Procedimientos de Operación y Biocontención de una Instalación para Ratones de Laboratorio con un Microbioma Natural: Procedimiento de Inmunofenotipado

Resumen

Aquí, describimos la estructura y los procedimientos operativos, incluidas las medidas de contención microbiana de una instalación para "ratones salvajes" utilizando como ejemplo la toma de muestras de sangre para el inmunofenotipado.

Resumen

El uso de ratones de laboratorio con un microbioma natural, como los "ratones salvajes", ofrece una herramienta de investigación prometedora tanto para la ciencia básica como para la aplicada debido a su gran parecido con el superorganismo humano. Sin embargo, la cría y el mantenimiento de estos ratones, que albergan un microbioma diverso que incluye bacterias, virus y parásitos, plantean desafíos significativos para las instalaciones de cría de animales en las instituciones de investigación. Para hacer frente a estos desafíos, se desarrolló un concepto de instalación especializada para albergar "ratones salvajes" en Charité - Universitätsmedizin Berlin. Este enfoque implicó diseñar una instalación con características estructurales y protocolos operativos específicos para contener de manera efectiva el microbioma natural, protegiendo así las áreas con estándares de higiene más altos.

Se demuestra una metodología para la toma de muestras de sangre de ratones libres de patógenos especificados (SPF) y "ratones salvajes" para el inmunofenotipado, destacando el flujo de trabajo y las medidas de biocontención implementadas en la instalación. Los resultados notables revelan que los "ratones salvajes" expuestos a un microbioma natural desarrollan distintas poblaciones de células inmunitarias, que se reducen significativamente en los ratones criados y mantenidos bajo estrictas condiciones de higiene.

La importancia de este estudio radica en su potencial para proporcionar a los investigadores acceso a ratones que poseen un microbioma natural y un sistema inmunológico maduro similar al de los adultos humanos. Este enfoque podría mejorar la traducibilidad de los hallazgos preclínicos a la práctica clínica, avanzando así en el campo de la investigación biomédica.

Introducción

La experimentación con ratones sigue siendo indispensable en la ciencia básica y aplicada, como la investigación preclínica y toxicológica. Sin embargo, la estandarización de la higiene en los entornos de laboratorio, con el objetivo de reducir el ruido biológico y minimizar la variabilidad en los resultados experimentales, ha llevado a la exclusión en gran medida de la microbiota natural. Por lo tanto, las condiciones en las que nacen y se mantienen ratones de laboratorio higiénicamente estandarizados, especificados y libres de patógenos (SPF) difieren de las condiciones del mundo real a las que normalmente se exponen los seres humanos y los animales. Este desajuste entre las condiciones de laboratorio y los entornos naturales en los que se producen las enfermedades humanas da lugar a la "falacia de la estandarización": suponer que minimizar la variación en las condiciones experimentales mejora los resultados traslacionales. Sin embargo, en realidad, limita la relevancia biológica de los hallazgos ^1,2. Por ejemplo, la investigación ha demostrado que la ausencia de diversidad microbiana y ambiental en ratones SPF puede dar lugar a un sistema inmunitario subdesarrollado, lo que socava la validez de los estudios inmunológicos y preclínicos³.

Se han propuesto varios enfoques para abordar la variación biológica en modelos de ratones, cada uno con sus propias ventajas y limitaciones, incluyendo el co-alojamiento con ratones salvajes y de tiendas de mascotas 3,4,5,6,7,8, la exposición secuencial a comensales 9, el mantenimiento de los animales en recintos al aire libre ¹⁰ o en camas de animales grandes¹¹, y los trasplantes fecales de ratones silvestres¹². Un nuevo modelo de ratón prometedor para la investigación preclínica y toxicológica es el modelo de "ratones salvajes", que consiste en cepas de ratones de laboratorio estándar que albergan un microbioma natural¹³. Estos "ratones salvajes" se generan mediante el trasplante de embriones de cepas de ratones de laboratorio a ratones capturados en la naturaleza. Durante el nacimiento, las cepas de ratones de laboratorio adquieren el microbioma natural de sus madres sustitutas, imitando la inoculación natural que se produce durante el parto humano¹³. Los "ratones salvajes" se pueden criar como cualquier otra cepa de ratón de laboratorio, con su microbioma natural conservado a lo largo de las generaciones.

