Artículo de método

Generación y cocultivo de microglía primaria murina y neuronas corticales

DOI:

10.3791/67078

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26 de julio de 2024

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1Department of Biochemistry, Microbiology & Immunology, University of Saskatchewan

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un cocultivo microglía-neuronal establecido a partir de células neuronales primarias aisladas de embriones de ratón en los días embrionarios 15-16 y microglía primaria generada a partir de los cerebros de ratones neonatos en los días postnatales 1-2.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las microglías son macrófagos residentes en los tejidos del sistema nervioso central (SNC), que realizan numerosas funciones que apoyan la salud neuronal y la homeostasis del SNC. Son una población importante de células inmunitarias asociadas con la actividad de la enfermedad del SNC, que adoptan fenotipos reactivos que potencialmente contribuyen a la lesión neuronal durante enfermedades neurodegenerativas crónicas como la esclerosis múltiple (EM). Los distintos mecanismos por los cuales la microglía regula la función neuronal y la supervivencia durante la salud y la enfermedad siguen siendo limitados debido a los desafíos para resolver las complejas interacciones in vivo entre la microglía, las neuronas y otros factores ambientales del SNC. Por lo tanto, el enfoque in vitro de co-cultivo de microglía y neuronas sigue siendo una herramienta valiosa para estudiar las interacciones microglía-neurona. Aquí, presentamos un protocolo para generar y co-cultivar microglía primaria y neuronas a partir de ratones. Específicamente, se aislaron microglía después de 9-10 días in vitro a partir de un cultivo de glía mixta establecido a partir de homogeneizados cerebrales derivados de ratones neonatos entre los días postnatales 0-2. Las células neuronales se aislaron de las cortezas cerebrales de embriones de ratón entre los días embrionarios 16-18. Después de 4-5 días in vitro, las células neuronales se sembraron en placas de 96 pocillos, seguidas de la adición de microglía para formar el cocultivo. El tiempo cuidadoso es crítico para este protocolo, ya que ambos tipos de células deben alcanzar la madurez experimental para establecer el cocultivo. En general, este cocultivo puede ser útil para estudiar las interacciones entre la microglía y las neuronas y puede proporcionar múltiples lecturas, incluida la microscopía de inmunofluorescencia, imágenes en vivo, así como ensayos de ARN y proteínas.

Introducción

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Las microglías son macrófagos residentes en los tejidos que facilitan la inmunovigilancia y la homeostasis en el sistema nervioso central (SNC)1,2,3. Se originan a partir de células progenitoras eritromieloides del saco vitelino que colonizan el cerebro durante el desarrollo embrionario 4,5,6 y se mantienen a lo largo de la vida del organismo a través de la autorrenovación, que implica proliferación y apoptosis7. En estado estacionario, la microglía en reposo tiene una morfología ramificada y realiza vigilancia tisular 8,9,10.

La microglía expresa numerosos receptores en la superficie celular, lo que les permite responder rápidamente a los cambios en el SNC11,12 y promover respuestas inflamatorias en caso de infecciones o lesiones tisulares 12,13,14, así como durante enfermedades neurodegenerativas 9,15, como la esclerosis múltiple (EM)16,17. La microglía también expresa receptores a varios neurotransmisores y neuropéptidos 18,19,20, lo que sugiere que también pueden responder y regular la actividad neuronal 21,22. De hecho, la microglía y las neuronas interactúan en diversas formas de comunicación bidireccional 8,23 como las interacciones directas mediadas por proteínas de membrana o las interacciones indirectas a través de factores solubles o células intermedias23,24.

Por ejemplo, varios neurotransmisores secretados por las neuronas pueden modular la actividad neuroprotectora o inflamatoria de la microglía 25,26,27. Además, las interacciones directas entre las neuronas y la microglía ayudan a mantener la microglía en un estado homeostático28. Por el contrario, las interacciones directas de la microglía con las neuronas pueden dar forma a los circuitos neuronales29 e influir en la señalización neuronal 30,31,32. Dado que las interrupciones de estas interacciones inducen hiperexcitabilidad de las neuronas30 y reactividad de la microglía33,34, las interacciones microglía-neuronas desreguladas están implicadas como un factor contribuyente a las enfermedades neurológicas33,35. De hecho, se ha descrito que las enfermedades psicóticas23,26 y neurodegenerativas presentan interacciones disfuncionales entre la microglía y las neuronas33. Si bien estas observaciones resaltan la importancia de la comunicación microglía-neurona en el SNC, los mecanismos específicos de cómo estas interacciones regulan las funciones microgliales y neuronales en la salud y la enfermedad son relativamente desconocidos.

