Experimentos de relajación de RMN 15N para la investigación de la dinámica estructural de proteínas de picosegundos a nanosegundos

Resumen

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) puede caracterizar la dinámica estructural de proteínas de una manera específica para cada residuo. Proporcionamos un protocolo práctico para registrar la relajación de RMN ¹⁵N R₁ y R₂ y los experimentos de efecto Overhauser heteronuclear (hetNOE) de {¹H}-¹⁵N, sensible a la escala de tiempo de picosegundos a nanosegundos.

Resumen

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) permite estudiar proteínas en solución y a temperaturas fisiológicas. Con frecuencia, los grupos amida de la columna vertebral de la proteína o los grupos metilo en las cadenas laterales se utilizan como indicadores de la dinámica estructural de las proteínas. Un estudio de dinámica estructural de la columna vertebral de proteínas globulares en muestras marcadas con ¹⁵N y completamente protonadas generalmente funciona bien para proteínas con un peso molecular de hasta 50 kDa. Cuando se aplica la deuteración de cadena lateral en combinación con espectroscopia optimizada de relajación transversal (TROSY), este límite puede extenderse hasta 200 kDa para proteínas globulares y hasta 1 MDa cuando el foco está en las cadenas laterales. Cuando se investigan proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP) o proteínas con regiones intrínsecamente desordenadas (IDR), estas limitaciones de peso no se aplican, pero pueden ir mucho más allá. La razón es que los IDP o IDR, caracterizados por una alta flexibilidad interna, suelen estar desacoplados dinámicamente. Varios métodos de RMN ofrecen información de resolución atómica sobre la dinámica estructural de las proteínas en una amplia gama de escalas de tiempo, desde picosegundos hasta horas. Las mediciones estándar de relajación de ¹⁵N describen la flexibilidad interna de una proteína y caracterizan la dinámica de la columna vertebral de la proteína experimentada en la escala de tiempo rápida de picos a nanosegundos. Este artículo presenta un protocolo práctico para configurar y registrar experimentos de RMN ¹⁵N R₁, R₂ y de efecto Overhauser heteronuclear (hetNOE). Mostramos datos ejemplares y explicamos cómo interpretarlos de forma sencilla y cualitativa antes de cualquier análisis más sofisticado.

Introducción

La función de una proteína está determinada no solo por su estructura tridimensional, sino también por su dinámica estructural, que abarca su flexibilidad interna y las transiciones estructurales entre las diferentes conformaciones que adoptará la proteína. La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) puede investigar la dinámica estructural de las proteínas en la solución ^1,2,3. Los desarrollos recientes en RMN de estado sólido detectada por protones también permiten la caracterización de la dinámica de proteínas en un estado menos soluble, como, por ejemplo, una membrana de bicapa lipídica ^4,5,6. En la RMN en solución, se puede estudiar la dinámica estructural de la columna vertebral de la proteína y las cadenas laterales de la proteína. Para una proteína globular, se puede lograr un estudio de dinámica estructural de la columna vertebral de la proteína hasta 50 kDa una vez que la proteína está marcada isotópicamente con ¹⁵N. Cuando se emplea la deuteración de cadena lateral y la espectroscopia optimizada de relajación transversal (TROSY), este límite puede extenderse hasta 200 kDa ^7,8. Cuando la atención se centra en la dinámica de la cadena lateral, la gama de proteínas y complejos accesibles puede ampliarse hasta 1 MDa ^2,9.

Las limitaciones de peso mencionadas no se aplican a las proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP), que con frecuencia muestran una alta dinámica intrínseca. Más del 30% del proteoma eucariota está compuesto por IDPs o regiones intrínsecamente alteradas (IDRs)10,11,12,13. Desempeñan un papel central en muchos procesos celulares, como la transducción de señales y la transcripción¹, y frecuentemente están implicados en la separación de fases intracelulares 14,15,16,17. Los desplazados internos carecen de una estructura nativa tridimensional (3D) bien definida en condiciones fisiológicas y tienen un paisaje energético débilmente canalizado o accidentado^17,18. Debido a una baja hidrofobicidad y una fuerte repulsión electrostática distribuida sobre la columna vertebral de los IDP o IDR, falta una fuerza motriz para plegarse a una estructura rígida¹⁹. Con frecuencia, los PIC adoptan una conformación plegada cuando se componen con otros socios de unión 10,20,21. Además, las modificaciones postraduccionales (PTM) amplían las posibilidades de plegamiento de los IDP o IDR^22,23. El mal plegamiento de los desplazados internos ha sido identificado como causa de diversas enfermedades, incluidas las neurodegenerativas 15,24,25,26.

Los IDP y los IDR muestran una gran flexibilidad interna 21,27,28. Los conjuntos conformacionales que muestran la variación de las posiciones atómicas y los ángulos diedros se derivaron de simulaciones de dinámica molecular y restricciones obtenidas a partir de datos experimentales 29,30,31,32. Debido a la dinámica y al desorden resultante en el estado congelado, la densidad difusa de electrones dificulta su caracterización estructural utilizando métodos de última generación en biología estructural, como la crio-EM o la cristalografía de rayos X. Además, las condiciones de cristalización o las técnicas de preparación de muestras para experimentos a temperaturas criogénicas pueden afectar el espacio conformacional experimentado por los desplazados internos. Sin embargo, la solución de RMN funciona bien para proteínas altamente dinámicas y, por lo tanto, es adecuada para investigar las IDP 16,20,22,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38.

Como se presentó anteriormente, la RMN en solución ofrece varias técnicas para estudiar la dinámica interna de las proteínas en una amplia gama de escalas de tiempo (Figura 1), basadas principalmente en la relajación del espín 31,33,38,39,40,41,42.

La relajación del espín de los ^{núcleos 15}N en los grupos amida de la columna vertebral de la proteína es inducida por cambios en la orientación del ángulo de enlace ¹H-15 N debido a la dinámica interna de la proteína y a los movimientos colectivos (incluida, cuando corresponda, la difusión rotacional)27,43,44,45,46,47,48,49,50,51 . A escalas de tiempo más cortas que el tiempo de correlación rotacional τ_R (el tiempo que la molécula necesita para rotar un radiante, también denominado tiempo de correlación de caída general), la anisotropía por desplazamiento químico (CSA) y el acoplamiento dipolar (D) están activos y no promediados por la difusión rotacional de la proteína. La dinámica interna de la columna vertebral de la proteína, que comprende variaciones en los ángulos de enlace, reorientaciones de enlaces y volteretas rotacionales, induce fluctuaciones estocásticas del CSA y el tensor de acoplamiento dipolar, lo que resulta en una variación del campo magnético local, lo que finalmente conduce a la relajación del espín de la RMN 47,48,52,53. Estas fluctuaciones pueden describirse mediante una función de correlación global. La transformada de Fourier de la función de correlación general se denomina función de densidad espectral. En la teoría semiclásica de la relajación de Redfield, las constantes de la tasa de relajación de la RMN se pueden describir mediante combinaciones lineales de estas funciones de densidad espectral⁵⁴.

Los experimentos de relajación de RMN ^{de 15}N de la columna vertebral desarrollados a principios de la década de 1990 comprenden experimentos de efecto Overhauser nuclear de ¹⁵N R₁, R_1ρ y {¹H}-¹⁵N, sensibles a la escala de tiempo de picosegundos (ps) nanosegundos (ns) rápidos, más rápido que el tiempo de correlación rotacional τ_R de la proteína 45,55,56,57. Para caracterizar la dinámica de la columna vertebral más lenta que el tiempo de correlación rotacional τ_R, se utilizan los llamados experimentos de dispersión de relajación, R_1ρ, y los experimentos de Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) sensibles a la dinámica de microsegundos (μs) - milisegundos (ms) 44,46,58,59,60,61. La dinámica más lenta que microsegundos puede ser capturada por RMN de transferencia de saturación de intercambio químico (CEST) de ¹⁵N⁶², espectroscopía de intercambio (EXSY, milisegundos a segundos) o RMN en tiempo real (RT) (segundos a horas)^63,64. El efecto PRE (mejora de la relajación paramagnética) de las sondas paramagnéticas, así como de los acoplamientos dipolares residuales (RDC), se puede utilizar para evaluar todo el rango de dinámicas de ps a ms 65,66,67,68.

Figura 1: Escalas de tiempo de la dinámica de la columna vertebral de proteínas y ventana de tiempo sensible de diferentes experimentos de dinámica de RMN. La RMN ofrece una variedad de métodos para caracterizar la dinámica de la columna vertebral de proteínas en una amplia gama de escalas de tiempo. Los diferentes movimientos experimentados por la columna vertebral de la proteína se indican en sus respectivas escalas de tiempo. El tiempo de correlación rotacional de la proteína, τ_R, es el tiempo que la proteína necesita para una rotación general (en un radiante). Los movimientos más rápidos que el tiempo de correlación rotacional de la proteína, τ_R, pueden asociarse con la flexibilidad interna de la proteína. Debajo de la flecha se indican varios experimentos de RMN y su sensibilidad a las escalas de tiempo respectivas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El siguiente protocolo describe la configuración de los experimentos de relajación de RMN de Lakomek et ^al.69 y Stief et ^al.70, utilizando un esquema de detección de coherencia cuántica única (HSQC) heteronuclear con sensibilidad mejorada. Antes de proceder a la implementación experimental, se ofrece una breve descripción general de la relajación del espín de RMN y los experimentos de relajación de RMN. Debido a las restricciones de tamaño y para mantener la comprensión de este protocolo, esta descripción general debe seguir siendo simplista (y, por lo tanto, incompleta).

La relajación longitudinal o de espín-red, caracterizada por el tiempo T₁ o la constante de velocidad R₁ = 1/ T₁ , describe el retorno de la magnetización al equilibrio de Boltzmann. En equilibrio, la magnetización se alinea a lo largo del eje del campo magnético exterior, que define el eje z del marco del laboratorio. Las densidades espectrales a frecuencias de Larmor altas (¹H) y pequeñas (¹⁵N) (las frecuencias de resonancia de RMN, por ejemplo, 600 MHz para ¹H para un imán de 14,1 Tesla) y las combinaciones lineales de estas frecuencias de Larmor contribuyen a la relajación de ¹⁵N R₁ , que se caracteriza por las constantes de velocidad de ¹⁵N R₁ medidas en rad·^s-1. Los movimientos en escalas de tiempo son inversos a estas frecuencias de Larmor; por lo tanto, los movimientos en la escala de tiempo de picosegundos a nanosegundos contribuyen a la constante de tasa de relajación R₁. Para las moléculas que muestran un volteo general y donde se puede definir un tiempo de correlación rotacional, la curva R₁ (T₁) muestra un máximo (mínimo) para ωτ_R = 1, con la correlación rotacional τ_R y la frecuencia de Larmor ω del espín bajo consideración. Si contribuyen varias frecuencias de Larmor, la que tiene la frecuencia más baja es la dominante, por ejemplo, ω_N en el caso de ¹⁵N R₁. El régimen de movimiento rápido (ωτ_R, mucho menor que 1) se aplica a moléculas pequeñas que giran muy rápido y para campos magnéticos bajos y baja viscosidad. El régimen de cámara lenta (ωτ_R mucho mayor que 1) es válido para moléculas más grandes que giran más lentamente y para campos magnéticos altos y alta viscosidad.

