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Artículo de método

Aislamiento mitocondrial robusto del tejido cardíaco de roedores

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DOI:

10.3791/67093

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23 de agosto de 2024

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1Department of Physiology, Michigan State University, 2Department of Kinesiology, Michigan State University

En este artículo

Resumen

Los estudios bioenergéticos y metabolómicos de las mitocondrias han revelado su papel multifacético en muchas enfermedades, pero los métodos de aislamiento de estos orgánulos varían. El método detallado aquí es capaz de purificar mitocondrias de alta calidad a partir de múltiples fuentes de tejidos. La calidad se determina mediante las proporciones de control respiratorio y otras métricas evaluadas con respirometría de alta resolución.

Resumen

El aislamiento mitocondrial se ha practicado durante décadas, siguiendo los procedimientos establecidos por pioneros en los campos de la biología molecular y la bioquímica para estudiar las deficiencias metabólicas y las enfermedades. Es necesaria una calidad mitocondrial constante para investigar adecuadamente la fisiología mitocondrial y la bioenergética; Sin embargo, hay muchos métodos de aislamiento diferentes publicados disponibles para los investigadores. Aunque las diferentes estrategias experimentales requieren diferentes métodos de aislamiento, los principios y procedimientos básicos son similares. Este protocolo detalla un método capaz de extraer mitocondrias bien acopladas de una variedad de fuentes de tejidos, incluidos animales pequeños y células. Los pasos descritos incluyen la disección de órganos, la purificación mitocondrial, la cuantificación de proteínas y varios controles de calidad. La principal métrica de control de calidad utilizada para identificar mitocondrias de alta calidad es el índice de control respiratorio (RCR). El RCR es la relación entre la frecuencia respiratoria durante la fosforilación oxidativa y la tasa en ausencia de ADP. Se discuten métricas alternativas. Si bien con este protocolo se obtienen valores altos de RCR en relación con su fuente de tejido, se pueden optimizar varios pasos para satisfacer las necesidades individuales de los investigadores. Este procedimiento es robusto y ha dado lugar sistemáticamente a mitocondrias aisladas con valores de RCR superiores a la media en modelos animales y fuentes de tejidos.

Introducción

Las mitocondrias son orgánulos subcelulares que establecen condiciones energéticas citoplasmáticas optimizadas para funciones celulares específicas. Si bien los estudios a nivel celular, de tejidos y de organismos pueden proporcionar información sobre la función mitocondrial, el aislamiento de los orgánulos ofrece un nivel de control experimental que no sería posible de otra manera. Los aislamientos mitocondriales se han realizado desde la década de 1940, lo que permite estudios mecanicistas del metabolismo y la respiración en una variedad de células y tejidos 1,2. La relevancia histórica de las mitocondrias también está bien documentada3. Como principales productoras de ATP, las mitocondrias desempeñan muchas funciones clave que son vitales para el funcionamiento óptimo de las células y losórganos. Dentro de la matriz mitocondrial, los sustratos son oxidados por el ciclo del TCA, produciendo equivalentes reductores y portadores de electrones móviles como NADH y UQH2 5,6. El citocromo C es el tercer principal portador móvil de electrones en la red de reacciones bioquímicas mitocondriales7. Estas moléculas son luego oxidadas por los complejos transmembrana del sistema de transporte de electrones (ETS) incrustados en la membrana mitocondrial interna8. Las reacciones redox del ETS se acoplan con la translocación de protones de la matriz al espacio intermembrana. Estos procesos establecen un gradiente electroquímico de protones que se utiliza para fosforilar ADP con Pi por F1F0 ATP sintasa para producir ATP 9,10. Los procesos individuales que ocurren en cada complejo pueden ser explorados con respirometría de alta resolución utilizando electrodos tipo Clark o ensayos de consumo de oxígeno en microplacas11,12. Además, los modelos de enfermedad y los tratamientos que utilizan mitocondrias aisladas pueden determinar el impacto o la importancia de la función mitocondrial en la progresión de ciertas patologías. Esto ha demostrado ser fructífero en el campo de la cardiología, donde las alteraciones en el suministro de combustible y sustrato se han utilizado para dilucidar cómo la disfunción mitocondrial influye en la insuficiencia cardíaca 13,14,15,16. También se sabe que las mitocondrias influyen en el desarrollo de otras enfermedades como la diabetes, el cáncer, la obesidad, los trastornos neurológicos y las miopatías17,18. Por lo tanto, el uso de mitocondrias aisladas o purificadas permite investigaciones mecanicistas del metabolismo oxidativo y la producción de ATP en el tejido fuente.