Dentro de un entorno complejo como el SNC, múltiples factores ambientales pueden influir en las interacciones microglía-neurona, lo que limita la capacidad de estudiar las interacciones celulares transitorias in vivo. Aquí, presentamos un sistema de cocultivo in vitro de microglía-neurona que se puede utilizar para estudiar las interacciones celulares directas entre la microglía y las neuronas. Este protocolo describe la generación de microglía primaria y neuronas a partir de las cortezas de ratones neonatos entre los días postnatales 0-2 y los días 16-18 de ratones embrionarios, respectivamente. A continuación, las neuronas y la microglía se cultivan conjuntamente en placas de 96 pocillos para realizar experimentos posteriores de alto rendimiento. Anteriormente utilizamos este enfoque para demostrar que la fagocitosis de la microglía protege a las neuronas de la muerte celular mediada por fosfatidilcolina oxidada37, lo que sugiere que este método puede ayudar a comprender las funciones de la microglía en el contexto de la neurodegeneración y la EM. Del mismo modo, los cocultivos microglía-neuronal también pueden ser útiles para investigar el impacto de la diafonía microglía-neurona en otros contextos, como las infecciones virales38 o las lesiones y reparaciones neuronales39. En general, los sistemas de cocultivo in vitro microglía-neurona permiten a los investigadores estudiar las interacciones microglía-neurona en un entorno manipulable y controlado, que complementa los modelos in vivo.

Protocolo

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Todos los animales utilizados en este estudio fueron alojados y manejados con la aprobación del Comité Universitario de Cuidado de Animales (UACC) de la Universidad de Saskatchewan y el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales (CCAC). Para este estudio se utilizaron ratones macho y hembra CD1 de los días postnatales 0-2 y embriones de los días 16-18 (E16-18) de ratones CD1 preñados. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cultivo primario de microglía

NOTA: Es crucial cronometrar los cultivos mixtos de glía y neuronas para que la microglía esté madura y lista para la cosecha dentro de los 2 días posteriores a la siembra de las neuronas en una placa de 96 pocillos.