Las proteínas globulares plegadas muestran un volteo general en solución, y se puede asignar un tiempo de correlación rotacional. Sin embargo, el concepto de volteo general ya no es válido para proteínas intrínsecamente desordenadas y con frecuencia difiere de la asignación de un solo tiempo de correlación rotacional. Aquí, el tiempo de correlación interna específico del residuo se vuelve más crítico.

La secuencia de pulsos descrita que mide frecuencias de relajación de ¹⁵N R₁ (Figura 2) se basa en un experimento de lectura HSQC con sensibilidad mejorada con una detección de eco/antieco para la detección en cuadratura^69,70,71. Se utilizan gradientes cortos con fuerza y longitud variables para la selección de la coherencia y la mejora de la supresión del agua⁷⁰. Durante ese tiempo, la polarización longitudinal de ¹⁵N se relajará. Los tiempos de decaimiento más largos conducen a intensidades reducidas en los planos 2D asociados de este espectro pseudo-3D (los puntos de datos de retardo se registran en la tercera dimensión). Un elemento de bucle, que se describe a continuación, se ejecuta un número creciente de veces para tiempos de relajación más largos. Dado que la relajación correlacionada entre la anisotropía de desplazamiento químico (CSA) de ¹⁵N y el acoplamiento dipolar de ¹H y ¹⁵N (D) también está activa durante el retardo de relajación, es necesario un pulso central de 180° I-BURP-2⁷², selectivo en los protones amida, para reenfocar la contribución mediante la relajación correlacionada cruzada (que si no se reenfoca conduciría a constantes de velocidad ¹⁵N R₁ sesgadas y erróneas).

Figura 2: Esquemas de secuencia de pulsos de RMN para determinar las constantes de la tasa de relajación de RMN. (A) ¹⁵N R_1ρ, (B) ¹⁵N R₁ y (C) experimento hetNOE, utilizando un esquema de lectura HSQC de sensibilidad mejorada^69,70. Los pulsos de 90°(x) se visualizan mediante rectángulos estrechos y los pulsos de 180°(x) mediante rectángulos anchos, a menos que se indique lo contrario. Se aplica el siguiente ciclo de fase: φ₆ = y, y, -y, -y; φ₇ = y, -y, φ_rec = y, -y, -y, y. La detección de cuadratura se logra invirtiendo la polaridad del gradiente G5 y el ciclo de fase de φ7 (detección de eco / anti-eco). (A) ^{Experimento de 15}N R_1ρ: El rectángulo negro representa el espín-bloqueo, para el cual la duración varía hasta adquirir diferentes retrasos de relajación. Los triángulos antes y después del bloqueo de espín indican los pulsos de forma adiabática que alinean la magnetización a lo largo del eje del campo magnético efectivo B_eff. G₁₀ es un gradiente opcional para evitar la amortiguación de la radiación de la magnetización del agua durante la fase de evolución. (B) ^{Experimento de 15}N R₁: La parte entre paréntesis muestra el elemento de bucle de la secuencia, repetido un número n de veces para que coincida con el retardo de relajación deseado. (C) El esquema de impulsos hetNOE es similar a la segunda mitad de los esquemas de impulsos R₁ y R_1ρ, es decir, el tiempo de evolución t₁ y el elemento de detección HSQC. Sin embargo, la magnetización de ¹⁵N se excita directamente sin ningún INEPT. La saturación de la magnetización del protón (para lograr una relajación cruzada entre ¹H y ¹⁵N) se logra mediante un tren de pulsos de 180 (¹H) aplicados durante al menos 5 s. Para el experimento de referencia se aplica un retardo en reposo de las mismas longitudes (en este caso, 5 s) sin ningún tren de impulsos. G₅ es un gradiente opcional para evitar la amortiguación de la radiación, y la inversión de la polaridad del gradiente G4, en combinación con la fase φ7 = y, -y, -y, y, logra la detección de cuadratura. Los pasos de transferencia de magnetización, representados por operadores de producto, están marcados en rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La constante de velocidad de relajación R₂ describe la relajación de la polarización transversal (en el plano xy ortogonal al campo magnético externo) debido a la pérdida de coherencia de fase entre el espín, lo que conduce a la desintegración de la magnetización detectable^53,54. La función de densidad espectral a frecuencias altas y pequeñas contribuye a R₂, similar a R₁. Sin embargo, la mayor contribución a R₂ se origina en la densidad espectral a frecuencia cero. Por esta razón, R₂ es muy sensible al volteo rotacional, descrito por el tiempo de correlación rotacional τ_R, que es del orden de unos pocos ns para una pequeña proteína globular a temperatura ambiente. Por lo tanto, los movimientos más lentos de la columna vertebral en el régimen de cientos de ps a ns bajos son los que más contribuyen. La dinámica de intercambio de la columna vertebral que provoca una modulación de la parte isótropa del tensor de desplazamiento químico de los ^{núcleos 15}N, en principio, añade una contribución de intercambio R_2ex a las constantes de velocidad R₂ 43,44,49,60,61. En los experimentos descritos, la contribución de R_2ex es suprimida por un bloqueo de espín que reenfoca la dinámica más lentamente que la frecuencia circular inversa del bloqueo de espín. El bloqueo de espín es un pulso de radiofrecuencia de onda continua larga que mantiene la magnetización alineada a lo largo del eje del campo magnético efectivo B_eff (la suma vectorial del campo ω₁ de bloqueo de espín y el desplazamiento químico de la frecuencia portadora de ¹⁵N (ver más abajo)). La relajación de la magnetización alineada a lo largo del eje B_1,eff se denomina relajación R_1ρ, que tiene un componente R₁ y un componente R₂. Usando la fórmula (1), R₂ se puede calcular a partir de R_1ρ y R₁^44,73:

(1).

El ángulo entre el eje del campo magnético efectivo B_eff y el campo magnético externo B₀ es . ω₁ es la amplitud de RF del bloqueo de espín y Ω el desplazamiento químico entre el desplazamiento químico de ¹⁵N del residuo correspondiente y la frecuencia portadora de ¹⁵N ^44,73.

El esquema de impulsos R_1ρ (Figura 2A, ⁷⁰) es muy similar al esquema ¹⁵N R₁ , excepto por el retardo de relajación. Para medir las tasas de relajación de ¹⁵N R_1ρ , el bloqueo de espín debe estar activo después de que la magnetización se haya alineado a lo largo del eje de campo efectivo B_eff mediante un pulso adiabático con la misma amplitud de radiofrecuencia (RF) que el bloqueo de espín. La duración del spin-lock se variará para obtener los diferentes retrasos de relajación.

El efecto Overhauser nuclear en estado estacionario {¹H}-¹⁵N (^{1 H-15}N NOE), denominado hetNOE en lo sucesivo, es la relación entre la tasa de relajación cruzada y la tasa de relajación longitudinal de ¹⁵N. Conduce a una reducción de la polarización de estado estacionario en ¹⁵N debido a la relajación cruzada con el protón tras la saturación de la polarización del protón 45,53,54,74,75. La relajación cruzada depende de las funciones de densidad espectral de la suma y diferencia ^{de las}frecuencias de Larmor 1 H y ¹⁵N. Por lo tanto, el hetNOE es sensible tanto a la dinámica de picosegundos rápidos (< 100 ps) como a la dinámica ps-ns (debido a su dependencia de R₁). La secuencia⁶⁹ (Figura 2C) se basa en una lectura HSQC de sensibilidad mejorada con gradientes Echo/Anti-Echo para la detección en cuadratura. Para la saturación de la magnetización de protones y el hetNOE resultante, la magnetización de protones de equilibrio se invierte y posteriormente se satura mediante pulsos de 180° que pulsan rápidamente durante aproximadamente 5 veces los ¹⁵ N T₁. Para el experimento de referencia, el retardo de recuperación es igual al retardo de saturación, pero sin el tren de pulsos de ¹H 180°. Se añade un retardo adicional de D1 = 2 s para el experimento de referencia y el que tiene una saturación de ¹H. Ambos experimentos se registran de forma consecutiva y difieren solo en la aplicación de pulsos de ¹H 180° (saturación) o no (referencia). La relación de las intensidades espectrales registradas en el experimento con una saturación de ¹H dividida por las intensidades del experimento de referencia (sin el tren de impulsos de protones de 180°) da el valor de {¹H}-¹⁵N NOE (hetNOE).

El siguiente protocolo describe la configuración de los experimentos de relajación por RMN de Lakomek et ^al.69 y Stief et ^al.70. Nos centramos en las secuencias de pulsos de RMN utilizando un esquema de detección HSQC de sensibilidad mejorada. Los experimentos ¹⁵N R₁ y R_1ρ se implementan como se describe en detalle por Stief et al.70, y el experimento hetNOE es descrito por Lakomek et ^al.69.

Protocolo

1. Preparación de la muestra de RMN

NOTA: El marcaje de isótopos de las proteínas se realiza para experimentos de RMN de dimensiones superiores y RMN avanzada. Cuando la expresión de proteínas en E. coli y la purificación de proteínas se han establecido utilizando medios ricos (por ejemplo, Luria-Bertani [LB] o medio de triptona de extracto de levadura 2x [2YT]) con un rendimiento de varios miligramos por litro, la preparación de una muestra de RMN marcada isotópicamente suele ser relativamente sencilla.

1. Para el marcaje de isótopos, utilice medios mínimos M9 para la expresión génica, donde el cloruro de amonio ¹⁵N es la única fuente de nitrógeno y la glucosa enriquecida con ¹³C es la única fuente de carbono.
2. Para la purificación de proteínas, siga el protocolo estándar establecido en el laboratorio para la proteína respectiva.
   NOTA: La sección de resultados muestra resultados representativos para un IDP, la proteína SNARE monomérica Sinaptobrevin-2 (1-96). El marcaje de isótopos de RMN de sinaptobrevina-2 se ha realizado como se describe en⁷⁰. Para mediciones de muy alta precisión, se recomienda utilizar concentraciones bajas de_D2O, inferiores al 5%. Esto se debe al efecto del isótopo de deuterio, que se puede observar en los experimentos de dispersión de relajación de ^{Hahn-Echo 15}N T₂ y en los experimentos de dispersión de relajación de ¹⁵N CPMG de baja frecuencia (no discutidos aquí), pero tiene solo un impacto mínimo en los experimentos de ¹⁵N R_1ρ (donde se reenfoca principalmente)⁷⁶.

