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Imágenes longitudinales in vivo de células de la retina con serotipos de virus adenoasociados personalizados mediante oftalmoscopia láser de barrido confocal

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DOI:

10.3791/67106

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11 de octubre de 2024

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1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Laboratory, 2Second Clinical Medical School, Capital Medical University, 3Beijing Institute of Brain Disorders, Collaborative Innovation Center for Brain Disorders, Capital Medical University, 4Beijing Key Laboratory of Fundamental Research on Biomechanics in Clinical Application, Capital Medical University

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el uso de vectores de virus adenoasociados (AAV) para el marcaje específico de células y la obtención de imágenes in vivo utilizando un oftalmoscopio láser de barrido confocal (CSLO). Este método permite la investigación de diferentes tipos de células de la retina y sus contribuciones a la función y la enfermedad de la retina.

Resumen

La naturaleza dinámica de los procesos celulares de la retina requiere avances en la administración de genes y las técnicas de monitoreo en vivo para mejorar la comprensión y el tratamiento de las enfermedades oculares. Este estudio presenta un enfoque optimizado de virus adenoasociados (AAV), utilizando serotipos y promotores específicos para lograr una eficiencia de transfección óptima en células de la retina específicas, incluidas las células ganglionares de la retina (RGC) y la glía de Müller. Aprovechando la precisión de la oftalmoscopia láser de barrido confocal (CSLO), este trabajo presenta un método no invasivo para la obtención de imágenes in vivo que captura la expresión longitudinal de la proteína verde fluorescente (GFP) mediada por AAV. Este enfoque elimina la necesidad de procedimientos terminales, preservando la continuidad de la observación y el bienestar del sujeto. Además, la señal de GFP se puede rastrear en las RGC infectadas por AAV a lo largo de la vía visual hasta el colículo superior (SC) y el núcleo geniculado lateral (LGN), lo que permite el potencial de mapeo directo de la vía visual. Estos hallazgos proporcionan un protocolo detallado y demuestran la aplicación de esta poderosa herramienta para estudios en tiempo real del comportamiento de las células de la retina, la patogénesis de la enfermedad y la eficacia de las intervenciones de terapia génica, ofreciendo información valiosa sobre la retina viva y sus conexiones.

Introducción

Al ser la única parte ópticamente accesible del sistema nervioso central, la retina sirve como un modelo valioso para la investigación en neurociencia. Las células ganglionares de la retina (CGR), las neuronas de salida de la retina que transmiten información visual al cerebro, desempeñan un papel crucial en la función visual. Su pérdida o disfunción conduce a un deterioro de la visión y a una ceguera irreversible, como se observa en el glaucoma y otras neuropatías ópticas2. La glía de Müller, las principales células gliales de la retina, son esenciales para mantener la homeostasis de la retina, proporcionar soporte estructural y metabólico a las neuronas, regular los niveles de neurotransmisores y contribuir a la reparación y regeneración de la retina3. Su disfunción está implicada en diversas enfermedades de la retina, como la retinopatía diabética4, la degeneración macular asociada a la edad5 y el síndrome isquémico ocular6. Las RGC y la glía de Müller exhiben interacciones cercanas e interdependencia; La glía de Müller proporciona un apoyo esencial a las CGR, mientras que la actividad de las RGC puede influir en la función de la glía de Müller 3,7. El estudio de las RGC y de la glía de Müller es crucial para comprender la función de la retina y desarrollar tratamientos eficaces para múltiples enfermedades de la retina.

Las evaluaciones actuales en la investigación de la retina utilizan principalmente técnicas como la tomografía de coherencia óptica (OCT) para medir el grosor de la capa de fibras nerviosas de la retina o las trayectorias de los haces de axones 8,9. Si bien estos métodos son invaluables para detectar la pérdida de RGC, no proporcionan una vista detallada de la morfología de RGC y las células gliales debido a la resolución limitada. Del mismo modo, aunque las técnicas avanzadas como la oftalmoscopia láser de barrido de óptica adaptativa (AO-SLO) permiten obtener imágenes a nivel celular de RGC, fotorreceptores y células gliales en la retina humana viva10, su complejidad técnica y su accesibilidad limitada limitan su uso principalmente a entornos de investigación especializados. Dadas estas limitaciones, existe la necesidad continua de desarrollar métodos más accesibles y fiables para el estudio en profundidad de poblaciones específicas de células de la retina in vivo.

En consecuencia, este protocolo tiene como objetivo introducir un enfoque de imagen alternativo adecuado para aplicaciones de investigación en células de la retina. Combina el poder del etiquetado específico del tipo de célula mediado por AAV con la naturaleza no invasiva de las imágenes CSLO. Los virus adenoasociados (AAV) son vectores versátiles de entrega de genes conocidos por su baja inmunogenicidad y su capacidad para transducir una amplia gama de tipos de células, incluidas las células en división y las que no sedividen 11. Esto los convierte en herramientas ideales para dirigirse a poblaciones celulares específicas dentro del complejo entorno de la retina. Mediante el uso de vectores AAV con serotipos y promotores cuidadosamente seleccionados, se puede lograr la expresión selectiva de proteínas fluorescentes en múltiples tipos de células de interés, como las RGC y la glía de Müller. Por ejemplo, AAV2 es conocido por su mayor eficiencia de transducción en las RGC12,13, mientras que AAV8 es marcadamente eficaz para dirigirse a los fotorreceptores14, y AAV9 demuestra fuertes capacidades de transfección en la glía de Müller15, mostrando una amplia eficiencia en varias capas de células de la retina. Es importante señalar que la eficacia de la AAV depende no solo de la elección del serotipo, sino también de los promotores, que dictan la intensidad y la especificidad celular de la expresión del transgén, lo que subraya la importancia de una selección cuidadosa para lograr una transducción óptima.

Para el etiquetado de RGC, este protocolo emplea AAV2 con el promotor de sinapsina humana (hSyn). AAV2 exhibe una transducción eficiente de RGCs después de la inyección intravítrea13, y el promotor hSyn, un promotor neuronal ubicuo, impulsa una expresión transgénica fuerte y específica dentro de estas células16. En el caso de la glía de Müller, el protocolo utiliza vectores AAV9 impulsados por el promotor17 de GfaABC1D, que demuestra una fuerte expresión de transgenes en estas células15. Este enfoque de etiquetado dirigido permite a los investigadores distinguir estas células del tejido retiniano circundante y rastrearlas a lo largo del tiempo, proporcionando una base para la vigilancia in vivo de las células de la retina y sus respuestas a los cambios bioambientales.