  1. Preparación
    1. Precaliente los medios de cultivo de glía completos, que incluyen el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa suplementado con un 10% de suero fetal bovino inactivado por calor, 50 U/mL de penicilina/estreptomicina con 2,92 mg/mL de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 1x aminoácidos no esenciales y 20 mM de HEPES en un baño de agua a 37 °C.
    2. Añadir 5 mL de 10 μg/mL de hidrobromuro de poli-L-ornitina (PO) a cada matraz T-75. Agite suavemente el matraz para asegurarse de que el PO cubra completamente el fondo del matraz. Incubar a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2 durante al menos 1 h.
      NOTA: Este paso de recubrimiento es necesario para facilitar la adhesión de las células a los matraces T-75.
  2. Aislamiento de cerebros de ratones neonatos P0-P2
    NOTA: Esterilice todas las herramientas de disección y mantenga la esterilidad de los reactivos. Asegurar el cumplimiento de las técnicas asépticas en todo momento.
    1. Antes de comenzar la disección, rocíe la encimera con etanol al 70% o spray desinfectante donde se llevará a cabo la disección. Configure el microscopio de disección y coloque la placa de Petri debajo del microscopio. Vierta 20 ml de medios L-15 de Leibovitz en la placa de Petri. Mantenga la tapa de la placa de Petri puesta mientras el microscopio no esté en uso para reducir la contaminación.
    2. Coloque varias capas de toalla de papel y rocíe bien las toallas de papel con etanol al 70%. Prepare las herramientas de disección (tijeras de disección, un par de micropinzas y pinzas de tejido) rociándolas a fondo con etanol al 70% y colocando las herramientas sobre las toallas de papel.
    3. Transfiera el ratón de los días postnatales 0-2 a las toallas de papel y rocíe bien el ratón con etanol al 70%. Decapitar al ratón con tijeras de disección (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente).
    4. Mientras sostienes suavemente la cabeza, haz una incisión en la línea media del cráneo desde el cuello hasta la nariz. Pela el cráneo con pinzas de tejido para revelar el cerebro.
    5. Con pinzas de tejido, saque suavemente el cerebro insertando las pinzas debajo del cerebro y levante el cerebro de la cabeza. Coloque inmediatamente el cerebro en la placa de Petri que contiene 20 mL de medios L-15 de Leibovitz.
    6. Bajo un microscopio de disección, extraiga cuidadosamente el tronco encefálico y las meninges con un par de micropinzas. Recoja los cerebros en un tubo cónico de 50 mL que contiene 5 mL de medio L-15 de Leibovitz.
  3. Disociación cerebral, siembra y mantenimiento del cultivo de glía mixta
    NOTA: Realice todos los pasos posteriores en un gabinete de bioseguridad.
    1. Picar los sesos en trozos de aproximadamente 1 mmy 2 con una hoja de bisturí desechable estéril. Transfiera con cuidado los cerebros picados a un nuevo tubo estéril de 50 ml.
    2. A los cerebros picados, añadir una concentración final de tripsina al 0,25% e incubar el tejido en un baño de agua a 37 °C durante 20 min. Cada 2-3 minutos, mezcle la solución invirtiendo suavemente el tubo para ayudar a la disociación del tejido.
    3. Desde la incubadora con 5% de CO2 , transfiera los matraces T-75 que contienen 5 mL de PO al gabinete de bioseguridad. Deseche el PO y enjuague los matraces 3 veces con una solución tampón de fosfato (PBS) estéril 1x. Asegúrese de enjuagar bien los frascos, ya que el exceso de PO es tóxico para las células.
    4. Transfiera el tejido digerido del baño de agua a 37 °C al gabinete de bioseguridad. Agregue 5 mL de medio de cultivo de glía completo para neutralizar la tripsina. Mezcle suavemente la suspensión de tejido con una pipeta de 10 ml.
    5. Coloque un colador de células de malla de nailon estéril de 70 μm en un tubo cónico estéril de 50 ml y humedezca la malla vertiendo aproximadamente 5 ml de L-15. Decantar cuidadosamente la suspensión celular a través del colador celular. Retire el émbolo de una jeringa estéril de 1 ml, muela el tejido en la malla con el émbolo para eliminar los grumos de tejido y genere una suspensión celular homogeneizada.
    6. Periódicamente, vierta aproximadamente 5 mL de los medios L-15 de Leibovitz en la malla de nailon de 70 μm y continúe triturando el tejido en la malla con el émbolo de la jeringa de 1 mL. Cuando quede poco o nada de tejido visible en la malla, desecha la malla y deja la suspensión celular a un lado.
    7. Mezcle la suspensión celular pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. A cada matraz, añadir volúmenes iguales de suspensión celular que contenga 1-2 cerebros con medios de cultivo de glía hasta un volumen final de 15 mL.
    8. Incubar las células a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2 durante la noche. Al día siguiente, lave los matraces dos veces con PBS estéril 1x para eliminar las células sueltas y los residuos.
    9. Añada 15 mL de medio de cultivo de glía completo y fresco al cultivo e incube a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5%. Después de 3 días, cambie la mitad del medio con 10 mL de medio de cultivo de glía fresco suplementado con 40 ng/mL de factor estimulante de colonias de macrófagos (MCSF).
      NOTA: A partir de entonces, la mitad del medio se reemplaza con 10 mL de medio de cultivo de glía fresco complementado con 40 ng/mL de MCSF cada 3 días. El cultivo se mantiene durante 8-10 días antes de cosechar la microglía.

