Aislamiento mitocondrial robusto del tejido cardíaco de roedores

Resumen

Los estudios bioenergéticos y metabolómicos de las mitocondrias han revelado su papel multifacético en muchas enfermedades, pero los métodos de aislamiento de estos orgánulos varían. El método detallado aquí es capaz de purificar mitocondrias de alta calidad a partir de múltiples fuentes de tejidos. La calidad se determina mediante las proporciones de control respiratorio y otras métricas evaluadas con respirometría de alta resolución.

Resumen

El aislamiento mitocondrial se ha practicado durante décadas, siguiendo los procedimientos establecidos por pioneros en los campos de la biología molecular y la bioquímica para estudiar las deficiencias metabólicas y las enfermedades. Es necesaria una calidad mitocondrial constante para investigar adecuadamente la fisiología mitocondrial y la bioenergética; Sin embargo, hay muchos métodos de aislamiento diferentes publicados disponibles para los investigadores. Aunque las diferentes estrategias experimentales requieren diferentes métodos de aislamiento, los principios y procedimientos básicos son similares. Este protocolo detalla un método capaz de extraer mitocondrias bien acopladas de una variedad de fuentes de tejidos, incluidos animales pequeños y células. Los pasos descritos incluyen la disección de órganos, la purificación mitocondrial, la cuantificación de proteínas y varios controles de calidad. La principal métrica de control de calidad utilizada para identificar mitocondrias de alta calidad es el índice de control respiratorio (RCR). El RCR es la relación entre la frecuencia respiratoria durante la fosforilación oxidativa y la tasa en ausencia de ADP. Se discuten métricas alternativas. Si bien con este protocolo se obtienen valores altos de RCR en relación con su fuente de tejido, se pueden optimizar varios pasos para satisfacer las necesidades individuales de los investigadores. Este procedimiento es robusto y ha dado lugar sistemáticamente a mitocondrias aisladas con valores de RCR superiores a la media en modelos animales y fuentes de tejidos.

Introducción

Las mitocondrias son orgánulos subcelulares que establecen condiciones energéticas citoplasmáticas optimizadas para funciones celulares específicas. Si bien los estudios a nivel celular, de tejidos y de organismos pueden proporcionar información sobre la función mitocondrial, el aislamiento de los orgánulos ofrece un nivel de control experimental que no sería posible de otra manera. Los aislamientos mitocondriales se han realizado desde la década de 1940, lo que permite estudios mecanicistas del metabolismo y la respiración en una variedad de células y tejidos ^1,2. La relevancia histórica de las mitocondrias también está bien documentada³. Como principales productoras de ATP, las mitocondrias desempeñan muchas funciones clave que son vitales para el funcionamiento óptimo de las células y los^órganos. Dentro de la matriz mitocondrial, los sustratos son oxidados por el ciclo del TCA, produciendo equivalentes reductores y portadores de electrones móviles como NADH y UQH₂ ^5,6. El citocromo C es el tercer principal portador móvil de electrones en la red de reacciones bioquímicas mitocondriales⁷. Estas moléculas son luego oxidadas por los complejos transmembrana del sistema de transporte de electrones (ETS) incrustados en la membrana mitocondrial interna⁸. Las reacciones redox del ETS se acoplan con la translocación de protones de la matriz al espacio intermembrana. Estos procesos establecen un gradiente electroquímico de protones que se utiliza para fosforilar ADP con Pi por F₁F₀ ATP sintasa para producir ATP ^9,10. Los procesos individuales que ocurren en cada complejo pueden ser explorados con respirometría de alta resolución utilizando electrodos tipo Clark o ensayos de consumo de oxígeno en microplacas^11,12. Además, los modelos de enfermedad y los tratamientos que utilizan mitocondrias aisladas pueden determinar el impacto o la importancia de la función mitocondrial en la progresión de ciertas patologías. Esto ha demostrado ser fructífero en el campo de la cardiología, donde las alteraciones en el suministro de combustible y sustrato se han utilizado para dilucidar cómo la disfunción mitocondrial influye en la insuficiencia cardíaca 13,14,15,16. También se sabe que las mitocondrias influyen en el desarrollo de otras enfermedades como la diabetes, el cáncer, la obesidad, los trastornos neurológicos y las miopatías^17,18. Por lo tanto, el uso de mitocondrias aisladas o purificadas permite investigaciones mecanicistas del metabolismo oxidativo y la producción de ATP en el tejido fuente.