2. Preparativos para la ejecución de los experimentos de relajación de RMN en el espectrómetro

NOTA: Los experimentos de relajación de RMN descritos son específicos para los espectrómetros Bruker. Han sido probados en sondas de triple resonancia criogénicas y a temperatura ambiente ^{de 1}H, ¹⁵N y ¹³C y consolas Avance III y Avance Neo operadas por el software Bruker Topsin 3.6 o superior.

1. Siga las precauciones.
   1. Haga una sesión informativa de seguridad antes de trabajar en el espectrómetro de RMN.
   2. Compruebe las especificaciones de potencia de la sonda del espectrómetro utilizado y elija una longitud de pulso y una potencia de pulso adecuadas para cada pulso, por ejemplo, comparando la consistencia con las entradas de la tabla "prosol" de Topspin.
2. Importe las secuencias de pulsos.
   1. Descargue los programas de pulso de RMN desde el sitio web que se indica a continuación o desde el repositorio extendido del Banco de Resonancia Magnética Biológica (BMRB) (bmrbig102) en el directorio /opt/topspin4.1.4/exp/stan/nmr/lists/pp/user de la computadora que opera el espectrómetro de RMN. Ajuste la versión topspin (aquí: topspin4.1.4 a la versión respectiva instalada en el espectrómetro).
   2. Descargue los pulsos en forma de RMN desde el sitio web que se indica a continuación o desde el repositorio extendido del Banco de Resonancia Magnética Biológica (BMRB) (bmrbig102) en el directorio /opt/topspin4.1.4/exp/stan/nmr/lists/pp/user de la computadora que opera el espectrómetro de RMN. Ajuste la versión topspin (aquí: topspin 4.1.4 a la versión respectiva instalada en el espectrómetro).
3. Calibrar el espectrómetro y la muestra.
   1. Establezca la temperatura de interés. Para la calibración de la temperatura, aplique los protocolos de la instalación. Por ejemplo, utilice una muestra de metanol-d4 e interprete la diferencia de desplazamiento químico observada utilizando el termómetro de RMN de la aplicación web (https://chem.ch.huji.ac.il/nmr/software/thermometer.html); Véase también⁷⁷.
   2. Inserte la muestra (más un 5% adicional D₂O para el bloqueo) y espere aproximadamente 10 minutos para permitir que la muestra equilibre su temperatura. Bloquee la señal de deuterio (²H) (comando: bloquear, seleccione H₂O+D₂O).
   3. Haga coincidir y sintonice los canales ¹H, ¹⁵N y ¹³C, por ejemplo, utilizando la rutina atma o atmm. Si no hay instalada una unidad de ajuste y ajuste automático, haga coincidir y ajuste manualmente la sonda con el comando wobb.
   4. Realice el calzado para un campo B₀ homogéneo, por ejemplo, utilizando la rutina topshim tg.
4. Calibra la longitud del pulso de 90° (¹H).
   1. Usa el experimento zg. Utilice getprosol para importar los parámetros de la sonda. Elija una duración corta de 5 μs para P1. Compruebe y corrija el nivel de potencia especificado de la sonda para PLW1 si es necesario.
   2. Comienza el experimento con zg. Procese los datos con efp. Ajuste la fase con .ph de modo que la línea de base es uniforme y la señal de RMN de la resonancia del agua está en fase.
   3. Estime un pulso de 360° (¹H) tomando un pulso común o aproximado de 90° (¹H) (por ejemplo, de las especificaciones del espectrómetro enumeradas) y multiplicándolo por un factor de cuatro. Ejecute el experimento y procéselo.
      NOTA: La duración elegida es demasiado larga si la señal es positiva y demasiado corta si es negativa. El pulso de 360° (¹H) será el paso por cero.
   4. Ajuste la longitud del pulso en consecuencia. Hazlo de forma iterativa para encontrar el cruce por cero. Divide el valor obtenido por cuatro. Ese será el pulso de 90° (¹H).
      NOTA: Una alternativa al método 360° descrito es la rutina pulscal , que se puede iniciar desde la línea de comandos y permite una calibración automatizada de ^{pulsos de 1}H.
5. Calibrar la frecuencia portadora O1 a la resonancia del agua.
   1. Copie el experimento zg escribiendo edc en la línea de comandos a un nuevo número de experimento. Escriba rpar para abrir los conjuntos de parámetros (Figura complementaria 1A).
   2. Busque el conjunto de parámetros ZGPR. Haga clic en el conjunto de parámetros ZGPR (Figura complementaria 1A), haga clic en Leer, elija Ejecutar "getprosol" y haga clic en Aceptar (Figura complementaria 1B).
   3. Cambie P1 a la longitud de pulso calibrada de 90° (¹H). Elija una longitud de saturación de D1 = 2 s y una potencia de pulso de PLW9 de 50 dB. Ajuste la ganancia del receptor (rg) a 16. Alternativamente, ejecute el ajuste de ganancia del receptor escribiendo rga y ajustando la ganancia del receptor al valor especificado (pero evite el "desbordamiento de ganancia del receptor").
   4. Escriba gs en la línea de comandos para iniciar una adquisición repetida y continua. Vaya a la ventana de adquisición y cambie el O1 para reducir el área FID dominada por la señal de agua (Figura complementaria 2).
   5. Haga clic debajo del marcador para disminuir el O1 y haga clic encima del marcador para aumentarlo. Utilice el botón de sensibilidad para cambiar el tamaño del paso. Guarde el O1 actual; Close detiene la adquisición repetida (Figura complementaria 2).
6. Calibra la longitud de pulso de 90° (¹⁵N).
   1. Copie el experimento zg en un nuevo número de experimento (escriba edc). Escriba rpar para leer el conjunto de parámetros HSQCFPF3GPPHWG para cambiar el programa de pulsos a un experimento HSQC de ^{1 H-15}N. Utilice la opción Mantener los parámetros P1, O1 y PLW1 (figura complementaria 1).
   2. Escriba getprosol 1H 1H) en μs> <90° (¹H) fuerza de pulso en db> en la línea de comandos para importar los parámetros de la sonda. Establezca el número de exploraciones (NS) en 8 y las exploraciones ficticias (DS) en 2.
      NOTA: < > especifica aquí los valores que se van a establecer. Por ejemplo: getprosol 1H 8.5 -11.79.
   3. Ejecute el primer incremento del experimento escribiendo zg en la línea de comandos. Copie el primer incremento en un nuevo número de experimento con rser 1 . Procese los datos con efp y phase el espectro con .ph. Utilice el primer incremento (experimento 1D) del experimento para los siguientes pasos.
      NOTA: El < > especificar el número elegido para el nuevo experimento, por ejemplo, rser 1 101.
   4. Escriba ased en la línea de comandos para abrir los parámetros de secuencia de pulsos del experimento 1D. Haga clic en la E en la línea PULPROG (ver Figura complementaria 3A) para abrir el editor de programas de pulsos.
   5. Utilice el siguiente flujo de trabajo para guardar la secuencia de pulsos con un nuevo nombre: haga clic en Archivo (esquina superior izquierda), Guardar como, introduzca el nuevo nombre y haga clic en Aceptar. A continuación, haga clic en Establecer PULPROG en el conjunto de datos (consulte la Figura complementaria 3B) y haga clic en Aceptar.
   6. Modifique la secuencia HSQC original de ^{1 H-15}N (guardada con un nuevo nombre, véase 2.6.4.) multiplicando los 90° (¹⁵N) después del período de evolución t₁ (antes de la transferencia inversa) por un factor de 2 (el pulso de 90° (¹⁵N) es ahora 180° (¹⁵N)). Presione Ctrl S para guardar la secuencia de pulsos. Ajuste la longitud del pulso a 90° (¹⁵N) (P21) para que la señal de RMN del primer incremento se desvanezca (en el cruce por cero) (Figura suplementaria 3B).
   7. Abra el experimento HSQC ^{1 H-15}N (experimento 2D) e introduzca la longitud de pulso calibrada de 90° (¹⁵N) (P21). Tipo getprosol 1H ¹H) en μs> <90° (¹H) fuerza de pulso en db> 15N ¹⁵N) longitud de pulso en μs> <90° (¹⁵N) fuerza de pulso en db> en la línea de comandos.
7. Determinar los anchos espectrales y la apropiación de los tiempos de adquisición.
   1. En la ventana de parámetros de adquisición para el experimento HSQC ^{1 H-15}N (escriba eda en la línea de comandos), ajuste la anchura espectral (parámetro de adquisición SW) y el número de incrementos de dimensión en dimensiones directas e indirectas (parámetro de adquisición TD).
      1. Elija para SW, 16 ppm en la dimensión directa (¹H) y 30 ppm en la indirecta (¹⁵N). Elija TD, 2048 en la dimensión directa (¹H) y 512 en la dimensión indirecta (¹⁵N).
   2. Adquiere el experimento HSQC ^{1 H-15}N.
      1. Compruebe que se detectan todas las señales de interés y que no hay artefactos de aliasing en el espectro. Cambie el O3P si el centro del espectro no encaja con el centro de la distribución de la señal de proteína a lo largo del eje ¹⁵N.
      2. Aumente el SW si la ventana espectral es demasiado pequeña. Aumente el TD para obtener una resolución FID más alta (consulte las especificaciones de la sonda para conocer la duración máxima del desacoplamiento).
         NOTA: Esta es la configuración general y el punto de partida para la configuración de los experimentos de relajación de RMN. Se recomienda registrar el experimento HSQC ^{1 H-15}N al principio y al final de todo el conjunto de experimentos y, para tiempos experimentales más prolongados, también en el medio para monitorear la integridad de la muestra.

3. Implementación de los experimentos de relajación por RMN

NOTA: Las secuencias de pulsos de relajación de RMN (Figura 2) están disponibles en https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences o en el repositorio ampliado del Banco de Resonancia Magnética Biológica (BMRB) (bmrbig102).