La oftalmoscopia láser de barrido confocal (CSLO) es una técnica de imagen no invasiva que proporciona imágenes de alta resolución de la retina viva, lo que permite la visualización en tiempo real de las poblaciones de células de la retina marcadas con fluorescencia 18,19,20. Un rayo láser enfocado escanea a través de la retina, capturando la luz emitida que pasa a través de un orificio para eliminar las señales desenfocadas, lo que da como resultado imágenes más nítidas con un contraste mejorado. Este protocolo utiliza un sistema Heidelberg Spectralis CSLO, que ha sido ampliamente utilizado para la obtención de imágenes de células de la retina en animales vivos, incluidos los estudios que visualizan las RGC 21,22 y la microglía23 marcadas con transgénicos. Mediante el empleo de la unidad HRA CSLO con un láser de 488 nm y los filtros adecuados, los investigadores pueden obtener imágenes de RGC marcadas con fluorescencia o glía de Müller en animales vivos después de la inyección intravítrea de vectores AAV portadores de genes reporteros fluorescentes. El protocolo de imágenes longitudinales, con sesiones semanales que cubren tanto la retina central como la periférica, realiza un seguimiento de los cambios a lo largo del tiempo. Para priorizar el bienestar animal, el protocolo utiliza el sistema automático de seguimiento ocular (ART) de la unidad HRA CSLO, lo que permite una adquisición precisa de imágenes sin necesidad de anestesia general o lentes de contacto.

Este protocolo aprovecha el poder combinado de AAV y CSLO para permitir el monitoreo longitudinal de tipos específicos de células de la retina in vivo. Al combinar la especificidad del tipo de célula del marcaje mediado por AAV con las capacidades de imágenes no invasivas y de alta resolución de CSLO, este método permite a los investigadores estudiar los cambios dinámicos en las RGC y la glía de Müller en respuesta a diversos estímulos o intervenciones. Estos conocimientos tienen un potencial significativo para informar el desarrollo de nuevas estrategias diagnósticas y terapéuticas para las enfermedades de la retina.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de la Capital, Beijing. Para todos los experimentos se utilizaron ratones machos C57BL/6J adultos de cuatro semanas de edad (con un peso de entre 15 y 20 g) y se alojaron en salas con temperatura controlada con un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas. La comida estándar para roedores y el agua estaban disponibles ad libitum. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Transfección de células retinianas mediada por AAV

NOTA: Para la transducción dirigida de RGC, este protocolo utiliza AAV2-hSyn-eGFP, que incorpora el promotor hSyn para impulsar una expresión robusta de GFP mejorada. La glía de Müller se ataca con AAV9-GfaABC1D-eGFP. Para lograr una eficiencia de transducción óptima y una expresión transgénica robusta, se recomienda un título mínimo de AAV de 1 x10 12 genomas virales (vg)/mL para las inyecciones intravítreas en ratones13.

  1. Cumpla con estrictos protocolos de seguridad al realizar procedimientos de transfección de células de la retina mediados por AAV para evitar la exposición accidental y garantizar un entorno de trabajo seguro.
  2. Realizar todos los procedimientos que involucren vectores virales dentro de un gabinete de bioseguridad (BSC) certificado. Equipar al personal con el equipo de protección personal (EPP) adecuado, incluyendo batas de laboratorio, guantes y protección para los ojos, durante todo el procedimiento.
  3. Deseche todos los objetos punzocortantes y materiales de riesgo biológico de manera adecuada de acuerdo con los protocolos de seguridad institucionales para mantener el cumplimiento y salvaguardar a todo el personal del laboratorio.

2. Preparación de vectores virales y animales

  1. Obtenga los vectores AAV2-hSyn-eGFP o AAV9-GfaABC1D-eGFP almacenados a -80 °C. Descongele los vectores en hielo inmediatamente antes de usarlos para preservar la integridad viral.
  2. Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico a una dosis de 50 mg/kg. Confirme la profundidad de la anestesia probando los reflejos del pie trasero antes de realizar más acciones.
  3. Recorte los bigotes para evitar interferencias con el área quirúrgica durante el procedimiento. Desinfecte la órbita con una solución de povidona yodada al 20% durante 2 s, luego enjuague abundantemente con solución salina normal estéril.
  4. Aplique una gota de proparacaína al 0,5% por vía tópica para minimizar las molestias y evitar movimientos oculares involuntarios.

3. Manipulación e inyección intravítrea de vectores virales

  1. Transfiera 1 μL de la solución de AAV seleccionada (ya sea AAV2-hSyn-eGFP o AAV9-GfaABC1D-eGFP) a un trozo de película de parafina limpia y preenfriada para evitar fluctuaciones de temperatura que puedan afectar la actividad viral.
  2. Aspire la solución de AAV con una jeringa de vidrio Hamilton con una aguja biselada de 33 G bajo el microscopio quirúrgico oftálmico.
  3. Coloque el ratón en decúbito ventral bajo el microscopio. Incline ligeramente la cabeza para elevar el lado ocular destinado a la inyección. Ajuste y optimice el aumento del microscopio para identificar claramente la región superior de la órbita del ratón.
  4. Inserte la aguja 1-2 mm detrás del limbo en el margen escleral superior del ojo en la cavidad vítrea. Inyecte las soluciones de AAV lentamente para evitar el reflujo o el daño inducido por la presión.
    NOTA: Ubicación del lugar de la inyección: Realice la inyección en el cuadrante temporal superior del ojo, aproximadamente 1 mm posterior al limbo. Elija esta ubicación para evitar los vasos sanguíneos principales y minimizar el riesgo de dañar el cristalino. Evite los sitios de inyección demasiado cerca del limbo para evitar la penetración del iris o la abrasión del cristalino. Evitar la vasculatura: Use un microscopio quirúrgico para examinar cuidadosamente el sitio de inyección planificado en busca de vasos sanguíneos visibles antes de la inyección. Si hay embarcaciones presentes, ajuste ligeramente el punto de entrada para evitarlas. Inserte la aguja en un ángulo poco profundo, paralelo al iris, para reducir aún más el riesgo de daño vascular. Evite las inyecciones repetidas en la misma área para reducir el riesgo de hemorragia subretiniana.
  5. Mantenga la aguja en su lugar durante 30 segundos para permitir que los vectores se dispersen dentro de la cámara vítrea y se asienten en la superficie de la retina, maximizando así las posibilidades de una transducción exitosa.
  6. Retire la aguja lentamente para minimizar el riesgo de reflujo vítreo.
  7. Aplique un ungüento antibiótico tópico en el lugar de la inyección inmediatamente después de la inyección. Asegúrese de que el ungüento se aplique de manera uniforme para cubrir completamente la superficie ocular, evitando la infección ocular y la inflamación.
    NOTA: La pomada antibiótica contiene 1 mg/g de dexametasona, 3500 UI/g de sulfato de neomicina y 6000 UI/g de sulfato de polimixina B.
  8. Coloque el mouse sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal durante la recuperación de la anestesia y vigílelos de cerca para detectar cualquier signo de angustia o anomalías. Una vez que estén completamente recuperados y no presenten complicaciones, devuélvalos a sus jaulas con acceso a comida y agua normales.