No faltan protocolos de aislamiento mitocondrial debido a su importancia en la investigación bioenergética. Además, se pueden encontrar métodos altamente específicos adaptados a subpoblaciones de mitocondrias dentro de tejidos y células ^19,20. Los pasos básicos del procedimiento son similares entre los métodos de aislamiento, pero se pueden hacer variaciones para la composición del tampón, los pasos de homogeneización y los espines de centrifugación para mejorar la cantidad y la calidad de las mitocondrias. Los cambios en estos aspectos se basan en la demanda metabólica del tejido, la función general del órgano, la densidad mitocondrial y otros factores. En tejidos como el hígado y el músculo esquelético, se utilizan homogeneizadores portátiles para preservar la integridad mitocondrial y limitar el daño a las membranas mitocondriales²¹. Sin embargo, cuando se aísla de los riñones, algunos protocolos sugieren el uso de homogeneización manual o kits comerciales para obtener mejores resultados²². Aunque ambos métodos producen mitocondrias funcionales, la calidad de los orgánulos puede verse comprometida por el tiempo adicional que se tarda en completar los aislamientos utilizando estos protocolos. La centrifugación también es vital para la extracción de proteínas mitocondriales, ya que separa los componentes celulares como los núcleos y otros orgánulos de las mitocondrias²³. Durante el proceso de aislamiento, se debate si se debe implementar la centrifugación diferencial o basada en la densidad para obtener aislados más puros²⁴. Si bien la centrifugación por densidad puede separar las mitocondrias de orgánulos de gravedad específica similar, como los peroxisomas, no está bien establecido si las mitocondrias de estos métodos representan mejor la función de los orgánulos in situ en comparación con las mitocondrias aisladas mediante centrifugación diferencial. En el campo de la fisiología mitocondrial, se prefiere la centrifugación basada en la densidad y puede modificarse fácilmente para aumentar la pureza del aislado. Antes de la experimentación, se debe considerar si se incorporan cambios en las fuerzas g, la duración de la centrifugación y el número de espines de centrifugación debido a su influencia en la purificación mitocondrial. Además, la resuspensión mitocondrial, posiblemente el paso más crucial durante el aislamiento, difiere mucho entre los estudios, con el uso de raspado, mezcla basada en vórtice u homogeneización 23,25,26. La resuspensión mecánica de estos tipos puede ser demasiado abrasiva y perjudicar la integridad de la membrana de las mitocondrias. Por esta razón, se debe realizar un lavado suave para corregir esto. A pesar de la gran cantidad de modulaciones y metodologías sugeridas, hay menos protocolos completos con alta reproducibilidad y adaptabilidad para modelos de roedores.

Los métodos descritos en este documento describen un protocolo detallado, robusto y altamente reproducible que produce mitocondrias purificadas y bien acopladas a partir de tejido cardíaco de animales pequeños. Como se ha demostrado, este método se puede adaptar fácilmente para adaptarse a las necesidades específicas de cada experimento y/o entorno de laboratorio para aislar mitocondrias de riñones, hígado y células cultivadas. Se pueden hacer modificaciones adicionales para aislar las mitocondrias de los tejidos y otros animales que no se enumeran aquí. Se proporcionan recetas de tampón utilizadas para todos los aislamientos y se pueden modificar si es necesario. Al igual que otros protocolos publicados, se implementan la homogeneización motorizada y la centrifugación diferencial; Sin embargo, se realizan ajustes tanto en el tiempo de cizallamiento como en la fuerza a la que se centrifugan las muestras para proporcionar sistemáticamente aislados mitocondriales de alta calidad, dependiendo de la fuente de aislamiento. En particular, este protocolo difiere de otros por el uso de un lavado suave mediante pipeteo para resuspender las mitocondrias granuladas, lo que ayuda a preservar la integridad de la membrana mitocondrial y a mantener la funcionalidad general de los orgánulos. La proteína mitocondrial se cuantifica mediante la determinación de la proteína total o mediante la medición de la actividad de la citrato sintasa. La utilidad y la amplia aplicabilidad de este método de aislamiento están respaldadas por los valores de las proporciones de control respiratorio (RCR) logradas en varios organismos y fuentes de tejidos.

Protocolo

El uso y tratamiento de todos los animales vertebrados se realizó de acuerdo con los protocolos aprobados, revisados y aceptados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Michigan. Este protocolo se diseñó utilizando cobayas albinas Hartley macho y hembra y ratas Sprague Dawley (SD). Para el aislamiento de mitocondrias cardíacas de cobayas, los animales fueron sacrificados a edades comprendidas entre 4-6 semanas (300-450 g). Las mitocondrias cardíacas de ratas SD de ambos sexos se obtuvieron entre las 10-13 semanas de edad (250-400 g). Las recetas de tampones se describen en la Tabla 1 y deben prepararse con anticipación. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación experimental

1. Antes de iniciar el aislamiento, etiquete dos tubos de centrifugación de 50 ml como "Spins 1 and 2" y "Spin 3".
2. Coloque los tubos, el tampón de aislamiento (IB) recién descongelado, unas tijeras afiladas para picar, una sonda de homogeneización ensamblada y un vaso de precipitados de 5 ml o un recipiente de tamaño equivalente sobre hielo.
3. Coloque el tampón de respiración (RB) recién descongelado en una incubadora para calentarlo para los ensayos respiratorios posteriores.
4. Enfriar previamente una centrífuga refrigerada a 4 °C.
5. Asegúrese de que todo el equipo esté dispuesto y de que se hayan añadido 20 μL de 7-15 U/mg de proteasa de Bacillus licheniformis al tubo etiquetado como "Spins 1 and 2".
6. Configure un sistema de presión dependiente de la gravedad para la perfusión mediante canulación utilizando tampón de cardioplejia (CB, Tabla 1), cánula de vidrio y tubo de plástico con una válvula de llave de paso conectada.
7. Organice las herramientas quirúrgicas e incluya tijeras y fórceps adecuados para la disección y canulación del corazón.
   NOTA: Toda el agua debe ser de calidad pura (18,2 MΩ·cm)

