Sintetizamos y caracterizamos un sustrato a base de gelatina sintonizable para el cultivo de células endoteliales vasculares (CE) en condiciones de flujo vascular relevantes. Esta superficie biomimética reproduce condiciones fisiológicas y patológicas, lo que permite el estudio de las fuerzas mecánicas sobre el comportamiento de la CE y avanza en nuestra comprensión de la salud vascular y los mecanismos de la enfermedad.
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Artículo de método
Modelo in vitro que integra la rigidez y el flujo del sustrato para estudiar las respuestas de las células endoteliales
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Resumen
Resumen
Presentamos un innovador modelo in vitro destinado a investigar los efectos combinados de la rigidez tisular y el estrés de cizallamiento en la función de las células endoteliales (CE), que son cruciales para comprender la salud vascular y la aparición de enfermedades como la aterosclerosis. Tradicionalmente, los estudios han explorado los impactos del esfuerzo cortante y la rigidez del sustrato en las CE, de forma independiente. Sin embargo, este sistema integrado combina estos factores para proporcionar una simulación más precisa del entorno mecánico de la vasculatura. El objetivo es examinar la mecanotransducción de la CE a través de varios niveles de rigidez tisular y condiciones de flujo utilizando CE humanas. Detallamos el protocolo para sintetizar hidrogeles de metacrilato de gelatina (GelMA) con rigidez sintonizable y sembrarlos con ECs para conseguir confluencia. Además, describimos el diseño y montaje de una cámara de flujo rentable, complementada con simulaciones de dinámica de fluidos computacional, para generar condiciones de flujo fisiológico caracterizadas por flujo laminar y niveles adecuados de esfuerzo cortante. El protocolo también incorpora el marcaje de fluorescencia para la microscopía confocal, lo que permite evaluar las respuestas de la CE tanto a la distensibilidad tisular como a las condiciones de flujo. Al someter las CE cultivadas a múltiples estímulos mecánicos integrados, este modelo permite realizar investigaciones exhaustivas sobre cómo factores como la hipertensión y el envejecimiento pueden afectar a la función de la CE y a las enfermedades vasculares mediadas por la CE. Los conocimientos obtenidos de estas investigaciones serán fundamentales para dilucidar los mecanismos subyacentes a las enfermedades vasculares y para desarrollar estrategias de tratamiento eficaces.
Introducción
El endotelio, que recubre la superficie interna de los vasos sanguíneos, desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la salud vascular. Las células endoteliales (CE) son fundamentales para regular diversas funciones cardiovasculares, incluyendo el control del tono de los vasos, la permeabilidad selectiva, la hemostasia y la mecanotransducción 1,2. La investigación ha relacionado firmemente la disfunción de la CE con un papel principal en el desarrollo de la aterosclerosis. En particular, las CE encuentran diversas fuerzas mecánicas en las interfaces donde interactúan con el flujo sanguíneo y los teji....
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Protocolo
1. Síntesis de GelMA
- Prepare una solución 0,2 M de carbonato de sodio anhidro y una solución 0,2 M de bicarbonato de sodio.
- Mezcle 46 mL de solución de bicarbonato de sodio con 15 mL de solución de carbonato de sodio y agregue 139 mL de agua desionizada (DI). Ajuste el pH a 9,5 utilizando 0,1 M de NaOH y HCl si es necesario.
- Añadir 10 g de gelatina tipo A de 300 floraciones de piel de cerdo a 100 mL de tampón de carbonato-bicarbonato a una concentración del 10% p/v.
- Disuelva la gelatina en un baño de agua a 55 °C mientras agita la solución a 700 rpm con un agitador magnético. Una vez que esté completamente disue....
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Resultados
La Figura 1 muestra la configuración experimental, describiendo el proceso de síntesis de GelMA a través de una reacción de metacrilación. El producto resultante se utilizó para fabricar el sustrato de hidrogel, sobre el que se sembraron las EC. Posteriormente, las células se introdujeron en la cámara de flujo para un experimento de flujo de 6 h a 12 dinas/cm2.
1Se utilizó espectroscopia de RMN H para evaluar el éxito de la reacción de metacr.......
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Discusión
El sistema vascular es un entorno dinámico en el que diversas fuerzas influyen significativamente en el comportamiento celular. Estudiar los eventos biológicos en las enfermedades cardiovasculares sin tener en cuenta estas fuerzas sería inexacto. Por lo tanto, los modelos celulares capaces de emular el entorno mecánico vascular son cruciales. Los investigadores ya han hecho progresos significativos en destacar el efecto de estas fuerzas en el comportamiento celular11. Sin embargo, para comprender .......
