Fabricación y caracterización de parches de microagujas para la carga y entrega de exosomas

Resumen

Los exosomas poseen un potencial clínico significativo, pero su aplicación práctica es limitada debido a la fácil eliminación in vivo y la poca estabilidad. Las microagujas presentan una solución al permitir la administración localizada mediante la perforación de barreras fisiológicas y la conservación en estado seco, abordando así las limitaciones de la administración de exosomas y ampliando su utilidad clínica.

Resumen

Los exosomas, como bioterapéuticos emergentes de "próxima generación" y vectores de administración de fármacos, tienen un inmenso potencial en diversos campos biomédicos, que van desde la administración de fármacos y la medicina regenerativa hasta el diagnóstico de enfermedades y la inmunoterapia tumoral. Sin embargo, el rápido aclaramiento mediante la inyección tradicional en bolo y la escasa estabilidad de los exosomas restringen su aplicación clínica. Las microagujas sirven como una solución que prolonga el tiempo de residencia de los exosomas en el sitio de administración, manteniendo así la concentración del fármaco y facilitando efectos terapéuticos sostenidos. Además, las microagujas también poseen la capacidad de mantener la estabilidad de las sustancias bioactivas. Por lo tanto, presentamos un parche de microagujas para cargar y administrar exosomas y compartimos los métodos, incluido el aislamiento de exosomas, la fabricación y la caracterización de parches de microagujas cargados con exosomas. Los parches de microagujas se fabricaron utilizando trehalosa y ácido hialurónico como materiales de punta y polivinilpirrolidona como material de soporte a través de un método de fundición de dos pasos. Las microagujas demostraron una resistencia mecánica robusta, con puntas capaces de soportar 2 N. Se utilizó piel de cerdo para simular la piel humana, y las puntas de las microagujas se derritieron completamente dentro de los 60 segundos posteriores a la punción de la piel. Los exosomas liberados por las microagujas mostraron morfología, tamaño de partícula, proteínas marcadoras y funciones biológicas comparables a las de los exosomas frescos, lo que permitió la absorción de las células dendríticas y promovió su maduración.

Introducción

Los exosomas, que son pequeñas vesículas liberadas por las células en la matriz extracelular, se han propuesto como potenciales bioterapéuticos y vectores de administración de fármacos para el tratamiento de varias enfermedades y cánceres¹. Durante su proceso de biogénesis, los exosomas encapsulan varias moléculas biológicamente activas desde el interior de las células, incluidas las proteínas funcionales y los ácidos nucleicos². Como resultado, cuando son absorbidos por las células receptoras durante el proceso de transporte, los exosomas tienen la capacidad de modular la expresión génica y las funciones celulares en las células diana³. Como una especie de mensajero de información natural, los exosomas se han aprovechado plenamente en la regeneración de tejidos, la regulación inmunitaria y como portadores de entrega⁴. A través de técnicas de ingeniería, se pueden enriquecer ligandos específicos en la superficie de los exosomas, lo que permite la inducción o inhibición de eventos de señalización en las células receptoras o se dirige a tipos específicos^{de células 5}. Los agentes quimioterapéuticos también pueden cargarse en exosomas para el tratamiento del cáncer⁶. Además, los exosomas tienen la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica para la entrega de carga terapéutica, lo que los hace muy prometedores para el tratamiento de trastornos cerebrales⁷. En comparación con los liposomas, los exosomas presentan una mayor absorción celular y una mejor biocompatibilidad⁸. Son capaces de entrar eficientemente en otras células, al tiempo que demuestran una mejor tolerancia y una menor toxicidad⁹. Sin embargo, la inyección tradicional en bolo de exosomas es propensa al secuestro y a la rápida eliminación por parte del hígado, los riñones y el bazo en^{el torrente} sanguíneo. Además, los exosomas tienen poca estabilidad in vitro y son susceptibles a condiciones de almacenamiento que restringen sus aplicaciones clínicas¹¹.