Los "ratones salvajes" albergan una microbiota diversa, que incluye bacterias, virus y parásitos, que normalmente se excluyen de las instalaciones de ratones SPF. En consecuencia, mantener un microbioma natural en las instalaciones de investigación presenta desafíos, ya que estos microbios deben contenerse sin comprometer los estándares generales de higiene SPF.

En Charité - Universitätsmedizin Berlin, se estableció una instalación dedicada a los "ratones salvajes", separada de las áreas SPF por estrictas medidas de biocontención. La instalación incluye salas de cría y experimentación, lo que garantiza que se mantenga el microbioma natural de los "ratones salvajes" mientras se protegen las áreas de SPF (Figura 1).

Las parejas fundadoras de la colonia de Charité fueron importadas de la colonia "Ratones salvajes" establecida en el Departamento de Investigación del Microbioma del Hospital Universitario de Erlangen, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), Alemania. Se les suministra un certificado sanitario y se les supervisa con un panel ampliado de patógenos zoonóticos antes de la importación de los fundadores de la colonia. Se utilizarán centinelas para monitorear el microbioma a lo largo del tiempo. Tanto el SPF como los "ratones salvajes" se alojan en las mismas condiciones. Los ratones se crían y se mantienen preferentemente en jaulas con ventilación individual (IVC) tipo II en grupos de cinco ratones. La temperatura dentro de la instalación es de 22 °C y el ciclo de luz/oscuridad es de 12 h. Los ratones reciben comida estándar a base de grano y agua del grifo. La esterilización de la ropa de cama y los artículos de enriquecimiento es innecesaria para los "ratones salvajes". Sin embargo, la esterilización en autoclave de estos elementos evita la confusión de materiales en las áreas donde se alojan los ratones SPF.

En este protocolo, se demuestran los procedimientos de inmunofenotipado tanto para SPF como para "ratones salvajes", destacando los estrictos protocolos de contención microbiana en las instalaciones de "ratones salvajes". Estas medidas garantizan la integridad de los entornos SPF al tiempo que proporcionan los beneficios de trabajar con ratones portadores de un microbioma natural.

Figura 1: Disposición de la instalación para ratones salvajes. E1 = acceso a la instalación. Las flechas indican la ruta de entrada a las instalaciones. E2 = acceso a la cabina de flujo de aire laminar desde el exterior de la instalación. PA = esclusa de personal con ducha de aire. AS = ducha de aire. R1, R2 = salas para la cría de ratones salvajes. R3 = espacio para mantener ratones salvajes. R4 = espacio para mantener ratones SPF. PR1 = sala de procedimientos para ratones con SPF. PR2 = sala de procedimientos para ratones salvajes. SB = banco de trabajo estéril. EE = salidas de emergencia. CR = vestuario frente a la cabina LAF. LAF = cabina de flujo de aire laminar para intervenciones bajo flujo de aire protector. A = autoclave. ER = sala de equipos. Las flechas verdes representan las rutas accesibles cuando se trabaja con animales SPF, y las flechas amarillas indican los caminos disponibles para trabajar con ratones salvajes después de ducharse al aire. Las flechas azules indican el acceso solo para el personal de cría. La línea roja marca la pared de vidrio dentro de la cabina LAF, que divide el espacio en dos secciones a las que se puede acceder desde E1 a través de PR2 o desde E2 a través de CR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

La instalación para "ratones salvajes" y los procedimientos con animales vivos fueron aprobados por la oficina estatal responsable de la experimentación animal, "Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin" (LAGeSo). Los pasos más importantes del protocolo se resumen en la Figura 2.

1. Obtener acceso a las instalaciones de Wilding

1. Obtenga una introducción personal a los procedimientos operativos y de biocontención de la instalación del oficial de bienestar animal responsable.
2. Obtenga la llave del transpondedor para ingresar a las instalaciones para "ratones salvajes" y reserve las salas de procedimientos a través del sistema de reservas en línea.

2. Entrada a las instalaciones para "ratones salvajes"

1. Deposita la ropa en el probador.
2. Cámbiese a la ropa de área: pantalones, kasak y cubrezapatos desechables (Figura 3).

