Method Article

Modelo in vitro para el estudio de la diferenciación y los cambios de las células epiteliales de las vías respiratorias murinas estimuladas con extracto de humo de cigarrillo

DOI:

10.3791/67057

⸱

July 12th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 2Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Center of Respiratory Medicine, China-Japan Friendship Hospital, 3National Center for Respiratory Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este trabajo describimos un modelo in vitro para aislar y diferenciar células epiteliales murinas de las vías respiratorias, centrándonos en su aclimatación al extracto crónico de humo de cigarrillo (CSE). El modelo podría utilizarse para caracterizar de forma exhaustiva el impacto multiómico de la CSE, lo que posiblemente proporcione información sobre las respuestas celulares bajo una exposición crónica al humo.

Abstract

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La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) se atribuye en gran medida a la exposición al humo del tabaco. Investigar cómo las células epiteliales de las vías respiratorias se adaptan funcionalmente al humo del tabaco es crucial para comprender la patogénesis de la EPOC. El presente estudio consistió en establecer un modelo in vitro utilizando células epiteliales murinos primarias de las vías respiratorias para imitar el impacto del humo del tabaco en la vida real. A diferencia de las líneas celulares establecidas, las células primarias conservan más propiedades similares a las de in vivo, incluidos los patrones de crecimiento, el envejecimiento y la diferenciación. Estas células exhiben una respuesta inflamatoria sensible y una diferenciación eficiente, por lo que representan de cerca las condiciones fisiológicas. En este modelo, las células epiteliales murinos primarias de las vías respiratorias se cultivaron durante 28 días bajo una interfaz aire-líquido con una concentración óptima de extracto de humo de cigarrillo (CSE), lo que condujo a la transformación de una monocapa de células indiferenciadas en un epitelio cilíndrico pseudoestratificado, indicativo de aclimatación a la CSE. A continuación, se aplicaron análisis multiómicos exhaustivos para dilucidar los mecanismos por los que la EIS influye en la diferenciación de las células basales de las vías respiratorias. Estos conocimientos proporcionan una comprensión más profunda de los procesos celulares que sustentan la progresión de la EPOC en respuesta a la exposición al humo del tabaco.

Introduction

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La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad pulmonar heterogénea con características complejas, mientras que los pacientes con EPOC tienden gradualmente a ser más jóvenes1. El tabaquismo, un factor de riesgo primario para la EPOC2, tiene un profundo impacto en las células epiteliales de las vías respiratorias, que sirven como barrera inicial contra el humo del tabaco. A pesar de esta asociación conocida, los mecanismos detallados a través de los cuales el humo del tabaco induce cambios en las células epiteliales de las vías respiratorias siguen siendo inadecuadamente explorados. El conocimiento profundo de estas alteraciones moleculares es esencial para identificar marcadores de diagnóstico precoz y dianas terapéuticas para la EPOC.

Para abordar esta brecha, desarrollamos un nuevo modelo in vitro utilizando células epiteliales murinas de las vías respiratorias. Estas células se sometieron a una estimulación a largo plazo con extracto de humo de cigarrillo (CSE), lo que nos permitió monitorear los cambios celulares dinámicos y explorar los cambios en las células epiteliales de las vías respiratorias bajo la estimulación a largo plazo del tabaco y el mecanismo subyacente. En este modelo, se utilizó transwell para proporcionar la interfaz aire-líquido de las células epiteliales de las vías respiratorias, y el extracto de humo de cigarrillo se estimuló en la etapa temprana de la diferenciación de las células epiteliales hasta el final de la diferenciación a los 28 días. Los estudios anteriores investigaron solo la diferenciación y la estimulación a corto plazo de las células epiteliales de las vías respiratorias (dominancia de la línea celular). Se limitaron a una sola vía regulatoria 3,4,5,6. Sin embargo, el protocolo presentado aquí utiliza células epiteliales primarias de las vías respiratorias de ratón y optimiza el proceso de extracción celular para una mejor actividad celular que los métodos anteriores de cultivo de células epiteliales de las vías respiratorias. Este modelo se centra en las alteraciones en la diferenciación celular junto con análisis transcriptómicos, proteómicos, metabolómicos y epigenómicos exhaustivos. Empleando inmunofluorescencia y técnicas multiómicas avanzadas, nuestro objetivo fue dilucidar las respuestas celulares de las células epiteliales de las vías respiratorias a la exposición crónica al humo del tabaco, contribuyendo así a una comprensión más profunda de la patogénesis de la EPOC. Este modelo se puede utilizar para explorar los cambios en el patrón de diferenciación de las células epiteliales de las vías respiratorias y su mecanismo causado por la estimulación a largo plazo de diversos contaminantes.