No faltan protocolos de aislamiento mitocondrial debido a su importancia en la investigación bioenergética. Además, se pueden encontrar métodos altamente específicos adaptados a subpoblaciones de mitocondrias dentro de tejidos y células 19,20. Los pasos básicos del procedimiento son similares entre los métodos de aislamiento, pero se pueden hacer variaciones para la composición del tampón, los pasos de homogeneización y los espines de centrifugación para mejorar la cantidad y la calidad de las mitocondrias. Los cambios en estos aspectos se basan en la demanda metabólica del tejido, la función general del órgano, la densidad mitocondrial y otros factores. En tejidos como el hígado y el músculo esquelético, se utilizan homogeneizadores portátiles para preservar la integridad mitocondrial y limitar el daño a las membranas mitocondriales21. Sin embargo, cuando se aísla de los riñones, algunos protocolos sugieren el uso de homogeneización manual o kits comerciales para obtener mejores resultados22. Aunque ambos métodos producen mitocondrias funcionales, la calidad de los orgánulos puede verse comprometida por el tiempo adicional que se tarda en completar los aislamientos utilizando estos protocolos. La centrifugación también es vital para la extracción de proteínas mitocondriales, ya que separa los componentes celulares como los núcleos y otros orgánulos de las mitocondrias23. Durante el proceso de aislamiento, se debate si se debe implementar la centrifugación diferencial o basada en la densidad para obtener aislados más puros24. Si bien la centrifugación por densidad puede separar las mitocondrias de orgánulos de gravedad específica similar, como los peroxisomas, no está bien establecido si las mitocondrias de estos métodos representan mejor la función de los orgánulos in situ en comparación con las mitocondrias aisladas mediante centrifugación diferencial. En el campo de la fisiología mitocondrial, se prefiere la centrifugación basada en la densidad y puede modificarse fácilmente para aumentar la pureza del aislado. Antes de la experimentación, se debe considerar si se incorporan cambios en las fuerzas g, la duración de la centrifugación y el número de espines de centrifugación debido a su influencia en la purificación mitocondrial. Además, la resuspensión mitocondrial, posiblemente el paso más crucial durante el aislamiento, difiere mucho entre los estudios, con el uso de raspado, mezcla basada en vórtice u homogeneización 23,25,26. La resuspensión mecánica de estos tipos puede ser demasiado abrasiva y perjudicar la integridad de la membrana de las mitocondrias. Por esta razón, se debe realizar un lavado suave para corregir esto. A pesar de la gran cantidad de modulaciones y metodologías sugeridas, hay menos protocolos completos con alta reproducibilidad y adaptabilidad para modelos de roedores.