2. Disección de tejidos

1. Inyectar a los animales sulfato de heparina estéril por vía intraperitoneal a una dosis de 500 U/kg.
2. Deje que el animal se siente en la cámara de inducción durante 15 minutos después de la administración de heparina. Durante este tiempo, suministre 2 L/min de gas_O2 puro para oxigenar completamente a los animales, calmarlos y minimizar cualquier estrés que pueda tener consecuencias adversas en el tejido de interés.
3. Iniciar la inducción de la anestesia mediante un flujo continuo de isoflurano al 0,5%. Después de 1 minuto, aumente al 1%. Continúe aumentando en un 1% cada minuto hasta alcanzar el 5%. Una vez al 5%, espere 1 min y controle el patrón de respiración del animal.
4. Una vez que la respiración se haya ralentizado y se vuelva dificultosa (aproximadamente a los 6,5 minutos), apague el flujo de isoflurano y oxígeno.
5. Retire rápidamente al animal de la cámara de inducción y verifique la profundidad anestésica adecuada apretando una pata y verificando el reflejo corneal. Si el animal responde a cualquiera de los estímulos, vuelva a colocarlo en la cámara de inducción, vuelva a administrar la anestesia y repita la verificación de la profundidad anestésica.
6. Una vez que se alcanza la profundidad adecuada de anestesia, decapitar rápidamente con una guillotina para cortar la columna cervical y colocar el cuerpo boca abajo en hielo.
7. Realice dos incisiones verticales paralelas desde las clavículas a lo largo de la caja torácica lateral a lo largo del tórax. Asegúrese de que las incisiones sean lo suficientemente profundas como para cortar las costillas en el tórax lateral, pero evite dañar las estructuras intratorácicas como el corazón o los grandes vasos.
   NOTA: El tamaño de las incisiones verticales depende del animal que se utilice. Si usa conejillos de indias y ratas, corte hasta el diafragma (aproximadamente 6,35 cm para ratas y 11 cm para conejillos de indias). Si se utilizan ratones, realizar una toracotomía estándar²⁷.
8. Exponga el corazón usando un hemostático para desplazar el tórax anterior y llenar la cavidad torácica expuesta con hielo. Este paso minimiza el tiempo de isquemia caliente y mejora la viabilidad de los orgánulos aislados.
9. Use pinzas para diseccionar sin rodeos el timo y el pericardio y exponer completamente el corazón.
10. Con fórceps, aplique una tracción inferior suave sobre el corazón para exponer e identificar la aorta. La aorta es el gran vaso más grueso que se ramifica desde la base del corazón. Otros vasos grandes, como la vena pulmonar, son notablemente más translúcidos que la aorta.
11. Corte la aorta aproximadamente 4-6 mm por encima de la raíz aórtica pero por debajo de los puntos de ramificación carotídea.
12. Cánula de la aorta y perfundir el corazón^28,29 con una solución helada para la cardioplejia (CB) utilizando una cabeza de presión dependiente de la gravedad hasta que las arterias coronarias se limpien de sangre y el órgano parezca blanqueado.
    NOTA: Para roedores grandes, un diámetro de cánula de 1,8-2,2 mm funciona bien, mientras que para roedores más pequeños, se recomienda un rango de diámetro de 1,4-1,8 mm. La retroperfusión no debe tardar más de 15-30 s para que los vasos coronarios se limpien de sangre.
13. Aísle el miocardio ventricular mediante la disección de las aurículas, el tejido valvular cartilaginoso y los tejidos grasos.
14. Coloque los ventrículos en un vaso de precipitados preenfriado de 10 mL que contenga 0,1-0,2 mL de IB helado.
15. Picar el pañuelo con unas tijeras quirúrgicas afiladas hasta que los trozos tengan aproximadamente 1 mm³.