Protocol

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El protocolo general requiere 44 días, incluyendo 1 día para la preparación de células epiteliales de las vías respiratorias aisladas de tráqueas murinas, 15 días para la proliferación celular y 28 días para la estimulación de CSE en la interfaz aire-líquido. Todos los animales de experimentación se alojan en la Sala de Animales de Barrera SPF del Centro de Experimentos Animales de la Universidad Médica de Capital y han sido revisados y aprobados por el Comité de Ética de Animales de Laboratorio y Experimentos con Animales de la Universidad Médica de Capital (AEEI-2020-100) para cumplir con los requisitos de las pautas ARRIVE7.

1. Aislamiento de células epiteliales primarias de las vías respiratorias murinas a partir de tráqueas murinos

  1. Preparación
    1. Prepare el medio de expansión completo combinando 1 mL de suplemento 50x y 0,05 mL de caldo de hidrocortisona con 48,95 mL de medio basal de expansión. Conservar a 4 °C y utilizar durante 4 semanas.
    2. Disuelva 7,5 mg de proteinasa y 5 mg de desoxirribonucleasa I en 5 mL de Ham's F-12 para preparar una solución de proteinasa. Filtrar para esterilizar y almacenar a 4 °C y utilizar en un plazo de 4 semanas.
    3. Prepare soluciones antibióticas añadiendo 0,05 mL de 100x penicilina/estreptomicina y 0,01 mL de gentamicina/anfotericina 500x a 5 mL de medio de expansión completo, PBS, y solución de proteinasa (100 U/mL de penicilina, 100 U/mL de estreptomicina, 10 μg/mL de gentamicina y 0,25 μg/mL de anfotericina B). Conservar a 4 °C y utilizar durante 4 semanas.
    4. Esterilizar el instrumental quirúrgico y preparar el gabinete de seguridad biológica para el aislamiento celular. Al mismo tiempo, asegúrese de que el equipo de cultivo celular estándar esté listo para su uso.
    5. Prepare platos recubiertos de colágeno de cola de rata añadiendo colágeno de cola de rata (100 μg/mL en ácido acético 0,02 N) en platos de cultivo de 100 mm y transpocillos de 24 mm (0,05 mL/cm2). Dejar abierto toda la noche bajo luz ultravioleta para su esterilización.
  2. Aislamiento de células epiteliales primarias de la vía aérea murina
    1. Utilice ratones C57BL/6 (de 6 a 8 semanas de edad, machos, criados con SPF) para el aislamiento de células epiteliales traqueales. Eutanasia con sobredosis de solución de pentobarbital sódico al 1% (aproximadamente 200 mg/kg). Utilice cinco ratones para obtener un rendimiento celular suficiente.
    2. Esterilice el ratón por inmersión en una solución de etanol al 75%, sin sumergir la nariz y la boca en alcohol para evitar que el alcohol fluya hacia la tráquea.
    3. Disecciona el ratón.
      1. Use cuchillas quirúrgicas y fórceps, un conjunto de dispositivos para cortar y abrir la epidermis desde la mandíbula inferior hasta la cavidad abdominal del ratón.
      2. Use otro conjunto de instrumentos quirúrgicos para desgarrar las glándulas tiroides de ambos lados y eliminar las conexiones entre la tráquea, el tejido muscular circundante y el esófago.
      3. Después de eso, corte con cuidado en el tórax, use fórceps para profundizar en la cavidad torácica, extraiga todo el pulmón y encuentre el final de la tráquea.
    4. Procesa la tráquea.
      1. Cortar la tráquea desde el cartílago tiroideo hasta la rama traqueobronquial y ponerla en un medio de expansión pre-frío que contenga cuatro antibióticos.
      2. Agite el tubo para enjuagar la mayor cantidad de sangre posible de la superficie de la tráquea, manténgalo en hielo y luego comience la cirugía para el próximo ratón.
    5. Transfiera todas las tráqueas recolectadas a un tampón PBS prefrío que contiene cuatro antibióticos (200 U/mL de penicilina, 200 U/mL de estreptomicina, 20 μg/mL de gentamicina y 0,5 μg/mL de anfotericina B) para el pretratamiento antes de la digestión.
    6. Use un conjunto de instrumentos quirúrgicos para eliminar los coágulos y otros tejidos de las superficies de la tráquea, y luego córtelos en un tamaño de 1 cm2 .
    7. Incubar el tejido traqueal en solución de proteinasa a 37 °C durante 40 min.
    8. Después de 40 minutos, agite el tubo varias veces y use un filtro de células de 40 μm para eliminar los tejidos restantes. Enjuagar las tráqueas picadas en un colador con 5 mL de medio de expansión, centrifugar la suspensión celular a 400 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
    9. Resuspender las células obtenidas en 8 mL de medio de expansión.
    10. Cuente las células viables usando azul de tripán y un hemocitómetro.
    11. Suspensión celular en placa P0 en placas de 100 mm (1 x 104 células vivas/cm2) prerecubiertas con colágeno de cola de rata, y cultivo de las células en una incubadora a 37 °C, 5% CO2.