Los métodos descritos en este documento describen un protocolo detallado, robusto y altamente reproducible que produce mitocondrias purificadas y bien acopladas a partir de tejido cardíaco de animales pequeños. Como se ha demostrado, este método se puede adaptar fácilmente para adaptarse a las necesidades específicas de cada experimento y/o entorno de laboratorio para aislar mitocondrias de riñones, hígado y células cultivadas. Se pueden hacer modificaciones adicionales para aislar las mitocondrias de los tejidos y otros animales que no se enumeran aquí. Se proporcionan recetas de tampón utilizadas para todos los aislamientos y se pueden modificar si es necesario. Al igual que otros protocolos publicados, se implementan la homogeneización motorizada y la centrifugación diferencial; Sin embargo, se realizan ajustes tanto en el tiempo de cizallamiento como en la fuerza a la que se centrifugan las muestras para proporcionar sistemáticamente aislados mitocondriales de alta calidad, dependiendo de la fuente de aislamiento. En particular, este protocolo difiere de otros por el uso de un lavado suave mediante pipeteo para resuspender las mitocondrias granuladas, lo que ayuda a preservar la integridad de la membrana mitocondrial y a mantener la funcionalidad general de los orgánulos. La proteína mitocondrial se cuantifica mediante la determinación de la proteína total o mediante la medición de la actividad de la citrato sintasa. La utilidad y la amplia aplicabilidad de este método de aislamiento están respaldadas por los valores de las proporciones de control respiratorio (RCR) logradas en varios organismos y fuentes de tejidos.

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Protocolo

El uso y tratamiento de todos los animales vertebrados se realizó de acuerdo con los protocolos aprobados, revisados y aceptados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Michigan. Este protocolo se diseñó utilizando cobayas albinas Hartley macho y hembra y ratas Sprague Dawley (SD). Para el aislamiento de mitocondrias cardíacas de cobayas, los animales fueron sacrificados a edades comprendidas entre 4-6 semanas (300-450 g). Las mitocondrias cardíacas de ratas SD de ambos sexos se obtuvieron entre las 10-13 semanas de edad (250-400 g). Las recetas de tampones se describen en la Tabla 1 y deben prepararse con anticipación. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación experimental

  1. Antes de iniciar el aislamiento, etiquete dos tubos de centrifugación de 50 ml como "Spins 1 and 2" y "Spin 3".
  2. Coloque los tubos, el tampón de aislamiento (IB) recién descongelado, unas tijeras afiladas para picar, una sonda de homogeneización ensamblada y un vaso de precipitados de 5 ml o un recipiente de tamaño equivalente sobre hielo.
  3. Coloque el tampón de respiración (RB) recién descongelado en una incubadora para calentarlo para los ensayos respiratorios posteriores.
  4. Enfriar previamente una centrífuga refrigerada a 4 °C.
  5. Asegúrese de que todo el equipo esté dispuesto y de que se hayan añadido 20 μL de 7-15 U/mg de proteasa de Bacillus licheniformis al tubo etiquetado como "Spins 1 and 2".
  6. Configure un sistema de presión dependiente de la gravedad para la perfusión mediante canulación utilizando tampón de cardioplejia (CB, Tabla 1), cánula de vidrio y tubo de plástico con una válvula de llave de paso conectada.
  7. Organice las herramientas quirúrgicas e incluya tijeras y fórceps adecuados para la disección y canulación del corazón.
    NOTA: Toda el agua debe ser de calidad pura (18,2 MΩ·cm)