3. Toma de muestras de sangre de ratones SPF en el área SPF

1. Transfiera los ratones con SPF (macho y hembra, 8-20 semanas) de la sala donde se mantienen (R4) a la sala de procedimientos para animales con SPF (PR1) en una jaula IVC cerrada.
2. Encienda el banco de flujo laminar y desinfecte la superficie del espacio de trabajo con etanol al 70% Vol. Trabaja dentro del banco.
3. Inspeccione los tubos capilares en busca de secciones rotas o astilladas para evitar un mayor riesgo de rotura o daño.
4. Bajo breve anestesia general con isoflurano (inducción al 5% de isoflurano en aire medicinal enriquecido con oxígeno, seguida de 1,5%-2,0% para mantenimiento), después de la pérdida del reflejo de retirada del pedal (como se indica mediante un pellizco en el dedo del pie), comprima las venas del cuello de los ratones agarrando el pescuezo.
5. Con una mano, asegure la cabeza del animal con el pulgar y el índice. Inserte un capilar fresco en el canto medial del ojo debajo de la membrana nictitante en un ángulo de 45°. Asegúrese de que el capilar esté colocado entre el globo ocular y la órbita ósea del ojo.
   NOTA: Para evitar traumatismos, no permita que la punta del tubo capilar toque la superficie del ojo.
6. Inserte el capilar a través de la membrana sinusal con un suave movimiento de rotación axial. Continúe girando el tubo en la parte posterior de la órbita hasta que la sangre fluya. Recoja un mínimo de 15 μL de sangre en un tubo de extracción de sangre que contenga ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (aproximadamente 1 gota).
7. Antes de retirar el capilar, afloje el agarre del pescuezo para mantener el sangrado en el tejido al mínimo. Para asegurar una buena hemostasia, use una gasa limpia o un hisopo para detener el sangrado.
8. Gire ligeramente el tubo para mezclar la sangre y el EDTA. No agite el tubo. Guarde la muestra de sangre en hielo.
9. Desinfecte la superficie de trabajo y apague el banco de flujo laminar. Regrese los ratones SPF en un IVC cerrado a la sala de alojamiento SPF (R4).

4. Entrar en la zona de "Ratones salvajes"

1. Quítese los zapatos y los calcetines en la antesala de la ducha de aire (PA). Póngase calcetines de área y equipo de protección personal (EPP) de cuerpo completo que consiste en un mono Tyvek, una redecilla para el cabello, si es necesario, guantes de algodón, guantes de nitrilo y mascarillas (Figura 3).
2. Ingrese a la ducha de aire en calcetines a través del revestimiento adhesivo del suelo. Mientras se ducha al aire, levante los brazos y realice un giro de 360°.
3. Salga de la ducha de aire y póngase los zapatos del otro lado.

5. Toma de muestras de sangre de "ratones salvajes"

1. Transfiera a los "ratones salvajes" (machos y hembras, de 8 a 20 semanas) de la sala donde se mantienen (R3) en una jaula IVC cerrada a la sala de procedimientos (PR2).
2. Encienda el banco de flujo laminar y desinfecte la superficie del espacio de trabajo.
3. Siga los procedimientos descritos para muestrear ratones con SPF en la sección 3, pasos 2-8.
4. Después de completar la toma de muestras de sangre, cámbiese los guantes. Desinfectar todos los materiales y superficies. Apague el banco de flujo laminar.

6. Exportación de muestras de sangre del área de "ratones salvajes" a través del gabinete de flujo de aire laminar (LAF)

NOTA: La sala de procedimientos (PR2) contiene un gabinete LAF, que sirve como cerradura de material y sala de intervención estéril. Las muestras se transfieren a través de la cabina LAF. El interior es accesible tanto desde el interior (a través de E1 y PR2) como desde el exterior (a través de E2 y CR) el área Wildling y está dividida en el medio por una pared de vidrio con una puerta corredera (Figura 1). Se requieren dos personas para exportar materiales: la Persona 1 (dentro del área de Wildling [a través de PR2]) realizará los pasos 6.1 y 6.2. La Persona 2 (fuera del área de Wildling [a través de E2]) realizará los pasos 6.3-6.5.