4. Imágenes in vivo con CSLO

  1. Preparación animal
    1. Seleccione el ratón infectado con AAV2-hSyn-eGFP o AAV9-GfaABC1D-eGFP después de 4 semanas de inyección intravítrea. Aplique una gota de una solución oftálmica que contenga 0,5% de tropicamida y 0,5% de fenilefrina en la superficie del ojo para dilatar la pupila hasta aproximadamente 2 mm de diámetro22.
      NOTA: Se recomienda un mínimo de 4 semanas de intervalo de tiempo de transducción de AAV para el marcaje fluorescente óptimo de las células de la retina después de la inyecciónintravítrea 13. Además, en nuestros experimentos de aplastamiento del nervio óptico (ONC), se tomaron imágenes de las retinas a las 4 semanas después de la infección, así como a los días 7 y 14 después de la lesión por aplastamiento. Estos puntos de tiempo se eligieron para capturar tanto la expresión inicial de AAV como la progresión de los cambios en la retina después de la ONC.
    2. Cubra la plataforma de imágenes con un trozo de la almohadilla limpia para evitar la posible contaminación de los excrementos de los animales durante el proceso de operación.
      NOTA: La plataforma de imágenes personalizada proporciona un amplio espacio para que el animal se acueste boca abajo, lo que garantiza la estabilidad y minimiza el movimiento durante la sujeción manual para una adquisición óptima de la imagen.
    3. Transfiera con cuidado el ratón a la plataforma de imágenes y permita un período de aclimatación de 2 a 5 minutos antes de la obtención de imágenes para minimizar el estrés y facilitar la adaptación al entorno de imágenes.
    4. Con la ayuda de un segundo técnico, sujete suavemente al animal mientras mantiene un estado consciente durante todo el procedimiento. Proporcione un intervalo de descanso de 10 segundos después de 15 segundos de imágenes para permitir el parpadeo y mantener la humedad de la córnea.
      NOTA: Frote suavemente la piel del cuero cabelludo para inducir el levantamiento espontáneo de los párpados, evitando el uso de inmovilización forzada de los párpados o dispositivos adicionales como pinzas, reduciendo así el riesgo de lesiones oculares. La anestesia general no se emplea para preservar la claridad óptica durante sesiones de imágenes prolongadas, ya que tiene el potencial de exacerbar la opacidad transitoria del cristalino. Equilibre la adquisición de imágenes de alta calidad con la comodidad y seguridad de los animales durante todo el procedimiento. Complete todo el procedimiento en 5 minutos para garantizar el bienestar del animal y mantener la calidad de las imágenes.
    5. Ajuste la postura de la cabeza y alinee la lente de la cámara ajustando la perilla de enfoque (Figura 1B) y el micromanipulador (Figura 1C) para apuntar a la región de interés (ROI) para la posterior obtención de imágenes in vivo .
  2. Configuración del sistema
    1. Coloque una lente gran angular de 55° sin contacto en la cámara para ampliar el campo de visión del área del fondo de ojo.
    2. Coloque la rueda de filtros en la posición A (angiografía) para permitir la adquisición del modo de imágenes de angiografía infrarroja (IR) y fluorescente (FA) (Figura 1A). Encienda el láser y la fuente de alimentación para activar el sistema de imágenes CSLO.
    3. Abra el software Heidelberg Eye Explorer y cree un nuevo examen haciendo clic en el icono Nuevo paciente en la parte superior de la barra de menú. Introduzca la información relevante del animal y acepte la curvatura corneal predeterminada de 7,7 mm en la ventana emergente.
    4. Seleccione el botón amarillo de inicio (Figura 1E) en la pantalla del panel de control para iniciar el modo de imagen en vivo.
  3. Imágenes CSLO in vivo
    1. Seleccione el modo IR (Figura 1G) con autofluorescencia a una longitud de onda de excitación de 820 nm en el panel de control. Para lograr imágenes de alta resolución, el High Res. El modo (HR) se activa a través de la interfaz de ventana o del panel de control manual (Figura 1F).
      NOTA: Las imágenes de reflectancia infrarroja (IR) suelen ser el primer paso en las imágenes oftálmicas CLSO, adquiridas antes de la angiografía con fluoresceína (FA), para proporcionar una vista de referencia. Incluso la iluminación, los artefactos mínimos y el enfoque nítido en los principales vasos de la retina son cruciales para la fiabilidad del enfoque en el plano z y el logro de imágenes IR de alta calidad.
    2. Mueva la lente hacia el ojo del ratón utilizando el joystick con el micromanipulador XYZ para un ajuste fino. Examine la transparencia óptica y gire la perilla de sensibilidad (Figura 1D) en sentido contrario a las agujas del reloj para disminuir el brillo de la imagen del fondo de ojo al 40%-60%, evitando así la sobreexposición del fondo de ojo y mejorando la visualización de los detalles de la retina.
    3. Ajuste la perilla de enfoque y el micromanipulador hasta que el disco óptico y los vasos de la retina se identifiquen sin ambigüedad en el fondo de ojo.
      NOTA: Criterios del plano focal óptimo: (1) Vista del fondo de ojo uniformemente iluminada sin esquinas oscuras. (2) Iluminación uniforme que rodea el disco óptico sin puntos oscuros focales ni distorsión. (3) Forma clara de la luz de los grandes vasos de la retina con el movimiento visible del flujo sanguíneo.
    4. Cambie al modo FA (Figura 1H) con un láser azul de estado sólido a una longitud de onda de excitación de 488 nm y un filtro de barrera a 500 nm. Gire la perilla de sensibilidad (Figura 1D) en el sentido de las agujas del reloj para aumentar el brillo de la imagen del fondo de ojo a 50%-107% para iluminar el área de la retina objetivo.
    5. Establezca el valor medio de ART (una barra azul en la parte inferior izquierda de la interfaz del software) en al menos 15 para mejorar la relación señal-ruido. Esta función promedia una serie de B-scans adquiridos en la misma ubicación, lo que mejora la calidad de la imagen.
      NOTA: Si bien un valor promedio de ART más alto generalmente mejora la calidad de la imagen a través del promedio, también extiende la duración del escaneo. Esta duración prolongada podría aumentar el riesgo de deshidratación de la córnea y fatiga de los animales, factores que deben considerarse cuidadosamente, especialmente en las imágenes de animales despiertos.
    6. Se realinean con el plano interno de la retina, dirigiéndose específicamente a las RGC que expresan GFP o a las células gliales de Müller. Se realizan ajustes finos para garantizar una iluminación nítida de la población celular deseada, como el soma y los axones de RGC, o el cuerpo de la célula de Müller. La sensibilidad de la imagen se equilibra para lograr una visualización óptima y evitar la sobresaturación de las células GFP positivas.
      NOTA: Para obtener las imágenes con una claridad y brillo comparables a los de la señal GFP, la adquisición de sensibilidad debe ser constante para todos los ratones del experimento.
    7. Presione la perilla de sensibilidad (Figura 1D) para iniciar el modo ART, que genera una imagen media en vivo en línea. Espere hasta que la barra azul (que representa el valor medio de ART) en la parte inferior izquierda de la interfaz del software haya alcanzado el valor de ART establecido (≥ 20 fotogramas) y toque el botón Adquirir en la interfaz de control para capturar las imágenes del fondo de ojo.
      NOTA: Para el modo ART, el seguimiento ocular está incorporado para compensar automáticamente los movimientos oculares menores durante la obtención de imágenes in vivo , lo que permite un enfoque consistente en el plano focal de la retina seleccionado.
    8. Una vez adquiridas las imágenes deseadas, salga del modo ART pulsando el mando de sensibilidad del panel táctil.
      NOTA: Para evitar la desecación de la córnea y permitir el parpadeo espontáneo, se implementaron descansos de 10 s cada 15 s durante el proceso de imagen.
    9. Para navegar por las áreas nasales y temporales de la retina, mueva el cabezal de la cámara horizontalmente mientras observa la imagen en vivo en la pantalla. Una vez alcanzada la región objetivo, ajuste el enfoque e inicie el proceso de obtención de imágenes como se describe en los pasos 2.3.1-2.3.8.
      NOTA: Mantenga los movimientos lentos y controlados de la cámara mientras garantiza una iluminación consistente y brillante del fondo de ojo. Si aparecen áreas oscuras, utilice el micromanipulador para ajustar la posición de la cámara verticalmente y volver a centrar la retina.
    10. Para obtener una imagen de la retina superior, ajuste suavemente la postura de la cabeza del ratón a una posición boca arriba. Incline moderadamente la cabeza de la cámara hacia arriba para alinearla con la región superior de la retina. Vuelva a ajustar el enfoque según sea necesario y proceda con la obtención de imágenes.
    11. Una vez finalizadas las imágenes, todas las regiones de la retina deseadas salen de la ventana de adquisición y las imágenes se guardan automáticamente. Aplique lubricante tópico en el ojo del que se obtiene la imagen para mantener la hidratación de la córnea.
    12. Para iniciar el examen del ojo contralateral, vuelva a colocar al animal en el lado opuesto de la plataforma y repita los pasos 2.3.1-2.3.11.