2. Cultivo de expansión y paso de células epiteliales primarias de la vía aérea murina

  1. Reemplace el medio para el cultivo de células P0 cada 3 días hasta que las células alcancen el 70%-80% de confluencia, generalmente dentro de los 6 días. En este punto, las células epiteliales tráqueales murinas pueden formar una monocapa intacta con apariencia de adoquín (Figura 1A-D).
  2. Precaliente volúmenes suficientes de PBS, medio de expansión completo y kit de disociación celular sin componentes animales (ACF) a 37 °C.
  3. Enjuague suavemente las células con 3 ml de PBS.
  4. Realizar la disociación enzimática.
    1. Añadir 3 mL de solución de disociación enzimática ACF a la placa e incubar a 37 °C durante 5 min. Después del pipeteo, desaloje las células suavemente y transfiera la suspensión celular a 3 ml de solución de inhibición de la enzima ACF.
    2. Repita la adición de 3 ml de solución de disociación enzimática de ACF y vuelva a incubar durante 5 minutos para garantizar el máximo desprendimiento de células.
  5. Girar la suspensión de celdas a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
  6. Vuelva a suspender las células en 1 mL de medio de expansión.
  7. Cuente las células viables usando azul de tripán y un hemocitómetro.
  8. Suspensión celular de placa P1 en varias placas de 100 mm (5 x 104 células vivas/cm2) pre-recubiertas con colágeno de cola de rata, y cultivo de las células en una incubadora a 37 °C, 5% CO2.

3. Diferenciación y estimulación de CSE de células epiteliales murinas primarias de la vía aérea en la interfaz aire-líquido