1. Desinfecte los recipientes de muestras. Retire los recipientes de muestras a través de la puerta corredera en la pared de vidrio de la cabina LAF.
2. Una vez completada la transferencia de los contenedores de muestras a la persona 2, reciba ropa protectora de la persona 2 (usa ropa protectora en la cerradura de la bata de la cabina) al otro lado de la cabina LAF y deséchela. Desinfectar todas las superficies.
3. Póngase ropa protectora en el acceso LAF frente a la cabina LAF (CR, Figura 1).
4. Reciba contenedores de muestras desinfectados de la zona Wildling sin contacto a través de la puerta corredera en la pared de vidrio de la cabina LAF.
5. Quítese la ropa protectora y pásela a través de la puerta corredera hacia el área interior de la cabina LAF para su eliminación.

7. Salir de las instalaciones para "ratones salvajes"

1. Deje los overoles desechables y los zapatos de área dentro del área. Deseche la redecilla para el cabello, los guantes de goma y la mascarilla.
   NOTA: Los zapatos y overoles se pueden reutilizar.
2. Ingrese a la ducha de aire inmediatamente en el área de calcetines. Levante los brazos y realice un giro de 360° mientras se ducha al aire.
3. Deje la ducha de aire y coloque los calcetines del área en el colector de ropa. Póngase los calcetines, los zapatos y los cubrezapatos desechables. Zona de depósito de ropa en el vestuario en el colector de lavandería. Cámbiate a la ropa en el probador

8. Procesamiento y análisis de muestras de sangre

1. Lleve muestras de sangre al laboratorio.
   1. Prepare un cóctel de tinción de anticuerpos conjugados con fluoróforos: Para cada muestra, agregue 0,25 μL de Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45, 0,25 μL de Brilliant Violet 605 anti-cadena TCR-β de ratón, 0,25 μL de APC anti-mouse CD4, 0,25 μL de Brilliant Violet 785 anti-mouse CD8, 0,25 μL de FITC anti-mouse CD44 y 0,25 μL de anticuerpo PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD62L a 50 μL de tampón de citometría de flujo (solución salina tamponada con fosfato, 2 mM de EDTA, 0,1% albúmina sérica bovina, 4 °C). Manténgalo en la oscuridad sobre el hielo hasta el paso 8.8.
      NOTA: Los fluoróforos utilizados se pueden adaptar a la configuración del citómetro de flujo que se utilizará para la adquisición de muestras.
2. Desinfectar los tubos de extracción de sangre. Agregue 2 mL de tampón de citometría de flujo helado a un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 mL. Coloque el tubo sobre hielo.
3. Tubo abierto de extracción de sangre. Añadir 10 μL de sangre al tubo que contiene el tampón de citometría de flujo y el vórtice de pulso.
4. Girar a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
5. Aspirar el sobrenadante. Agregue 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC), vórtice de pulso e incube durante 3 minutos a temperatura ambiente (RT).
6. Agregue 100 μL de PBS 10x. Girar a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
7. Repita los pasos 8.5-8.6.
8. Aspirar el sobrenadante. Añadir 50 μL de cóctel de tinción de anticuerpos, vórtice e incubar durante 20 minutos en hielo en la oscuridad.
9. Agregue 1 mL de tampón de citometría de flujo. Girar a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
10. Aspirar el sobrenadante. Añadir 180 μL de tampón de citometría de flujo.
11. Añadir 20 μL de SYTOX Blue Dead Cell Stain (concentración final 1:1000) para la discriminación de vivos/muertos.
12. Adquiera muestras en un citómetro de flujo y analice los datos utilizando el software de adquisición de citómetros de flujo o el programa de análisis de datos de citometría de flujo.