1. Configura el archivo ¹⁵N R_1ρ experimento.
   1. Copie el experimento HSQC (tipo edc) en un nuevo directorio. Escriba ased y cambie el programa de impulsos al experimento ¹⁵N R_1ρ haciendo clic en los tres puntos de la línea de parámetros PULPROG en los parámetros de la secuencia de impulsos (véase la figura complementaria 3A). Haga doble clic en el programa de pulsos, haga clic en Establecer PULPROG en el conjunto de datos (consulte la Figura complementaria 3B) y haga clic en Aceptar.
      NOTA: Pueden aparecer algunos mensajes de error. Cierre estos mensajes.
   2. Escriba gpnam en la línea de comandos para insertar todas las formas de degradado que faltan (gpnam1- gpnam9) como se describe en la secuencia de pulsos (Figura complementaria 4).
   3. Escriba vplist en la línea de comandos. Haga clic en los tres puntos (Figura complementaria 5A), Archivo (esquina superior izquierda) y Nuevo (Figura complementaria 5B).
   4. Escriba un nombre para una nueva vplist ficticia y presione OK. Cree la vplist ficticia (5 m, 65 m, 25 m, 45 m, 15 m, 55 m, 35 m, 10 m; una nueva fila para cada entrada de vplist). Presione Ctrl S para guardar la lista y cerrar la ventana de la vplist (Figura complementaria 5C).
   5. Haga doble clic en el nombre de la vplist recién creada (Figura complementaria 5B).
      NOTA: Esto es necesario para evitar errores de compilación en la secuencia de pulsos. Las entradas apropiadas de la vplist se determinarán más adelante (punto 3.1.29.).
   6. Escriba ased para abrir los parámetros de la secuencia de pulsos (Figura complementaria 6). Introduzca todas las intensidades de gradiente y las longitudes de gradiente que faltan, tal como se indican en la secuencia de pulsos (Figura complementaria 6D).
   7. Introduzca para el contador de bucle L₃ (número de puntos complejos en la dimensión indirecta) 1/2 de la entrada TD de ¹⁵N en la ventana de parámetros de adquisición (eda). Introduzca para el contador de bucles L₆ el número de puntos de datos de relajación registrados utilizados para ajustar la curva de relajación.
      NOTA: Este número L₆ corresponde al número de entradas vplist, aquí: 8 (Figura complementaria 6A).
   8. Establezca el pulso adiabático TanhTan_half.nl, descargado del sitio web especificado anteriormente, como la forma del pulso ¹⁵N SP8. Ajuste el pulso adiabático TanhTan_2nd.nl del sitio web como la forma del pulso ¹⁵N SP9 (Figura complementaria 6C).
   9. Ajuste la entrada P8 a la longitud del pulso TanhTan adiabático, lo suficientemente largo como para garantizar la adiabaticidad del pulso; aquí se elige P8 = 3000 μs (Figura suplementaria 6C).
   10. Establezca el desacoplamiento ^{de 15}N (CPDPRG 3) en un esquema de desacoplamiento garp. Utilícelo para la longitud de desacoplamiento PCPD3 200 μs (Figura complementaria 6C).
   11. Establezca el retardo de recuperación entre exploraciones en al menos D1 = 2 s o más.
       NOTA: Para la elección de un retraso de recuperación adecuado, consulte la sección Discusión.
   12. Establezca los escaneos ficticios (DS) en al menos 64 para el experimento final (durante la configuración, DS = 4 es suficiente por razones de tiempo). Como punto de partida, utilice un número de exploraciones (NS) de 4; utilice múltiplos de 4 si la relación señal-ruido (SNR) es demasiado baja (Figura suplementaria 6A).
   13. Ajuste el O1 a la frecuencia portadora calibrada del paso 2.5. Ajuste el O2P a 176 ppm y copie el O3P del experimento ^{HSQC 1 H-15}N (Figura suplementaria 6A-C).
   14. Ajuste la longitud de pulso P7 a la longitud de pulso de 90° (¹⁵N) calibrada en el paso 2.6. Además, copie el nivel de potencia del pulso de 90° (¹⁵N) del paso 2.6 a PLW3 y PLW7 (Figura complementaria 6C).
   15. Ajuste la longitud de pulso P1 y P19 a la longitud de pulso de 90° (¹H) calculada en el paso 2.4. (Figura complementaria 6B).
   16. Establezca el número de incrementos en la dimensión indirecta TD = l₃ * 2 * l₆ (eda o escriba td en la línea de comandos).
       NOTA: Todos los parámetros de la secuencia de pulsos descritos aquí se anotan adicionalmente en la secuencia de pulsos.
   17. Establezca el pulso de forma SP5 en una forma I-BURP2 (Iburp2.1000). Ajuste la longitud del pulso P15 a 2000 μs. Abra la pantalla de la herramienta de forma haciendo clic en la E junto al pulso de forma I-BURP2 en la ventana de parámetros de secuencia de pulso Topspin (ased) (Figura complementaria 6B).
   18. Simule el pulso de forma con la longitud correcta haciendo clic en el botón Iniciar simulación de RMN. Compruebe la longitud del pulso con forma [μs] (= 2000 μs) y el ángulo de rotación [°] (= 180°) en la ventana de simulación. Haga clic en Iniciar RMN-SIM (Figura complementaria 7A).
   19. Verifique el rango de excitación y elija la longitud de pulso I-BURP2 adecuada para cubrir la dispersión espectral de ¹H de la proteína, pero evite la excitación del agua al mismo tiempo. Establezca P15 en la longitud de pulso con forma de la ventana de simulación con el mejor pulso IBURP-2 simulado (Figura complementaria 7B).
       NOTA: Se elige la longitud adecuada si el I-BURP2 excita (> un 95% de efectividad) toda la región amida. Para simular un pulso I-BURP2 con una longitud diferente, cierre la ventana del perfil de excitación y edite la longitud del pulso con forma en la ventana de simulación. Haga clic en Iniciar RMN-SIM. Los pulsos con una longitud más corta tienen un rango de excitación más amplio en Hz.
   20. Ajuste SPOFFS5 para cambiar la frecuencia portadora del pulso I-BURP2 y desplazar el rango de excitación hacia la izquierda o la derecha para evitar que el pulso I-BURP2 toque y perturbe la magnetización del agua (Figura complementaria 6B).
   21. Para determinar el nivel de potencia adecuado del pulso con forma, abra la herramienta de forma Bruker, haga clic en el botón Iniciar simulación de RMN y establezca la longitud del pulso I-BURP2 en Longitud de pulso con forma [μs]. Recuerde la longitud correspondiente de un pulso rectangular suave de 90° (¹H), visible en la ventana de simulación en el pulso cuadrado de 90° correspondiente [μs] (Figura suplementaria 7A).
   22. Escriba calcpowlev. Utilice el pulso duro de 90° (¹H) (P1) en microsegundos como longitud de referencia (Figura complementaria 8B) y el pulso rectangular suave de 90° (¹H) correspondiente al pulso I-BURP2 en microsegundos como la nueva longitud (Figura complementaria 8A). Recuerde la diferencia de potencia Δ en dB entre el pulso duro de 90° (¹H) y el pulso rectangular suave (Figura 8C suplementaria). Copie la intensidad del pulso duro de 90° (¹H) en dB a SPW5 y agregue la diferencia memorizada Δ en dB (Figura suplementaria 6B).
   23. Para determinar el nivel de potencia del bloqueo de giro, calcule la longitud de pulso de 90° (¹⁵N) correspondiente del bloqueo de giro. Utilice la fórmula: longitud de pulso de 90° (¹⁵N) en s = 0,25 / (potencia de bloqueo de espín en Hz).
   24. Utilice calcpowlev para calcular la diferencia de potencia Δ en dB entre la potencia del bloqueo de giro y el pulso duro de 90° (¹⁵N) (P7). Nuevo: Longitud de pulso de 90° (¹⁵N) del bloqueo de espín en μs (Figura suplementaria 8A). Ref: longitud de pulso dura de 90° (¹⁵N) en μs (Figura suplementaria 8B). Copie el nivel de potencia PLW7 del impulso duro de 90° (¹⁵N) en dB al nivel de potencia de bloqueo de espín PLW8 (Figura complementaria 6C) y agregue la diferencia de potencia calculada Δ en dB (Figura complementaria 8C).
   25. Copie el nivel de potencia del spin-lock PLW8 a los niveles de potencia SPW8 y SPW9. (Figura complementaria 6C).
   26. Para determinar el nivel de potencia del desacoplamiento de ¹⁵N, utilice calcpowlev para calcular la diferencia de potencia Δ entre la potencia del pulso de desacoplamiento de 90° (¹⁵N) (PCPD3) y el pulso duro de 90° (¹⁵N) (P7). Nuevo: PCPD3 en μs (200) (Figura suplementaria 8A). Ref: longitud de pulso dura de 90° (¹⁵N) en μs (Figura suplementaria 8B). Copie el nivel de potencia PLW7 del impulso duro de 90° (¹⁵N) en dB al nivel de desacoplamiento PLW31 (Figura complementaria 6C) y añada Δ en dB (Figura suplementaria 8C).
   27. Para utilizar la compensación de temperatura, incluya #define TEMP_COMPENSATION (eliminando el punto y coma en la secuencia de pulsos). Establezca P18 en la duración máxima del bloqueo de espín utilizado en el experimento ¹⁵N R_1ρ .
       NOTA: Se recomienda desactivar la compensación de temperatura para la primera prueba del experimento.
   28. En el caso de muestras marcadas con ¹⁵N ¹³C, incluya # para definir LABEL_CN en el programa de pulsos (eliminando el punto y coma en la secuencia de pulsos). Ajuste P4 a la longitud de pulso calculada con la fórmula de⁷⁸. Por ejemplo, corresponde a 23,70 μs a 600 MHz y 11,85 μs a 1200 MHz. Escriba calcpowlev para calcular la diferencia de potencia en dB entre P4 y el pulso duro (¹³C). Copie la potencia de pulso duro (¹³C) en dB a PLW4 y agregue la Δ en dB. Copie PLW4 a PLW2 (Figura complementaria 6B).
   29. Determine los retrasos de relajación para un muestreo adecuado.
       1. Ejecute los primeros ocho FID (en caso L₆ = 8) y procéselos (rser < nuevo número de experimento>). Elija las entradas en la vplist en las que la intensidad máxima del experimento con el retraso más largo disminuya a al menos 1/e (aprox. 37%), pero no menos del 25% en comparación con el experimento con el retraso más corto (que sirve como referencia).
       2. Ajuste las entradas restantes de la vplist para lograr un muestreo uniforme de las disminuciones de intensidad entre el FID con el retraso más largo y el FID con el retraso más corto. Lea la NOTA y las especificaciones de potencia de la sonda.
          NOTA: Los residuos que se relajan lentamente dominarán el primer FID. Ajuste las entradas restantes de la vplist para lograr un muestreo uniforme de las disminuciones de intensidad entre el primer y el segundo FID. No exceda la potencia y longitud máximas permitidas de bloqueo de giro de la sonda (consulte el manual de la sonda y las especificaciones de la sonda). En caso de compensación de temperatura, verifique P18 (duración máxima de bloqueo de giro), ya que se aplicará la duración total de bloqueo de giro de P18, dividida entre el retardo de relajación y la compensación de temperatura. Contiene tiempo (retraso de relajación) + tiempo (compensación de temperatura) = const = P18. Para un bloqueo de espín de 2 kHz, preferimos no exceder una duración de espín de más de 65 ms, utilizando un retardo de recuperación (D1) de 2 s. En ese caso, se debe tomar un compromiso entre la duración máxima del bloqueo de giro y el retraso de relajación más largo a favor de la duración máxima permitida del bloqueo de giro. En caso de retrasos de recuperación D1 más largos, pueden ser aplicables potencias de bloqueo de giro más largas. Lo que cuenta es la deposición general de potencia en la sonda a lo largo del tiempo. Si se requieren duraciones de bloqueo de giro más largas, solo aumente las longitudes de bloqueo de giro en pequeños pasos y observe la señal de bloqueo. Como regla general, ajuste el nivel de bloqueo en el tercio superior de la pantalla de bloqueo. Si el nivel de bloqueo se reduce en más de dos cuadrados durante la ejecución de la secuencia de pulsos, la potencia de bloqueo de espín depositada en la sonda es demasiado.
   30. Escriba rga en la línea de comandos para determinar la ganancia del receptor. Para una buena relación señal-ruido, apunte a un valor de ganancia del receptor (rg) entre 128 y 256, lo que demuestra una buena supresión de agua.
       NOTA: No se puede alcanzar una ganancia del receptor entre 128 y 256 indica una señal de agua demasiado fuerte. En ese caso, la potencia y las duraciones del gradiente se ajustan suavemente hasta que se alcanza la ganancia del receptor. Véase también la sección de Discusión.
   31. Inicie una ejecución de prueba del experimento ¹⁵N R_1ρ escribiendo zg en la línea de comandos. Compruebe que la señal de agua esté bien suprimida para todos los retrasos (de 1 a 8, en caso de 8 retrasos en la vplist). Marque también el incremento 9, que es el segundo incremento del esquema de detección de cuadratura (Echo/Anti-Echo).
2. Configure el experimento ¹⁵N R₁ .
   1. Copie el experimento de ¹⁵N R_1ρ y cambie el programa de impulsos al experimento de ¹⁵N R₁ .
   2. Escriba vclist, genere una vclist y escriba la vclist ficticia descrita en⁷⁰: 0, 24, 6, 20, 4, 16, 8, 12; una nueva fila para cada entrada vclist).
   3. Ased abierto. Compruebe las longitudes y las intensidades de los gradientes. Cambie GPZ9 a 14%.
   4. Compruebe las longitudes de los pulsos, las formas de los pulsos y las intensidades de los pulsos (los valores correctos deberían haberse copiado del experimento ¹⁵N_{R 1ρ} ).
   5. En el caso de muestras marcadas con ¹⁵N¹³C, utilice #define LABEL_CN en el programa de pulsos.
   6. Para el uso de la compensación de temperatura, incluya #define TEMP_COMPENSATION.
   7. Ejecute los primeros ocho FID (en caso de L₆ = 8) y procéselos (rser < nuevo número de experimento>). Elija las entradas en el vclist en las que la intensidad máxima del experimento con el retardo más largo disminuya a al menos 1/e (aprox. 37%) pero no menos del 25% en comparación con el experimento con el retardo más corto. Ajuste las entradas restantes de la vplist para lograr un muestreo uniforme de las disminuciones de intensidad entre el FID con el retraso más largo y el FID con el retraso más corto.
      NOTA: Solo se permiten números pares para las entradas vclist.
3. Configure el experimento {¹H}-¹⁵N NOE.
   1. Copie el experimento de relajación ¹⁵N R₁ y cambie la secuencia de pulsos al esquema de pulsos {¹H}-¹⁵N NOE.
   2. Ajuste la duración del período de saturación con el contador de bucles L₈. El espaciado entre pulsos de 180° (¹H) es de 22 ms⁷⁹ (2* 1 / J_NH). Para lograr los resultados más precisos, utilice un período de saturación de aproximadamente 5 veces el ¹⁵N T₁ (¹⁵N) de la proteína. Aquí: 5 s. Eso correspondería a L8 = 230.
      NOTA: La sección de discusión proporciona consejos adicionales sobre cómo elegir el período de saturación/retraso de recuperación.
   3. Cambie la longitud y la intensidad de los gradientes como se describe en el esquema de pulsos. Utilice formas de degradado sinusoidal.20.
   4. Establezca el número de incrementos en la dimensión indirecta igual a TD = l₃ * 2 * 2
   5. En el caso de muestras marcadas con ¹⁵N¹³C, utilice #define LABEL_CN y -DLABEL_CN como ZGOPTNS.
   6. Ejecute los esquemas de pulso escribiendo zg en la línea de comandos.