2. Cultivo de neuronas primarias

  1. Preparación
    1. Descongele el suplemento B-27 plus del sistema de cultivo neuronal B-27 plus. Precalentamiento del medio neurobasal plus del sistema de cultivo neuronal B-27 plus, 1x Solución Salina Equilibrada de Hank (HBSS) y suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor a 37 °C en un baño de agua.
    2. Cubrir los matraces T-25 con 5 mL de 10 μg/mL PO e incubar los matraces durante al menos 1 hora a 37 °C. Prepare los instrumentos y suministros para la disección.
      NOTA: Este paso de recubrimiento facilita la adhesión de las células a los matraces T-25.
  2. Aislamiento cerebral de embriones de ratón E16-E18
    NOTA: Esterilice todas las herramientas de disección y mantenga la esterilidad de los reactivos. Asegurar el cumplimiento de las técnicas asépticas en todo momento.
    1. Antes de comenzar la disección, rocíe la encimera con etanol al 70% o spray desinfectante donde se llevará a cabo la disección. Configure el microscopio de disección y coloque la placa de Petri debajo del microscopio. Vierta 20 ml de 1x HBSS en la placa de Petri. Mantenga la tapa de la placa de Petri puesta mientras el microscopio no esté en uso para reducir la contaminación.
    2. Coloque varias capas de toalla de papel y rocíe bien las toallas de papel con etanol al 70%. Prepare las herramientas de disección (tijeras de resorte, un par de micropinzas y pinzas de tejido) rociándolas minuciosamente con etanol al 70% y colocando las herramientas sobre las toallas de papel.
    3. Anestesiar a una rata embarazada entre los días 16-18 de gestación con isoflurano y sacrificar a la rata por luxación cervical (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente).
    4. Coloque el ratón boca arriba sobre un trozo de toalla de papel empapado en etanol al 70%. Desinfectar la zona abdominal con etanol al 70%. Levante la piel de la parte inferior del abdomen con pinzas de tejido y realice una incisión en forma de V desde este punto hasta la caja torácica inferior con tijeras de disección.
    5. Agarre los cuernos uterinos que contienen los embriones con pinzas de tejido y extraiga suavemente los embriones de la cavidad abdominal. Desinfectar brevemente los cuernos uterinos que contienen embriones con etanol al 70%.
    6. Disecciona un embrión de su saco individual a la vez. Con unas tijeras de resorte, haz una incisión en la línea media en la parte superior del cráneo, comenzando desde la parte posterior del cuello hasta la nariz. Luego, levante el cráneo del sitio de la incisión para revelar el cerebro. Extraiga suavemente el cerebro con pinzas de tejido y transfiéralo a una placa de Petri de 10 cm que contenga 15 ml de HBSS 1x.
    7. Bajo un microscopio de disección, extraiga cuidadosamente el tronco encefálico y las meninges a ambos lados de las cortezas encefálicas con un par de micropinzas. Transfiera las cortezas cerebrales a un tubo cónico de 50 mL que contenga 10 mL de HBSS 1x y colóquelo en hielo.
  3. Disociación cerebral y siembra de neuronas corticales en cultivo celular
    NOTA: Realice todos los pasos posteriores en un gabinete de bioseguridad.
    1. Picar los sesos en trozos de aproximadamente 1 mmy 2 en el tubo cónico de 50 ml con una hoja de bisturí desechable estéril. Transfiera los cerebros picados a un nuevo tubo cónico estéril de 50 ml.
    2. Añadir tripsina al tubo con una concentración final del 0,25%. Sumerja el tubo en un baño de agua caliente a 35-38 °C durante 15 minutos y mezcle suavemente el tubo para homogeneizar el tejido cada 2-3 minutos.
    3. Retire el tubo del baño de agua caliente. Pipetear suavemente la suspensión de tejido hacia arriba y hacia abajo para disociar aún más las células, luego agregue 0,5 mL de FBS inactivado por calor a la suspensión homogeneizada para neutralizar la actividad de la tripsina. Evite las burbujas de aire para minimizar la toxicidad para las células neuronales.
    4. Coloque un colador de células de malla de nailon estéril de 70 μm en un tubo cónico estéril de 50 ml y humedezca la malla agregando aproximadamente 5 ml de medio neurobasal. Filtre la suspensión celular a través del filtro celular de malla de nailon de 70 μm. Con un émbolo de jeringa de 1 ml, muela suavemente el tejido en el colador de celdas. Vierta periódicamente aproximadamente 5 mL de HBSS 1x mientras continúa moliendo para lavar el filtro de celdas.
    5. Centrifugar el tubo cónico a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Durante este tiempo, diluya el suplemento B-27 plus en medios neurobasales plus hasta una concentración final de 1x para usarlo como medio neurobasal completo.
    6. Deseche el PO en los matraces T-25 y enjuague los matraces tres veces con 5 mL de 1x PBS.
    7. Decantar cuidadosamente para eliminar el sobrenadante y resuspender la pastilla celular pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 2-3 mL de medio neurobasal completo. Determine la concentración de células y el número total de células con un hemocitómetro y azul de tripano. Espere hasta 1.0 x 107 células por embrión.
    8. Coloque las células en los matraces T-25 recubiertos de PO con aproximadamente 2,0 x 107 células por matraz en 5 ml de medio neurobasal completo. Incubar el cultivo celular a 37 °C en una incubadora de 5% de CO2 .
    9. Realice un cambio de medio medio cada 2-3 días reemplazando 2,5 mL de medio del matraz de cultivo con medios neurobasales completos recién hechos.