Las microagujas, un conjunto de puntas de aguja de tamaño micrométrico, tienen la capacidad de penetrar las barreras fisiológicas para la administración de fármacos de moléculas pequeñas¹², proteínas¹³, ácidos nucleicos¹⁴ y nanomedicinas¹⁵. Las microagujas están diseñadas con precisión para atacar las lesiones en la superficie de la piel, y sus puntas dispersas garantizan una distribución uniforme del fármaco en el sitio objetivo, amplificando así su impacto terapéutico¹⁶. El diseño y la composición del material de las microagujas facilitan el almacenamiento en seco de sustancias bioactivas como proteínas y ácidos nucleicos, mejorando su estabilidad¹⁷. Los métodos tradicionales de inyección tienen una duración de acción relativamente corta y pueden causar dolor, induciendo miedo en los pacientes¹⁸. La longitud de la microaguja, del tamaño de un micrómetro, minimiza el trauma tisular y evita la estimulación nerviosa, eliminando así el dolor y mejorando la distensibilidad del paciente¹⁹. Además, la facilidad de uso de las microagujas permite a los pacientes autoadministrarse el tratamiento sin necesidad de personal especializado¹⁶. Además de la piel, las microagujas también se pueden utilizar en tejidos como los ojos²⁰, la mucosa oral²¹, el corazón²² y los vasos sanguíneos²³. La aplicación de microagujas para la administración clínica de exosomas proporciona una estrategia prometedora y prospectiva.

Por lo tanto, presentamos un parche de microagujas (exo@MN) cargado con exosomas y divulgamos su método de fabricación. Los parches de microagujas se fabricaron utilizando un método de fundición de dos pasos, junto con centrifugación y secado al vacío, que promueve la agregación de exosomas en las puntas de las microagujas, mejorando así la eficiencia de la administración. Tanto las puntas de las agujas como el soporte se construyeron con materiales que exhiben una excelente biocompatibilidad y solubilidad en agua. Se incorporaron trehalosa y ácido hialurónico (AH) como materiales de punta para proporcionar protección a los exosomas, y se eligió polivinilpirrolidona (PVP) disuelto en etanol absoluto como material de soporte. La morfología del parche de microagujas se caracterizó mediante microscopía y microscopio electrónico de barrido (SEM). Las pruebas mecánicas de la microaguja se evaluaron utilizando un tensímetro para confirmar su capacidad para penetrar en la piel, y se investigó que la tasa de liberación en la piel de cerdo era de 60 s. Además, se caracterizó la morfología, el tamaño y el contenido de proteínas de los exosomas frescos y de los exosomas en exo@MN mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM), análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y Western blot (WB). La internalización de exosomas por células dendríticas (CD) se caracterizó mediante microscopio láser confocal de barrido (CLSM) y la maduración de las CD se evaluó mediante citometría de flujo. La caracterización morfológica y las funciones biológicas de los dos tipos de exosomas son esencialmente consistentes.

Protocolo

Este estudio no requiere autorización ética, ya que la piel de cerdo utilizada para los experimentos descritos en la sección 3 se compró como orejas de cerdo comestibles en el mercado y no se obtuvo de animales de experimentación.

1. Aislamiento de exosomas

1. Cultivo celular
   1. Cultive células de cáncer epitelial de ovario de ratón ID8 en el medio de cultivo Eagle Medium Modified (DMEM) de Dulbecco que contiene un 10% de suero fetal bovino y una solución de penicilina-estreptomicina al 1% (100×) (ver Tabla de Materiales) en placas de Petri con un diámetro de 15 cm.
   2. Incubar las células ID8 en una incubadora de CO₂ (ver Tabla de Materiales) a 37 °C y 5% de CO₂ hasta que la densidad celular alcance el 90%.
2. Aislamiento de exosomas
   1. Retire el medio de cultivo de las placas de Petri y lávelas dos veces con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco. Añadir 20 mL de DMEM sin suero fetal bovino (ver Tabla de Materiales) y solución de penicilina-estreptomicina (ver Tabla de Materiales). Continuar la incubación a 37 °C y 5% de CO₂ durante 48 h.
   2. Recoja el sobrenadante de cultivo celular de 20 placas de Petri de 15 cm de diámetro. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante para eliminar las células libres.
   3. Centrifugar a 2000 x g durante 10 min 4 °C y recoger el sobrenadante para eliminar los restos celulares.
   4. Conecte el sistema de filtración al vacío desechable de 0,22 μm (consulte la tabla de materiales) a la bomba de vacío de agua circulante (consulte la tabla de materiales). Cree un vacío para permitir que el sobrenadante pase a través de la membrana de poliéter sulfona de 0,22 μm y entre en la cámara inferior del sistema de filtración, eliminando eficazmente las vesículas o impurezas mayores de 0,22 μm del sobrenadante.
      1. Para conectar la bomba de vacío, encienda el interruptor de la bomba y luego conéctelo a la entrada de aire del sistema de filtración al vacío. Al cerrar, desconecte primero la conexión con la bomba y luego apague la bomba de vacío. Este procedimiento ayuda a evitar el reflujo de la bomba de vacío y la contaminación del fluido de cultivo.
   5. Añadir 15 mL de sobrenadante al tubo interior del tubo de ultrafiltración de 100 kDa (ver Tabla de Materiales). Centrifugar a 3500 x g durante 10 min a 4 °C y retirar el líquido del tubo exterior.
      NOTA: Retenga las partículas de más de 100 kDa en la membrana del tubo interior, mientras que las proteínas de menos de 100 kDa se centrifugarán al tubo exterior junto con la solución. Los exosomas eran mayores de 100 kDa y se agregaron en la membrana del tubo interno.
   6. Repita los pasos anteriores hasta que el volumen total del líquido esté dentro de los 5 ml. Recoja el líquido de la cámara de aire y agregue 1 ml de DPBS. Utilice una pipeta para pipetear repetidamente en el tubo interior, asegurando la resuspensión de los exosomas adjuntos en DPBS, y luego recójalos.
   7. Centrifugar a 10000 x g durante 60 min a 4 °C y transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga de 6 mL de cierre rápido (ver Tabla de Materiales). Selle el tubo con un sellador térmico.
   8. Centrifugar a 100.000 x g durante 2 h 4 °C utilizando una ultracentrífuga (ver Tabla de Materiales). Abra el tubo de centrífuga de cierre rápido, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 100 μL de DPBS. Esta es la solución del exosoma.
      NOTA: Durante el proceso de resuspensión del pellet, es necesario pipetear y agitar la pared del tubo al menos 200 veces con una pipeta.