2. Disección de tejidos

  1. Inyectar a los animales sulfato de heparina estéril por vía intraperitoneal a una dosis de 500 U/kg.
  2. Deje que el animal se siente en la cámara de inducción durante 15 minutos después de la administración de heparina. Durante este tiempo, suministre 2 L/min de gasO2 puro para oxigenar completamente a los animales, calmarlos y minimizar cualquier estrés que pueda tener consecuencias adversas en el tejido de interés.
  3. Iniciar la inducción de la anestesia mediante un flujo continuo de isoflurano al 0,5%. Después de 1 minuto, aumente al 1%. Continúe aumentando en un 1% cada minuto hasta alcanzar el 5%. Una vez al 5%, espere 1 min y controle el patrón de respiración del animal.
  4. Una vez que la respiración se haya ralentizado y se vuelva dificultosa (aproximadamente a los 6,5 minutos), apague el flujo de isoflurano y oxígeno.
  5. Retire rápidamente al animal de la cámara de inducción y verifique la profundidad anestésica adecuada apretando una pata y verificando el reflejo corneal. Si el animal responde a cualquiera de los estímulos, vuelva a colocarlo en la cámara de inducción, vuelva a administrar la anestesia y repita la verificación de la profundidad anestésica.
  6. Una vez que se alcanza la profundidad adecuada de anestesia, decapitar rápidamente con una guillotina para cortar la columna cervical y colocar el cuerpo boca abajo en hielo.
  7. Realice dos incisiones verticales paralelas desde las clavículas a lo largo de la caja torácica lateral a lo largo del tórax. Asegúrese de que las incisiones sean lo suficientemente profundas como para cortar las costillas en el tórax lateral, pero evite dañar las estructuras intratorácicas como el corazón o los grandes vasos.
    NOTA: El tamaño de las incisiones verticales depende del animal que se utilice. Si usa conejillos de indias y ratas, corte hasta el diafragma (aproximadamente 6,35 cm para ratas y 11 cm para conejillos de indias). Si se utilizan ratones, realizar una toracotomía estándar27.
  8. Exponga el corazón usando un hemostático para desplazar el tórax anterior y llenar la cavidad torácica expuesta con hielo. Este paso minimiza el tiempo de isquemia caliente y mejora la viabilidad de los orgánulos aislados.
  9. Use pinzas para diseccionar sin rodeos el timo y el pericardio y exponer completamente el corazón.
  10. Con fórceps, aplique una tracción inferior suave sobre el corazón para exponer e identificar la aorta. La aorta es el gran vaso más grueso que se ramifica desde la base del corazón. Otros vasos grandes, como la vena pulmonar, son notablemente más translúcidos que la aorta.
  11. Corte la aorta aproximadamente 4-6 mm por encima de la raíz aórtica pero por debajo de los puntos de ramificación carotídea.
  12. Cánula de la aorta y perfundir el corazón28,29 con una solución helada para la cardioplejia (CB) utilizando una cabeza de presión dependiente de la gravedad hasta que las arterias coronarias se limpien de sangre y el órgano parezca blanqueado.
    NOTA: Para roedores grandes, un diámetro de cánula de 1,8-2,2 mm funciona bien, mientras que para roedores más pequeños, se recomienda un rango de diámetro de 1,4-1,8 mm. La retroperfusión no debe tardar más de 15-30 s para que los vasos coronarios se limpien de sangre.
  13. Aísle el miocardio ventricular mediante la disección de las aurículas, el tejido valvular cartilaginoso y los tejidos grasos.
  14. Coloque los ventrículos en un vaso de precipitados preenfriado de 10 mL que contenga 0,1-0,2 mL de IB helado.
  15. Picar el pañuelo con unas tijeras quirúrgicas afiladas hasta que los trozos tengan aproximadamente 1 mm3.