3. Cocultivo de neuronas primarias y microglía

NOTA: Todos los pasos posteriores deben realizarse en un gabinete de bioseguridad estéril.

  1. Semillas de neuronas en placas de 96 pocillos
    1. Añadir 100 μL de 10 μg/mL de PO por pocillo e incubar los matraces durante al menos 1 h a 37 °C para recubrir los pocillos con PO. Lave la placa con 1x PBS 3 veces antes de sembrar las celdas y aspire cualquier líquido restante después del último lavado.
    2. Las neuronas cultivadas en matraces T-25 se cosechan para el cocultivo después de 2-5 días de cultivo. Sustituya el medio por 5 mL de solución 1x Versene con tripsina al 0,25% y 1 mg/mL de DNasa I para separar las neuronas del matraz. Coloque los matraces dentro de la incubadora durante 5-6 minutos para la digestión y agite suavemente el matraz cada 2-3 minutos para ayudar al desprendimiento de las células.
    3. Saque el matraz de la incubadora y compruebe si las células se desprenden bajo un microscopio. Agregue 0,5 mL de FBS inactivado por calor para neutralizar la tripsina y la DNasa I. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 mL. Lave el matraz con 5 mL de medio neurobasal completo una vez para maximizar las neuronas recolectadas. Recoja todas las células en el mismo tubo cónico de 15 ml.
    4. Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente el pellet de células en 2-3 mL de medio neurobasal completo.
    5. Cuente las células con un hemocitómetro y agregue medios neurobasales completos para lograr una concentración final de 7.5 x 105 neuronas/mL. Siembre 100 μL de la suspensión celular en cada pocillo en la placa de 96 pocillos recubierta de PO para obtener 7,5 x 104 neuronas/pocillo. Se espera un rendimiento de 5-6 millones de neuronas por matraz.
    6. Incuba las neuronas en una placa de 96 pocillos durante la noche. Agregue 100 μL de medio neurobasal completo a cada pocillo al día siguiente.
      NOTA: Una vez que las neuronas muestran un crecimiento apropiado del proceso de neurita (alrededor del día 3-4 después de la siembra en placas de 96 pocillos), están listas para el cocultivo con la microglía.
  2. Aislamiento y cocultivo microglía-neuronal
    1. Entre 8 y 10 días de cultivo de glía mixta, recoja la microglía lavando suavemente los matraces T-75 con medios de cultivo de glía en cada matraz con una pipeta de 10 mL, y transfiera las células y los medios a un tubo cónico estéril de 50 mL. Vuelva a lavar los matraces con 10 ml de medios de cultivo de glía frescos para separar la microglía adicional de los matraces y recoger los medios. Se espera un rendimiento de 7,5 x10,5 5 microglías por matraz.
    2. Añada 20 mL de medio de cultivo de glía fresco suplementado con 20 ng/mL de MCSF a cada matraz. La microglía se puede cosechar una o dos veces más si se mantiene el cultivo de glía mixta.
    3. Centrifugar la recogida de células a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente el pellet en 2 mL de medio neurobasal completo.
    4. Cuente las células con un hemocitómetro y azul de tripán. Añadir medios neurobasales completos hasta una concentración final de 2,5 x 105 células/mL.
    5. De la placa de cultivo neuronal de 96 pocillos, extraiga 100 μL de medio neurobasal y agregue 100 μL de suspensión celular de 2,5 x 105 células/mL para sembrar 2,5 x 104 microglías por pocillo de 7,5 x 104 neuronas. Incubar el cultivo durante la noche a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2 para permitir que la microglía se asiente. El cocultivo ahora se puede utilizar para experimentos posteriores.

Resultados

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En la Figura 1A se muestra un diagrama de flujo que muestra los pasos clave del cultivo de glía mixta para microglía. En general, se esperan células dispersas y desechos celulares excesivos en el día 1 (Figura 1B). Para el día 4, se debe observar un aumento en el número de células, especialmente con la generación de astrocitos adherentes, como lo indica su morfología alargada (Figura 1C). Se pueden observar algunas microglías en la parte superior de los astrocitos o como pequeñas células redondas flotando en el medio. Para el día 8, una capa confluente de astrocitos formará las capas adherentes de las células, mientras que la microglía aparecerá como células redondas y brillantes que están semiunidas a los astrocitos o flotando en el medio (Figura 1D). Si la densidad microglial es baja para el día 8, el cultivo puede incubarse durante días adicionales antes de la cosecha.