2. Fabricación de exo@MN

1. Preparación del molde maestro
   1. Construya un modelo de microaguja con una matriz de 10 x 10 utilizando software CAD, con puntas de forma cónica con los siguientes parámetros: una altura de 1200 μm, un diámetro de base de 400 μm y un paso (distancia entre microagujas adyacentes) de 900 μm.
   2. Utilice resina HTL como material e imprima el molde maestro de la microaguja utilizando una impresora 3D (ver Tabla de Materiales).
   3. Sumerja el molde maestro en etanol absoluto durante 1 h para eliminar cualquier resina adherida a la superficie.
   4. Exponga el molde a la luz ultravioleta durante 5 minutos para que se seque.
   5. Sumergir el molde una vez más en etanol absoluto durante 1 h, seguido de un secado a 60 °C en un horno de secado durante 1 h. El molde maestro está listo.
2. Preparación del molde de producción
   1. Mezcle los componentes A y B del polidimetilsiloxano (PDMS, consulte la tabla de materiales) en una proporción de 10:1. Remueve bien y vierte la mezcla en un molde maestro.
   2. Coloque el molde de PDMS a una presión de 1 psi durante 15 minutos para eliminar las burbujas de aire de la mezcla de PDMS.
   3. Curar el molde de PDMS a 60 °C durante 2 h y luego desmoldar para obtener el molde de producción de la microaguja.
   4. Limpie el molde de producción con agua ultrapura antes de usarlo.
3. Preparación de la solución
   1. Cuantifique el contenido de proteínas de la solución de exosomas utilizando un kit de ensayo de BCA (consulte la tabla de materiales). Agregue una cantidad adecuada de DPBS para lograr una concentración de 10 μg/μL para la solución de exosomas.
   2. Prepare una solución de 200 mg/mL de trehalosa (ver Tabla de Materiales) utilizando DPBS como solvente. Revuelva durante 20 minutos para asegurar una disolución completa.
   3. Prepare una solución de 200 mg/mL de ácido hialurónico (AH, ver Tabla de Materiales) utilizando DPBS como disolvente. Revuelva durante la noche para asegurar la disolución completa.
   4. Prepare una solución de 150 mg/mL de polivinilpirrolidona (PVP, ver Tabla de Materiales) utilizando etanol absoluto como solvente. Revuelva durante la noche para asegurar la disolución completa.
   5. Mezclar la solución de exosomas (10 μg/μL) y la solución de trehalosa (200 mg/mL) en una proporción de volumen de 1:1. Luego, agregue un volumen igual de solución de HA (200 mg / mL). Mezcle bien para obtener la solución de punta.
4. Fabricación de exo@MN
   1. Procese la superficie del molde de PDMS utilizando un limpiador de plasma (ver Tabla de Materiales) durante 30 s a un grado bajo para mejorar su hidrofilicidad.
   2. Añada 40 μL de la solución de puntas al molde de PDMS. Centrifugar a temperatura ambiente (RT) y 3000 x g durante 3 min para asegurar que el líquido llene la capa de agujas del molde.
   3. Retirar el exceso de líquido del molde y secar a RT en un horno de secado al vacío (ver Tabla de Materiales) durante 1 día.
   4. Agregue 200 μL de solución de PVP al molde de PDMS. Centrifugar 3000 x g durante 3 min en RT para asegurarse de que el líquido llene la capa de soporte del molde.
   5. Seque el molde en RT en un horno de secado durante 1 día, luego desmolque para obtener el parche exo@MN.
      NOTA: Mantenga el parche de exo@MN almacenado en un horno de secado hasta que esté listo para usar.