3. Purificación mitocondrial y cuantificación de proteínas

1. Transfiera el tejido picado al tubo de centrífuga preenfriado etiquetado como "Splines 1 y 2" que contiene la solución de proteasa.
2. Agregue IB helado hasta un volumen final de 25 mL.
3. Utilizando un homogeneizador de rotor-estator manual motorizado, disperse el tejido a 18.000 rpm en hielo durante 20-25 s.
4. Centrifugar el tejido homogeneizado en un tubo marcado como "Splines 1 y 2" a 8.000 x g durante 10 min a 4 °C.
5. Deseche el sobrenadante (que contiene proteasa) vertiéndolo en la garrafa de desecho y enjuague suavemente el pellet con 5 mL de IB para eliminar la proteasa residual.
6. Después de desechar el enjuague, vuelva a suspender el pellet con IB fresco y helado hasta un volumen final de 25 mL mediante un vórtice suave.
7. Centrifugar a 800 x g durante 10 min a 4 °C.
8. Retire el sobrenadante (contiene mitocondrias) vertiéndolo suavemente en un tubo preenfriado de 50 ml con la etiqueta "Spin 3". Mientras vierte, tenga cuidado de evitar desalojar la parte superior suelta del pellet. Como alternativa, se puede utilizar una pipeta de transferencia o una tireta para recoger el sobrenadante.
9. Centrifugar el sobrenadante a 8000 x g durante 10 min a 4 °C.
10. Deseche el sobrenadante resultante y conserve el gránulo que contiene mitocondrias.
11. Utilice una toallita sin pelusa para absorber el exceso de sobrenadante de la pared interior del tubo, teniendo cuidado de no alterar el pellet. Mantenga el pellet a 4 °C en hielo tanto como sea posible.
12. Para resuspender las mitocondrias, agregue 80 μL de IB helado en el fondo del tubo. Vuelva a suspender suavemente el pellet lavando repetidamente IB sobre el pellet.
13. Para evitar la creación de burbujas, configure una micropipeta para aspirar y suministrar entre 40 y 60 μL de volumen.
14. A medida que el gránulo mitocondrial se dispersa, aumente el volumen de la micropipeta para resuspender eficazmente las mitocondrias granuladas. Evite tocar el pellet con la punta de la pipeta y evite hacer burbujas.
15. Una vez resuspendidas, transfiera las mitocondrias a un tubo de microcentrífuga preenfriado y etiquételas como mitocondrias estándar. Tome nota del volumen total de resuspensión.
16. Para determinar la concentración de proteínas mitocondriales en la muestra, realice un ensayo de proteínas totales utilizando los conocidos ensayos de proteínas BCA o Bradford, según se define en las instrucciones del fabricante.
    NOTA: Una estrategia alternativa o complementaria para evaluar el rendimiento es determinar la actividad de la citrato sintasa. Como referencia, el contenido mitocondrial se puede cuantificar siguiendo el protocolo descrito en Vinnakota et ^al.30.

4. Controles de calidad

1. En un tubo de microcentrífuga preenfriado, diluya el stock mitocondrial hasta la concentración de trabajo deseada con IB.
   NOTA: Las existencias mitocondriales se diluyen a 40 mg/mL para trabajar a una concentración final de 0,1 mg/mL para los ensayos de respirometría cuando se utilizan aislados de tejido cardíaco.
2. Enjuague las cámaras de oxígrafo, los tapones y las jeringas de microlitros diez veces con agua destilada para limpiarlos antes de usarlos en los ensayos de respirometría.
3. Para probar la viabilidad y la calidad de los aislados mitocondriales, cargue 2,3 mL de tampón de respiración (RB) en cámaras de oxígrafo y deje que la señal de consumo de oxígeno se equilibre a 37 °C durante unos 10 minutos o cuando la tasa esté cerca de 0.
4. Una vez que la señal esté equilibrada, empuje hacia abajo los tapones y aspire el exceso de tampón que emerge del capilar del tapón.
5. Agregue 1 mM de EGTA usando una jeringa de microlitros para quelar cualquier calcio residual en los tampones o en la muestra mitocondrial.
6. Para alimentar la respiración, agregue 5 mM de piruvato de sodio y 1 mM de L-malato.
7. Después de la adición de sustratos, agregue un bolo de mitocondrias diluidas para lograr una concentración de trabajo y permitir que la respiración ocurra durante 5 minutos. Este período se denomina FUGA o respiración en estado 2.
8. A los 5 minutos, agregue un bolo de 500 μM de ADP para iniciar la respiración del estado 3, también denominada OXHPOS, y permita que las mitocondrias respiren hasta la anoxia.
9. Calcule la tasa de control respiratorio (RCR) dividiendo la tasa máxima de consumo de oxígeno durante el estado 3 por la tasa de consumo de oxígeno justo antes de la adición de ADP en el estado 2 (consulte la figura 1).
   NOTA: También se puede utilizar una expresión alternativa de RCR de 1 - 1/RCR como métrica de calidad, que está delimitada entre 0 y 1; sin embargo, dificulta la diferenciación de la calidad utilizando esta métrica cuando el RCR > 10 (véase la Figura 2).
10. Enjuague las cámaras y los tapones 10 veces con agua pura para limpiar el oxígrafo y realizar ensayos posteriores. Si la respirometría es completa, llene las cámaras con etanol al 70% y coloque tapones en las cámaras hasta el próximo uso.

Resultados

Una vez finalizado el aislamiento mitocondrial, la calidad y la funcionalidad de los aislados deben probarse mediante la cuantificación de las tasas de consumo de oxígeno (J_O2) mediante respirometría de alta resolución. Para ello, las existencias mitocondriales se diluyeron a 40 mg/mL para permitir concentraciones de trabajo de 0,1 mg/mL en 2 mL de RB para todos los ensayos de respirometría utilizando mitocondrias cardíacas aisladas. La respiración fue alimentada por 5 mM de piruvato de sodio y 1 mM de L-malato en presencia de 1 mM de EGTA, un quelante de calcio, y se permitió que se equilibrara durante 5 min para establecer el estado 2 de la respiración. Durante este estado, las tasas de consumo de oxígeno deben promediar 45-55 pmol/mL/s o 27-33 nmol/mg/min. Tenga en cuenta la tasa de consumo de oxígeno dependiente del electrodo y realice las correcciones de fondo adecuadas cuando sea necesario. La fosforilación oxidativa (estado 3) se inicia a los 5 minutos mediante un bolo de 500 μM de ADP. Las adiciones de sustrato y el trazado representativo se detallan en la Figura 1. Las mitocondrias funcionales tendrán un aumento inmediato de J_O2 después de la adición de ADP, que varía según la fuente de tejido, como se muestra en la Figura 2. Sin el uso de EGTA, el calcio residual tiene efectos variables sobre las tasas máximas de J_O2 durante OXPHOS, dependiendo de la concentración mitocondrial, la disponibilidad de sustrato y otros factores ambientales. La composición del tampón es importante para la preservación de la integridad y funcionalidad de la membrana mitocondrial. Todas las recetas de tampones mencionadas a lo largo del protocolo se detallan con más detalle en la Tabla 1 y se pueden utilizar para todas las preparaciones mitocondriales descritas en este documento.