3. Purificación mitocondrial y cuantificación de proteínas

  1. Transfiera el tejido picado al tubo de centrífuga preenfriado etiquetado como "Splines 1 y 2" que contiene la solución de proteasa.
  2. Agregue IB helado hasta un volumen final de 25 mL.
  3. Utilizando un homogeneizador de rotor-estator manual motorizado, disperse el tejido a 18.000 rpm en hielo durante 20-25 s.
  4. Centrifugar el tejido homogeneizado en un tubo marcado como "Splines 1 y 2" a 8.000 x g durante 10 min a 4 °C.
  5. Deseche el sobrenadante (que contiene proteasa) vertiéndolo en la garrafa de desecho y enjuague suavemente el pellet con 5 mL de IB para eliminar la proteasa residual.
  6. Después de desechar el enjuague, vuelva a suspender el pellet con IB fresco y helado hasta un volumen final de 25 mL mediante un vórtice suave.
  7. Centrifugar a 800 x g durante 10 min a 4 °C.
  8. Retire el sobrenadante (contiene mitocondrias) vertiéndolo suavemente en un tubo preenfriado de 50 ml con la etiqueta "Spin 3". Mientras vierte, tenga cuidado de evitar desalojar la parte superior suelta del pellet. Como alternativa, se puede utilizar una pipeta de transferencia o una tireta para recoger el sobrenadante.
  9. Centrifugar el sobrenadante a 8000 x g durante 10 min a 4 °C.
  10. Deseche el sobrenadante resultante y conserve el gránulo que contiene mitocondrias.
  11. Utilice una toallita sin pelusa para absorber el exceso de sobrenadante de la pared interior del tubo, teniendo cuidado de no alterar el pellet. Mantenga el pellet a 4 °C en hielo tanto como sea posible.
  12. Para resuspender las mitocondrias, agregue 80 μL de IB helado en el fondo del tubo. Vuelva a suspender suavemente el pellet lavando repetidamente IB sobre el pellet.
  13. Para evitar la creación de burbujas, configure una micropipeta para aspirar y suministrar entre 40 y 60 μL de volumen.
  14. A medida que el gránulo mitocondrial se dispersa, aumente el volumen de la micropipeta para resuspender eficazmente las mitocondrias granuladas. Evite tocar el pellet con la punta de la pipeta y evite hacer burbujas.
  15. Una vez resuspendidas, transfiera las mitocondrias a un tubo de microcentrífuga preenfriado y etiquételas como mitocondrias estándar. Tome nota del volumen total de resuspensión.
  16. Para determinar la concentración de proteínas mitocondriales en la muestra, realice un ensayo de proteínas totales utilizando los conocidos ensayos de proteínas BCA o Bradford, según se define en las instrucciones del fabricante.
    NOTA: Una estrategia alternativa o complementaria para evaluar el rendimiento es determinar la actividad de la citrato sintasa. Como referencia, el contenido mitocondrial se puede cuantificar siguiendo el protocolo descrito en Vinnakota et al.30.

4. Controles de calidad

  1. En un tubo de microcentrífuga preenfriado, diluya el stock mitocondrial hasta la concentración de trabajo deseada con IB.
    NOTA: Las existencias mitocondriales se diluyen a 40 mg/mL para trabajar a una concentración final de 0,1 mg/mL para los ensayos de respirometría cuando se utilizan aislados de tejido cardíaco.
  2. Enjuague las cámaras de oxígrafo, los tapones y las jeringas de microlitros diez veces con agua destilada para limpiarlos antes de usarlos en los ensayos de respirometría.
  3. Para probar la viabilidad y la calidad de los aislados mitocondriales, cargue 2,3 mL de tampón de respiración (RB) en cámaras de oxígrafo y deje que la señal de consumo de oxígeno se equilibre a 37 °C durante unos 10 minutos o cuando la tasa esté cerca de 0.
  4. Una vez que la señal esté equilibrada, empuje hacia abajo los tapones y aspire el exceso de tampón que emerge del capilar del tapón.
  5. Agregue 1 mM de EGTA usando una jeringa de microlitros para quelar cualquier calcio residual en los tampones o en la muestra mitocondrial.
  6. Para alimentar la respiración, agregue 5 mM de piruvato de sodio y 1 mM de L-malato.
  7. Después de la adición de sustratos, agregue un bolo de mitocondrias diluidas para lograr una concentración de trabajo y permitir que la respiración ocurra durante 5 minutos. Este período se denomina FUGA o respiración en estado 2.
  8. A los 5 minutos, agregue un bolo de 500 μM de ADP para iniciar la respiración del estado 3, también denominada OXHPOS, y permita que las mitocondrias respiren hasta la anoxia.
  9. Calcule la tasa de control respiratorio (RCR) dividiendo la tasa máxima de consumo de oxígeno durante el estado 3 por la tasa de consumo de oxígeno justo antes de la adición de ADP en el estado 2 (consulte la figura 1).
    NOTA: También se puede utilizar una expresión alternativa de RCR de 1 - 1/RCR como métrica de calidad, que está delimitada entre 0 y 1; sin embargo, dificulta la diferenciación de la calidad utilizando esta métrica cuando el RCR > 10 (véase la Figura 2).
  10. Enjuague las cámaras y los tapones 10 veces con agua pura para limpiar el oxígrafo y realizar ensayos posteriores. Si la respirometría es completa, llene las cámaras con etanol al 70% y coloque tapones en las cámaras hasta el próximo uso.