En la Figura 2A se muestra un diagrama de flujo que muestra los pasos clave del cultivo neuronal. En un cultivo sano, las neuronas se unirán y formarán procesos de neurita después de 1-3 días in vitro (Figura 2B). De manera similar, al sembrar neuronas en una placa de 96 pocillos, aparecerán redondas inicialmente, pero para el día 3, las neuronas deberían volverse adherentes y formar procesos de neuritas que se conecten con las neuronas vecinas (Figura 2C). Por el contrario, los cultivos de neuronas no saludables contendrán grupos de células y restos celulares, que pueden ser el resultado de una disociación celular deficiente o de un mal manejo de las neuronas (Figura 2D).

En la Figura 3A se muestra un diagrama de flujo que muestra los pasos clave del protocolo de cocultivo microglía-neurona. Después de añadir 2,5 x 104 microglías a 7,5 x 104 neuronas, deben aparecer microglías redondas y grandes en la parte superior o entre las neuronas y los procesos de neuritas (Figura 3B). Para visualizar aún más el cocultivo microglía-neurona, la microglía y las neuronas solas o en cocultivo se marcaron con anticuerpos 1 (IBA-1, rojo) y tubulina βIII (TUJ1, verde)37 para microscopía de inmunofluorescencia (Figura 3C-F).

Proceso de cultivo celular: suspensión unicelular de cortezas de ratones; pasos que se muestran en el diagrama; imágenes de microscopio.
Figura 1: Descripción general del cultivo primario de microglía. (A) Diagrama de flujo de los pasos clave en la generación de un cultivo de glía mixta. (B-D) Imágenes representativas de microscopio de campo claro de 10x de cultivo de glía mixta en el día 1 (B), el día 4 (C) y el día 8 (D). Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagrama del proceso de cultivo neuronal; Preparación e imágenes de células embrionarias de ratón en placas T25 de 96 pocillos.
Figura 2: Resumen del cultivo de neuronas primarias. (A) Diagrama de flujo de los pasos clave en la generación de neuronas. (B) Imágenes representativas de microscopio de campo claro de 10x que muestran neuronas cultivadas en matraces T-25. (C) Microscopio representativo de campo claro de 10x de neuronas cultivadas en una placa de 96 pocillos. (D) Microscopio representativo de campo claro de 10x de un grupo neuronal no saludable en una placa de 96 pocillos. Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Flujo de trabajo de aislamiento de microglía y análisis de microscopía; Las imágenes de inmunofluorescencia muestran marcadores celulares.
Figura 3: Descripción general del cocultivo microglía-neurona. (A) Diagrama de flujo de los pasos clave para el cocultivo microglía-neurona. (B) Imágenes representativas de microscopio de campo claro de 10x de cocultivo microglía-neurona en placas de 96 pocillos. Barras de escala: 100 μm. (C,D) Imágenes representativas de microscopía de inmunofluorescencia de neuronas solas (C), microglía sola (D), cocultivo de neuronas y microglía de día 2 (E), o cocultivo de neuronas y microglía de 12 días (F) en una placa de 96 pocillos. La microglía y las neuronas están marcadas con IBA-1 (rojo) y tubulina βIII (verde), respectivamente. Los núcleos se tiñen con DAPI (azul). Las imágenes de inmunofluorescencia se adquirieron utilizando un objetivo de inmersión en agua de 25x, 0,8 NA, con un microscopio de fluorescencia de campo amplio. Barras de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo describe un protocolo para aislar y cultivar neuronas primarias y microglía primaria de ratón, que posteriormente se utilizan para establecer un cocultivo microglía-neurona que se puede utilizar para estudiar cómo las interacciones de la microglía y las neuronas regulan su salud y función celular. Este enfoque relativamente simple y accesible puede proporcionar información crítica sobre los mecanismos y los resultados funcionales de las interacciones de las neuronas de la microglía en el SNC.