4. Procesamiento y análisis de los experimentos de RMN registrados

NOTA: Los espectros se han registrado utilizando un sistema Bruker. El procesamiento se realiza mediante un sistema operativo Unix o Linux. El procesamiento de los espectros y el análisis de los datos se realizaron utilizando NMRPipe⁸⁰ y python3. El software NMRPipe se puede descargar en https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/index.html. Los scripts de procesamiento basados en NMRPipe se descargan del sitio web: https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences o del repositorio ampliado del Banco de Resonancia Magnética Biológica (BMRB) (bmrbig102). Se recomienda el uso de NMRPipe. Si NMRPipe no está disponible o no se desea, se pueden utilizar alternativas como CCPN⁸¹ o SPARKY (SPARKY 3, o sus sucesores NMRFAM-SPARKY⁸² o POKY⁸³ ).

1. Procesar y analizar ¹⁵N R₁ experimento.
   NOTA: Los siguientes comandos se ejecutan en un terminal Unix.
   1. Copie los archivos del directorio descargado R1_processing en el directorio que contiene los datos experimentales R1 (directorio de trabajo).
   2. Haga que los archivos sean ejecutables mediante el comando de terminal: > chmod u+x *.com
   3. Ejecute > bruker para abrir la utilidad de conversión NMRPipe y generar el archivo fid.com. Haga clic en Leer parámetros. Cambie el Recuento de dimensiones a dos si se cuentan tres dimensiones y vuelva a hacer clic en Leer parámetros . A continuación, haga clic en Borrar secuencia de comandos, Actualizar secuencia de comandos y Guardar secuencia de comandos (Figura complementaria 9).
      NOTA: Si la frecuencia portadora no es correcta, cambie las PPM de la posición central después de hacer clic en Leer parámetros por segunda vez.
   4. Ejecutar > ./fid.com
   5. Convierta la vclist en una vplist con entradas de ms: retraso en ms = 40 ms * entrada de vclist. Utilice > cp vclist vplist y edite la vplist.
   6. Utilice > ./split.com para dividir los datos pseudo 3D en ocho archivos 2D.
   7. Edite los valores tauValues (valores vplist en el orden de la vplist) y los valores idxExpmt (orden de los valores tauValues con respecto a la hora) en nmrproc.com (Figura complementaria 10).
   8. Utilice > ./nmrproc.com para procesar los datos sin procesar de los ocho espectros 2D.
   9. Utilice > nmrDraw para dibujar los espectros.
      1. Utilice el espectro de referencia (primera entrada en vplist) para estos pasos. Cambie a ese espectro cambiando la dimensión z a uno (esquina superior izquierda). Ajuste el nivel de contorno usando los botones + y - junto al botón Factor . Vuelva a dibujar el espectro con el botón Dibujar.
      2. Utilice un nivel de contorno en el que se puedan reconocer todas las señales de interés con solo unas pocas señales provenientes del ruido (el nivel de contorno está en el borde del nivel de ruido) (Figura complementaria 11).
   10. Corrija la fase del espectro, tipo v para la proyección vertical de la señal 1D y h para la proyección horizontal de la señal 1D. Ajuste la fase con P0 y P1 (Figura complementaria 11), recuerde la diferencia de fase y corrija la fase en el archivo nmrproc.com (Figura complementaria 10).
       NOTA: Si el espectro se invierte en la dimensión ¹⁵N, elimine el -neg en la línea: | nmrPipe -fn FT -neg \ (Figura suplementaria 10).
   11. Cierre nmrDraw y vuelva a procesar con > nmrproc.com. Para la selección de picos (después de que el espectro se haya faseado correctamente y el espectro de referencia se muestre con un nivel de contorno en el que todos los picos estén presentes), escriba K (shift + k), presione Detectar y haga clic en Guardar. (Figura complementaria 11).
   12. Copie una lista de picos en el directorio de trabajo y cambie -assName en ass.com por el nombre de la lista de picos (Figura complementaria 12).
       NOTA: Un ejemplo de una lista de picos en el formato correcto está disponible en https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences
       y en el repositorio ampliado del Banco de Resonancia Magnética Biológica (BMRB) (bmrbig102).
   13. Ejecute > ./ass.com para asignar los espectros. Compruebe la asignación que sugiere el script para los distintos picos. Utilice el botón izquierdo del ratón para asignar y el botón derecho del ratón para desasignar picos. Utilice el botón Siguiente para ir al siguiente aminoácido y Anterior para ir al aminoácido anterior (Figura complementaria 13).
       NOTA: El nivel de contorno se puede cambiar con + y - en la esquina superior derecha. Utilice el botón Dibujar para volver a dibujar el espectro con el nuevo nivel de contorno (Figura complementaria 13).
   14. Después de completar la tarea, haga clic en Guardar y, a continuación, en Guardar de nuevo. A continuación, haga clic en Salir, Cancelar y Salir (Figura complementaria 13).
   15. Ejecute > python3 NoneDeleter.py para crear relax.tab, que contiene solo información sobre los picos asignados.
   16. Ejecute > ./relax.com para generar el autofit.com script.
   17. Ejecute > ./autoFit.com para realizar una interpolación de Fourier y generar pseudo proporciones de los diferentes tiempos de retardo para cada aminoácido (se generan axt.tab y nlin.tab ).
   18. Ejecute > ./model.com para generar el script de modelExp.com basado en los datos de nlin.tab.
   19. Ejecute > ./modelExp.com para ajustar la curva de evolución de cada residuo con un modelo de optimización de mínimos cuadrados no lineal.
   20. Ejecute > bash summary.tcl -in relax.tab > t1.tab. Ignore un posible mensaje de error: GDB Aviso: Pueden aparecer 21 valores faltantes en el archivo de tabla .
   21. Copie t1.tab en un directorio R1R2 recién creado.
2. Procese y analice el experimento ¹⁵N R_1ρ .
   1. Copie los archivos del directorio descargado R1rho_processing en el directorio que contiene los datos experimentales de R_1ρ (directorio de trabajo).
   2. Ejecute > chmod u+x *.com
   3. Ejecute > bruker para abrir la utilidad de conversión NMRPipe y generar el archivo fid.com. Véase también el procesamiento de los espectros ¹⁵N R₁ .
   4. Ejecutar > ./fid.com
   5. Ejecute > ./split.com para dividir los datos pseudo 3D en ocho archivos 2D.
   6. Ejecute > ./nmrproc.com (edite los tauValues [valores vplist] y el idxExpmt de antemano) para procesar los datos sin procesar de los ocho espectros 2D (Figura complementaria 10).
   7. Ejecute > nmrDraw para dibujar los espectros y elegir los picos. Utilice el espectro de referencia (primera entrada en vplist) para estos pasos. Siga el mismo procedimiento que para el experimento ¹⁵N R₁ .
   8. Copie una lista de picos en el directorio de trabajo y cambie -assName en ass.com por el nombre de la lista de picos (Figura complementaria 12).
   9. Ejecute > ./ass.com y siga el mismo procedimiento que para el experimento ¹⁵N R₁ .
   10. Ejecute > python3 NoneDeleter.py para crear relax.tab, que contiene solo información sobre los picos asignados.
   11. Ejecute > ./relax.com
   12. Ejecutar > ./autoFit.com
   13. Ejecute > ./model.com
   14. Ejecute > ./modelExp.com
   15. Ejecute > bash summary.tcl -in relax.tab > t1rho. tab. Ignore el posible mensaje de error: GDB Aviso: Es posible que falten 21 valores en el archivo de tabla .
   16. Copie el siguiente encabezado en el archivo t1rho.tab (los valores se pueden obtener del archivo fid.com) (Figura complementaria 14):
       OBSERVACIÓN: 600MHz para T1rho
       OBSERVACIÓN -yOBS = 60.818 (ponga aquí el valor encontrado en fid.com)
       OBSERVACIÓN -yCAR = 119.06 (ponga aquí el valor que se encuentra en fid.com)