Resultados

Los "ratones salvajes" albergan potencialmente microorganismos típicamente excluidos de las instalaciones de SPF, lo que plantea un desafío para las prácticas de cría de animales dentro de las instituciones de investigación que mantienen estrictos estándares de higiene. En los últimos 4 años, los científicos y veterinarios de la Charité - Universitätsmedizin Berlin y el Centro Alemán para la Protección de los Animales de Laboratorio (Bf3R) han desarrollado una instalación dedicada a los ratones con un microbioma natural, incorporando estrictas medidas de biocontención a través de un esfuerzo colaborativo (Figura 1). Para llevar a cabo este diseño, una instalación de ratones existente se sometió a una extensa reconstrucción, incluida la instalación de una ducha de aire y una cabina de flujo de aire laminar. Las áreas donde se crían y mantienen los "ratones salvajes" y los ratones SPF están separadas por la ducha de aire y ambas áreas tienen salas de procedimiento designadas. El material termoestable sale del área para los "ratones salvajes" solo a través del autoclave, mientras que los materiales termolábiles, como las muestras, se pueden exportar a través del gabinete LAF para su posterior procesamiento en áreas de laboratorio (Figura 2). El cumplimiento estricto de todas las medidas de biocontención es esencial para evitar la contaminación de las áreas donde se mantienen las condiciones de higiene SPF (Figura 3). En conjunto, el diseño y las medidas de biocontención de la instalación de "ratones salvajes" en Charité - Universitätsmedizin Berlin brindan a los científicos la oportunidad de realizar investigaciones con ratones que albergan un microbioma natural y, al mismo tiempo, prevenir eficazmente la propagación de microorganismos a áreas de la instalación animal con niveles de higiene más altos.

La citometría de flujo es el método de referencia en inmunología celular y se utiliza para interrogar a las poblaciones de células inmunitarias en la sangre y los tejidos en respuesta a condiciones ambientales alteradas. Por ejemplo, los seres humanos adultos tienen un número sustancial de células T de memoria circulando en la sangre, que se desarrollan tras la exposición a microorganismos^{del medio ambiente}. En este caso, se utilizó la citometría de flujo para sondear las células T de memoria en la sangre de ratones criados y mantenidos en condiciones de SPF y en la sangre de "ratones salvajes" (Figura 4). Los "ratones salvajes" colonizados con un microbioma natural, presentan una población distinta de células T de memoria. Por el contrario, los ratones criados y mantenidos en condiciones de SPF han reducido en gran medida las células T de memoria en la circulación sanguínea. Por lo tanto, la citometría de flujo puede caracterizar el impacto de diferentes entornos microbianos en el compartimento inmunitario. La granulación de los datos puede aumentarse mediante la inclusión de marcadores de células inmunitarias adicionales. Los enfoques recientemente desarrollados en citometría de flujo, como la citometría por tiempo de vuelo (CyTOF) y la citometría de flujo espectral, permiten adquirir información sobre multitud de parámetros y, por lo tanto, ampliar el número de (sub)poblaciones de células inmunitarias que se pueden cuantificar en la misma muestra de sangre y tejido. Además, la producción de citoquinas celulares también se puede evaluar mediante citometría de flujo, lo que proporciona información sobre la función de las células en respuesta a un microbioma natural.

Figura 2: Flujo de trabajo en la instalación de Wildling. La toma de muestras de sangre y el procesamiento de muestras son ejemplos, pero pueden ser reemplazados por otros procedimientos, como intervenciones quirúrgicas con muestras de tejido e histología. Para ver las abreviaturas, consulte la leyenda de la Figura 1 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Comparación de los requisitos de equipo de protección personal (EPP) para áreas SPF y silvestres. En la zona SPF (izquierda), el EPI estándar consta de una sola capa de ropa protectora. Por el contrario, la zona Wildling (derecha) requiere un proceso de EPI de tres pasos antes de entrar en la ducha de aire: se lleva un kasac (ropa interior protectora = paso 1) debajo del mono (paso 2). Esta capa adicional ayuda a mantener la higiene y evita la contaminación cruzada entre áreas. Después de la ducha de aire, se deben usar zapatos designados para el área silvestre (paso 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Inmunofenotipo de "ratones salvajes". Las muestras de sangre de ratones machos SPF (n = 5 ratones y "ratones Wilding" (n = 5 ratones), de 14 semanas de edad, se tiñeron con un cóctel de anticuerpos conjugados con fluoróforos contra CD45, cadena TCR-β, CD4, CD8, CD44 y CD62L. Los números son la proporción de la desviación estándar de la puerta parental ±. La estrategia de compuerta se muestra para los ratones SPF, a excepción de los dos últimos blots de SPF y "ratones salvajes". En los "ratones salvajes", las células T de memoria central y efectora aumentan en comparación con los ratones que se crían y mantienen en condiciones de SPF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Los ratones con un microbioma natural son una herramienta de investigación prometedora para la ciencia básica y aplicada debido a su mayor parecido con el superorganismo humano 3,9,10,11,12. Los intentos de incorporar la complejidad biológica en los modelos de ratón han llevado al desarrollo de varios enfoques, cada uno con sus propias ventajas y limitaciones 3,7,8,9,10,11,12. Los "ratones salvajes" combinan los beneficios de un entorno de laboratorio controlado con un microbioma natural. Este enfoque mantiene la estabilidad en condiciones experimentales al tiempo que preserva la diversidad microbiana natural necesaria para estudiar interacciones biológicas complejas. En consecuencia, las terapias biomédicas desarrolladas y probadas en "ratones salvajes" tienen un gran potencial para una traducción exitosa a aplicaciones clínicas.