5. Procesamiento y análisis de imágenes

  1. Exportación y preparación de imágenes
    1. Abra el software Heidelberg Eye Explorer y seleccione la sesión de imágenes CSLO deseada con buena calidad. Elija imágenes únicas o consecutivas de la misma ubicación de la retina con ajustes de sensibilidad consistentes a lo largo del tiempo.
    2. Excluya las imágenes borrosas con poco enfoque o claridad corneal, asegurándose de que solo se utilicen para el análisis imágenes con una visualización clara de las estructuras de la retina. Exporte estas imágenes en formato TIFF para su posterior procesamiento.
  2. Alineación y recorte de imágenes
    1. Agrupe las imágenes por ojo de ratón en función de la misma región de la retina.
      NOTA: Las imágenes originales adquiridas del sistema CSLO se guardan en el siguiente formato: TIFF, con una dimensión de 1536 x 1536 píxeles, una resolución de 5,69 mmm/píxel y un valor ART de ≥15.
    2. Para los exámenes de seguimiento, importe las imágenes en un software de procesamiento de imágenes adecuado. Gire y alinee las imágenes según sea necesario para que coincidan con la orientación de la imagen de referencia. Al guardar o exportar las imágenes procesadas, utilice ajustes que mantengan la calidad de imagen más alta posible para minimizar los posibles artefactos de compresión.
    3. Alinee las imágenes CSLO de una serie temporal del mismo ojo girándolas para que coincidan con la imagen de referencia respectiva utilizando la vasculatura y el disco óptico como puntos de referencia.
      NOTA: Examine cuidadosamente cada imagen alineada y, antes de proceder a recortarla, asegúrese de que cumplan con los siguientes criterios: (1) Captura completa de la región retiniana: la imagen debe abarcar completamente la región retiniana de interés prevista, incluidos los puntos de referencia clave como el disco óptico y los vasos sanguíneos principales; (2) Ausencia de artefactos de movimiento: La imagen debe estar libre de desenfoque, rayas o duplicación de estructuras causadas por el movimiento de los ojos durante la toma de imágenes; (3) Distorsión mínima: La imagen debe representar con precisión la estructura de la retina sin artefactos de deformación, estiramiento o compresión que podrían surgir de los ángulos de la imagen o los efectos de la lente. (4) Equilibrio de las métricas de calidad de imagen: evaluaciones de los niveles de ruido de fondo (desviación estándar de las intensidades de píxeles en áreas sin estructura < 5 (escala 0-255)); relación señal-ruido (SNR >20), consistencia de la iluminación (coeficiente de variación entre seis cuadrantes de imagen <10%) y uniformidad de la imagen (coeficiente de variación en regiones homogéneas <15%).
    4. Seleccione la imagen girada y expórtela en formato TIFF. Para cada punto de tiempo, utilice la herramienta de recorte para seleccionar y recortar aleatoriamente de 5 a 10 áreas (de 300 x 300 píxeles cada una) que contengan celdas positivas para GFP de las imágenes de calidad aprobada. Exporte cada imagen recortada individualmente en formato TIFF para su posterior análisis.
  3. Medición de la intensidad de fluorescencia
    1. Abra las imágenes CSLO recortadas (escala de grises de 8 bits, 300 x 300 píxeles) en ImageJ/Fiji.
    2. Para examinar los cambios generales en las señales fluorescentes, mida la intensidad de fluorescencia total por imagen recortada utilizando Analizar > medir (o Ctrl + M). Registre el valor "Medio", que representa la intensidad media de fluorescencia GFP de toda la imagen recortada.
  4. Cuantificación de RGC
    1. En ImageJ/Fiji, ajuste el umbral de intensidad de las imágenes CSLO recortadas utilizando Imagen > Ajustar > Brillo/Contraste para lograr una visualización óptima de los cuerpos individuales de soma blanco sobre el fondo negro.
      NOTA: Determine un umbral individualizado después de revisar el lote de imágenes recortadas, o aplique un algoritmo de umbral coherente (por ejemplo, el método5 de Huang en ImageJ/Fiji). Para el método de Huang: (1) Convertir imágenes a escala de grises de 8 bits (Tipo de imagen > > 8 bits). (2) Acceda a la herramienta de umbrales (Imagen > Ajustar > umbral). (3) Seleccione Huang como método de umbral. (4) Obtenga una vista previa de la segmentación y haga clic en Aplicar. El umbral se calculará automáticamente y se mostrará en el histograma de la imagen.
    2. Active el complemento Cell Counter y haga clic en cada soma RGC positivo para GFP para contar. Registre el número total de celdas marcadas en la región analizada. Repita este proceso para todas las imágenes recortadas de cada punto de tiempo de seguimiento.
  5. Análisis de datos
    1. Exporte los datos de recuento de células e intensidad de fluorescencia a una hoja de cálculo o software estadístico (por ejemplo, GraphPad Prism).
    2. Realizar las pruebas estadísticas adecuadas con base en el diseño experimental y las hipótesis correspondientes. Interpreta los resultados y concluye.