Para lograr un cocultivo óptimo, varios aspectos críticos de este protocolo requieren un cuidado adicional. Durante los aislamientos cerebrales (pasos 1.2.6 y 2.2.7), las meninges adheridas a la superficie del cerebro embrionario y postnatal deben eliminarse por completo antes de recolectar los tejidos. Al igual que otros protocolos de neuroglía, la extirpación incompleta de las meninges puede dar lugar a que el cultivo celular se contamine con células endoteliales o células derivadas de la sangre 40,41,42. Además, cuando se cultivan neuronas primarias (pasos 2.3.7 y 3.1.4), es crucial generar una suspensión unicelular y evitar los grupos celulares antes de sembrar las neuronas en matraces o placas de 96 pocillos. Los agregados neuronales no se adherirán correctamente en el cultivo y provocarán un estrés neuronal excesivo y la muerte celular. Además, el tratamiento prolongado de las neuronas con tripsina cuando se intenta disociarlas de los matraces T-25 puede causar la muerte celular no deseada (paso 3.1.2). Para mitigar esto, las neuronas pueden sembrarse directamente en placas de 96 pocillos a la densidad celular deseada después de la disociación de cerebros embrionarios (paso 2.3.7). Además, en este protocolo, se seleccionó una relación neurona:microglía 3:1 para representar parcialmente una cantidad elevada de microglía que puede estar presente en el microambiente del SNC durante la neuroinflamación. Alternativamente, la proporción de células en el cocultivo puede ajustarse según la necesidad experimental. Además, el punto de tiempo seleccionado para las neuronas de cocultivo puede extenderse si se pretende evaluar estados neuronales más maduros.

En particular, cuando se disocian neuronas de matraces T-25 a placas de 96 pocillos, el uso de tripsina sola puede resultar en una disociación incompleta y la formación de grupos celulares en lugar de un cultivo monocapa en placas de 96 pocillos (Figura 2D). Para abordar este problema, las neuronas se pueden disociar del matraz T-25 utilizando 1 solución de Versene que contiene 1 mg/ml de DNasa I. Otros factores que contribuyen a la agregación neuronal y a la reducción de la viabilidad son la trituración incompleta de la suspensión celular, la neutralización inadecuada de la tripsina con FBS inactivado por calor, la centrifugación excesiva o la formación prolongada de gránulos celulares. Por lo tanto, garantizar la disociación adecuada del tejido y la generación de una suspensión unicelular es fundamental para establecer un cocultivo saludable de microglía y neurona.

Este protocolo tiene como objetivo recapitular las interacciones microglía-neurona in vitro para comprender mejor la importancia funcional de sus interacciones en el SNC. Mientras que se han desarrollado otros tipos de sistemas de cocultivo, como el cultivo de poblaciones celulares individuales en diferentes superficies para permitir el tratamiento independiente de dos poblaciones celulares43,44, este sistema de cultivo mixto permite el contacto directo y cercano de la microglía y las neuronas. Además, cuando se mantiene adecuadamente a través de cambios de medio medio cada 3 días, este sistema de cultivo mixto puede permanecer saludable desde 12 días (Figura 3F) hasta potencialmente 3 semanas, lo que permite estudios a largo plazo de las interacciones neuronal-microglía45.

Si bien la relativa simplicidad del sistema de cocultivo es ventajosa para la accesibilidad, una limitación clave de este enfoque es que el cultivo celular bidimensional no representa completamente el entorno tisular del SNC. De hecho, se ha demostrado que un tricultivo de microglía, neuronas y astrocitos imita la respuesta neuroinflamatoria in vivo de forma más fiable que la microglía o el cocultivo astrocito-neurona46,47. Además, los desarrollos recientes en los sistemas de organoides cerebrales con microglía y otras células gliales, incluidos los astrocitos y los oligodendrocitos, son más adecuados para estudiar la arquitectura tisular tridimensional (3D) y las interacciones del SNC48. De manera similar, se ha demostrado que un sistema de tricultivo humano en 3D que comprende neuronas, microglía y astrocitos es eficaz para modelar la condición de la enfermedad de Alzheimer49. Otros cocultivos de microglía y neurona humana pueden ser fisiológicamente más relevantes para los estudios de enfermedades neurodegenerativas. Por ejemplo, el cocultivo de microglía y neuronas motoras derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas50 puede ser útil para el estudio de enfermedades como la esclerosis lateral amiotrófica51. Sin embargo, dada la abundancia relativa y el bajo costo de generar neuronas primarias y microglía a partir de ratones, la evaluación del cocultivo microglía-neurona en placas de 96 pocillos puede ser un enfoque de alto rendimiento para estudiar los mecanismos y las implicaciones funcionales de las interacciones microglía-neurona. Los ensayos posteriores pueden incluir el uso de imágenes de células vivas para determinar los cambios funcionales celulares en tiempo real, la secuenciación de ARN para determinar los cambios transcripcionales celulares, la microscopía de inmunofluorescencia para determinar los cambios fenotípicos celulares, la espectrometría de masas para determinar los cambios celulares y proteómicos, o el ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas y Western blot para medir las proteínas secretadas en el sobrenadante de cocultivo.