Sin embargo, aún queda por determinar en qué modelos de enfermedad preclínica "ratones salvajes", son superiores a los ratones SPF. Además, los ratones con un microbioma natural albergan microorganismos, como gusanos altamente transmisibles, que normalmente están excluidos de las instalaciones institucionales. Por lo tanto, la cría y el trabajo con estos ratones presentan desafíos para las prácticas de cría de animales dentro de las instituciones de investigación.

El establecimiento de una instalación para "ratones salvajes" implicó un esfuerzo de colaboración de científicos, veterinarios y funcionarios institucionales de Charité - Universitätsmedizin, el Centro Alemán para la Protección de Animales de Laboratorio (Bf3R) y la Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU). Después de desarrollar el concepto de instalación, una instalación existente para ratones se sometió a una extensa reconstrucción para incorporar estrictas medidas de biocontención. La instalación está certificada para operaciones de bioseguridad de nivel 2 (BSL-2) con respecto a la investigación con patógenos humanos.

Aquí, se describen los procedimientos operativos y de biocontención en la instalación para "ratones salvajes" utilizando como ejemplo la toma de muestras de sangre para el inmunofenotipado por citometría de flujo. Es obligatorio el cumplimiento estricto de las medidas de biocontención mientras se trabaja en la instalación para "ratones salvajes" para evitar la propagación de microorganismos a otras áreas de la instalación animal. Esto incluye la restricción del acceso a las instalaciones a la menor cantidad de personas posible, según el grupo de investigación. Además, se requiere una sesión introductoria obligatoria realizada por el oficial de bienestar animal institucional antes de obtener acceso inicial a las instalaciones. La información general y los Procedimientos Operativos Estándar (SOP) para trabajar dentro de la instalación de Wildling también están disponibles en un sitio web interno ("Wildling wiki"^)14,15.

Mientras se trabaja dentro de las instalaciones, el EPP debe usarse correctamente. Por ejemplo, es esencial asegurarse de que no haya pelo expuesto fuera de la redecilla, ya que los huevos de los parásitos podrían adherirse a ella. Si el experimento involucra tanto "ratones salvajes" como ratones SPF, primero se deben manipular ratones SPF. Las áreas para "ratones salvajes" y ratones SPF dentro de la instalación están separadas por una ducha de aire, y cada área está equipada con salas de procedimientos designadas. Estas salas se pueden reservar a través de un sistema de reservas en línea, lo que garantiza procesos de trabajo fluidos y un número limitado de personas dentro de las instalaciones. Se permite que un máximo de dos personas por área por sala de procedimientos (PR1, PR2, LAF) trabajen en cada barrera al mismo tiempo. Se aplican excepciones a los experimentos que requieren personal adicional para garantizar la ejecución ética y competente de los procedimientos. Los ratones son transferidos entre salas dentro de sus respectivas áreas en jaulas IVC cerradas, que solo se pueden abrir debajo de un banco de flujo laminar para garantizar la contención microbiana y la seguridad en el trabajo. La sala de procedimientos en el área de "Ratones salvajes" también contiene una cabina de flujo de aire laminar (LAF). Esta cabina LAF debe utilizarse para la disección y cirugía de "ratones salvajes", incluida la transferencia de embriones. La transferencia de embriones es un procedimiento crítico en el contexto de los "ratones salvajes", ya que se utiliza para generar nuevos modelos de "ratones salvajes". Por ejemplo, la transferencia de embriones de cepas de ratones genéticamente modificados (OGM) a "ratones salvajes" de tipo salvaje se utiliza para crear cepas de OGM salvajes. La cabina LAF también se utiliza para la exportación de muestras, lo que requiere coordinación con una persona fuera del área de "Ratones salvajes". El procesamiento adicional de muestras se puede realizar en el espacio de laboratorio adyacente, lo que permite a los investigadores manejar materiales sensibles al tiempo en el sitio y limitar los lugares donde se procesan las muestras de "ratones salvajes".