  1. Confirme el tipo de celda.
    1. Verificar el origen epitelial de las células aisladas mediante un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) con anticuerpos contra citoqueratinas. Las células de semilla en portaobjetos de vidrio recubiertas por colágeno de cola de rata y usan paraformaldehído para fijarlas durante al menos 12 horas después de que las células alcancen el 80% de confluencia.
    2. Lave los portaobjetos 3 veces con solución de PBS durante 5 min y descárguelos con 3% de BSA y 0,1% de tritón X-100 en solución de PBS a temperatura ambiente (RT) durante 1 h.
    3. Incubar portaobjetos durante la noche a 4 °C con anticuerpo comercial anti-citoqueratina pan, a una dilución de 1:500.
    4. Al día siguiente, lavar los portaobjetos 3 veces con solución de PBS durante 5 min e incubarlos con tampón de anticuerpos secundarios a una dilución de 1:1000 en RT durante 2 h en la oscuridad.
    5. Después de la incubación, lavar los portaobjetos 3 veces con PBS (5 min por lavado) y añadirles DAPI a una dilución de 1:1000. Después de la incubación en RT durante 15 min, lave los portaobjetos una vez con PBS durante 5 min.
    6. Observe los portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia y compare los patrones de expresión con un control positivo (línea celular A549) y un control negativo (línea celular Raw264.7) (Figura 2).
  2. Siembra las células para la diferenciación.
    1. Separe y centrifugue las células P2 como se ha descrito anteriormente, y vuelva a suspender el pellet de la célula en un volumen adecuado de medio de expansión para facilitar la siembra de 1 x 104 células vivas/cm2.
    2. Pipetear 1 mL de suspensión celular en la cámara apical del inserto de membrana de policarbonato transwell. Al compartimento basal del transpocillo, añadir 1,5 mL de medio de proliferación.
  3. Incubar las células a 37 °C y cambiar completamente todo el medio en las cámaras basales y apicales cada 3 días utilizando medio de expansión hasta alcanzar la confluencia. Esto suele tardar entre 3 y 6 días.
  4. Prepare 50 mL de medio de diferenciación completo agregando 5 mL de ALI 10x Supplement, 500 μL de ALI Maintenance Supplement, 100 μL de solución de heparina y 250 μL de solución madre de hidrocortisona a 44.15 mL de ALI Basal Medium.
  5. Preparar la CSE.
    1. Burbujear un cigarrillo a través de 12,5 mL de medio de diferenciación y luego filtrarlo a través de un filtro de poros de 0,22 μm para preparar CSE. Para garantizar la estandarización entre experimentos y lotes de CSE, mida la absorbancia a 320 nm en un espectrofotómetro y defina la densidad óptica (OD) de 1 como 100%8.
  6. Utilice el medio de diferenciación que contiene una concentración adecuada de CSE para estimular las células epiteliales murinos primarias de las vías respiratorias para detectar efectos sobre la diferenciación de las células.
  7. Permitir que las células se diferencien durante 28 días, durante los cuales se cambia el medio de la cámara basal y se lava el lado apical dos veces por semana retirando el medio de la cámara apical y reemplazando el medio de la cámara basal con el medio de diferenciación que contiene la concentración adecuada de CSE.
  8. Analice las células después de la exposición.
    1. Después de la exposición a un medio de diferenciación que contenga CSE, recoja las células y los sobrenadantes de cultivo en cualquier momento (es decir, 0-28 días) para detectar cambios morfológicos (es decir, ensayo de inmunofluorescencia (IFA) o tinción de hematoxilina-eosina (HE) o para procedimientos analíticos bioinformáticos (es decir, transcriptómica, proteómica, metabolómica, etc.).

Results

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Diferenciación
Las células epiteliales murinas de las vías respiratorias se diferenciaron con éxito después de cultivarlas en una interfaz aire-líquido con un medio de diferenciación durante 28 días. La presencia de células ciliadas y caliciformes se demostró mediante el ensayo de inmunofluorescencia del marcador de cilios α-tubulina acetilada (verde; Figura 3A) y el marcador de células caliciformes Mucin5AC, respectivamente6 (rojo; Figura 3B).

Determinación de la concentración de CSE para la diferenciación celular
Estimular las células epiteliales aisladas con diferentes concentraciones de CSE durante 24 h. Los resultados mostraron que las células epiteliales disminuyeron en viabilidad celular cuando la concentración de CSE fue superior al 6% (p <0.05, Figura 4A). Con el fin de mantener la actividad celular bajo estimulación a largo plazo, se utilizaron medios de cultivo que contenían 2%, 4% y 6% de CSE para estimular la diferenciación de las células epiteliales durante 28 días. Además, los resultados mostraron que con el aumento de la concentración de CSE, no hubo una muerte celular significativa en las células epiteliales (Figura 4B), pero hubo un cambio gradual en el número de resistencias transmembrana intercelulares (TEER) (Figura 4C) y células exfoliadas (Figura 4D). Además, se observó una reducción general de las células diferenciadas y las células ciliadas cuando los cultivos de células epiteliales de las vías respiratorias murinas se expusieron crónicamente a la EIS (Figura 4E-H). Por lo tanto, se eligió el medio de diferenciación que contenía un 6% de CSE para desregular la función de la barrera epitelial y reducir el número de células ciliadas sin disminuir la viabilidad celular mientras se diferenciaban las células epiteliales durante 28 días.