   17. Ejecute > ./extract_PPM.com para generar una tabla denominada fusionOffset.tab que contenga el desplazamiento de la frecuencia máxima de ¹⁵N en relación con la frecuencia portadora (que será necesaria para calcular el ángulo θ para la extracción de datos R₂ a partir de los datos R₁ y R_1ρ ).
3. Resumir los datos de relajación.
   1. Copie el t1rho.tab y el fusionOffset.tab en el directorio R1R2.
   2. Copie el script crtR1p.tcl en el directorio R1R2, ajuste la frecuencia del espectrómetro y la potencia de bloqueo de espín, y ejecute bash crtR1p.tcl | sort -n > R1R2.tab. (Figura complementaria 15). R1R2.tab contendrá las constantes de velocidad R_1ρ ajustadas, el ángulo theta, las constantes de velocidad R₂ y las constantes de velocidad R₁ .
4. Procese y analice el experimento hetNOE.
   1. Copie los archivos del directorio descargado NOE_processing en el directorio de datos experimental NOE (directorio de trabajo).
   2. Execute > chmod u+x *.com
   3. Ejecute > bruker para abrir la utilidad de conversión NMRPipe y generar el archivo fid.com. Haga clic en Leer parámetros. Cambie el Recuento de dimensiones a dos si se contaron tres dimensiones y vuelva a pulsar Leer parámetros . A continuación , pulse Borrar guión, Actualizar guión y Guardar guión.
   4. Ejecutar > ./fid.com
   5. Ejecute > ./split.com (Una vplist con dos entradas (0, 1) debe crearse antes)
   6. Ejecute > ./ft2.com
   7. Ejecute > nmrDraw para dibujar el espectro y seleccionar los picos en el espectro de referencia (dimensión z = 1). Extraiga y recuerde el ruido (presione T = shift + t). La corrección de fase y la selección de picos siguen el mismo procedimiento que el experimento ¹⁵N R₁ .
   8. Copie una lista de picos en el directorio de trabajo y cambie -assName en ass.com por el nombre de la lista de picos (Figura complementaria 12)
   9. Ejecute > ./ass.com para asignar los espectros. Siga el mismo procedimiento que se detalla para el experimento ¹⁵N R₁ .
   10. Ejecute > python3 NoneDeleter.py para crear relax.tab.
   11. Ejecutar > ./script.com
   12. Ejecute > ./autoFit.com
   13. Cambia el ruido en error_hetnoe.tcl.
   14. Execute > bash error_hetnoe.tcl |sort -n > hetNOE.tab

Resultados

A continuación se muestran algunos datos ejemplares de relajación de RMN registrados en la proteína SNARE vesicular Sinaptobrevin-2 (1-96), frecuentemente llamada VAMP2 (proteína 2 asociada a vesículas). Para registrar los datos de RMN, utilizamos una muestra de 171 μM ¹⁵N Synaptobrevin-2 (1-96) (denominada Syb-2 a continuación) en un tampón MES (pH 6,0) de 50 mM que contenía 150 mM de NaCl, 0,1 mM de TCEP y 1 mM de EDTA. Todos los datos experimentales se registraron a 278,15 K utilizando un volumen de 250 μL llenado en un tubo de muestra de RMN de 3 mm. Los experimentos se realizaron en un espectrómetro Bruker 600 MHz AVANCE III HD equipado con una criosonda de resonancia cuádruple Bruker 5 mm QCI ¹H, ¹⁵N, ¹³C, ³¹P.

La Figura 3 muestra las constantes de velocidad de relajación ¹⁵N, R₁ y R₂ específicas del residuo ajustadas a las curvas de relajación de RMN obtenidas de los experimentos de relajación de RMN. En el eje y, se trazan las constantes de velocidad de relajación respectivas para los residuos individuales a lo largo de la secuencia de proteínas (en el eje x). Además, se muestran los valores de NOE heteronuclear ^{1 H-15}N (hetNOE) extraídos de las relaciones de intensidad de los experimentos saturados y no saturados (referencia) de la medición de RMN heteronuclear ^{1 H-15}N.

Los datos heteronucleares de NOE y las constantes de velocidad de ¹⁵N R₂ se interpretan más fácilmente que los datos de ¹⁵N R₁ . Por lo tanto, comenzaremos con ellos.

NOE heteronuclear:
Los NOE heteronucleares {¹H}-¹⁵N son sensibles a la dinámica interna en la escala de tiempo de picosegundos rápidos (<100 ps, debido a su dependencia de relajación cruzada) pero también a la dinámica ps-ns (debido a su dependencia R₁ ) y pueden tomar valores generalmente entre 0 y (un poco menos de) 1 para proteínas plegadas. En los campos más altos serán sistemáticamente más altos (pero siempre más bajos que 1).

Describen la flexibilidad interna de la proteína. Cuando se comparan los valores de hetNOE a las mismas intensidades de campo, se mantiene: Cuanto menor es el {¹H}-¹⁵N NOE, más dinámico es el residuo respectivo. En el caso de los desplazados internos, normalmente se observan pequeños residuos específicos {¹H}-¹⁵N NOE, por ejemplo, del orden de 0,5 y menores a 600 MHz. Sin embargo, también se encuentran {¹H}-¹⁵N NOE negativos para los IDP, incluso hasta -2 a 500 MHz. Para Syb-2 monomérico, {¹H}-¹⁵N NOE medido a 600 MHz oscila entre -0,5 para el dominio del enlazador N-terminal y 0,5 para el dominio del enlazador C-terminal. Los valores aumentan gradualmente desde el extremo N hasta el extremo C, lo que indica una flexibilidad decreciente gradual/rigidez creciente (Figura 3C).

Constantes de velocidad de ¹⁵N R₂
¹⁵Las constantes de velocidad N_{R 2} son sensibles a la dinámica ps - ns que modula la orientación del vector de enlace N-H por la caída general de la proteína, el movimiento de los planos peptídicos y la torsión de los ángulos diedros de la columna vertebral. A diferencia de los valores de {¹H}-¹⁵N NOE y R_1, las constantes de velocidad de ¹⁵N R₂ están dominadas por la densidad espectral J(0) asociada con el volteo general (rotacional) de la proteína. Por lo tanto, para las proteínas plegadas globularmente, las constantes de velocidad de ¹⁵N R₂ se escalan en tamaño de acuerdo con el volteo general y el tamaño de la proteína. En el caso de los IDP verdaderos, no se puede asignar un tiempo de correlación rotacional global. Aun así, se puede ajustar un tiempo de correlación lento dependiente de la longitud de la cadena⁸⁴, como se espera para los polímeros, pero la dinámica interna específica del residuo tiene un mayor impacto en las constantes de velocidad de ¹⁵N R₂ . Dentro de la misma proteína, las constantes de velocidad ¹⁵N R₂ permiten la discriminación de estructuras frente a regiones no estructuradas con diferente movilidad interna específica del residuo. Cuanto menor sea la constante de velocidad ^{observada 15}N R₂ , más móvil será el residuo respectivo. Las constantes de velocidad altas de ¹⁵N R₂ son características de los elementos de la estructura secundaria, como las α-hélices o las β-strandos. Las constantes de tasa de relajación R₂ bajas son características de las regiones de bucle e intrínsecamente desordenadas. Para el Syb-2 monomérico (1-96), observamos constantes de velocidad ¹⁵N R₂ bajas en general, consistentes con su carácter intrínsecamente desordenado. La rigidez interna aumenta (la movilidad disminuye) desde el extremo N hasta el dominio del enlazador C-terminal antes de descender al extremo C flexible (Figura 3B).

Constantes de velocidad de ¹⁵N R₁
Las tasas de relajación de R₁ son sensibles a la dinámica de picosegundos (ps) y nanosegundos (ns) más rápida. Sin embargo, su interpretación directa de la dinámica interna es más compleja que las anteriores. Hay un campo T₁ (R₁) mínimo (máximo) cuando T₁ se traza en función de la correlación rotacional τ_R: T_1min en τ_{R, min} = 1/ ω. Para moléculas de caída rápida con un τ_R < τ_{R, min,} por ejemplo, moléculas pequeñas o proteínas globulares pequeñas, las constantes de velocidad R₁ más bajas indican un aumento de la dinámica de la columna vertebral de la proteína (igual que para R₂). En el caso de proteínas más grandes, con τ_R > τ_{R, min}, es lo contrario, y las constantes de tasa de relajación R₁ más altas representan una dinámica aumentada (opuesta a R₂).