Resultados

Siguiendo el protocolo presentado, se visualizaron y rastrearon con éxito diferentes células de la retina in vivo utilizando una combinación de entrega de genes mediada por AAV y CSLO. AAV2-hSyn-eGFP transdució eficazmente las RGC, lo que dio lugar a una expresión robusta de eGFP en toda la retina, como lo confirmó CSLO y la colocalización con el marcador específico de RGC, la proteína de unión al ARN con empalme múltiple (RBPMS), que se encuentra específicamente en la capa de células ganglionares (Figura 2 y Figura 3). El protocolo también confirmó la capacidad de dirigirse a la glía de Müller utilizando AAV9-GfaABC1D-eGFP. La visualización de CSLO reveló una expresión generalizada de eGFP, específicamente dentro de las capas internas de la retina, consistente con el segmento de distribución principal conocido de la glía de Müller. La señal positiva de GFP también está altamente colocalizada con el marcador de glía de Müller, la glutamina sintetasa (GS), lo que confirma aún más la especificidad de este enfoque (Figura 2E, F y Figura 3B). Estos hallazgos reafirmaron la versatilidad de la administración génica asistida por AAV para estudiar diferentes tipos de células de la retina. Para confirmar la capacidad de dirigirse a la glía de Müller, se utilizó AAV9-GfaABC1D-eGFP. Las imágenes CSLO revelaron una expresión generalizada de eGFP, específicamente dentro de las capas internas de la retina, consistente con la distribución conocida de la glía de Müller (Figura 2E, F). Este patrón de expresión selectiva se validó aún más por el alto grado de colocalización observado entre la señal de GFP y el marcador de glía de Müller, glutamina sintetasa (GS) (Figura 3B).

Para cuantificar la especificidad y la eficiencia del enfoque de diana viral tanto para las RGC como para la glía de Müller, se realizó un análisis de colocalización para comparar la fluorescencia de GFP con marcadores de tipo celular estándar (Figura 3B, D). Se analizaron un total de 6 ojos de ratón. Para los RGC dirigidos con AAV2-hSyn-GFP, la eficiencia de transducción fue del 64 % ± 3 %, mientras que la especificidad de la transducción fue del 68 % ± del 3 %. Para la glía de Müller dirigida con AAV9-GF9-GF1D-GFP, la eficiencia de transducción fue del 58% ± 2% y la especificidad de la transducción fue del 71% ± 2%. Estos resultados demuestran que este enfoque de administración de genes mediado por AAV permite el etiquetado selectivo de distintos tipos de células de la retina, lo que destaca su versatilidad para estudiar los procesos celulares y moleculares en la retina.

Para evaluar la idoneidad de CSLO para la monitorización longitudinal de las perturbaciones de las células de la retina, se realizó un modelo de ONC transitoria en ratones infectados con AAV2-hSyn-eGFP. Se observó una disminución progresiva en la señal de eGFP y en los números de RGC durante dos semanas (Figura 4). La supervivencia de RGC se cuantificó con tres métricas: intensidad de fluorescencia de CSLO, recuentos de células in vivo para imágenes de CSLO y recuentos de RGC ex vivo de células RBPMS positivas. Después del procesamiento de la imagen, como se describe en el paso 4, se recortaron al menos 10 regiones de interés (ROI) de cada retina (6 ojos en total), lo que garantizó que cada ROI abarcara la misma ubicación de la retina y exhibiera señales celulares claras en cada punto de tiempo. A continuación, se cuantificó la intensidad de fluorescencia de CSLO midiendo la intensidad media dentro de cada ROI recortado en cada punto de tiempo. In vivo, los recuentos celulares se obtuvieron contando manualmente las CGR individuales positivas para GFP dentro del mismo ROI recortado en cada punto de tiempo. Por último, se recolectaron retinas para la inmunotinción con RBPMS, y se contaron las células positivas para RBPMS dentro de 24 áreas definidas de las que se obtuvieron imágenes por sector de la retina para cada retina. Se encontraron correlaciones negativas significativas entre las tres métricas de supervivencia de RGC (intensidad de fluorescencia de CSLO, recuentos de células in vivo y recuentos de células ex vivo RBPMS positivos) y el tiempo posterior a la ONC (p < 0,001 para todos, Figura 4C), lo que demuestra una pérdida y degeneración progresivas de RGC. Es importante destacar que no se observaron diferencias significativas entre los diferentes grupos experimentales en términos de densidad inicial de RGC o tasa de disminución, lo que indica una consistencia bruta en el modelo de ONC y el enfoque de imagen. Estos hallazgos son consistentes con estudios previos sobre el daño de RGC después de ONC y validan la efectividad de este protocolo basado en CSLO como una herramienta no invasiva y confiable para monitorear la salud de RGC.

Para investigar más a fondo las proyecciones axonales de RGC dentro de la vía visual, se utilizó un enfoque de doble marcaje con la combinación de marcado eGFP mediado por AAV con la subunidad B (CTB) de la toxina del cólera trazador anterógrado24. Los ratones recibieron una inyección intravítrea de CTB y fueron sacrificados 2 días después para su análisis histológico. La colocalización de las señales de eGFP y CTB en los nervios ópticos confirmó el trazado positivo de los axones de RGC (Figura 5A). Para estudiar más a fondo los cambios de señales después de la lesión axonal, los ratones fueron sometidos a un aplastamiento unilateral del nervio óptico (ONC), un modelo de daño agudo de RGC25. Brevemente, los ratones fueron anestesiados, y un nervio óptico fue expuesto y aplastado aproximadamente 1 mm detrás del globo usando pinzas finas durante 5 s, induciendo una axotomía RGC significativa y la posterior degeneración. Después de la lesión por ONC, se observó una marcada reducción en la intensidad de eGFP y CTB, lo que indica una pérdida sustancial de fibras nerviosas y una interrupción del transporte axonal. Un análisis más detallado de las secciones cerebrales reveló proyecciones de RGC al colículo superior (SC), una estructura del mesencéfalo involucrada en la integración sensoriomotora y los movimientos oculares, y al núcleo geniculado lateral (LGN), el principal centro de transmisión de información visual a la corteza visual. Después de la ONC, se reveló una disminución de la intensidad de la GFP en el lado contralateral de la lesión (Figura 5B-E). Estos hallazgos demuestran la utilidad de este método para estudiar la degeneración axonal de RGC y mapear sus patrones de proyección in vivo, ofreciendo una alternativa potencial a los métodos tradicionales de rastreo invasivo.