Todos los demás materiales deben permanecer dentro de las instalaciones de Wildling o deben ser esterilizados en autoclave antes de salir de las instalaciones. Después del trabajo, todos los materiales y superficies se desinfectan con desinfectantes apropiados para las condiciones BSL2. Las personas que ingresaron a las instalaciones para "ratones salvajes" tienen prohibido ingresar a cualquier otra instalación de animales el mismo día.

La investigación en la instalación se lleva a cabo en el marco del consorcio científico "The Wildling Mouse Model in Health and Disease (Wildling HeaD)", lo que facilita la comunicación entre los científicos que trabajan con "ratones salvajes", así como el intercambio de métodos y experiencias. El consorcio cuenta con el apoyo de Responsible PrecliniX en el Centro QUEST para la Investigación Responsable del Instituto de Salud de Berlín (BIH), que ayuda en los procedimientos de preregistro de estudios con animales, el diseño experimental sólido y la gestión de la calidad (www.bihealth.org/en/quest/service/service/responsible-preclinix).

En resumen, se ha creado una instalación de última generación, equipada con estrictas medidas de biocontención, para apoyar la investigación preclínica segura y ética. Esta instalación facilita el estudio de los "ratones salvajes", que albergan un microbioma natural, cerrando eficazmente la brecha entre las condiciones controladas de laboratorio y los entornos microbianos similares al mundo real. Para construir una instalación como la descrita, es esencial priorizar la ciencia en equipo y la colaboración interdisciplinaria, incorporando la experiencia de científicos, veterinarios y funcionarios institucionales para garantizar el diseño y la operación efectivos de entornos de alta biocontención. Además, es crucial implementar medidas estrictas de biocontención, brindar capacitación integral y desarrollar Procedimientos Operativos Estándar (SOP) claros. El establecimiento de una estructura de comunicación eficiente, como una wiki interna, y el monitoreo y la validación continuos de las condiciones experimentales mejorarán aún más la eficacia y la seguridad de la instalación en el manejo de modelos complejos como los "ratones salvajes".

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alexa Fluor 700 anti-ratón anti-ratón CD45		clon BioLegend 103127 30F-11
Animal Chow	Altromin	1324
APC anti-ratón anti-ratón CD4	BioLegend	100515	RM4-5 Tubo de
extracción de sangre	Greiner	450475	MiniCollect K3E, K3EDTA
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A9647-100G
Brilliant Violet 605 anti-ratón Anticuerpo de cadena TCR-beta	BioLegend	109241	Clon H57-597
Brilliant Violet 785 anti-ratón CD8 Anticuerpo BioLegend		100749	Clon 53-6.7
Capilar	Hirschmann	9000210	Hirschmann minicaps, Na-hep
EDTA	Corning	46-034-CI
FITC anticuerpo CD44 antiratón	BioLegend	103021	Clon IM7
PerCP/Cianina 5.5 anti-ratón CD62L anticuerpo BioLegend		104431	Clon MEL-14
Solución salina tamponada con fosfato (10x)	Gibco	12579099
solución salina tamponada con fosfato (1x)	Gibco	14190094
Tubo de poliestireno de fondo redondo	Sarstedt	55.476.005
SYTOX Tinción azul de células muertas	Invitrogen	S34852
Tyvek en general (DuPont)	Fisher Scientific	11371633