Experimentos de relajación de RMN 15N para la investigación de la dinámica estructural de proteínas de picosegundos a nanosegundos

Resumen

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) puede caracterizar la dinámica estructural de proteínas de una manera específica para cada residuo. Proporcionamos un protocolo práctico para registrar la relajación de RMN ¹⁵N R₁ y R₂ y los experimentos de efecto Overhauser heteronuclear (hetNOE) de {¹H}-¹⁵N, sensible a la escala de tiempo de picosegundos a nanosegundos.

Resumen

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) permite estudiar proteínas en solución y a temperaturas fisiológicas. Con frecuencia, los grupos amida de la columna vertebral de la proteína o los grupos metilo en las cadenas laterales se utilizan como indicadores de la dinámica estructural de las proteínas. Un estudio de dinámica estructural de la columna vertebral de proteínas globulares en muestras marcadas con ¹⁵N y completamente protonadas generalmente funciona bien para proteínas con un peso molecular de hasta 50 kDa. Cuando se aplica la deuteración de cadena lateral en combinación con espectroscopia optimizada de relajación transversal (TROSY), este límite puede extenderse hasta 200 kDa para proteínas globulares y hasta 1 MDa cuando el foco está en las cadenas laterales. Cuando se investigan proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP) o proteínas con regiones intrínsecamente desordenadas (IDR), estas limitaciones de peso no se aplican, pero pueden ir mucho más allá. La razón es que los IDP o IDR, caracterizados por una alta flexibilidad interna, suelen estar desacoplados dinámicamente. Varios métodos de RMN ofrecen información de resolución atómica sobre la dinámica estructural de las proteínas en una amplia gama de escalas de tiempo, desde picosegundos hasta horas. Las mediciones estándar de relajación de ¹⁵N describen la flexibilidad interna de una proteína y caracterizan la dinámica de la columna vertebral de la proteína experimentada en la escala de tiempo rápida de picos a nanosegundos. Este artículo presenta un protocolo práctico para configurar y registrar experimentos de RMN ¹⁵N R₁, R₂ y de efecto Overhauser heteronuclear (hetNOE). Mostramos datos ejemplares y explicamos cómo interpretarlos de forma sencilla y cualitativa antes de cualquier análisis más sofisticado.

Introducción

La función de una proteína está determinada no solo por su estructura tridimensional, sino también por su dinámica estructural, que abarca su flexibilidad interna y las transiciones estructurales entre las diferentes conformaciones que adoptará la proteína. La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) puede investigar la dinámica estructural de las proteínas en la solución ^1,2,3. Los desarrollos recientes en RMN de estado sólido detectada por protones también permiten la caracterización de la dinámica de proteínas en un estado menos soluble, como, por ejemplo, una ....

Protocolo

1. Preparación de la muestra de RMN

NOTA: El marcaje de isótopos de las proteínas se realiza para experimentos de RMN de dimensiones superiores y RMN avanzada. Cuando la expresión de proteínas en E. coli y la purificación de proteínas se han establecido utilizando medios ricos (por ejemplo, Luria-Bertani [LB] o medio de triptona de extracto de levadura 2x [2YT]) con un rendimiento de varios miligramos por litro, la preparación de una muestra de RMN marcada isotópicamente suele ser relativamente sencilla.

1. Para el marcaje de isótopos, utilice medios mínimos M9 para la expre....

Resultados

A continuación se muestran algunos datos ejemplares de relajación de RMN registrados en la proteína SNARE vesicular Sinaptobrevin-2 (1-96), frecuentemente llamada VAMP2 (proteína 2 asociada a vesículas). Para registrar los datos de RMN, utilizamos una muestra de 171 μM ¹⁵N Synaptobrevin-2 (1-96) (denominada Syb-2 a continuación) en un tampón MES (pH 6,0) de 50 mM que contenía 150 mM de NaCl, 0,1 mM de TCEP y 1 mM de EDTA. Todos los datos experimentales se registraron a 278,15 K utilizando un volumen de 250 μL .......

Discusión

Este protocolo describió la configuración de los experimentos de relajación de ^{RMN 15}N por Lakomek et ^al.69 y Stief et ^al.70. Nos centramos en las secuencias de pulsos de RMN utilizando un esquema de detección HSQC de sensibilidad mejorada. Los experimentos ¹⁵N R₁ y R_1ρ se implementan como se describe en detalle por Stief et al.70, y el experimento hetNOE es descrito por Lakomek et ^al.69

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Espectrómetro Bruker 600 MHz AVANCE III HD 	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html	experimentos de RMN realizados