Figura 1: Proceso de fabricación de exo@MN parches. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Caracterización de exo@MN parches

1. Observación de la morfología
   1. Pegue el reverso del parche sobre una superficie inclinada 45° y colóquelo bajo un microscopio estereoscópico (consulte la tabla de materiales).
   2. Enciende el iluminador y captura la morfología del parche con un objetivo 4x.
2. Microscopía electrónica de barrido (SEM)
   1. Fije el parche a la etapa de muestra con adhesivo conductor y trátelo con un recubridor fino automático (consulte la tabla de materiales) durante 30 s.
   2. Capture imágenes del parche exo@MN utilizando SEM (ver Tabla de Materiales) con un voltaje de aceleración de 1 kV.
3. Ensayos mecánicos
   1. Corte una matriz de 3 x 3 del parche y colóquela con las puntas hacia arriba en la plataforma rígida de un medidor de tracción (consulte la tabla de materiales). Ajuste la altura de la sonda para acercarla a las puntas de las agujas sin tocarlas.
   2. Ajuste los parámetros para que se detengan cuando la presión alcance los 20 N automáticamente. Comprima las puntas de las agujas verticalmente a una velocidad de 0,5 mm/min y registre el perfil de carga frente al desplazamiento.
4. Disolución
   1. Compra orejas de cerdo frescas en el mercado y córtalas en trozos (5 cm x 5 cm x 0,3 cm). Extienda la piel de cerdo sobre una mesa y use papel para secar la humedad de la superficie.
   2. Prepare cuatro parches secos de microagujas con las puntas de las agujas hacia abajo sobre la piel del cerdo, espaciando ligeramente cada parche. Con los dedos pulgar e índice, presione verticalmente cada parche de microaguja. Retire un parche cada 15 s.
   3. Coloque inmediatamente el parche retirado en un horno de secado y seque durante 5 min. Corte una columna de puntas de microagujas, colóquelas horizontalmente debajo de un microscopio (consulte la Tabla de materiales) y use una lente de objetivo de 4x para observar la disolución de las puntas.

4. Caracterización de exosomas en exo@MN parche

NOTA: Las puntas de las microagujas de exo@MN se disuelven en 100 μL de solución de DPBS para realizar la siguiente caracterización de los exosomas liberados.

1. Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
   1. Trate la malla de cobre (ver Tabla de Materiales) con un tratamiento hidrofílico usando un limpiador de iones (ver Tabla de Materiales) durante 5 min.
   2. Dispense 10 μL de la muestra en el lado de carbono de la malla de cobre. Déjalo reposar durante 1 minuto, luego retira el líquido secándolo con papel de filtro por los bordes.
   3. Añadir 10 μL de acetato de uranilo al 3% (ver Tabla de Materiales) a la muestra. Déjalo reposar durante 10 s, luego retira el líquido secando con papel de filtro de los bordes.
   4. Añadir 10 μL de acetato de uranilo al 3% a la muestra. Déjalo reposar durante 1 minuto, luego retira el líquido secándolo con papel de filtro por los bordes y sécalo al aire RT.
   5. Captura de imágenes de los exosomas utilizando TEM (ver Tabla de Materiales) con un voltaje de aceleración de 80 kV.
2. Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)
   1. Diluya la solución de exosomas con DPBS para lograr una concentración de partículas de 1 x 10⁷ partículas/mL. Inyecte lentamente 1 mL de la solución de exosoma en la cámara de muestra del NTA utilizando una jeringa de 1 mL (ver Tabla de Materiales).
   2. Establezca el tipo de procedimiento operativo estándar (SOP) del instrumento en EV-488 para detectar la distribución del tamaño de los exosomas.
3. Western blot (WB)
   1. Prepare el tampón de lisis mezclando el tampón de lisis del ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA): fluoruro de fenilmetanosulfonilo (ver Tabla de Materiales) en una proporción de 100:1. Lise los exosomas en hielo durante 20 minutos, vórtices cada 10 minutos.
   2. Centrifugar la solución a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C. Recoja el sobrenadante para medir la concentración de proteínas.
   3. Agregue 5 veces el tampón de carga SDS-PAGE (consulte la Tabla de materiales) al sobrenadante en una proporción de volumen de 1 : 4 y mezcle bien. Calentar a 100 °C durante 10 min para desnaturalizar las proteínas.
   4. Añadir 5 μL de un marcador de proteína preteñido de 180 kDa (ver Tabla de Materiales) y 10 μg de muestra desnaturalizada a un gel prefabricado al 4%-20% (ver Tabla de Materiales). Haga funcionar el sistema de electroforesis (consulte la tabla de materiales) a 60 V durante 10 min y luego a 140 V durante 50 min.
   5. Transfiera las proteínas del gel a una membrana de PVDF (ver Tabla de Materiales) preactivada con metanol. Realizar el sistema de electroforesis a 290 mA durante 90 min en hielo.
   6. Incubar la membrana de PVDF en una solución de leche desnatada al 5% durante 1 h. Lave tres veces con solución salina tamponada tris con interpolación (TBST, consulte la Tabla de materiales) durante 5 minutos cada una.
   7. Corta las bandas objetivo en función de la posición de la proteína. Incubar las bandas con el anticuerpo anti-ratón CD63 y el anticuerpo anti-ratón Alix (ver Tabla de Materiales) diluidos a la concentración adecuada de acuerdo con las instrucciones del fabricante, e incubar durante la noche a 4 °C.
   8. Lave las bandas tres veces con TBST. Incubar con IgG anti-conejo conjugada con HRP (ver Tabla de Materiales) en RT durante 1 h. A continuación, vuelva a lavar tres veces con TBST.
   9. Aplique un reactivo de detección de súper ECL (consulte la Tabla de materiales) para cubrir la superficie de las bandas, y exponga y capture inmediatamente las bandas con un generador de imágenes en gel (consulte la Tabla de materiales).
4. Microscopía de barrido láser confocal (CLSM)
   1. Cultive 5 x 10⁵ DC en un plato confocal utilizando 2 mL de medio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) (ver Tabla de Materiales). Añadir exosomas o exo@MN, e incubar a 37 °C durante 24 h.
   2. Añada una gota de Hoechst 33342 a cada placa confocal e incube en la oscuridad a 37 °C durante 20 min.
   3. Realice imágenes con un CLSM (consulte la Tabla de materiales) utilizando una lente de objetivo de 60x. Aplique una gota de aceite de inmersión (consulte la tabla de materiales) sobre la lente y coloque la placa confocal sobre la plataforma. Ajuste los ejes x/y/z para localizar el plano focal adecuado de las células.
   4. Inicie la generación de imágenes con canales DAPI/TRITC/TD, seleccione una resolución de 1024 px y establezca el modo rápido en 1/8 s.
5. Citometría de flujo
   1. Cultive las CD en una placa de 6 pocillos, cada pocillo contiene 5 x 10⁵ celdas y 2 mL de medio 1640. Añadir volúmenes iguales de solución de DPBS, exosomas, microagujas sin exosomas y exo@MN, respectivamente, e incubar a 37 °C durante 24 h.
   2. Transfiera el medio de cada pocillo a tubos centrífugos. Centrifugar a 300 x g durante 3 min a 4 °C y retirar el sobrenadante.
   3. Agregue 0,5 μL de anticuerpo FITC-CD11c, 2,5 μL de anticuerpo APC-CD80 y 0,5 μL de anticuerpo Pacific Blue I-A/I-E (ver Tabla de Materiales) a 100 μL de solución de BSA al 5% (ver Tabla de Materiales). Mezclar bien, resuspender las células e incubar en una coctelera en hielo y en la oscuridad durante 20 min.
   4. Añadir 1 mL de DPBS y centrifugar a 300 x g durante 3 min a 4 °C, luego retirar el sobrenadante. Repita el lavado dos veces para eliminar los anticuerpos no unidos y, a continuación, proceda a analizar los canales fluorescentes correspondientes mediante citometría de flujo (ver Tabla de Materiales).
      1. En primer lugar, en el diagrama de dispersión FSC-A/SSC-A, dirija la población de células principales como P1. En el diagrama de dispersión SSC-A/SSC-H de la población de células P1, conecte una región P2 cuadrada a lo largo de la diagonal para eliminar las células agregadas.
      2. Realice análisis de fluorescencia en la población de células P2 utilizando los canales FITC, APC y Pacific Blue. Establezca la condición de parada para recoger 10.000 celdas en la puerta P2.

