probóscide en la cera.
- Coloque cables de estimulación en ambos ojos, un cable de tierra en el abdomen y electrodos de registro de vidrio en los músculos de salto (TTM) de cada lado.
- Estimula el circuito GF con estímulos individuales para medir la latencia de respuesta de ambos músculos. Estimula el circuito con trenes de estímulos de 100 Hz y 200 Hz, respectivamente, para medir la siguiente frecuencia para ambos músculos.
8. Disección y etiquetado del sistema de fibra gigante para la obtención de imágenes confocales
NOTA: La disección del SNC mosca y la inyección de tinte se detallan en Boerner y Godenschwege14.
- Retire suavemente la mosca de la cera dental con pinzas y transfiérala a una placa de Petri revestida de elastómero de silicona bajo un endoscopio de disección.
- Retire las patas, las alas y la probóscide con unas tijeras y use alfileres de insectos para asegurar el lado dorsal de la mosca hacia arriba en el recubrimiento de elastómero.
- Haz una incisión lateral a lo largo de la línea media desde la parte media del abdomen, a través de todo el tórax y hacia arriba por el cuello, conectando el tórax con la cabeza. Abre la mosca con alfileres para insectos. Extrae órganos y glándulas de la mosca sin dañar el sistema nervioso.
NOTA: En este punto, los axones GF se pueden inyectar con colorantes para marcar los GF y las neuronas acopladas eléctricamente13. - Retire la cápsula de la cabeza para exponer el cerebro.
9. Inmunohistoquímica del sistema nervioso
- Después de la disección del SNC, fije la mosca en PFA al 4% en PBS durante 45 min a temperatura ambiente (RT). Lavar durante 20 min en PBS a RT (3 veces).
- Bloquear la muestra durante 1 h a RT en BSA al 3% en PBS con una solución de detergente al 0,5%.
- Incubar durante 2-3 noches a 4 °C en BSA al 3% en PBS con solución de detergente al 0,3% y anti-GFP de conejo (1:500). Lavar durante 20 min en PBS a RT (6 veces).
- Incubar durante la noche a 4 °C en PBS con Alexa 488 anti-conejo. Lavar durante 20 min en PBS a RT (6 veces).
- Deshidrate muestras con una serie ascendente de etanol (50%, 70%, 90%, 100% etanol) durante 10 minutos en cada paso. Retira los alfileres y recorta el abdomen y los músculos de vuelo. Transfiera el resto del tórax que contiene el sistema nervioso a un portaobjetos y cúbralo con un medio de montaje como el salicilato de metilo. Coloque un cubreobjetos sobre la muestra y séllela con esmalte de uñas.
- Obtener imágenes del sistema nervioso en un microscopio confocal para analizar la anatomía del terminal GF.
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Resultados
Este método se puede utilizar para manipular el desarrollo de redes neuronales específicas en el sistema nervioso de Drosophila. La principal pregunta de investigación aquí fue la formación de conexiones sinápticas. La eliminación de la GF presináptica o la TTMn postsináptica permitió la investigación de la sinaptogénesis reactiva en esta sinapsis central y los mecanismos moleculares cruciales para la función y el desarrollo sináptico. Como se describe en el protocolo, se realizó una ablación celular con láser d...
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Discusión
La ablación celular con un microscopio de 2 fotones demostró ser un método muy exitoso para manipular el desarrollo de circuitos neuronales en Drosophila. Dado que este método no es invasivo, causa un daño mínimo al animal. Los datos respaldan la utilidad de esta manipulación específica de la célula de circuitos conocidos.
Crucial para el éxito de la ablación fue la selección del controlador Gal4 más adecuado. Dado que el GFS está bien estudiado, se han descrito muchas líneas específi...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los experimentos con el microscopio de 2 fotones se realizaron en el Núcleo de Imágenes Celulares Avanzadas del Instituto del Cerebro Stiles-Nicholson de la FAU. Nos gustaría agradecer a la Iniciativa de Ciencias de la Vida de Júpiter por su apoyo financiero.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 AffiniCabra Pura Anti-Conejo IgG (H+L) | Jaxkson ImmunoResearch | 111-545-003 | |
| Proteína fluorescente anti-verde, conejo | Fisher Scientific | A11122 | concentración 1:500 |
| Apo LWD 25x/1.10W Objetivo | Nikon | MRD77220 | inmersión en agua larga distancia |
| de trabajo Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma | B4287-25G | |
| Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser | Coherent | ||
| Cotton Ball | Genesee Scientific | 51-101 | |
| Dextra, Tetrametilrodamina, 10.000 MW, Lisina fijable (fluoro-Ruby) | Fisher Scientific | D1817 | |
| Drosophila | de Gu y O'Dowd, 2006 | ||
| Ethyl Ether | Fisher Scientific | E134-1 | Peligro, líquido inflamable |
| Alimento para moscas B (receta de Bloomington) | LabExpress | 7001-NV | |
| Salicilato de metilo | Fisher Scientific | O3695-500 | |
| Tubo de microcentrífuga 1,5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Cubreobjetos de microscopio 18x18 #1.5 | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Vector trazador de neurobiotina | Laboratorios | SP-1120 | |
| Microscopio multifotónico Nikon A1R | Nikon | en posición vertical FN1 soporte de microsope | |
| NIS Elements Investigación avanzada | Nikon | Software de adquisición y análisis de datos | |
| Paraformaldehído (PFA)Fisher | Scientific | T353-500 | |
| PBS (Salin tamponada con fosfato) | Fisher BioReagents | BP2944-100 | Tabletas |
| R91H05-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 40594 | |
| shakB(lethal)-GAl4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51633 | |
| Superfrost portaobjetos de vidrio para microscopio | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | solución de detergente | |
| para 422355000 UAS-10xGFP | Bloomington Centro de Stock de Drosophila | 32185 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