Análisis multiómico
Se cosecharon dos grupos de células estimuladas con medio diferencial que contenía 0% o 6% de CSE durante 28 días. Se extrajo el ARNm total para el análisis transcriptómico. Después de la preparación de la biblioteca, la secuenciación, el control de calidad, el mapeo de lecturas al genoma de referencia y la cuantificación de la expresión génica, se analizó la expresión diferencial de genes entre los dos grupos. El paquete clusterProfiler R se utilizó para realizar un análisis de enriquecimiento de la Ontología Génica (GO) para genes que exhibían expresión diferencial, con ajustes realizados para tener en cuenta las discrepancias en la longitud de los genes (Figura 5A). La Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG, por sus siglas en inglés) sirve como una base de datos integral que facilita la comprensión de las funcionalidades y roles complejos del sistema biológico en varios niveles, incluidos el celular, el de organismos y el ecológico, mediante la integración de datos a nivel molecular derivados de extensos conjuntos de datos, como los producidos por secuenciación genómica y metodologías experimentales de alto rendimiento (Figura 5B). Para la proteómica, las proteínas totales se extrajeron de dos grupos de células a los 28 días después de cultivos con medios diferenciales que contenían 0% o 6% de CSE. Después de la prueba de calidad de proteínas, la eliminación de sal, la hidrólisis enzimática de proteínas, el etiquetado de péptidos con etiquetas de masa en tándem (TMT), la separación de fracciones, el análisis de LC-MS, la identificación de proteínas y la cuantificación de proteínas, se pueden definir las proteínas expresadas diferencialmente entre dos grupos. El análisis de GO se llevó a cabo utilizando el programa interproscan contra la base de datos de proteínas no redundantes (Figura 6A), y KEGG se utilizó para analizar la vía (Figura 6B). Para la metabolómica, los sobrenadantes de cultivo se recolectaron de dos grupos de células epiteliales de las vías respiratorias a los 28 días después de los cultivos con un medio de diferenciación que contenía 0% o 6% de CSE. Después del análisis, identificación y cuantificación de metabolitos de HPLC-MS/MS, se pueden definir los metabolitos diferenciales entre los dos grupos. Se utilizaron la base de datos KEGG (Figura 7A), la base de datos de metaboloma humano (figura 7B) y la base de datos de mapas de lípidos (figura 7C) para anotar todos los metabolitos. Se utilizó la base de datos KEGG para analizar las funciones de estos metabolitos diferenciales y las vías metabólicas (Figura 7D). Para la epigenómica, se realizó ATAC-seq como se informó previamente9. Los núcleos se extrajeron de dos grupos de células a los 28 días después del cultivo con un medio diferencial que contenía 0% o 6% de CSE, y el pellet de los núcleos se resuspendió en la mezcla de reacción de transposasa Tn5. La reacción de transposición se incubó a 37 °C durante 30 min. Después de agregar un adaptador, la preparación de la biblioteca, la evaluación de la calidad, la agrupación y la secuenciación, se puede definir la epigenómica diferencial entre dos grupos. El análisis de enriquecimiento de GO de genes diferencialmente relacionados con picos refleja directamente la distribución numérica de genes diferencialmente relacionados con picos en ítems GO enriquecidos en procesos biológicos, componentes celulares y función molecular (Figura 8A). Se utilizó la base de datos KEGG para analizar las funciones de estos genes y vías diferenciales (Figura 8B).

Genes que codifican proteínas de unión estrecha
Los datos transcriptómicos mostraron que, después de la estimulación a largo plazo de CSE, hubo una disminución de la expresión de numerosos genes que codifican proteínas de unión estrecha, incluidos Cgn, Cldn2, Cldn3, Cldn8, Cldn10, Cldn20, Cldn23, Jam2 y Ocln (Figura 9A), en los que la expresión reducida de Cldn3 y Ocln se confirmaron aún más mediante Western-Blot e inmunohistoquímica (IHC) (Figuras 9B-E). Estos datos sugieren que la exposición a CSE reduce notablemente la expresión de proteínas de unión estrecha de las células epiteliales de las vías respiratorias.

Expresión de citocinas y quimiocinas
Además de la ruptura de las conexiones estrechas, la transcriptómica también mostró que después de la estimulación a largo plazo de CSE, la expresión de algunas citocinas y quimiocinas, incluidas Cxcl5, Csf3, Il1a, Il34, Ccl20 e Il33, aumentaba, pero la expresión de Ccl5 disminuía (Figura 10A). La prueba Luminex confirmó además que hubo un aumento de las concentraciones de CXCL-5, CSF-3 e IL-1α (Figura 10B-D), pero una disminución de CCL-5 (Figura 10E) en el sobrenadante de las células epiteliales de las vías respiratorias murinas. Estos resultados sugieren que la exposición a CSE actúa selectivamente sobre la expresión de citocinas y quimiocinas.