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Divulgaciones
Los autores declaran que se ha presentado una solicitud de patente provisional (Nº 63/634.853) con el título Cámara de flujo con un sustrato mecánicamente sintonizable, y que no existen otros intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Los autores extienden su gratitud a Robert Egan por su ayuda en la fabricación de la cámara de flujo. Los autores agradecen a Lucas McCauley por su ayuda durante los experimentos. Además, les gustaría agradecer a las instalaciones centrales del Instituto de Imágenes Químicas de Sistemas Vivos (CILS) de la Universidad Northeastern por permitir el acceso a los microscopios confocal. Los autores agradecen el apoyo financiero proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH 1R01EB027705 otorgado a SB) y la Fundación Nacional de Ciencias (NSF CAREER Awards: DMR 1847843 a SB y CMMI 1846962 a EE).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| (trimetoxisilil)metacrilato de propilo, tetrametiletilendiamina (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 Fabricación de | hidrogel |
| 3-(trimetoxisilil)Metacrilato de propilo | Sigma-Aldrich | 440159 | Salinización de vidrio |
| ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)-Medios de montaje que contienen Vector | Laboratories | H-1200 | Inmunotinción |
| Acetona | Thermo Fisher Scientifics | A18-4 | GelMA Síntesis |
| Alexa Fluor 555 Faloidina | Tecnología de señalización celular | 8953S | Inmunotinción |
| Persulfato de amonio (APS) | Bio-RAD | 1610700 | Fabricación de hidrogel |
| Lámina acrílica fundida transparente resistente a los arañazos y a los rayos UV (45/64'') | McMaster-CARR | 8560K165 | |
| Microscopio confocal | Carl Zeiss Meditex AG | Zeiss LSM 800 | Inmunotinción |
| Covidien Monoject Rigid Pack 60 mL Jeringas sin Agujas | Fisher | 22-031-375 Experimento de | flujo |
| Kit de crecimiento EC | Colección de cultivos tipo americano (ATCC) | PCS-100-041 | Etanol de cultivo celular |
| a prueba | de 200 Decon Labs | 2701 | Gelatina de salinización |
| de vidrio tipo A (300 flores) de piel porcina | Sigma-Aldrich | G1890 | GelMA Síntesis |
| Ácido acético glacial | Thermo Fisher Scientifics | 9526-33 | Salinización de vidrio |
| Silicona de alta pureza y alta temperatura Lámina | de caucho McMaster-Carr | 87315K74 | Fabricación de cámara de flujo |
| Células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) | Colección de cultivo tipo americano (ATCC) | PSC-100-010 | Cultivo celular |
| M3x30mm Tornillos de máquina Tornillo de cabeza redonda de zócalo hexagonal 304 Sujetadores de acero inoxidable Pernos 20 piezas Uxcell | B07Q5RM2TP | Fabricación de | |
| cámara de flujoAccionamiento digital Masterflex L/S con Easy-Load® 3 cabezales de bomba para tubos de precisión; Experimento | VWR | #MFLX77921-65 | VCA |
| Tubo de bomba de precisión Masterflex L/S, Puri-Flex, L/S 25; 25 pies | VWR | #MFLX96419-25 | Flow Experiment |
| Anhídrido metacrílico (MAH) | Sigma-Aldrich | 276685 | GelSíntesis |
| de MA Paraformaldehído | Thermo Fisher Scientifics | 043368.9M | Cultivo celular |
| salina tamponada con fosfato (PBS) | Gibco | 14080-055 | |
| General Bicarbonato de sodio | Fisher Chemical | S233-3 | GelMA Síntesis |
| Carbonato de sodio | Fisher Chemical | S263-500 | GelMA Synthesis |
| educativa de SOLIDWORKS SOLIDWORKS | |||
| Student Edition Desktop, 2023 | SolidWorks | N/A | Diseño de cámara |
| de flujo Medio basal vascular | Colección de cultivos de tipo americano (ATCC) | PCS-100-030 | Cultivo celular |
Referencias
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Suowen, X., et al. Endothelial dysfunction in atherosclerotic cardiovascular diseases and beyond: From mechanism to oharmacother....
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Reimpresiones y permisos