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Resultados

Una vez finalizado el aislamiento mitocondrial, la calidad y la funcionalidad de los aislados deben probarse mediante la cuantificación de las tasas de consumo de oxígeno (JO2) mediante respirometría de alta resolución. Para ello, las existencias mitocondriales se diluyeron a 40 mg/mL para permitir concentraciones de trabajo de 0,1 mg/mL en 2 mL de RB para todos los ensayos de respirometría utilizando mitocondrias cardíacas aisladas. La respiración fue alimentada por 5 mM de piruvato de sodio y 1 mM d...

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Discusión

El cumplimiento de los métodos descritos de manera concisa en este protocolo asegurará el aislamiento de las mitocondrias bien acopladas del tejido cardíaco de pequeños roedores, además de otros tipos de tejidos y fuentes. En general, el proceso debe durar un total de 3-3,5 h, durante las cuales todos los tejidos, muestras y aislados animales deben permanecer en hielo a 4 °C tanto como sea posible para limitar la degradación. Este procedimiento es robusto y puede modificarse de varias ma...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no hay nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Daniel A. Beard y Kalyan C. Vinnakota por sus contribuciones fundamentales a este protocolo. Este trabajo fue financiado por la subvención NSF CAREER MCB-2237117.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de microcentrífuga de 1,7 mL Vaso de
10 mLPara disección y picado de órganos
A5285Ensayos de respirometría
Kit de ensayo de proteínas BSAThermo ScentificPI23225Cuantificación de proteínas mitocondriales
DextrosaSigma DX0145Para tampón (CB)
Etilenglicol-bis(2-amino-etiléter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético Sigma E4378Para tampones (CB e IB) y ensayos de respirometría
Cánula de vidrioRadnotiPerfusión cardíaca para conejillos de indias y ratas
Heparina sódica mucosa porcinaSigma SRE0027-250KUInyección IP animal
RespirómetroElectrodo tipo Clark; Oxígrafo con cámaras de 2 mL Cámara
de inducción
IsofluranoSigma 792632Anestésico 
Ácido L-málicoSigma 02288-50G Ensayos derespirometría
Cloruro de magnesio hexahidratadoSigma M9272Para tampón (RB)
ManitolSigma MX0214
microlitrosTamaños que van desde 5– 50 y micro; L Lector
microplacasDebe ser capaz de incubar a 37 ° C 
MOPSSigma 475898Para todos los tampones
O2 tanque
OMNI THQ HomogeneizadorOMNI International 12-500Homogeneizadores de estator de rotor similares funcionarán
pipetasVolúmenes de   2– 20 y micro; L; 20– 200 y micro; L; 200– 1000 y micro; L
Cloruro de potasioSigma P3911Para tampones (RB y CB)
Fosfato de potasio dibásicoSigma 795496Para tampones (IB y RB)
Proteasa de Bacillus licheniformisSigma P5459
Cloruro de sodioSigma S9888Para tampón (CB)
Piruvato de sodioBiorreactivos FisherBP356-100Ensayos de respirometría
SacarosaSigma 8510-OPPara tampón (IB)
disección quirúrgicaDepende del animal y de la fuente
de tejido CentrífugaDebe enfriarse a 4 °C; C 
precipitados de vidrio de Tubos de centrífuga de 50 mL Centrifugación Adenosina 5'-difosfato sal monopotásica dihidratada Sigma  de alta resolución Para jeringas de tampón (IB) deKit de de mesa

Referencias

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