El aislamiento exitoso de las mitocondrias se denota mediante la obtención de valores de RCR que se encuentran dentro del rango dado para cada especie y fuente de tejido, como se muestra en la Tabla 2. Con base en los datos recopilados con este protocolo, si se aíslan mitocondrias cardíacas de conejillos de indias, ratas o ratones, las RCR deben ser ≥16, ≥8 y ≥5, respectivamente. Si se aísla del hígado o el riñón de rata, los RCR deben ser de ≥6, mientras que los RCR de las células se consideran aceptables si están por encima de 3,8. Si los valores de RCR caen por debajo de estos rangos o si hay diferencias cualitativas en los trazados de la respirometría, se recomienda realizar un ensayo adicional con nuevos RB y sustratos para descartar problemas de contaminación. Aunque la transformación 1-1/RCR limita los valores entre 0 y 1, esta métrica no se recomienda cuando se compara la calidad mitocondrial entre sexos o especies cuando el valor de RCR es superior a 10. Por esta razón, se cuantificaron los valores estándar de RCR (Estado 3/Estado 2 o OXPHOS/LEAK) durante toda la experimentación. En la Tabla 3 se detalla la información sobre las modulaciones que se pueden realizar en este protocolo para aislar mejor las mitocondrias del corazón, el hígado, los riñones y las células de ratón.

Figura 1: Regiones de interés para los controles de calidad mediante respirometría de alta resolución. Las cámaras respiratorias se cargaron con 2 mL de RB y se dejaron equilibrar a 37 °C hasta que la tasa de consumo de oxígeno estuvo cerca de 0. Una vez equilibrado, se añadió 1 mM de EGTA, un quelante de calcio, junto con 5 mM de piruvato de sodio y 1 mM de L-malato. Tras la adición de estos sustratos, se añadieron mitocondrias a la concentración de trabajo deseada (0,1 mg/mL) y se les permitió respirar durante 5 min para alcanzar el estado de respiración 2 (amarillo). A los 5 minutos, se añadieron 500 μM de ADP para iniciar la respiración en el estado 3 (rojo). Los RCR se determinaron promediando en el tiempo las tasas de consumo de oxígeno denotadas por los cuadros rojo y amarillo para comparar el estado 3 con el estado 2. El estado 4 se indica con el recuadro verde y representa el período de hidrolización de la ATPasa extramitocondrial del ATP y se puede utilizar para evaluar la integridad de la membrana externa en los ensayos de citocromo C. Los datos mostrados se recogieron utilizando mitocondrias cardíacas de rata SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Trazos representativos de J_O2 y proporciones de control respiratorio en fuentes animales y de tejidos. La calidad de las mitocondrias aisladas se probó cuantificando las tasas de consumo de oxígeno mediante respirometría de alta resolución. La respiración fue alimentada por 5 mM de piruvato de sodio y 1 mM de L-malato en presencia de 1 mM de EGTA. Se permitió que las mitocondrias y los sustratos respiraran durante 5 minutos para que la respiración en estado 2 se estabilizara. Las tasas máximas de consumo de oxígeno después de la adición de ADP se compararon con las tasas de consumo de oxígeno del estado 2 antes de la ADP para calcular las tasas de control respiratorio (RCR) para cada tejido. La calidad mitocondrial se evaluó adicionalmente mediante el cálculo de los valores de 1-1/RCR caracterizados por los estándares de eficiencia de control de P-L. Los gráficos de barras a la derecha de cada trazado indican los valores promedio de RCR masculino (azul) y femenino y 1-1/RCR ± SD para un tejido determinado. (A), (B) y (C) se refieren a los datos recopilados con conejillos de indias, ratas Sprague Dawley (SD) y corazones de ratón del virus de la leucemia Friend B (FVB), respectivamente. (D) y (E) detallan los resultados del hígado y el riñón de rata SD, mientras que (F) se refiere a las células HEK293. Se recogieron los tres lóbulos hepáticos más grandes, mientras que los dos riñones se utilizaron para el aislamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Recetas tampón. El tampón de cardioplejia (CB), el tampón de aislamiento (IB) y el tampón de respiración (RB) utilizados durante todo el proceso de aislamiento deben prepararse con anticipación de acuerdo con las instrucciones enumeradas. El CB puede almacenarse hasta un mes a 4 °C, mientras que el IB y el RB pueden conservarse durante 4 meses a -80 °C. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Análisis de la relación de control respiratorio. El aislamiento mitocondrial para los análisis funcionales se llevó a cabo en una amplia gama de especies y fuentes de tejidos en roedores machos y hembras, así como en células HEK293. Se detalla el tamaño de la muestra de cada sexo, fuente de tejido y especie junto con los valores promedio de RCR y 1-1/RCR ± DE. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Modulaciones recomendadas al protocolo de aislamiento mitocondrial para diferentes tejidos para aumentar el rendimiento proteico. Los cambios en las cantidades de proteasa y las centrifugaciones se muestran según la fuente de tejido. Las cantidades medias de proteína total (mg) se calcularon a partir de los resultados del ensayo de proteína BSA y el volumen de resuspensión del pellet mitocondrial final. Los valores se informan como la media ± DE. Las instrucciones en negrita incluidas en la columna de centrifugación aconsejan si se debe descartar, retener o agrupar el sobrenadante. El descarte se refiere a la eliminación del sobrenadante en un contenedor de desechos biológicos, mientras que la retención y la agrupación se refieren a transferir el sobrenadante al siguiente tubo de centrifugación o recogerlo para el centrifugado final, respectivamente. Se pueden encontrar más detalles sobre las alteraciones del protocolo en la sección de discusión. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