5. Análisis estadístico

1. Expresar datos cuantitativos como medias ± desviaciones estándar (DE). Evalúe la significación estadística utilizando el análisis de prueba t utilizando una aplicación de software de análisis de datos adecuada. Considere valores p inferiores a 0,05 para indicar significación estadística. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Resultados

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de exosomas, fabricación y caracterización de exo@MN parche. La Figura 1 ilustra el diagrama de flujo del proceso para la fabricación de exo@MN parche. Los exosomas se mezclaron con trehalosa y HA, y luego la mezcla se agregó al molde de microagujas y se centrifugó. Este proceso facilitó la agregación de exosomas en las puntas de las agujas, promoviendo una rápida liberación. Después del secado, se agregó una solución de PVP y se centrifugó para llenar el molde por completo. Tras el secado completo, se retiró el molde para obtener los parches exo@MN. La morfología de las microagujas se caracterizó mediante microscopía y SEM, como se muestra en la Figura 2. Las puntas del parche exo@MN exhibían una forma cónica dispuestas en una matriz de 10 x 10 con puntas de aguja afiladas e intactas. La punta de la microaguja puede soportar una fuerza de 2 N, lo que le permite penetrar a través de la barrera cutánea. Además, se empleó piel porcina como sustituto de la piel humana para simular la aplicación de parches exo@MN. Los parches se presionaron sobre la piel del cerdo para observar el tiempo de liberación, y las puntas de las microagujas se derritieron por completo en 60 s. Los parches exo@MN se disolvieron en DPBS y se caracterizaron, como se muestra en la Figura 3. Las imágenes TEM capturaron vesículas con estructuras típicas en forma de copa, consistentes con la morfología de los exosomas. La distribución del tamaño de partícula de la solución exo@MN por NTA reveló que las partículas se concentraban predominantemente dentro del rango de 50-250 nm. Sin embargo, también había algunas partículas más grandes presentes, que pueden atribuirse a las propiedades adhesivas del material HA, lo que provoca la agregación de exosomas. El análisis WB de las proteínas CD63/Alix en la solución exo@MN demostró que exo@MN era capaz de retener parcialmente las proteínas de los exosomas. La funcionalidad biológica de los exosomas liberados por el exo@MN se validó en la Figura 4, centrándose en la absorción de exosomas por parte de las células y la activación de las células dendríticas en comparación con los exosomas frescos. Las imágenes CLSM confirmaron la absorción eficiente tanto de exosomas frescos como de exosomas en el exo@MN por parte de las DC. Las imágenes representativas y las estadísticas proporcionales de la citometría de flujo demuestran que los exosomas en exo@MN poseen funciones biológicas que promueven la activación de las CD similares a los exosomas frescos.

Figura 2: Caracterización de exo@MN parches. (A) Imágenes de microscopio estereoscópico de exo@MN parches. Barra de escala = 400 μm. (B) Imagen SEM de exo@MN parches. Barra de escala = 200 μm. (C) Los perfiles de carga frente a desplazamiento de exo@MN parche. (D) Imágenes microscópicas de exo@MN parches insertados en la piel del cerdo en diferentes momentos. Barra de escala = 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Caracterización de exosomas frescos y exosomas en exo@MN. (A) Morfología de exosomas por TEM. Barra de escala = 100 nm. (B) Distribución del tamaño de partícula de los exosomas por NTA. (C) CD63 y Alix de exosomas por WB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Pruebas biológicas de exosomas frescos y exosomas en exo@MN. (A) Imágenes CLSM de exosomas tomados por DCs. Barra de escala = 10 μm. (B) Gráficos representativos de activación de DCs por citometría de flujo. (C) Cuantificación del porcentaje de CD11c⁺CD80⁺MHCII⁺ DCs. Los datos se presentan como media ± DE (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