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Figura 1: Crecimiento de las células epiteliales primarias de las vías respiratorias murinas. (A) Las células recién aisladas aparecen redondas y transparentes. (B) Para el día 2 después del aislamiento, las células expandidas se formaron en islas de células pequeñas. (C) Para el día 4, la formación de islas celulares más grandes. (D) Para el día 6, más del 90% de fusión con la morfología del adoquín. (Aumento de 4x; barras de escala: 250 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Ensayo de inmunofluorescencia de marcadores de células epiteliales. Expresión de citoqueratina en células epiteliales murinas primarias de las vías respiratorias, A549 (control positivo) y Raw264.7 (control negativo). Núcleos teñidos con DAPI (aumento de 63x; barras de escala: 40 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Ensayo de inmunofluorescencia para marcadores de células ciliadas y caliciformes. Los marcadores utilizados fueron acetilados (A) α-Tubulina y (B) Mucina 5AC para confirmar las células de cilios y las células caliciformes, respectivamente (100 aumentos; barras de escala: 10 μm en el panel A y 50 μm en el panel B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Impacto de las concentraciones de CSE en las células epiteliales. (A) Viabilidad celular a las 24 h a concentraciones variables de CSE. (B) Viabilidad celular a los 28 días. (C) Medición de TEER. (D) Recuento de células exfoliadas. (E-H) Inmunofluorescencia para células ciliadas (verde) y caliciformes (púrpura) a concentraciones de CSE del 0%, 2%, 4% y 6% (aumento de 20x; barras de escala: 50 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Análisis de enriquecimiento de GO y KEGG para la expresión génica. (A) Significado del término GO en el proceso biológico enriquecido, el componente celular y la función molecular. (B) Proporción de genes expresados diferencialmente en las vías KEGG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Análisis de la expresión de proteínas. (A) Gráfico de barras de enriquecimiento de GO que muestra la expresión diferencial de proteínas. (B) Análisis de la vía KEGG basado en proteínas expresadas diferencialmente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Análisis de la vía de metabolitos KEGG. (A) Anotación de todos los metabolitos utilizando la base de datos KEGG. (B) Anotar todos los metabolitos utilizando la Base de Datos del Metaboloma Humano. (C) Anotación de todos los metabolitos utilizando la base de datos de Lipidmaps. (D) La distribución de metabolitos expresados diferencialmente en varias vías KEGG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8: Análisis de expresión génica diferencialmente relacionada con picos. (A) Gráfico de barras de enriquecimiento de GO que muestra la expresión diferencial de proteínas. (B) Análisis de la vía KEGG basado en proteínas expresadas diferencialmente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 9: Expresión de la proteína de unión estrecha en células epiteliales de las vías respiratorias murinas con o sin estimulación de CSE. (A) Mapa de calor de la expresión de la proteína de unión estrecha en el transcriptoma. (B-E) Los niveles de expresión de (B,C) Cldn3 y (D,E) Ocln en células epiteliales murinas de las vías respiratorias se detectaron mediante Western Blot e inmunohistoquímica para Cldn3 y Ocln (80 aumentos; barras de escala: 50 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 10: Análisis de la expresión de citocinas. (A) Mapa de calor del transcriptoma de la expresión de citoquinas. (B-E) Ensayo Luminex para los niveles de CXCL-5, CSF-3, IL-1α y CCL-5 en células con/sin estimulación de CSE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

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La EPOC es una enfermedad inflamatoria crónica común de las vías respiratorias. La exposición al humo del tabaco conduce a la inflamación crónica de las vías respiratorias, la remodelación de las vías respiratorias y la destrucción estructural de los pulmones, que es el resultado de la interacción de varias células estructurales y células inmunitarias10. Como primera línea del sistema inmune innato en el pulmón, las células epiteliales de las vías respiratorias juegan un papel muy importante durante el desarrollo de la enfermedad11. Desde este punto de vista, aclarar cómo las células epiteliales cambian y regulan las células posteriores bajo la estimulación de sustancias nocivas es un problema científico que debe resolverse con urgencia.