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Figura 1: Sistema de imágenes de oftalmoscopio láser de barrido confocal (CSLO) e interfaz del panel de control para imágenes de retina en vivo. (A-D) Componentes del sistema de imágenes: Estas imágenes representan los componentes clave del dispositivo HRA CSLO. (A) La palanca del filtro está configurada en la posición "A" para imágenes combinadas de reflectancia infrarroja (IR) y angiografía con fluoresceína (FA). (B) La perilla de enfoque ajusta el enfoque fino de la lente del objetivo. (C) El micromanipulador permite el posicionamiento, la alineación y la iluminación precisos del haz de luz a la retina a través de múltiples grados de libertad (por ejemplo, ejes X, Y, Z) y rotación. (D) La perilla de sensibilidad controla el brillo de las imágenes IR y FA ajustando la amplificación de la señal de luz detectada. Al presionar la perilla, se inicia el promedio de la imagen, que combina varios fotogramas para reducir el ruido y mejorar la relación señal-ruido. (E-H) Interfaz del panel de control: Las capturas de pantalla muestran el panel de control CSLO con la configuración utilizada para la adquisición y visualización de imágenes en vivo. (E) Se inicia el panel de control de adquisición. (F) Se recomienda el modo de alta resolución para obtener una calidad de imagen óptima. (G) Se resaltan los ajustes de imágenes IR, lo que permite la visualización de las estructuras de la retina y los vasos sanguíneos. (H) La configuración de imágenes FA muestra opciones para imágenes de fluorescencia de un solo punto y multipunto, lo que permite la detección de señales fluorescentes dentro de las células de la retina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Imágenes CSLO in vivo de células retinianas marcadas con fluorescencia después de la transfección de AAV en ratones C57. (A) La línea de tiempo experimental de las imágenes longitudinales asistidas por CSLO después de la transfección de AAV en el ojo del ratón. (B) Imágenes CSLO representativas de las regiones superior y central de la retina de un ratón C57 después de 4 semanas de expresión de AAV2-hSyn-eGFP. Barra de escala: 500 μm. (C) Un montaje de retina cosido manualmente de (B) muestra la distribución de las células de la retina que expresan eGFP. Barra de escala: 500 μm. (D) Una imagen CSLO ampliada del área en caja en (C) y la imagen de microscopía confocal correspondiente de un montaje plano de retina. La colocalización de eGFP (verde) con el marcador RGC RBPMS (rojo) confirma la expresión mediada por AAV en las células ganglionares de la retina (ejemplos encerrados en un círculo). Barra de escala: 50 μm. (E) Un montaje cosido manualmente de una retina de ratón C57 4 semanas después de la inyección con AAV9-GfaABC1D-eGFP, que demuestra la expresión de eGFP específica de la glía de Müller. Barra de escala: 500 μm. (F) Una imagen CSLO ampliada del área en caja en (E) y la imagen de microscopía confocal correspondiente de un montaje plano de retina. La colocalización de eGFP (verde) con el marcador de glía de Müller, glutamina sintetasa (GS, rojo), confirma la expresión mediada por AAV en las células gliales de Müller (ejemplos encerrados en un círculo). Barra de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Especificidad del tipo de célula de la entrega de genes mediada por AAV en la retina de ratón. (A) Inmunohistoquímica de una sección de retina y flatmount de ratones C57 después de 4 semanas de infección por AAV2-hSyn-eGFP. La colocalización de GFP (verde) con RBPMS (rojo) confirma la expresión específica de RGC. Barra de escala: 50 μm. (B) Cuantificación de la eficiencia y especificidad de la transducción AAV2-hSyn-GFP en RGCs. La eficiencia se representa como el porcentaje de RGCs positivas para RBPMS que también expresan GFP en el flatmount retiniano. La especificidad se representa como el porcentaje de células GFP positivas que también son positivas para RBPMS en la sección de la retina (n = 6 ojos de 4 ratones). (C) Tinción de inmunofluorescencia de una sección de retina y flatmount de ratones C57 después de 4 semanas de infección por AAV9-GfaABC1D-eGFP. La colocalización de GFP (verde) con GS (rojo) confirma la expresión específica de la glía de Müller. Barra de escala: 50 μm. (D) Cuantificación de la eficiencia y especificidad de la transducción AAV9-GfaABC1D-GFP en la glía de Müller. La eficiencia se representa como el porcentaje de glía de Müller GS-positiva que también expresa GFP en la retina flatmount. La especificidad se representa como el porcentaje de células GFP positivas que también son positivas para GS en la sección de la retina (n = 6 ojos de 3 ratones). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Monitorización longitudinal de CSLO de la supervivencia de RGC tras el aplastamiento agudo del nervio óptico (ONC) en ratones AAV2-hSyn-eGFP. (A) Un diagrama esquemático de la línea de tiempo experimental de la lesión aguda del nervio óptico después de la infección por AAV. (B) Imágenes longitudinales de CSLO de la misma retina en un ratón AAV2-hSyn-eGFP al inicio, 7 días y 14 días después de la ONC, visualizando las RGC que expresan señales de GFP. A la derecha se muestran imágenes ampliadas de las áreas en caja, junto con imágenes representativas de microscopía confocal de montes planos de retina que demuestran la morfología y distribución de RGC. Barras de escala: 100 μm. (C) La cuantificación de la supervivencia de RGC durante dos semanas después de la ONC se evaluó midiendo el cambio porcentual tanto en el número de células como en la intensidad fluorescente de CSLO en relación con el valor basal (media ± SEM). No se observaron diferencias significativas entre los grupos en cada momento (ANOVA de un factor). El análisis de regresión lineal reveló correlaciones negativas significativas entre el tiempo posterior a la lesión y las métricas de supervivencia de RGC basadas en la fluorescencia de GFP (r² = 0,945, p < 0,001), la tinción de RBPMS (r² = 0,888, p < 0,001), el recuento de células CSLO (r² = 0,511, p < 0,001) y la intensidad fluorescente de CSLO (r² = 0,7486, p < 0,001). n = 6 ratones/grupo/punto de tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Mapeo asistido por AAV de las proyecciones axonales de RGC a lo largo de la vía visual. (A) Imágenes representativas de microscopía de fluorescencia de un par de nervios ópticos de un ratón AAV2-hSyn-eGFP, que demuestran axones RGC marcados con GFP (verde) y colocalización con el trazador axonal anterógrado toxina B del cólera (CTB, magenta). El panel superior proporciona una visión general de todos los nervios ópticos (barra de escala: 1000 μm), mientras que el panel inferior ofrece vistas ampliadas de las regiones en caja (barra de escala: 100 μm). Dos semanas después de la lesión ONC, las señales de GFP y CTB muestran una marcada reducción en todo el nervio óptico (lado izquierdo), lo que indica pérdida axonal de RGC y alteración a lo largo de la vía visual. (B) Proyecciones axonales de RGC al colículo superior (SC). Las secciones coronales del cerebro de un ratón AAV2-hSyn-eGFP 2 semanas después de la ONC resaltan los axones RGC marcados con GFP (verde) y la tinción de CTB (magenta) dentro del SC. Izquierda (L): SC contralateral; Derecha (derecha): SC ipsilateral (lado lesionado por ONC). Barra de escala: 1000 μm. (C) Una vista ampliada de la región en caja en (B) demuestra la colocalización de las señales GFP y CTB (imagen combinada), destacando los haces axonales de RGC y sus patrones de proyección dentro del SC. Barra de escala: 100 μm. (D) Proyecciones axonales de RGC al núcleo geniculado lateral (LGN) después de ONC, revelando axones de RGC marcados con GFP (verde) y tinción de CTB (magenta) dentro del LGN. Izquierda (L): LGN contralateral; Derecha (derecha): LGN ipsilateral (lado lesionado por ONC). Barra de escala: 1000 μm. (E) Una vista ampliada de la región en caja en (D) resalta los haces axonales de RGC y sus patrones de proyección dentro del LGN. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El protocolo presentado detalla un método robusto y accesible para la vigilancia in vivo de poblaciones específicas de células de la retina, aprovechando el poder de la entrega de genes mediada por AAV y las imágenes de CSLO. Este enfoque ofrece varias ventajas sobre los métodos tradicionales, ya que facilita los estudios longitudinales de la dinámica de las células de la retina y sus respuestas a lesiones o enfermedades en condiciones fisiológicas o patológicas.