Figura 3: Datos de relajación de RMN. Los datos se registraron y evaluaron siguiendo el protocolo y el flujo de trabajo descritos anteriormente. (A) Constantes de la tasa de relajación ¹⁵N R₁ específicas del residuo a lo largo de la columna vertebral de la proteína Syb2 (1-96). (B) ¹⁵constantes de velocidad de relajación N_{R 2} , calculadas a partir de datos R_1ρ y R₁ utilizando la fórmula (1). (C) tasas de transferencia hetNOE a lo largo de la red troncal de Syb2 (1-96). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Lectura de los parámetros de RMN. Se muestra la interfaz de macro rpar . (A) Visión general de todos los conjuntos de parámetros. El recuadro rojo marca la barra de búsqueda. Los números rojos se refieren a los pasos respectivos del protocolo. Haga doble clic para elegir un conjunto de parámetros. (B) Descripción general de los parámetros que se pueden importar al experimento actual. Las opciones para ejecutar getprosol o para mantener parámetros específicos del experimento actual están marcadas con recuadros rojos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Posicionamiento de la frecuencia portadora de ¹H para una supresión óptima del agua. Se muestra la interfaz de macro gs . Mientras el experimento está en bucle, es posible cambiar diferentes parámetros del experimento. El marcador se puede utilizar aquí para cambiar el parámetro elegido durante la adquisición. Al hacer clic sobre el marcador, el parámetro se eleva en el valor especificado en "sensibilidad". El interruptor de sensibilidad se puede utilizar para ajustar el tamaño del paso del marcador. En el lado derecho, se puede ver el FID en vivo. Para la calibración del O1, el objetivo es minimizar el área FID marcada con un recuadro rojo, ya que el FID suele estar dominado por la señal de agua. La reducción del área FID va de la mano con una disminución de la señal de agua y una mejor supresión de agua. Los números rojos se refieren a los pasos respectivos del protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Una mirada más cercana a la secuencia de pulsos HSQC ^{1 H-15}N y sus parámetros de adquisición. (A) Parámetros de secuencia de impulsos del experimento HSQC ^{1 H-15}N HSQCFPF3GPPHWG. Haga clic en "E" para abrir la ventana del editor de programas de pulsos en B. (B) Editor de programas de pulsos ^{del HSQCFPF3GPPHWG}de experimentos 1 ^H-15N HSQC. La línea comentada (línea 91) con un pulso de ¹⁵N 90° muestra la línea original para un experimento HSQC de ^{1 H-15}N. En la línea 92, el pulso de ¹⁵N 90° se cambia a un pulso de ¹⁵N 180°. Este cambio hace que el experimento ^{HSQC 1 H-15}N sea un programa de pulso de calibración para la calibración de pulso duro de 90° ¹⁵N. Para editar secuencias de pulsos, guarde primero la secuencia con un nuevo nombre. Utilice el siguiente flujo de trabajo: haga clic en Archivo, Guardar como, introduzca el nuevo nombre, haga clic en Aceptar y haga clic en Establecer PULPROG en el conjunto de datos. Los números rojos se refieren a los pasos respectivos del protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura 4 complementaria: Configuración de los degradados. Se muestra la interfaz de la macro gpnam para cambiar las formas, longitudes e intensidades de los degradados. Para abrir la interfaz de parámetros de secuencia de pulsos utilizada, se deben introducir todas las formas de gradiente GPNAM. Los números rojos se refieren a los pasos respectivos del protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 5: Configuración de los retrasos de relajación. Interfaz de la macro vplist (idéntica a la macro vclist). (A) Interfaz para elegir una vplist. Al hacer clic en los tres puntos, se abre la interfaz B. (B) Interfaz para elegir una vplist por DoubleClick, o crear una nueva lista haciendo clic en Archivo, y Nuevo. (C) La interfaz se abre creando una nueva lista o editando una lista existente. La lista se puede guardar haciendo clic en Archivo y Guardar. Los números rojos se refieren a los pasos respectivos del protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 6: Parámetros de secuencia de pulsos del experimento 15N R1ρ. (A-D) Todos los parámetros esenciales que deben cambiarse en el protocolo están marcados con cuadros rojos y los pasos asociados. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura 7 complementaria: Interfaz de la macro shapetool . Un I-BURP2 (utilizado en los experimentos) se abre como un pulso de forma. (A) Parámetros del pulso de forma seleccionado. Al hacer clic en el botón Iniciar simulación de RMN marcado con un cuadro rojo, se abren las ventanas de parámetros de simulación con los parámetros de simulación Longitud de pulso con forma [μs] (= 2000 μs) y el Ángulo de rotación [°] (= 180°). Al hacer clic en el botón Iniciar RMN-SIM se abre la ventana de simulación (B), que muestra el ancho de banda de inversión del pulso I-BURP2. Los números rojos se refieren a los pasos respectivos del protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura 8 suplementaria: Interfaz de la macro calcpowlev . (A) Ventana de entrada para la longitud del impulso cuya potencia se va a calcular. (B) Ventana de entrada del pulso de referencia (principalmente el pulso duro de 90°). (C) La ventana de resultados muestra la diferencia de intensidad de pulso en dB entre un pulso con la nueva longitud de pulso y un pulso con la longitud de pulso de referencia. Atención: Esta diferencia solo es válida si ambas longitudes de pulso corresponden al mismo pulso en cuanto a forma y ángulo de rotación. Los números rojos se refieren a los pasos respectivos del protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 9: Procesamiento de espectros de RMN: Interfaz de la herramienta de conversión NMRPipe. Al hacer clic en Leer parámetros , se leen automáticamente los parámetros del experimento. El script de conversión se muestra a la derecha. Todos los parámetros se pueden ajustar individualmente. Después de cambiar los parámetros mediante Borrar secuencia de comandos, se recomienda actualizar lasecuencia de comandos . Haga clic en Guardar script para guardar el script en fid.com, como se muestra a la derecha. Los números rojos se refieren a los pasos respectivos del protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 10: El archivo nmrproc.com para el procesamiento espectral. Se muestra el código utilizado en el archivo nmrproc.com para procesar los datos sin procesar en formato NMRPipe. La entrada tauValues y la entrada idxExpmt deben establecerse antes del procesamiento. Los valores tauValues corresponden a las entradas vplist en ms para el experimento ¹⁵N R_1ρ (entradas vclist recalculadas en ms para el experimento ¹⁵N R₁ ). En cuanto a la longitud del retardo de relajación, las entradas idxExpmt corresponden al orden de las entradas vplist (entradas vclist para el experimento 15N R1). En el script, las posiciones para cambiar la fase del espectro están marcadas con cuadros rojos. Los números rojos se refieren a los pasos respectivos del protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 11: Visualización de espectros de RMN y selección de picos. Se muestra una descripción general de nmrDraw con un espectro abierto. Utilice los botones + y - para cambiar el factor, que va de la mano con un cambio en el nivel de contorno. El cambio de la dimensión Z permite el cambio entre el experimento HSQC con diferentes retrasos de relajación. Utilice Dibujar para volver a dibujar el espectro con los parámetros modificados. El control deslizante P0 y el control deslizante P1 permiten cambios en la fase del espectro. Estos cambios de fase no se guardarán en los datos procesados; El cambio de fase debe introducirse manualmente en el archivo de nmrproc.com y volver a ejecutar el archivo nmrproc.com. La macro Detección de picos permite seleccionar los picos del espectro en el nivel de contorno establecido. Los números rojos se refieren a los pasos respectivos del protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 12: Asignación semiautomatizada de picos de RMN con NMRDraw. Se muestra el código del archivo ass.com y debe ejecutarse para iniciar la asignación de la señal NMR. Cambie -assName a la lista máxima de intereses generada. Esta lista de picos tiene que estar en el mismo formato que la lista de picos adjunta ass.syb2.hn_1200.tab en la carpeta peaklist (en la carpeta zip descargada en https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences). El número rojo se refiere al paso respectivo en el protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 13: Inspección visual de picos y asignaciones de RMN. La interfaz de la macro de asignación se abre ejecutando ass.com. Utilice el botón izquierdo del ratón para asignar picos y el botón derecho del ratón para desasignar picos. Use Siguiente para ir al siguiente aminoácido y Anterior para ir al aminoácido anterior. Con + y -, el nivel de contorno se puede cambiar mediante Dibujar, que redibuja el espectro. Uso del flujo de trabajo: Salir, Guardar y Salir guarda la tarea y finaliza el programa. Los números rojos se refieren a los pasos respectivos del protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 14: Extracción de las constantes de velocidad R₂ de ¹⁵N de los datos R_1ρ y R₁. Paso 1. Se muestra el contenido del archivo t1rho.tab. Se debe agregar un código marcado con un cuadro rojo antes de calcular las tarifas R₂ a partir de las tarifas R_1ρ. El número rojo se refiere al paso respectivo en el protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 15: Extracción de las constantes de velocidad R₂ de ¹⁵N de los datos R_1ρ y R₁. Paso 2. Se muestra el contenido del archivo crtR1p.tcl. Antes de ejecutar, las entradas en el cuadro rojo deben cambiarse como se describe en el protocolo. Los números rojos se refieren a los pasos respectivos del protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este protocolo describió la configuración de los experimentos de relajación de ^{RMN 15}N por Lakomek et ^al.69 y Stief et ^al.70. Nos centramos en las secuencias de pulsos de RMN utilizando un esquema de detección HSQC de sensibilidad mejorada. Los experimentos ¹⁵N R₁ y R_1ρ se implementan como se describe en detalle por Stief et al.70, y el experimento hetNOE es descrito por Lakomek et ^al.69.

Al configurar los experimentos de relajación de RMN, el ¹⁵N R_1ρ es el más crítico, ya que elegir un período de relajación máximo demasiado largo o una amplitud de RF demasiado alta del bloqueo de giro puede dañar la sonda. Para el período de relajación, es deseable muestrear la curva de decaimiento completa por igual desde el 100% de intensidad hasta el 25% de intensidad (en comparación con el experimento de referencia). En el caso de proteínas que se relajan lentamente, como las IDP, con ¹⁵N T₂ veces largas, con frecuencia no será asequible muestrear la curva de desintegración en toda su extensión porque la deposición de potencia en la sonda debe ser limitada.

