Imágenes longitudinales in vivo de células de la retina con serotipos de virus adenoasociados personalizados mediante oftalmoscopia láser de barrido confocal

Resumen

Este protocolo describe el uso de vectores de virus adenoasociados (AAV) para el marcaje específico de células y la obtención de imágenes in vivo utilizando un oftalmoscopio láser de barrido confocal (CSLO). Este método permite la investigación de diferentes tipos de células de la retina y sus contribuciones a la función y la enfermedad de la retina.

Resumen

La naturaleza dinámica de los procesos celulares de la retina requiere avances en la administración de genes y las técnicas de monitoreo en vivo para mejorar la comprensión y el tratamiento de las enfermedades oculares. Este estudio presenta un enfoque optimizado de virus adenoasociados (AAV), utilizando serotipos y promotores específicos para lograr una eficiencia de transfección óptima en células de la retina específicas, incluidas las células ganglionares de la retina (RGC) y la glía de Müller. Aprovechando la precisión de la oftalmoscopia láser de barrido confocal (CSLO), este trabajo presenta un método no invasivo para la obtención de imágenes in vivo que captura la expresión longitudinal de la proteína verde fluorescente (GFP) mediada por AAV. Este enfoque elimina la necesidad de procedimientos terminales, preservando la continuidad de la observación y el bienestar del sujeto. Además, la señal de GFP se puede rastrear en las RGC infectadas por AAV a lo largo de la vía visual hasta el colículo superior (SC) y el núcleo geniculado lateral (LGN), lo que permite el potencial de mapeo directo de la vía visual. Estos hallazgos proporcionan un protocolo detallado y demuestran la aplicación de esta poderosa herramienta para estudios en tiempo real del comportamiento de las células de la retina, la patogénesis de la enfermedad y la eficacia de las intervenciones de terapia génica, ofreciendo información valiosa sobre la retina viva y sus conexiones.

Introducción

Al ser la única parte ópticamente accesible del sistema nervioso central, la retina sirve como un modelo valioso para la investigación en neurociencia^. Las células ganglionares de la retina (CGR), las neuronas de salida de la retina que transmiten información visual al cerebro, desempeñan un papel crucial en la función visual. Su pérdida o disfunción conduce a un deterioro de la visión y a una ceguera irreversible, como se observa en el glaucoma y otras neuropatías ópticas². La glía de Müller, las principales células gliales de la retina, son esenciales para mantener la homeostasis de la....

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de la Capital, Beijing. Para todos los experimentos se utilizaron ratones machos C57BL/6J adultos de cuatro semanas de edad (con un peso de entre 15 y 20 g) y se alojaron en salas con temperatura controlada con un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas. La comida estándar para roedores y el agua estaban disponibles ad libitum. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en e....

Resultados

Siguiendo el protocolo presentado, se visualizaron y rastrearon con éxito diferentes células de la retina in vivo utilizando una combinación de entrega de genes mediada por AAV y CSLO. AAV2-hSyn-eGFP transdució eficazmente las RGC, lo que dio lugar a una expresión robusta de eGFP en toda la retina, como lo confirmó CSLO y la colocalización con el marcador específico de RGC, la proteína de unión al ARN con empalme múltiple (RBPMS), que se encuentra específicamente en la capa de células ganglionares (

Discusión

El protocolo presentado detalla un método robusto y accesible para la vigilancia in vivo de poblaciones específicas de células de la retina, aprovechando el poder de la entrega de genes mediada por AAV y las imágenes de CSLO. Este enfoque ofrece varias ventajas sobre los métodos tradicionales, ya que facilita los estudios longitudinales de la dinámica de las células de la retina y sus respuestas a lesiones o enfermedades en condiciones fisiológicas o patológicas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Aguja de calibre 33	Hamilton Corp., Reno, NV, EE. UU	. 7803-05	Para inyección intravítrea
de proparacaína al 0,5%	Santen Farmacéutica Co., Ltd.		Anestetésicos tópicos
AAV2-hSyn-eGFP	OBiO Technology Corp., China		Título del virus: 2,7 x 1012 genomas virales (vg)/mL
AAV9-GfaABC1D-eGFP	WZ Biosciences Inc., China		Título del virus: 4,5 x 1012 genomas virales (vg)/mL
Betadine	Healthy medical company	001651	Antisépticos tópicos
Pinzas escelares corneales (dentadas)	Mingren Eye Instruments, China	MR-F301A	Para la seguridad del párpado durante la inyección intravítrea
Pinza Dumont 05#	FST	51-AGT5385	Para aplastamiento del nervio óptico
Prisma GraphPad	Prisma GraphPad, EE. UU		Dibujo gráfico y análisis estadístico
HRA Spectralis	Heidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, Alemania		Modo "IR" y "FA" para imágenes CSLO
Imagen J/	Institutos Nacionales de Salud de Fiji, EE. UU.		Procesamiento de imágenes
Pomada antibiótica Maxitrol	Alcon Laboratories, INC. EE. UU.	0065-0631	Antibióticos tópicos
Jeringa de microlitros	Hamilton Corp., Reno, NV, EE. UU.	7633-01	Para inyección intravítrea
Mydrin-P Solución oftálmica	Santen Pharmaceutical Co., Ltd, Japón		Dilatación de la pupila
Microscopio quirúrgico oftálmico	Leica AG, Heerbrugg, Suiza	M220	Para operaciones quirúrgicas
Pentorbarbitol Sodio Sigma	Aldrich, EE. UU	57-33-0	Genereal Aneasthetics
Powerpoint	Microsoft Corporation, EE. UU		Alineación y recorte de imágenes
VISCOTEARS Gel líquido (carbómero)	Dr. Gerhard Mann, químico-farmacéutico. Fabrik, Alemania		Lubricante tópico

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