Recientemente, se han descrito varios modelos animales de EPOC que han superado algunas limitaciones12. En estos modelos se pueden observar niveles moderados de inflamación neutrofílica de las vías respiratorias, una firma inflamatoria Th1/Th17, una marcada hiperproducción de moco, un aumento de la remodelación de las vías respiratorias, una disminución de la función pulmonar y un agrandamiento de los espacios aéreos. Aunque estos modelos requieren solo 1 mes para establecer cambios similares a la EPOC, lo que sucedió en los ratones expuestos al humo del cigarrillo dentro de 1 mes aún no está claro. El uso de la estimulación de CSE a largo plazo tiene la ventaja de ser más fácil de calibrar, lo que significa que las células epiteliales de las vías respiratorias pueden exponerse a estímulos de cigarrillos lo más severos posible sin morir, al igual que las células epiteliales de las vías respiratorias en los fumadores. En este caso, el seguimiento de los cambios patológicos dinámicos que conducen a la inflamación de las vías respiratorias y a la formación de enfisema es fundamental para comprender mejor la patogénesis de la EPOC relacionada con el tabaquismo. Por lo tanto, establecimos un modelo in vitro para imitar el estado del humo e intentamos monitorear los cambios dinámicos durante la exposición de la EIS a las células epiteliales de las vías respiratorias. Además, las células epiteliales de las vías respiratorias relativamente purificadas hacen que el estudio multiómico sea más fácil que el de los tejidos completos, lo que puede ayudarnos a encontrar las respuestas moleculares y celulares en la exposición de las células epiteliales de las vías respiratorias a la ESI y a identificar las vías clave y las dianas terapéuticas de la EPOC de alto rendimiento.

Aquí, el protocolo que describe el aislamiento de células epiteliales traqueales murinas se adapta de los protocolos de Hilaire et al.13 y You et al.14 con algunas modificaciones. En el protocolo utilizado en este estudio, las células epiteliales de las vías respiratorias murinas se propagaron y diferenciaron en una estructura pseudoestratificada que contenía células ciliadas y caliciformes utilizando una interfaz aire-líquido y un medio que contenía CSE, estableciendo así un modelo de aclimatación crónica de la CSE. Los siguientes eventos son los puntos clave del presente modelo.

Teniendo en cuenta que la luxación cervical podría forzar mecánicamente el cuello y dañar físicamente las células epiteliales, y que la anestesia con hidrato de cloral también podría afectar las vías aéreas, se utilizó pentobarbital sódico para la eutanasia15. Durante los procedimientos quirúrgicos en ratones, sumergir solo el cuello y las áreas inferiores para evitar que el alcohol ingrese a la nariz podría aumentar la viabilidad de las células epiteliales de las vías respiratorias16. Los datos preliminares del presente estudio demostraron que las células epiteliales de las vías respiratorias sometidas a intubación traqueal o inmersión en alcohol tenían baja viabilidad y no se expandían. Además, para obtener células epiteliales de las vías respiratorias sin eritrocitos, se debe tener cuidado en los procedimientos quirúrgicos para evitar la contaminación de la sangre al aislar las vías respiratorias principales.

Incluso en ratones libres de patógenos específicos, las vías respiratorias colonizaron microbios significativos. La adición de antibióticos apropiados en el medio de expansión de las células epiteliales murinos primarias de las vías respiratorias murinas P0 es esencial para evitar la contaminación por patógenos bacterianos o fúngicos. Una solución cóctel de penicilina, estreptomicina, anfotericina B y gentamicina17 asegura eficazmente la expansión de las células epiteliales murinas P0 de las vías respiratorias en un entorno estéril in vitro . Los experimentos preliminares demostraron que si no hay una inhibición efectiva de la contaminación bacteriana, las células epiteliales murinos P0 de las vías respiratorias morirán antes del primer paso.

En los métodos de digestión, se probaron tanto 4 °C como 37 °C. Los resultados de los experimentos preliminares indicaron que la digestión a 37 °C superó a 4 °C en términos de eficiencia de tiempo, viabilidad celular y rendimiento celular.

Antes de la siembra de las células epiteliales, el colágeno de la cola de rata se disolvía en ácido acético y se utilizaba para el recubrimiento de la placa de cultivo para mejorar la adhesión de las células epiteliales18. Sin embargo, la densidad del recubrimiento de colágeno no debe ser demasiado alta ni demasiado baja; Una densidad insuficiente no proporciona condiciones de adhesión adecuadas, mientras que una densidad excesiva da lugar a residuos cristalinos en la superficie del cultivo.