El cumplimiento de los métodos descritos de manera concisa en este protocolo asegurará el aislamiento de las mitocondrias bien acopladas del tejido cardíaco de pequeños roedores, además de otros tipos de tejidos y fuentes. En general, el proceso debe durar un total de 3-3,5 h, durante las cuales todos los tejidos, muestras y aislados animales deben permanecer en hielo a 4 °C tanto como sea posible para limitar la degradación. Este procedimiento es robusto y puede modificarse de varias maneras para adaptarse mejor a los objetivos experimentales y a los modelos utilizados. Una modulación que se puede realizar durante el proceso de disección de tejidos es la exclusión de la heparina. La heparina se administra para prevenir la formación de coágulos sanguíneos³¹ , pero no es necesaria si el corazón se canula y perfunde lo suficientemente rápido (dentro de 1,5 min después de la decapitación). Además, se recomienda la perfusión del corazón mediante CB para roedores de mayor tamaño, por lo que cuando se trabaja con corazones de ratón u otros órganos se aconseja incluir lavados con IB antes del picado y la homogeneización inicial. Este paso permite descartar la sangre arrastrada por el proceso de disección. Otros cambios incluyen alteraciones en las velocidades de homogeneización y centrifugación para aumentar el rendimiento de proteína mitocondrial. Los descritos anteriormente son para aislar mitocondrias cardíacas de conejillos de indias y ratas. Es importante destacar que este protocolo se puede adaptar para aislar mitocondrias del hígado, los riñones, los corazones de los ratones y las células de roedores. Las alteraciones recomendadas en el volumen de proteasa, homogeneización y centrifugación en función de tipos de tejidos y animales específicos se detallan con más detalle en la Tabla 3.

Después de la formación de la pastilla mitocondrial purificada a partir de la etapa final de centrifugación, las mitocondrias deben resuspenderse en IB preenfriado. El volumen de IB añadido depende del tamaño de la pastilla mitocondrial, pero es de unos 80 μL para los conejillos de indias y las ratas. Si se aísla de corazones de ratón, se añaden 60 μL de IB para la resuspensión. Al aislar las mitocondrias por primera vez, se recomienda agregar volúmenes más pequeños de IB para no diluir la solución madre. Debido a la consistencia de los gránulos mitocondriales formados después de purificar muestras del hígado y los riñones, se debe agregar mucho menos IB (20 μL) para la resuspensión. Otros métodos sugieren el uso de la resuspensión mecánica a través del raspado que puede ser abrasivo para las membranas mitocondriales y disminuir la integridad general^32,33. Al utilizar este protocolo, se recomienda lavar suavemente el pellet con IB para mejorar la calidad de las mitocondrias. Durante este proceso, hay que tener cuidado de evitar la producción de burbujas o de alterar el pellet con la punta de la pipeta, ya que esto puede provocar la ruptura de la membrana y el mal plegamiento de las proteínas³⁴. Solo empujar hasta el primer tope de la pipeta puede ayudar a reducir la probabilidad de que se formen burbujas. Se debe lavar suavemente la pipeta hasta que la totalidad del pellet esté en suspensión. El rendimiento total de resuspensión debe ser de 150-200 μL para las mitocondrias cardíacas de cobayas y ratas y aparecer de color marrón claro. Las muestras más concentradas tendrán un tono marrón más oscuro y se pueden diluir para adaptarse al rango de concentración de trabajo deseado después de la cuantificación de la proteína mitocondrial.