En la actualidad, los principales métodos de aislamiento de exosomas son la ultracentrifugación, la centrifugación en gradiente de densidad, la ultrafiltración, la precipitación, las perlas magnéticas de inmunoafinidad y la microfluídica²⁴. Debido a la limitada capacidad de carga de las microagujas causada por su pequeño espacio en la punta de la aguja, es necesario aumentar la concentración de exosomas para cargar más. Por lo tanto, elegimos la ultrafiltración para concentrar el sobrenadante del cultivo celular y luego utilizamos la ultracentrifugación para aislar los exosomas. La concentración de exosomas se incrementó con una pequeña cantidad de resuspensión líquida para que las microagujas pudieran cargarse con decenas o cientos de microgramos de exosomas. Sin embargo, este método da como resultado una presencia significativa de proteínas en la solución aislada del exosoma. Además, se produce una pérdida sustancial de exosomas durante el proceso de centrifugación. Hoy en día, una de las limitaciones de la aplicación terapéutica de los exosomas es la falta de métodos efectivos para aislar exosomas con alta pureza y en grandes cantidades. A medida que se explora cada vez más el potencial clínico de los exosomas, existe la necesidad de desarrollar técnicas más avanzadas en el futuro para abordar los desafíos asociados con su extracción.

La tecnología clave en este estudio es el diseño de microagujas basadas en exosomas. Con el fin de minimizar el desperdicio de exosomas y lograr efectos terapéuticos más fuertes, se adoptó un método de fundición de dos pasos para fabricar exo@MN parches. La trehalosa ha sido reportada previamente como un material adecuado para la preservación liofilizada de exosomas²⁵, mientras que el AH exhibe una excelente biocompatibilidad, hidrofilicidad y funciones en la inhibición de la inflamación y la promoción de la reparación de la piel²⁶. La fabricación de puntas de aguja cargadas con exosomas utilizando estos dos materiales ayuda a mantener la actividad biológica de los exosomas, lo que permite su rápida disolución y liberación dentro de la piel. Además, este enfoque minimiza el riesgo de infección y contribuye a la rápida recuperación de la piel. A través de la centrifugación y el secado al vacío, los exosomas se concentraron en las puntas de las microagujas. Teniendo en cuenta la incompatibilidad del etanol y la trehalosa, se seleccionó como material de soporte el PVP disuelto en etanol absoluto. Este método de fabricación en capas mejoró efectivamente la eficiencia de entrega de los exosomas.

La escasa estabilidad de los exosomas in vitro, ya sea almacenados a 4 °C, 37 °C o -80 °C, puede provocar cambios en la estructura del exosoma o su degradación¹¹. Para resolver este problema, varios estudios han explorado los métodos de almacenamiento de los exosomas, como la liofilización. La tecnología de microagujas proporciona otra estrategia novedosa. Al secar en RT, la tecnología de microagujas puede mejorar la estabilidad de los exosomas y se puede utilizar directamente para la administración de exosomas sin otros tratamientos. Además, el proceso de extracción de exosomas es complejo y propenso a la degradación, lo que dificulta las aplicaciones a gran escala. El almacenamiento de exosomas extraídos mediante la tecnología de microagujas no simplifica los pasos de extracción, pero reduce el número de extracciones necesarias. Una sola extracción puede producir una gran cantidad de parches exo@MN, que se pueden almacenar durante un período prolongado. El uso de microagujas de exosomas del mismo lote para cada tratamiento minimiza el impacto potencial de las variaciones entre diferentes lotes en los resultados terapéuticos, mejorando así la repetibilidad y la fiabilidad de la nanoplataforma de exosomas²⁷. Esto proporciona más posibilidades para la aplicación clínica de los exosomas.