El éxito de este método depende de varios pasos críticos. En primer lugar, lograr una eficiencia óptima de transducción de AAV es fundamental para una expresión robusta y específica del reportero fluorescente en la población de células diana. Esto puede estar influenciado por factores como la selección del serotipo de AAV, el título viral y la técnica de inyección 13,15,16. En segundo lugar, el manejo y la sujeción adecuados de los animales durante las imágenes CSLO son esenciales para minimizar los artefactos de movimiento y mantener la calidad de la imagen. El empleo de una plataforma de imágenes personalizada y evitar la anestesia general contribuye a lograr una visualización clara y consistente de las estructuras de la retina. En tercer lugar, es necesaria una optimización cuidadosa de los parámetros de imagen CSLO, incluidos los ajustes de enfoque, sensibilidad y promedio, para obtener imágenes de alta resolución con un ruido mínimo y una relación señal-ruido óptima26. Por último, para abordar las posibles limitaciones y garantizar la fiabilidad de los datos, implementamos estrictas medidas de control de la calidad de la imagen y aumentamos el número de animales en el diseño de nuestro estudio.

El sistema Spectralis HRA CSLO cuenta con un seguimiento ocular automático que mejora las imágenes longitudinales clínicas. Su función de seguimiento automático en tiempo real (ART) puede fijarse en un área específica de la retina durante la obtención de imágenes, lo que reduce los artefactos de movimiento. Para la imagen clínica humana, el sistema también incluye un algoritmo para el seguimiento a largo plazo de la misma ubicación anatómica de la retina27. Sin embargo, estas tecnologías no están optimizadas para estudios con roedores debido a las diferencias anatómicas significativas entre los ojos humanos y los de roedores. Los ojos de los roedores son mucho más pequeños (3-4 mm de diámetro en comparación con los 24 mm de los humanos) y carecen de ciertos puntos de referencia como la mácula, lo que presenta desafíos únicos para el seguimiento automatizado28. En consecuencia, los investigadores que estudian modelos de roedores se basan principalmente en métodos manuales, utilizando puntos de referencia anatómicos como los patrones de los vasos y la cabeza del nervio óptico para localizar regiones específicas de la retina y mantener planos de imagen consistentes a lo largo de las sesiones13,22. Este enfoque es necesario no solo debido a los puntos de referencia limitados en los ojos de los roedores, sino también debido a los posibles cambios sustanciales en la retina inducidos por manipulaciones experimentales, que podrían confundir a los sistemas automatizados no diseñados para estos desafíos específicos. Por lo tanto, el desarrollo de algoritmos especializados de seguimiento ocular y alineación para imágenes de retina de roedores representa una dirección futura crucial. En particular, la adaptación de los algoritmos de seguimiento a largo plazo para el uso de animales pequeños podría mejorar significativamente la precisión y la reproducibilidad de los estudios longitudinales.

Si bien las técnicas histológicas tradicionales requieren el sacrificio de animales e impiden los estudios longitudinales, este método de imagen CSLO asistido por AAV ofrece un enfoque no invasivo para monitorear la dinámica de las células de la retina in vivo. Este enfoque se basa en trabajos previos que demuestran la utilidad de las imágenes de cSLO para el seguimiento de cambios longitudinales en células específicas de la retina después de una lesión, particularmente en modelos animales que utilizan el marcaje de proteínas fluorescentes transgénicas 19,21,22,29. Estos estudios han puesto de manifiesto la capacidad de CSLO para visualizar una serie de eventos de las células de la retina in vivo, como la muerte celular, la supervivencia y, potencialmente, incluso la migración o el crecimiento del proceso. Este protocolo amplía la aplicación de esta técnica para estudiar la transducción mediada por AAV de poblaciones específicas de células de la retina, lo que nos permite monitorear los efectos a largo plazo de la administración de AAV y la expresión de transgenes dentro de la retina y proporciona información crucial sobre la progresión de las enfermedades de la retina y la eficacia de las intervenciones terapéuticas. Las evaluaciones clínicas actuales que utilizan OCT se centran principalmente en la pérdida de axones de RGC mediante la medición del grosor de la capa de fibras nerviosas de la retina9, pero carecen de la resolución para evaluar la morfología individual de RGC o la afectación de las células gliales. Aunque AO-SLO permite la obtención de imágenes a nivel celular en la retina humana viva10, su complejidad y disponibilidad limitada restringen su uso principalmente en entornos de investigación. Además, la diferenciación de los tipos de células gliales dentro de AO-SLO a menudo requiere métodos de etiquetado adicionales30. Este método supera estas limitaciones al proporcionar un enfoque más completo y accesible para visualizar y rastrear RGC individuales y otras poblaciones de células de la retina marcadas con fluorescencia a lo largo del tiempo. Esto abre vías para investigar las respuestas celulares en diversas condiciones, lo que ayuda en el desarrollo de terapias dirigidas. Además, la combinación de imágenes CSLO asistidas por AAV con optogenética31 o imágenes de calcio32 puede profundizar aún más la comprensión de la función de las células de la retina y sus funciones en el procesamiento visual, el desarrollo de circuitos y la regeneración.