Los ensayos de proteínas estándar que utilizan BSA son óptimos para la cuantificación de proteínas mitocondriales³⁵. Los ensayos de proteínas deben retrasarse e incubarse durante las duraciones y temperaturas recomendadas definidas por el protocolo del fabricante. En el caso de las mitocondrias aisladas, la incubación a 37 °C durante 30 minutos permite un desarrollo de color bien extendido y una cuantificación precisa de las proteínas. Al cuantificar la cantidad total de proteína, se recomienda al principio diluir las mitocondrias resuspendidas y el IB en proporciones de 1:50, 1:100 y 1:200 para garantizar que los resultados del ensayo de proteínas estén dentro del rango de calibración. En el kit del fabricante se proporcionan más detalles sobre cómo realizar ensayos de proteínas utilizando BSA como estándar, por lo que es posible que las recomendaciones enumeradas en este documento no sean aplicables. También se debe realizar un ensayo de CS para determinar el contenido mitocondrial en cada muestra. Este ensayo está bien establecido y permite una mayor normalización si se estudian las diferencias biológicas entre los subtipos mitocondriales³⁶.

Después de la determinación de proteínas, el stock mitocondrial debe diluirse para lograr la concentración final de trabajo deseada para los ensayos de respirometría. Las mitocondrias aisladas de conejillos de indias y corazones de rata se diluyen a 40 mg/mL, y se añaden 5 μL de este stock a la cámara respiratoria para obtener una concentración de trabajo de 0,1 mg/mL. Si se aísla de corazones de ratón individuales o de riñones e hígado, es posible que no sea necesario diluir el stock mitocondrial. También se pueden agregar mayores volúmenes de mitocondrias para obtener las concentraciones deseadas. Las tasas de consumo de oxígeno durante el estado 2 que están entre 35-55 pmol/mL/s son aceptables para la mayoría de los análisis de respirometría²⁸. Los detalles sobre cómo se realizan y analizan los RCR se explican en la Figura 1 y en la sección de resultados representativos; Sin embargo, es importante tener en cuenta que la respiración es alimentada por piruvato y malato. Otras condiciones del sustrato, como el succinato y la rotenona, darán lugar a diferentes valores de RCR, ya que la relación P/O y otras variables bioenergéticas son diferentes³⁷. El uso de piruvato y malato como combustibles respiratorios logra una rotación casi máxima del ciclo de TCA y la producción de equivalentes reductores; sin embargo, la actividad máxima del ciclo de TCA y la función ETS acoplada se obtienen con 5 mM de piruvato, 1 mM de L-malato y 20 mM de succinato. Al estimular la fosforilación oxidativa para cuantificar las tasas de consumo de oxígeno durante el estado 3, se añade ADP a concentraciones de al menos 10 veces el K_D estimado para el ADP del translocador de nucleótidos de adenina³⁸. Esto se puede lograr mediante bolos superiores a 350 μM de ADP, y es por eso que se utilizaron 500 μM en todos los ensayos experimentales. Si la duración del estado 3 es demasiado corta, se pueden utilizar concentraciones mitocondriales más bajas para prolongarlo. Para un análisis más detallado de la respiración, se pueden realizar modulaciones en la concentración de ADP que se introduce en el sistema para adaptarse mejor a los parámetros experimentales³⁹. Cuando se desarrolló por primera vez este protocolo, se utilizó un ensayo de citocromo C para evaluar la integridad de la membrana externa de los aislados mitocondriales⁴⁰. Si los valores de RCR están por debajo de los rangos esperados, realice la prueba del citocromo C para evaluar si el daño a la membrana externa es significativo. Para ello, añada 10 μM de citocromo C a la cámara respiratoria y confirme que el aumento de la respiración está por debajo del 5 o el 10% de la tasa del estado 4. Los rangos esperados se encuentran a partir de estudios publicados anteriormente y son específicos de la especie, el tejido y el sustrato. Si la adición de citocromo c estimula la respiración en estado 4 por encima del 10%, se puede repetir el último centrifugado de 8.000 x g para eliminar las mitocondrias dañadas. Dicho esto, el daño de la membrana externa puede ser parte del fenotipo de una enfermedad y, por lo tanto, la prueba del citocromo C debe interpretarse teniendo esto en cuenta⁴¹. Una vez que se obtienen valores de RCR consistentemente altos con efectos estimulados por el citocromo C bajos (<10%), esta prueba solo se hace necesaria y aconsejable si los valores de RCR se encuentran fuera de los rangos aceptables. Si la prueba de citocromo C es de <10% y los valores de RCR se encuentran fuera del rango esperado, como se detalla en la Tabla 2, repita el ensayo de respirometría con nuevo RB después de lavar con agua destilada 10 veces. Si aún se observan tasas disminuidas, es necesario fabricar reactivos frescos (piruvato, malato, EGTA y ADP) para diagnosticar el problema. Además, los ensayos de citocromo C se pueden realizar mediante ELISA y el uso de colorantes mitocondriales como TMRE^33,42. Dependiendo del tipo de tejido y la fuente, estas opciones pueden ser más adecuadas para determinar la integridad de la membrana externa.