En futuras investigaciones, vale la pena explorar métodos que permitan un control preciso de la carga útil y minimizar las variaciones del fármaco entre las puntas de las agujas. Esto se puede lograr a través de la optimización de procesos, la implementación de medidas de control de calidad y la utilización de técnicas avanzadas. Abordar estos aspectos contribuirá significativamente al desarrollo de sistemas de administración de fármacos fiables y coherentes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
100x soluciones de penicilina-estreptomicina	Jrunbio Scientific	MA0110	Cultivo celular
180 kDa marcador de proteína pre-teñido	Thermo	26616	Western blot
3% Acetato de uranilo	Henan Ruixin Experimental Supplies	GZ02625	Caracterización morfológica de exosomas
Impresora 3D	Tecnología BMF	Molde nanoArch S130	preparación
4%– 20% gel prefabricado	Genscript	ExpressPlus PAGE GEL	Western blotting
5× Búfer de carga SDS-PAGE	Titan 04048254		Western blot
Anticuerpo Alix anti-ratón	Biolegend	12422-1-AP	Western blot
Anticuerpo CD63 anti-ratón	Biolegend	ab217345	Western blot
APC anticuerpo CD80 anti-ratón	Biolegend	104713	Anticuerpo
Auto recubridor fino	ZIZHU	JBA5-100	Caracterización morfológica de la microaguja
Kit de ensayo BCA	Beyotime	P0012	Ensayo de concentración de proteínas
Centrífuga	Thermo Fisher	Muitifuge X1R pro	Centrífuga de celdas
Bomba de vacío de agua circulante	Yuhua Instrument	SHZ-D(III)	filtración
Incubadora de CO2	Eppendorf	CellXpert C170	Cultivo celular
Microscopio de escaneo láser confocal	Nikon	A1HD25	Imágenes de fluorescencia
Malla de cobre	Beijing Zhongjingkeyi Technology	JF-ZJKY/300	Caracterización morfológica de los exosomas
D- (+)-Trehalosa dihidratado	Aladdin	5138-23-4	Fabricación de microagujas
Dulbecco' Águila modificada' s medio	Meilunbio	MA0212	Cultivo celular
Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato	Meilunbio	MA0010	Cultivo celular
Sistema de electroforesis	Bio-rad	PowerPac-basic	Western blot
Suero fetal bovino	Jrunbio	Scientific JR100	Cultivo celular
FITC anticuerpo anti-ratón CD11c	Biolegend	117305	Anticuerpo
Citometría de flujo	BD	LSR Fortessa	Detección de fluorescencia
Generador de imágenes en gel	Cytiva	Amersham ImageQuant 800	Western blot
HRP conjugado con HRP IgG	CST	7074S	Western blot
Resina HTL	Tecnología		Preparación
moldes Ácido hialurónico (MW = 300 kDa)	Bloomage Biotechnology	9004-61-9	Fabricación de microagujas
Aceite de inmersión	Nikon	MXA22168	Imágenes de fluorescencia
Limpiador de iones	JEOL	EC-52000IC	Caracterización morfológica de exosomas
Microscopio	Olympus	CKX53	Observe el proceso de disolución de la punta de la microaguja
Célula de cáncer epitelial de ovario de ratón ID8	MeisenCTCC	CC90105	Cultivo celular
Análisis de seguimiento de nanopartículas	Metrix	ZetaView	Análisis de tamaño de exosomas
Azul del Pacífico Anticuerpo I-A/I-E anti-ratón	Biolegend	107619	Anticuerpo
Fluoruro de fenilmetanosulfonilo	Beyotime	ST507	Inhibidores de la proteasa
Limpiador de plasma	Hefei Kejing Tecnología de materiales	PDC-36G	Fabricación de microagujas
Polidimetilsiloxano	Dow Corning	9016-00-6	Preparación de moldes
Polivinilpirrolidona (MW = 40 kDa)	Aladdin	9003-39-8	Fabricación de microagujas
Prisma	GraphPad	Versión 9	Análisis estadístico
Membrana de PVDF	Millipore	IPVH00010	Western blot
Centrífuga de cierre rápido	Beckman	344619	Extracción de exosomas
Tampón de lisis RIPA	Applygen	C1053	Membrana de lisis
Roswell Park Memorial Institute 1640	Meilunbio	MA0548	Cultivo celular
Microscopio electrónico de barrido	JEOL	JSM-IT800	Caracterización morfológica de la microaguja
Microscopio estereoscópico	Olympus	SZX16	Caracterización de la morfología
Reactivo de detección Super ECL	Applygen	P1030	Western blot
Tensímetro	Instron	68SC-05	Ensayos mecánicos
Microscopio electrónico de transmisión	JEOL	JEM-2100plus	Caracterización morfológica de exosomas
Tris tamponado solución salina	Sangon Biotech	JF-A500027-0004	Western blot
Tween-20	Beyotime	ST825	Western blot
Ultracentrífuga	Beckman	Optima XPN-100	Extracción de exosomas
Tubo de ultrafiltración	Millipore	UFC910096	Concentración de exosomas
Horno de secado al vacío	Shanghai Yiheng Technology	DZF-6024	Fabricación de microagujas Sistema de filtración al
vacío	Biosharp	BS-500-XT	Filtración