A pesar de la solidez de este enfoque, se deben reconocer algunas limitaciones y posibles consideraciones de solución de problemas. Puede producirse variabilidad en la eficiencia de la transducción de AAV, lo que requiere la optimización de los parámetros de inyección o del título viral para tipos específicos de células o condiciones experimentales. Las imágenes CSLO pueden verse afectadas por factores como las opacidades de la córnea, la inestabilidad de la película lagrimal y los movimientos oculares, lo que requiere un seguimiento y ajustes cuidadosos durante la adquisición de imágenes. Además, la limitada profundidad de penetración de CSLO restringe la visualización a las capas internas de la retina, excluyendo potencialmente estructuras más profundas como los fotorreceptores33. El sistema Spectralis cSLO permite una visualización clara de las distintas características y patrones celulares dentro de la retina34. Si bien esta modalidad de imagen puede facilitar la observación de una sola célula en ciertas condiciones, como se demostró en un trabajo anterior en el que se visualizaron RGC individuales en ratones Thy1-YFP22 escasamente marcados, puede plantear desafíos para cuantificar células individuales en escenarios densamente marcados. Por ejemplo, en este estudio, el marcaje masivo de RGC con eGFP después de una infección de retina mediada por AAV a veces puede dificultar la visualización clara de células individuales, particularmente en áreas con variaciones en los niveles de expresión y superposición celular. Este desafío se agrava aún más cuando se obtienen imágenes de la glía de Müller, ya que su morfología alargada, que abarca todo el grosor de la retina35, dificulta la captura de una sola célula dentro de un solo plano focal utilizando cSLO. Por lo tanto, la evaluación de la eficiencia de la infección por glía de Müller mediada por AAV9 se basa principalmente en la evaluación de los patrones generales de transducción y la distribución mediante imágenes CSLO.

Además, mientras que el promedio de ART en el sistema HRA mejora la calidad de la imagen, el aumento de la duración de la exploración presenta limitaciones prácticas, especialmente en la obtención de imágenes de animales despiertos. El valor medio de ART seleccionado de 15 es para equilibrar la calidad de la imagen con el tiempo de escaneo, proporcionando una reducción de ruido suficiente y manteniendo una duración de escaneo razonable. Para minimizar la incomodidad y el estrés de los animales, los procedimientos de diagnóstico por imágenes deben optimizarse para lograr una mayor eficiencia, emplear personal capacitado y capacitado en el manejo y la obtención de imágenes de animales despiertos, y monitorear diligentemente a los animales para detectar signos de malestar o sequedad de la córnea durante las sesiones de diagnóstico por imágenes. Estas medidas fueron cruciales para garantizar tanto la calidad de los datos como el bienestar animal, lo que pone de manifiesto la importancia de tener en cuenta ambos factores a la hora de emplear el promedio de ART para la obtención de imágenes de retina in vivo en modelos animales despiertos.

Al reconocer estas limitaciones y las posibles fuentes de variabilidad, los investigadores pueden tomar las medidas adecuadas para optimizar los protocolos de obtención de imágenes, minimizar los artefactos y garantizar la fiabilidad y la reproducibilidad de sus datos.

En general, este método accesible y fácilmente implementable ofrece un medio poderoso para investigar la compleja interacción entre las RGC y la glía de Müller, especialmente en respuesta a lesiones o enfermedades. Al permitir a los investigadores visualizar y cuantificar estas interacciones dinámicas, este enfoque facilita el descubrimiento de nuevos mecanismos celulares y moleculares que subyacen a las patologías de la retina. Esto, a su vez, arroja luz sobre el desarrollo de estrategias terapéuticas específicas y mejores medidas para contrarrestar la enfermedad.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82130029). La Figura 2A y la Figura 4A se crearon con BioRender.com.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Aguja de calibre 33Hamilton Corp., Reno, NV, EE. UU. 7803-05Para inyección intravítrea
de proparacaína al 0,5% Santen Farmacéutica Co., Ltd.Anestetésicos tópicos
AAV2-hSyn-eGFP OBiO Technology Corp., ChinaTítulo del virus: 2,7 x 1012 genomas virales (vg)/mL 
AAV9-GfaABC1D-eGFPWZ Biosciences Inc., ChinaTítulo del virus: 4,5 x 1012 genomas virales (vg)/mL 
BetadineHealthy medical company001651Antisépticos tópicos
Pinzas escelares corneales (dentadas)Mingren Eye Instruments, ChinaMR-F301APara la seguridad del párpado durante la inyección intravítrea
Pinza Dumont 05#FST51-AGT5385Para aplastamiento del nervio óptico
Prisma GraphPadPrisma GraphPad, EE. UUDibujo gráfico y análisis estadístico
HRA SpectralisHeidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, AlemaniaModo "IR" y "FA" para imágenes CSLO
Imagen J/Institutos Nacionales de Salud de Fiji, EE. UU.Procesamiento de imágenes
Pomada antibiótica MaxitrolAlcon Laboratories, INC. EE. UU.0065-0631Antibióticos tópicos
Jeringa de microlitrosHamilton Corp., Reno, NV, EE. UU.7633-01Para inyección intravítrea
Mydrin-P Solución oftálmicaSanten Pharmaceutical Co., Ltd, JapónDilatación de la pupila
Microscopio quirúrgico oftálmico Leica AG, Heerbrugg, SuizaM220Para operaciones quirúrgicas
Pentorbarbitol Sodio SigmaAldrich, EE. UU57-33-0Genereal Aneasthetics
PowerpointMicrosoft Corporation, EE. UUAlineación y recorte de imágenes
VISCOTEARS Gel líquido (carbómero)Dr. Gerhard Mann, químico-farmacéutico. Fabrik, AlemaniaLubricante tópico 
. . .

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