Dado que la microglía es un mediador importante de la salud y las enfermedades del SNC, este cocultivo también se puede utilizar para investigar el efecto de las moléculas y compuestos relacionados con la enfermedad en la comunicación bidireccional entre la microglía y las neuronas. En el contexto de la EM, la microglía activada puede asumir un papel destructivo, contribuyendo al empeoramiento de la patología 52,53. Por ejemplo, pueden segregar citoquinas proinflamatorias y especies reactivas de oxígeno, así como promover la activación de astrocitos45. Este protocolo puede ayudar a interrogar aún más el papel dañino de la microglía mediante el tratamiento de la microglía en el cocultivo con citocinas inflamatorias que se encuentran elevadas en la EM y la evaluación de los resultados de la salud neuronal. Alternativamente, este cocultivo microglía-neurona se ha utilizado para mostrar el efecto protector de la microglía sobre las neuronas en respuesta a la fosfatidilcolina oxidada, un producto oxidativo descubierto en MS54. Además, la apoptosis neuronal remodela la expresión génica de la microglía durante el desarrollo al promover la supervivencia y la fagocitosis de la microglía55. Por lo tanto, este protocolo también puede ayudar a determinar el impacto de la muerte neuronal en el fenotipo y la función de la microglía.

En resumen, este protocolo describe la generación y el cocultivo de neuronas primarias derivadas de ratones y microglía in vitro. El cocultivo de microglía y neuronas establecido en placas de 96 pocillos puede ser un enfoque de alto rendimiento para interrogar los mecanismos y la función de las interacciones de la microglía con las neuronas en el contexto de la salud y la enfermedad del SNC, incluida la EM.

Divulgaciones

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

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JP agradece el apoyo financiero del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá y la Facultad de Medicina de la Universidad de Saskatchewan. YD agradece el apoyo financiero del Fondo de Inversión de la Facultad de Medicina de la Universidad de Saskatchewan, la Subvención de Descubrimiento del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (RGPIN-2023-03659), la Subvención Catalyst de MS Canada (1019973), la Subvención de Establecimiento de la Fundación de Investigación en Salud de Saskatchewan (6368) y la Subvención de Investigación del Cerebro de Futuros Líderes en el Cerebro Canadiense de la Fundación Brain Canada. Las figuras 1A, 2A y 3A se crearon con BioRender.com.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de Petri de 10 cm Pescador 07-202-011Estéril
1x VerseneGibco15040-066
B-27 Plus Sistema de Cultivo Neuronal Gibco 
Microscopio de disecciónVWR
DNase IRoche11284932001
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11960-044
Suero fetal bovino ThermoFisher Sci12483-020
HBSS (10x)Gibco14065-056
HemacitómetroHausser Scientific1475
HEPES ThermoFisher Sci15630080
Leibovitz' s L-15 Medio (1x)Fisher Scientific 
Factor estimulante de colonias de macrófagos Peprotech315-02
Micro-PinzasRWDF11020-11Autoclave/Estéril
Aminoácidos no esencialesCytivaSH3023801
PBS (10x)ThermoFisher SciAM9625
Penicilina Estreptomicina Glutamina (100x)Gibco103780-16
Hidrobromuro de poli-L-ornitina SigmaP3655-100MG
Piruvato de sodio (100 mM)Gibco11360-070
Tijeras de resorteRWDS11008-42Autoclave/Estéril
Cuchilla quirúrgica Feather08-916-5DMatraces estériles
T-25Matraces Fisher10-126-9
T-75 matraces  Fisher13-680-65
Pinza de tejidoCodman30-4218esterilizadas en autoclave/estériles
RWDS12052-10Trypan azul esterilizado en autoclave/estéril
;Thermofisher Sci 15250-061
Tripsina (2,5%)ThermoFisher Sci
Zeiss
A365340121083027 Tijeras de tejido Microscopio de inmunofluorescencia de campo amplio 15090046

Referencias

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