Un paso crítico es mantener vivas más células epiteliales y evitar la contaminación por fibroblastos. Para lograr estos, recomendamos que 1) el uso del kit de disociación celular sin componentes animales puede aislar suavemente las células epiteliales y reducir el daño celular innecesario y 2) el uso de medio diferencial que contiene hidrocortisona puede inhibir el crecimiento de fibroblastos y promover la proliferación de células epiteliales.

Los cultivos monocapa sumergidos tradicionales de células epiteliales de las vías respiratorias han sido un elemento básico en la investigación respiratoria y los estudios toxicológicos. Sin embargo, estos métodos no logran replicar con precisión las características diferenciadas de los tejidos epiteliales de las vías respiratorias que se encuentran in vivo. Para abordar esta limitación, hemos optado por un modelo epitelial alternativo de la vía aérea. Este modelo se basa en el cultivo de células primarias de la vía aérea en andamios de membrana microporosa, como los proporcionados por los sistemas transwell, en una interfaz aire-líquido19. La exposición de la superficie apical al aire ambiente en esta configuración de cultivo ALI es fundamental para fomentar la diferenciación celular, imitando así más de cerca las condiciones in vivo 20.

Si la diferenciación no es efectiva, es crucial evaluar las posibles razones. Esto incluye la posibilidad de que las células epiteliales de las vías respiratorias hayan sufrido un paso excesivo, lo que puede comprometer su capacidad de diferenciación. Además, es imperativo asegurarse de que la acumulación de moco y líquido dentro de la cámara apical se elimine por completo durante el proceso de intercambio de medios quincenal, ya que el contenido residual puede impedir el proceso de diferenciación.

Si bien este modelo presenta ciertas limitaciones, sigue siendo una herramienta valiosa para la investigación. Una limitación es que el uso de un medio que contiene CSE para estimular las células epiteliales de las vías respiratorias puede no replicar completamente las condiciones in vivo experimentadas por las células epiteliales de las vías respiratorias en fumadores. Además, la viabilidad de las células epiteliales ciliadas diferenciadas in vitro suele limitarse a un mes. A pesar de estas limitaciones, el modelo integra eficazmente varios aspectos clave: facilita el estudio de la diferenciación de las células epiteliales de las vías respiratorias en la interfaz aire-líquido, la aclimatación a largo plazo a la CSE y la aplicación de análisis multiómicos durante un determinado período de tiempo. Este enfoque integral ofrece un marco sofisticado y holístico para futuras investigaciones sobre los mecanismos fisiológicos y patológicos de las células epiteliales de las vías respiratorias. Además, ayuda en la identificación de posibles biomarcadores y dianas terapéuticas para las enfermedades de las vías respiratorias. Esperamos que nuestra experiencia proporcione información útil para aquellos que deseen utilizar este modelo para estudios relevantes.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82090013).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100x Solución de penicilina/estreptomicinaGibco15140122
24 mm Transwell con 0,4 y micro; m Inserto de membrana de poliéster para poros, estérilBIOFILTCS016012
40 y micro; m Filtro de célulasFalcon352340
500x Gentamicina/Anfotericina SoluciónGibcoR01510
acetilado α-TubulinaCST#5335
Acetil-α-Tubulina (Lys40) (D20G3)XP Conejo mAb cellsignal#5335
Kit de disociación de células libres de componentes animalesStemcell05426
Anti-pan Anticuerpo de citoqueratinaabcamab7753
CigarrilloMarlboro
Claudin3immunowayYT0949
Desoxirribonuclasa I de páncreas bovinoSigma-AldrichDN25
Desoxirribonuclasa I de páncreas bovinoSigmaDN25
Jamón' s F-12Sigma-AldrichN6658
Solución de heparina Stemcell07980
Solución madre de hidrocortisonaStemcell07925
Mucina 5ACabcamab212636
Ocludinproteintech27260-1-AP
PBS CytosciCBS004S-BR500
Solución de penicilina-estreptomicinaGibco15140122
PneumaCult-ALI
Célula madre05002 
PneumaCult-ALI 10x SuplementoStemcell05003 
PneumaCult-ALI Suplemento de Mantenimiento Stemcell05006
PneumaCult-Ex Plus 50x SuplementoStemcell05042
PneumaCult-Ex Plus Stemcell Medio Basal05041
Pronase ESigma-AldrichP5147
Cola de Rata ColágenoCorning354236
Azul TrypanCélula madre07050 
de medio basal

References

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