Determinación de la función ciliar y la impermeabilidad de la membrana del epitelio pseudoestratificado de la vía aérea pulmonar

Summary

El cultivo de la interfaz aire-líquido se usa comúnmente para desarrollar epitelio pseudoestratificado de las vías respiratorias mediante la diferenciación de células epiteliales bronquiales humanas normales primarias que imitan el lado apical de las vías respiratorias pulmonares. Aquí, describimos un protocolo sencillo para determinar su calidad mediante el monitoreo de sus propiedades biofísicas, como la función ciliar y la integridad de la membrana.

Abstract

La diferenciación de las células epiteliales primarias de las vías respiratorias pulmonares en la interfaz aire-líquido (ALI) es una técnica popular para desarrollar un epitelio pseudoestratificado multicelular de las vías respiratorias que imita el lado apical de las vías respiratorias pulmonares. Si bien se espera la diferenciación de las células primarias de las vías respiratorias pulmonares, la evaluación de las propiedades biofísicas como la función ciliar y la impermeabilidad de la membrana proporciona una evaluación de la calidad del epitelio de las vías respiratorias y garantiza la fiabilidad del experimento. Aquí, describimos un protocolo sencillo para el desarrollo de epitelio pseudoestratificado multicelular de la vía aérea en cultivo de ALI y evaluamos dos propiedades biofísicas importantes: la función ciliar y la impermeabilidad de la membrana. Para determinar la función ciliar, capturamos el movimiento ciliar de un epitelio diferenciado de la vía aérea durante 4 semanas utilizando una cámara de alta velocidad conectada a un microscopio invertido, seguido de la cuantificación de la frecuencia de latidos ciliares (CBF) utilizando el sistema Simon Amon Video Analysis (SAVA). También medimos la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) utilizando un voltímetro-ohmio para determinar la integridad de la barrera epitelial del epitelio de las vías respiratorias.

Introduction

Las enfermedades respiratorias crónicas como el asma, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y la fibrosis quística son algunos de los principales problemas de salud en todo el mundo^. La prevalencia de enfermedades respiratorias causadas por virus como el virus de la influenza A humana, el virus respiratorio sincitial (VRS) y el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) también causa una carga económica y de salud pública². Por lo tanto, existe una inmensa necesidad de desarrollar regímenes de tratamiento para las enfermedades respiratorias que conducen....

Protocol

El protocolo debe realizarse en condiciones estériles bajo una campana de flujo laminar de nivel de bioseguridad 2 (cabina de bioseguridad). Todo el medio y las soluciones deben descongelarse a 37 °C antes de su uso. La centrifugación debe realizarse a 4 °C. Todos los materiales utilizados en el experimento deben ser estériles. Las células primarias (donante no identificado) se obtuvieron en colaboración con la Dra. Kristina Bailey en el Centro Médico de la Universidad de Nebraska (UNMC), Omaha, NE. Las células primarias provienen de donantes no identificados, y las células no pertenecen al sujeto humano de los NIH. Las células se ob....

Results

Evaluamos tanto la función ciliar como la impermeabilidad de la membrana del epitelio de la vía aérea obtenida a partir de la diferenciación de células primarias NHBE de dos donantes independientes no identificados (dos no fumadores, adultos sanos o adultos con EPOC, mujeres mayores de 50 años). Para la determinación de la función ciliar, se determinó el CBF del epitelio diferenciado de la vía aérea a los 28 días. Observamos que el CBF alcanzó al menos 3 Hz para ambos epitelios de la vía aérea, lo que fue comparable a lo.......

Discussion

El epitelio primario de las vías respiratorias humanas (cultivo ALI) se utiliza cada vez más como modelo pulmonar in vitro para evaluaciones biológicas con el fin de investigar la función y los mecanismos y reducir el uso de animales¹⁴. ALI tiene varias ventajas sobre cualquier cultivo sumergido monocapa. Por ejemplo, proporciona un epitelio pseudoestratificado de las vías respiratorias similar a un tejido que imita el lado apical de las ví.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x DPBS	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	14190-144
crecimiento de células epiteliales para las vías respiratorias	PromoCell, Alemania	C-21060
Anfotericina B	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	15290-026
EVOM2 voltios Ohmímetro	World Precision Instruments, EE. UU.	No aplicable
Solución de heparina Tecnologías	STEMCELL, EE. UU	07980
Hidrocortisona stock	STEMCELL technologies, EE. UU	07926
Microscopio: Leica DMI8 (Microscopio Leica) con cámara de alta velocidad de 120f/seg (Basler) asociada al microscopio. Microsope también fijado con incubadora de cámara de etapa i8.	Leica, EE. UU.	No aplicable
Penicilina-Estreptomicina	Corning, EE. UU	30-002-CI
PneumaCult-ALI Medio basal	Tecnologías STEMCELL, EE. UU	05002
PureCol	Advanced BioMatrix, EE. UU	5005
Sistema de análisis de video (SAVA) de Sisson-Ammons. Software V.2.1.15	Amson Engineering, EE.UU.	No aplicable