Para la amplitud de radiofrecuencia (RF) de ¹⁵N, teóricamente, cuanto mayor sea la amplitud de RF, ν_spin-lock, mejor, ya que se pueden reenfocar más procesos de intercambio. Como regla general, los procesos de intercambio más lentos que 1 / (2π ν_spin-lock ) se pueden reenfocar. Sin embargo, se aplican limitaciones de potencia de RF. Por ejemplo, en nuestra mano, no superaríamos un período máximo de bloqueo de espín de 65 ms cuando se aplica una amplitud de RF de 2 kHz para mantenernos seguros. Al mismo tiempo, la amplitud de RF de bloqueo de espín en un espectrómetro de 600 MHz debe ser superior a 1 kHz, por ejemplo, 1,4 kHz a 600 MHz, lo que ha demostrado ser suficiente para la pequeña proteína globular gb3⁶⁹. Para cubrir los anchos espectrales y evitar efectos de resonancia fuera de resonancia a intensidades de campo más altas, la amplitud de RF correspondiente debe escalar con el campo magnético, por ejemplo, 1,5 veces mayor a 900 MHz (ν_spin-lock  2 kHz). Sin embargo, debe permanecer dentro de las limitaciones de la sonda. (Consulte la lista local de limitaciones de potencia del espectrómetro y póngase en contacto con el gerente de su instalación de RMN para obtener asesoramiento).

Para la elección del espaciamiento de los retardos de relajación entre el experimento de referencia (retardo acortado) y el período de retardo más largo (determinado por los factores discutidos anteriormente), preferimos un espaciado igual de los puntos de datos del retardo de relajación y elegimos un número de 8 (si el tiempo de medición asignado y la relación señal-ruido lo permiten). El primer incremento (y los siguientes) estará dominado por los residuos más intensos (y frecuentemente más lentos). Por lo tanto, dependiendo del rango dinámico de la proteína, las señales de RMN de varios residuos en la secuencia de proteínas pueden haber decaído después del período de relajación máxima elegido. Al espaciar equitativamente los puntos de retardo, nos aseguramos de que las curvas de relajación de los residuos que se relajan rápidamente también estén cubiertas por un número suficiente de puntos de datos que muestreen la curva de relajación.

Además, una buena elección del retraso de recuperación es esencial para obtener datos de relajación precisos y evitar daños a largo plazo en la sonda. Elegimos un retardo de recuperación de al menos D1 = 2 s para evitar cualquier daño a la sonda. Para obtener resultados precisos, también se debe dar tiempo suficiente a la polarización longitudinal de la proteína ¹H y ¹⁵N para que vuelva al equilibrio o al menos a un estado estable y estacionario. El ¹H T₁ suele variar entre 1 s y 4 s a 600 MHz para una proteína de tamaño pequeño o mediano (hasta 20 kDa); para proteínas más grandes y campos más altos, el ¹H T₁ aumentará aún más. Para la pequeña proteína globular gb3, encontramos que D1 = 3,5 s es suficiente para los experimentos ¹⁵N R₁ y R_1ρ . Para el IDP pequeño Syb-2 presentado en este protocolo, recientemente demostramos que D1 = 2 s era adecuado⁷⁰.

El hetNOE de ¹⁵N tiene la sensibilidad más baja, ya que la excitación comienza en ¹⁵N, y no se aplica ^{1 H-15}N INEPT al comienzo de la secuencia de pulsos. Además, el período de saturación de ¹H y el retraso de recuperación de ¹⁵N deben ser 5 veces ¹⁵N T₁ para obtener datos precisos. Mientras que para el IDP Syb-2 presentado aquí, un retardo de saturación/recuperación de 5 s más un retardo de recuperación D1 adicional de 2 s (7 s en total) era suficiente, para proteínas más grandes y/o proteínas deuteradas, este tiempo puede ser sustancialmente más largo, por ejemplo, 10 s o más. Sin embargo, si los datos cualitativos son lo suficientemente buenos, se puede aceptar una ligera compensación sistemática. En ese caso, se pueden obtener resultados razonables ya a 3 veces ¹⁵N T₁, ya que se alcanzará el 95% de la saturación. En ese caso, los valores hetNOE resultantes mostrarán un desplazamiento sistemático a valores más altos.

En este protocolo, trabajamos con ¹⁵N Syb-2 totalmente protonada, que es el más rentable. Se recomienda la deuteración de cadena lateral para reducir el número de vías de relajación y trabajar con los pares de espín de amida de la columna vertebral ^{1 H-15}N más aislados. Sin embargo, al comparar ¹⁵N²H Syb-2 y ¹⁵N syb-2, observamos muy pocas diferencias entre las muestras deuteradas y las completamente protonadas⁷⁰. A efectos prácticos, los datos de relajación de la RMN se registran con frecuencia en las muestras marcadas dobles o triples (¹⁵N¹³C o ²H¹⁵N¹³C). Las secuencias de pulsos de RMN discutidas son capaces de reenfocar la evolución del acoplamiento J entre ¹³C con ^{núcleos de 1}H o ¹⁵N. Obviamente, también las vías de relajación aumentarán cuando se introduzca el etiquetado ¹³C. Sin embargo, en nuestras manos, a efectos prácticos, el error introducido, si es que lo hay, es inferior al 5% y podría ser aceptable cuando sólo se necesitan datos cualitativos.

Cuando se trabaja con proteínas de diferentes tamaños para la detección, con frecuencia surge la cuestión de si elegir experimentos⁷⁰ detectados por HSQC con sensibilidad mejorada o experimentos⁶⁹ detectados por TROSY. En el caso de las proteínas pequeñas, los experimentos de RMN detectados por HSQC con sensibilidad mejorada ofrecen una ganancia de señal a ruido del doble (siempre que se pueda obtener una buena supresión de agua). En el caso de las proteínas más grandes, los experimentos detectados por TROSY serán los ganadores. El punto de equilibrio es de aproximadamente 20 kDa para las proteínas plegadas. En el caso de los IDP, para los que se pueden obtener constantes de velocidad R₂ bajas que aumentan aproximadamente linealmente con el aumento de las longitudes de cadena, el punto de equilibrio puede desplazarse a pesos moleculares más altos. A efectos prácticos, recomendamos implementar los experimentos detectados por HSQC o TROSY con sensibilidad mejorada en caso de duda. A continuación, elija el que proporcione la mejor relación señal-ruido en el primer incremento.

El debate sobre si se deben elegir los experimentos detectados por HSQC o TROSY con sensibilidad mejorada solo se aplica cuando la relación señal-ruido es el criterio principal. Cuando se requieren los anchos de línea más pequeños y la resolución más alta, TROSY siempre ganará. TROSY también ofrece siempre la mejor supresión de agua, ya que se requieren menos pulsos de protones y no se requiere desacoplamiento de protones. Nos remitimos al artículo⁶⁹ publicado anteriormente para una discusión más extensa.

Una observación más sobre el tema de la supresión del agua. Si bien establecer la ganancia del receptor (rg) en 16 puede ser suficiente en las consolas Bruker Avance NEO, una ganancia del receptor en el rango de 128-256 suele ser deseable para las consolas Bruker Avance (más antiguas). El rg alcanzable (determinado por el comando rga de Bruker) se obtiene frecuentemente a partir de la intensidad de la señal de agua residual al nivel de ruido. Una mala supresión de agua siempre introducirá ruido adicional en los espectros. Por lo tanto, incluso si se puede lograr un rg = 16 en una consola Bruker Avance NEO, la señal de agua restante puede contribuir sustancialmente al nivel de ruido. Por lo tanto, la relación señal-ruido se reduciría. En consecuencia, recomendamos apuntar a un nivel rg de 128-256. Las secuencias de pulsos⁷⁰ presentadas han sido probadas a 600 MHz y 1200 MHz. Ambas intensidades de campo funcionan con la misma configuración de gradiente, tal como se indica en la secuencia de pulsos. Los recomendamos al menos como un buen punto de partida para una mayor optimización.

Como se mencionó en la introducción, los experimentos de relajación de RMN discutidos cubren solo el rango de tiempo de picosegundos a nanosegundos. Para obtener información sobre la dinámica de microsegundos a milisegundos, nos referimos a los experimentos de dispersión de relajación, los experimentos CPMG y una extensión de los experimentos R_1ρ con amplitudes de bloqueo de espín cambiantes (o frecuencias portadoras) 44,46,58,59,60,61,85,86 . La dinámica más lenta que microsegundos puede ser capturada ¹⁵N CEST (transferencia de saturación de intercambio químico) RMN⁶², espectroscopía de intercambio (EXSY, milisegundos a segundos) o RT (tiempo real) RMN (segundos a horas)^63,64. El efecto PRE (mejora de la relajación paramagnética) de las sondas paramagnéticas, así como de los acoplamientos dipolares residuales (RDC), se puede utilizar para evaluar todo el rango de dinámicas de ps a ms 65,66,67,68.

Todos estos experimentos cubren solo la dinámica de la columna vertebral. Para investigar la dinámica de la cadena lateral, Kay y sus colaboradores introdujeron otra plétora de experimentos de RMN, proporcionando información sobre la dinámica de la cadena lateral para proteínas de hasta 1 MDa ^2,87.

Para obtener más información cuantitativa sobre la dinámica de la columna vertebral de las proteínas, es necesario un análisis combinado de los tres parámetros de RMN, ¹⁵N R₁, R₂ y hetNOE, que a veces involucra incluso otros parámetros, como las constantes de tasa de relajación correlacionadas entre sí. Se han desarrollado diferentes métodos de análisis sofisticados. El llamado enfoque sin modelo se ha aplicado ampliamente en la RMN biomolecular 43,88,89,90,91. Además, el mapeo de densidad espectral puede proporcionar información valiosa 55,92,93. Si bien estos son métodos de análisis potentes para proteínas globulares con un tiempo de correlación rotacional bien definido, su aplicabilidad es limitada para los IDP. Un dominio plegado es necesario para definir un tiempo de correlación rotacional³⁹. Esto se puede eludir parcialmente cuando la función de correlación C(t) se puede modelar mediante la suma de funciones que decaen exponencialmente en caso de que las diferentes escalas de tiempo involucradas puedan estar bien separadas 23,31,84. En ausencia de un tiempo de correlación rotacional bien definido, los enfoques alternativos que implican una distribución de tiempos de correlación, por ejemplo, el análisis IMPACT⁹⁴ o el análisis DETECTOR^95,96, son una alternativa. Además, un análisis combinado de los datos de relajación de la RMN y las simulaciones de MD también es prometedor para los desplazados internos⁹⁷; En la actualidad, todavía nos enfrentamos a limitaciones de muestreo y campo de fuerza para simulaciones de átomos completos de IDP más grandes^31,98.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Espectrómetro Bruker 600 MHz AVANCE III HD 	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html	experimentos de RMN realizados