Si bien no hay limitaciones importantes en el uso de este protocolo para aislar las mitocondrias cardíacas, es importante tener en cuenta que se deben tener en cuenta ciertas consideraciones al utilizar estos métodos. La calidad de los aislados mitocondriales se ve muy afectada por la temperatura y el tiempo necesario para perfundir el corazón y resuspender el pellet purificado. Por lo tanto, es posible que se requiera familiaridad con estos procesos para obtener RCR comparables a los que se informan aquí. Además, la composición de los tampones y soluciones utilizados durante el proceso de aislamiento es importante, ya que afecta directamente a la integridad y función mitocondrial⁴³. Los tampones enumerados en la Tabla 1 se proporcionan como referencias y han permitido el aislamiento de mitocondrias bien acopladas en una variedad de fuentes de tejidos, pero se pueden realizar cambios para limitar la cantidad de cloruro en los análisis de respiración, ya que esto puede interferir con la translocación de nucleótidos de adenina y la función ETS²⁸. La composición del tampón también se puede alterar para aislar mejor las mitocondrias hepáticas. Dado que el hígado tiene concentraciones altas de ácidos grasos, se aconseja lavar el órgano y el tejido picado con un tampón que contenga concentraciones elevadas de BSA si se observan RCR fuera del rango esperado. Aunque la calidad de los aislados mitocondriales obtenidos de secciones hepáticas está bien acoplada y es consistente, esta alteración podría resultar en una mejor función de los orgánulos. También debe reconocerse que el aislamiento de las mitocondrias de las células que utilizan estos métodos requiere una gran cantidad de células cultivadas, lo que plantea una limitación potencial. Además, este protocolo no está diseñado específicamente para aislados celulares, pero ha demostrado ser exitoso cuando se implementa. Por lo tanto, los métodos de aislamiento dirigidos para células cultivadas pueden ser de mejor uso. Alternativamente, para evaluar la calidad mitocondrial, los investigadores pueden optar por sondas fluorescentes para calcular los RCR. Los métodos espectrofluorométricos son una opción popular, especialmente si se extraen cantidades más bajas de proteína^44,45.

En general, este protocolo se puede utilizar para aislar sistemáticamente mitocondrias cardíacas bien acopladas de animales pequeños como conejillos de indias y ratas. Se puede modificar fácilmente para aumentar los rendimientos de proteínas cambiando las velocidades de homogeneización, los tiempos de centrifugación y el número de espines para permitir el aislamiento mitocondrial de los corazones, el hígado, los riñones y las células de ratón. Además, este protocolo es lo suficientemente general y robusto como para que se haya utilizado para investigar la función mitocondrial de especies no mamíferas como la lamprea de mar⁴⁶, así como para realizar análisis estructurales utilizando microscopía clásica y crioelectrónica^40,47. Si bien muchos estudios recientes se centran en la exploración del comportamiento mitocondrial en sistemas celulares y tisulares intactos, la amplitud y profundidad de la información extraída de mitocondrias aisladas utilizando estos métodos revela impactos en la metabolómica, el estrés oxidativo y la producción de ATP que nunca carecerán de mérito. El aislamiento de mitocondrias bien acopladas permite a los investigadores investigar aspectos clave del desarrollo y la progresión de la enfermedad que de otro modo no serían posibles en modelos de células completas. Debido a la versatilidad de este protocolo, los cambios en la energética mitocondrial observados en patologías como enfermedades cardiovasculares, diabetes y trastornos neurológicos pueden ser explorados utilizando la metodología aquí descrita.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de microcentrífuga de 1,7 mL Vaso de
10 mL	Para disección y picado de órganos
		A5285	Ensayos de respirometría
Kit de ensayo de proteínas BSA	Thermo Scentific	PI23225	Cuantificación de proteínas mitocondriales
Dextrosa	Sigma	DX0145	Para tampón (CB)
Etilenglicol-bis(2-amino-etiléter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético	Sigma	E4378	Para tampones (CB e IB) y ensayos de respirometría
Cánula de vidrio	Radnoti		Perfusión cardíaca para conejillos de indias y ratas
Heparina sódica mucosa porcina	Sigma	SRE0027-250KU	Inyección IP animal
Respirómetro			Electrodo tipo Clark; Oxígrafo con cámaras de 2 mL Cámara
			de inducción
Isoflurano	Sigma	792632	Anestésico
Ácido L-málico	Sigma	02288-50G Ensayos de	respirometría
Cloruro de magnesio hexahidratado	Sigma	M9272	Para tampón (RB)
Manitol	Sigma	MX0214
		microlitros	Tamaños que van desde 5– 50 y micro; L Lector
		microplacas	Debe ser capaz de incubar a 37 ° C
MOPS	Sigma	475898	Para todos los tampones
O2 tanque
OMNI THQ Homogeneizador	OMNI International	12-500	Homogeneizadores de estator de rotor similares funcionarán
pipetas			Volúmenes de   2– 20 y micro; L; 20– 200 y micro; L; 200– 1000 y micro; L
Cloruro de potasio	Sigma	P3911	Para tampones (RB y CB)
Fosfato de potasio dibásico	Sigma	795496	Para tampones (IB y RB)
Proteasa de Bacillus licheniformis	Sigma	P5459
Cloruro de sodio	Sigma	S9888	Para tampón (CB)
Piruvato de sodio	Biorreactivos Fisher	BP356-100	Ensayos de respirometría
Sacarosa	Sigma	8510-OP	Para tampón (IB)
		disección quirúrgica	Depende del animal y de la fuente
de tejido Centrífuga			Debe enfriarse a 4 °C; C